KR101951846B1 - 콜리스틴(Colistin) 내성세균을 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 콜리스틴 내성세균의 검출방법 - Google Patents

콜리스틴(Colistin) 내성세균을 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 콜리스틴 내성세균의 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 콜리스틴(Colistin) 내성세균을 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 콜리스틴(Colistin) 내성세균의 검출방법에 관한 것이다. 구체적으로, 세균에서 콜리스틴 항생제에 대한 내성을 제공하는 mcr -1(mobile colitin resistance-1) 유전자를 타겟으로 하는, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 특정 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 중합효소연쇄반응 수행시 기존에 사용되고 있는 프라이머 세트보다 어닐링 온도범위가 넓고 비특이적인 밴드가 적게 검출되므로 콜리스틴 내성 세균의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

콜리스틴(Colistin) 내성세균을 검출하기 위한 프라이머 및 이를 이용한 콜리스틴 내성세균의 검출방법{PRIMERS FOR DETECTION OF COLISTIN-RESISTANT BACTERIA AND DETECTING METHOD OF COLISTIN-RESISTANT BACTERIA USING THE SAME}
본 발명은 콜리스틴(Colistin) 내성세균을 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 콜리스틴(Colistin) 내성세균의 검출방법에 관한 것이다.
콜리스틴은 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa) 로부터 생산되는 펩티드계 항생물질로서 1950년에 그람음성 세균에 대해 항균활성을 갖는다는 것이 처음 보고(Koyama Y. 등, J. Antibiotics, 3 , 457, 1950)되었다. 강한 신장 독성이 있어 그 동안 잘 쓰이지 않았으나 다양한 항생제 내성 슈퍼 박테리아의 등장으로 인해 근래 최후의 항생제로 다시 주목받고 있으며, 시겔라속, 대장균, 녹농균 및 살모넬라속 등의 그람음성 세균에 의해 유발되는 감염증을 치료하기 위해 사용되고 있다.
그러나 2015년 말 중국에서 가축에서 분리한 E. coli의 이동성 플라스미드에서 콜리스틴 항생제에 내성을 제공하는 유전자인 mcr-1(Mobile Colistin Resistance-1)이 처음으로 보고(Lancet Infect Dis 2016;16: 16168)된 이후, 이미 이 유전자를 가지고 있는 세균이 아시아, 유럽, 아메리카 및 아프리카 등 전 대륙에 걸쳐 농축산 뿐 아니라 환경, 임상검체에서도 발견되고 있음이 확인되었다. 구체적으로 mcr-1 유전자를 함유하는 플라스미드는 E . coli 뿐 아니라, K.pneumoniae, Enterobacter spp. 등 다양한 임상, 가축의 장내에서 흔한 그람음성균에서 발견되고 있는 실정이며 이는 이종 세균 간에도 쉽게 전파될 수 있다는 점에서 기존의 항생제 내성 슈퍼 박테리아와 더불어 공중보건학적으로 심각한 위협이 되고 있다.
임상에서 카바페넴에 내성을 나타내는 장내세균의 경우 최후의 항생제로 콜리스틴을 이용한 치료가 이용된다. 하지만 콜리스틴에 내성을 나타내는 경우에는 치료가 극히 어렵다. 이에 콜리스틴 내성의 확산을 막고 조기에 내성 유전자를 가진 세균을 검출하기 위해서 이동성이 있는 mcr-1 내성유전자의 빠르고 정확한 감별이 더욱 필요하다. 중국에서 이를 위한 mcr-1 PCR 프라이머 세트를 보고하였으나 증폭산물의 크기가 작고 비특이적인 밴드가 확인되는 문제점이 있었다(Lancet Infect Dis 2016;16: 16168). 이에 본 발명자들은 높은 정확도로 mcr -1 유전자를 가진 세균을 검출하기 위해 어닐링 온도의 범위가 넓고 비특이 밴드가 적게 나타나는 mcr-1 프라이머 세트를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 콜리스틴(Colistin) 내성세균 검출용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 콜리스틴 내성세균 검출용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 사용하여 콜리스틴 내성세균을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 콜리스틴(Colistin) 내성세균 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 콜리스틴 내성세균 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 콜리스틴 내성세균 검출용 키트를 제공한다.
아울러, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 하여 본 발명에 따른 프라이머 세트로 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 콜리스틴 내성세균의 검출방법을 제공한다.
