CN110541043A - 一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用 - Google Patents

一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110541043A
CN110541043A CN201910604416.7A CN201910604416A CN110541043A CN 110541043 A CN110541043 A CN 110541043A CN 201910604416 A CN201910604416 A CN 201910604416A CN 110541043 A CN110541043 A CN 110541043A
Authority
CN
China