세균에서 콜리스틴 항생제에 대한 내성을 제공하는 mcr -1(mobile colitin resistance-1) 유전자를 타겟으로 하는, 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 특정 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 중합효소연쇄반응 수행시 기존에 사용되고 있는 프라이머 세트보다 어닐링 온도범위가 넓고 비특이적인 밴드가 적게 검출되므로 콜리스틴 내성 세균의 검출에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 콜리스틴 내성에 관여하는 mcr-1 유전자의 1,626bp 염기서열을 나타낸 도이다. 청색 바탕의 흰색 서열은 Liu et al. 의 논문에서 처음 보고한 프라이머세트를, 적색 바탕의 흰색 서열은 본 발명에서 새로 제작한 mcr-1IF 및 mcr-1IR프라이머를 나타내고 있다.
도 2는 mcr-1 유전자 양성균주를 동정하기 위해 다양한 프라이머세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 mcr-1IF 및 mcr-1IR 프라이머를 이용, PCR의 최적온도를 찾아내기 위해 다양한 어닐링(annealing) 온도 조건에서 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 mcr-1IF 및 mcr-1IR 프라이머를 이용한 PCR에서 주형 DNA 농도의 최저검출 한계를 측정하기 위해 주형 mcr -1 유전자 농도를 200ng부터 2pg까지 6단계로 10배씩 단계적으로 희석하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 mcr-1IF 및 mcr-1IR 프라이머를 이용, mcr-1 유전자 양성균주와 음성균주로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 mcr-1IF 및 mcr-1IR 프라이머를 이용하여 mcr-1 양성균주로부터 추출한 게놈 DNA의 농도별로 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 콜리스틴(Colistin) 내성세균 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 콜리스틴은 바실러스 폴리믹사(Bacillus polymyxa) 로부터 생산되는 펩티드계 항생물질로서 시겔라속, 대장균, 녹농균 및 살모넬라속 등의 그람음성 세균에 의해 유발되는 감염증의 치료에 적용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 프라이머는 세균에서 콜리스틴 항생제에 대한 내성을 제공하는 mcr -1(mobile colitin resistance-1) 유전자내의 특정 단편을 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 상기 유전자의 특정 서열에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개의 염기서열로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 콜리스틴 내성 세균을 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자 및 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 콜리스틴(Colistin) 내성세균 검출용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 세균에서 콜리스틴 항생제에 대한 내성을 제공하는 mcr-1(mobile colitin resistance-1) 유전자내의 특정 단편을 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 상기 유전자의 특정 서열에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개의 염기서열로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 조성물에는 상기 프라이머 세트 이외에 역전사 중합효소, DNA 중합효소, Mg2 +와 같은 조인자, 또는 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)가 포함될 수 있다. 역전사된 cDNA 또는 게놈 DNA를 증폭하기 위하여 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, DNA 중합효소의 예로 E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 또는 박테리오파지 T7 DNA 중합효소가 있다. 중합효소는 박테리아 그 자체로부터 분리하거나 상업적으로 구입하거나 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자를 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 mcr-1(mobile colitin resistance-1) 유전자의 서열을 기초로 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머를 제작하고, 이를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 기존에 보고된 mcr-1 유전자에 대한 프라이머 세트를 이용하는 것보다 프라이머의 어닐링 온도범위가 넓고 PCR 산물에서 비특이적인 밴드가 적게 검출됨을(도 참조) 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 콜리스틴 내성세균 검출용 조성물을 포함하는 콜리스틴 내성세균 검출용 키트를 제공한다.
상기 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다. 상기 프라이머는 세균에서 콜리스틴 항생제에 대한 내성을 제공하는 mcr -1(mobile colitin resistance-1) 유전자내의 특정 단편을 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 mcr-1(mobile colitin resistance-1) 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍 이외에도 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다. 한편, 키트에 포함되는 성분들은 액상 형태로 제조될 수도 있고, 포함 성분들의 자유도를 낮추어 제품의 안정성을 제고하기 위해 건조된 형태로 제조될 수도 있다. 이러한 건조된 형태로의 제조를 위해서는 건조 단계의 적용이 필요하고, 이때 가온건조, 자연건조, 감압건조, 동결건조 또는 이들의 복합 공정이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하는 것을 포함하는 콜리스틴 내성세균의 검출방법을 제공한다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
상기 프라이머 세트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 프라이머는 mcr -1(mobile colitin resistance-1) 유전자내의 특정 단편에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있으며, 상기 프라이머 세트는 상기 특정 영역의 유전자에 상보적으로 결합가능한 10 내지 40개의 염기서열로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 15 내지 30개의 염기서열로 이루어진 정방향 또는 역방향 프라이머 쌍일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> mcr -1 유전자를 표적으로 한 프라이머 디자인 및 제작
프라이머는 mcr-1 유전자의 1,626bp를 대상으로 GC함량 40~60%, 증폭 산물의 크기는 600 내지 800bp가 되도록 본원에서 디자인하고 화학적으로 합성하였다(마크로젠, 대전, 한국). 기존에 보고된 프라이머와 새로 제작한 프라이머의 서열은 하기 표 1과 같다.
mcr -1 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머 서열
프라이머
set		 프라이머 프라이머 서열 (5’→3’) 증폭크기
(bp)
A mcr-1AF gcgcggatgagtatgatgtc (서열번호 3) 522
mcr-1AR ccagactttcgccatgatcg (서열번호 4)
B
 mcr-1BF ccaaaatgccctacagaccg (서열번호 5) 592
mcr-1BR gacatcatactcatccgcgc (서열번호 6)
C mcr-1CF tgttcttgtggcgagtgttg (서열번호 7) 468
mcr-1CR acaggcagtaaaatcagcgc (서열번호 8)
D
 mcr-1DF attcggactcaaaaggcgtg (서열번호 9) 426
mcr-1DR ccagactttcgccatgatcg (서열번호 10)
E
 mcr-1EF gcgctgattttactgcctgt (서열번호 11) 414
mcr-1ER gacatcatactcatccgcgc (서열번호 12)
F
 mcr-1FF gccaatctactcggtgggta (서열번호 13) 821
mcr-1FR ccagactttcgccatgatcg (서열번호 14)
G
 mcr-1GF tgctattaatcatgggcgcg (서열번호 15) 733
mcr-1GR cgccacaagatacttacgcc (서열번호 16)
H
 mcr-1HF atgctactgatcaccacgct (서열번호 17) 726
mcr-1HR gacatcatactcatccgcgc (서열번호 18)
I mcr-1IF cagtgcgccaaaagatacca (서열번호 1) 784
mcr-1IR accgttctcacccagacttt (서열번호 2)
기존
 mcr-1F cggtcagtccgtttgttc (서열번호 19) 309
mcr-1R cttggtcggtctgtaggg (서열번호 20)
도 1에 표시한 바와 같이 mcr -1 유전자의 전장 1,626bp 서열에서 청색 바탕의 흰색 서열은 Liu et al.(Lancet Infect Dis. 2016 Feb;16(2):161-8)의 논문에서 처음 보고한 프라이머세트(mcr-1F 및 mcr-1R)를, 적색 바탕의 흰색 서열은 본 발명에서 새로 제작한 프라이머세트(mcr-1IF 및 mcr-1IR)를 나타내고 있다. 도 1에 개시된 mcr-1 유전자 1,626bp를 회사(마크로젠,대전)에 의뢰하여 합성한 DNA를 상기 표 1의 프라이머쌍을 이용한 PCR의 양성대조군으로 사용하였다.
< 실험예 1> mcr -1 유전자 증폭을 위한 최적 프라이머 세트 스크리닝
본 발명에서 새롭게 제작한 다양한 프라이머세트를 이용하여, 콜리스틴 내성균주의 게놈 DNA 및 합성한 mcr -1 유전자를 주형으로 하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다.
사용한 균주는 하기의 표 2와 같다. 표 2에 개시된 균주들로부터 게놈 DNA를 추출한 후 PCR을 위한 주형으로 이용하였다. 구체적으로 게놈 DNA는 Maxwell® 16 Cell DNA Purification Kit(Promega, USA) 및 Maxwell® 16 Instrument(Promega, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 분리하여 PCR을 위한 주형으로 사용하였다. PCR은 Maxime PCR PreMix (Intron, Korea)에 주형 DNA 2㎕(100ng/㎕)와 정방향 프라이머(10pmole/㎕) 및 역방향 프라이머(10pmole/㎕)를 1㎕씩 넣고 증류수를 혼합하여 총 20㎕ PCR 반응액을 만든 후 프라이머의 Tm값을 고려하여 하기 표 3의 조건에서 수행하였다. PCR 증폭산물은 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동하였고 1kb plus Ladder(invitrogen, USA)를 사이즈 마커를 이용하여 증폭산물의 크기를 확인하였다.
실험균주
구분 균주등록번호 균종
mcr -1 양성균주 NCCP 16283 E. coli
NCCP 16284 E. coli
NCCP 16285 E. aerogenes
음성 표준균주 ATCC 25922 E. coli
mcr -1 음성참조균주 CESP20140251 Enterobacter species
PCR 반응 조건
구분 　 온도 시간 싸이클수
사전 변성 94℃ 5min 1
변성(denaturation) 94℃ 30sec 30
어닐링(annealing) 56℃ 1min
신장(elongation) 72℃ 45sec
최종 신장 72℃ 10min 1
그 결과 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 mcr-1IF 및 mcr-1IR 프라이머 세트(프라이머 세트 I)가 음성 대조군 균주에서 비특이적 증폭산물을 생성하지 않고, 양성 대조군(합성 mcr-1 유전자) 및 mcr -1 유전자 양성 균주에서도 비특이적 산물 없이 특이적인 산물만 생성하므로 mcr -1 유전자의 검출에 가장 효율적임을 알 수 있었다(도 2).
< 실험예 2> 사전 합성한 mcr -1 유전자를 주형으로 한 mcr -1 유전자 증폭 조건 확립
실험예 1에서 확인한 최적의 프라이머 세트 I(mcr-1F 및 mcr-1R 프라이머)를 이용하여, 콜리스틴 내성균주 검출을 위한 mcr -1 유전자 단편의 중합효소연쇄반응(PCR) 조건을 최적화하고자 하였다.
<2-1> 프라이머 어닐링 (annealing) 조건
프라이머 세트 I를 이용한 mcr -1 유전자 단편의 PCR과정에서 최적의 프라이머 어닐링 온도를 확인하고자 하였다.
PCR은 Maxime PCR PreMix (Intron, Korea)에 합성한 mcr -1 유전자 주형 DNA 2㎕(1ng/㎕)와 정방향 프라이머(mcr-1F 또는 mcr-1IF, 10pmole/㎕) 및 역방향 프라이머(mcr-1R 또는 mcr-1IR, 10pmole/㎕)를 1㎕씩 넣고 증류수를 혼합하여 총 20㎕ PCR 반응액을 만든 후 어닐링온도를 50℃, 52℃, 54℃, 56℃, 58℃, 60℃ 및 62℃로 다양하게 변화시킨 하기 표 4의 조건에서 수행하였다. PCR 증폭산물은 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동하였고 1kb plus Ladder(invitrogen, USA)를 사이즈 마커를 이용하여 증폭산물의 크기를 확인하였다.
PCR 반응 조건
구분 　 온도 시간 싸이클수
사전 변성 94℃ 5min 1
변성(denaturation) 94℃ 30sec 30
어닐링(annealing) 50℃, 52℃, 54℃
56℃, 58℃, 60℃
62℃		 1min
신장(elongation) 72℃ 45sec
최종 신장 72℃ 10min 1
그 결과 기존 mcr-1F 및 mcr-1R 프라이머 세트를 이용한 경우 어닐링 온도가 낮을수록 비특이적 증폭물이 생성되었으나 본 발명의 mcr-1IF 및 mcr-1IR 프라이머 세트 I를 이용한 경우에는 확인한 모든 어닐링온도 조건에서 비특이적 증폭물이 생성되지 않음을 확인하였다(도 3).
<2-2> 프라이머 세트 I를 이용한 PCR 반응에서 주형 DNA의 검출능
프라이머 세트 I를 이용한 mcr -1 유전자 단편의 PCR을 이용한 증폭에 있어 주형 DNA의 농도에 따른 증폭 정도를 확인하기 위하여 상기 실험예 <2-1>에 기재된 방법과 기본적으로 동일하나 프라이머 어닐링단계를 52℃에서 1분으로 설정하고, 합성한 mcr -1 유전자 DNA를 PCR 반응물당 200ng에서 2pg까지 주형 게놈 DNA의 농도를 희석하여 PCR을 수행하였다(Lane 1, 200ng; Lane 2, 20ng; Lane 3, 2ng; Lane 4, 200pg; Lane 5, 20pg; Lane 6, 2pg; Lane 7, DW(3차증류수)).
그 결과 PCR 반응물에서 주형 DNA가 최소 20pg이 포함된 경우까지 본 발명의 프라이머세트 I를 이용한 mcr -1 유전자 단편 서열의 증폭이 가능함을 알 수 있었다(도 4).
< 실험예 3> 국내 임상에서 분리한 mcr -1 유전자함유 균주를 이용한 mcr -1 유전자 증폭
임상에서 분리된 mcr -1 유전자 포함 균주에 대해 실험예 2에서 확인한 최적 조건에서 프라이머 세트 I로 PCR을 수행하였다.
<3-1> 본 발명 프라이머 세트를 이용한 mcr -1 유전자 포함 균주의 동정
사용한 균주는 상기의 표 2와 같다. 구체적으로 표 2에 개시된 균주들로부터 게놈 DNA를 추출한 후 PCR을 위한 주형으로 이용하였다. 구체적으로 게놈 DNA는 Maxwell® 16 Cell DNA Purification Kit(Promega, USA) 및 Maxwell® 16 Instrument(Promega, USA)를 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 분리하였고 PCR은 Maxime PCR PreMix (Intron, Korea)에 DNA 2㎕(100ng/㎕)와 정방향 프라이머(mcr-1F 또는 mcr-1I-F, 10pmole/㎕) 및 역방향 프라이머(mcr-1R 또는 mcr-1I-R, 10pmole/㎕)를 1㎕씩 넣고 증류수를 혼합하여 총 20㎕ PCR 반응액을 만든 후 하기 표 5의 조건으로 수행하였다. 양성 대조군으로는 합성한 mcr -1 유전자 DNA를 이용하였으며, PCR 증폭산물은 1.2% 아가로스 겔에서 전기영동하여 확인하였다.
PCR 반응 조건
구분 　 온도 시간 싸이클수
사전 변성 94℃ 5min 1
변성(denaturation) 94℃ 30sec 30
어닐링(annealing) 52℃ 1min
신장(elongation) 72℃ 45sec
최종 신장 72℃ 10min 1
그 결과, mcr-1IF 및 mcr-1IR 프라이머 세트 I를 이용한 경우 레인 5 내지 6의 음성균주, 레인 7의 음성대조군(DW)에서는 어떠한 산물도 증폭되지 않았으며 레인 1 내지 3의 mcr -1 유전자 양성균주에서만 비특이적 산물없이 선명한 단편의 증폭을 확인할 수 있었다(도 5).
<3-2> 본 발명 프라이머 세트를 이용한 PCR 반응에서 mcr -1 유전자 양성균주 유래의 주형 DNA의 검출능
mcr -1 유전자 양성균주에서 추출한 게놈 DNA의 농도에 따른 증폭 정도를 확인하기 위하여 PCR 반응물당 200ng에서 2pg까지 주형 게놈 DNA의 농도를 희석하여 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다(Lane 1, 200ng; Lane 2, 20ng; Lane 3, 2ng; Lane 4, 200pg; Lane 5, 20pg; Lane 6, 2pg; Lane 7, DW(3차증류수); Lane 8, mcr-1 합성유전자 200ng).
그 결과 프라이머세트 I를 이용하였을 때, PCR 반응물에 mcr -1 유전자 양성균주에서 추출한 게놈 DNA가 최소 20pg이 포함된 경우까지 mcr -1 유전자 단편 서열의 효율적인 증폭이 가능함을 알 수 있었다(도 6).
<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> PRIMERS FOR DETECTION OF COLISTIN-RESISTANT BACTERIA AND DETECTING METHOD OF COLISTIN-RESISTANT BACTERIA USING THE SAME <130> 2017P-09-022 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1IF <400> 1 cagtgcgcca aaagatacca 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1IR <400> 2 accgttctca cccagacttt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1AF <400> 3 gcgcggatga gtatgatgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1AR <400> 4 ccagactttc gccatgatcg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1BF <400> 5 ccaaaatgcc ctacagaccg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1BR <400> 6 gacatcatac tcatccgcgc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1CF <400> 7 tgttcttgtg gcgagtgttg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1CR <400> 8 acaggcagta aaatcagcgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1DF <400> 9 attcggactc aaaaggcgtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1DR <400> 10 ccagactttc gccatgatcg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1EF <400> 11 gcgctgattt tactgcctgt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1ER <400> 12 gacatcatac tcatccgcgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1FF <400> 13 gccaatctac tcggtgggta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1FR <400> 14 ccagactttc gccatgatcg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1GF <400> 15 tgctattaat catgggcgcg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1GR <400> 16 cgccacaaga tacttacgcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1HF <400> 17 atgctactga tcaccacgct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1HR <400> 18 gacatcatac tcatccgcgc 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1F <400> 19 cggtcagtcc gtttgttc 18 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mcr-1R <400> 20 accgttctca cccagacttt 20

Claims (5)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 각각 기재되는 염기서열로 이루어진 콜리스틴(Colistin) 내성세균 검출용 프라이머 세트.
  2. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 콜리스틴(Colistin) 내성세균 검출용 조성물.
  3. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 콜리스틴(Colistin) 내성세균 검출용 키트.
  4. 검체로부터 분리된 핵산을 주형으로 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계를 포함하는 콜리스틴(Colistin) 내성세균의 검출 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 검체는 임상검체 또는 환경검체인 것을 특징으로 하는 콜리스틴(Colistin) 내성세균의 검출 방법.
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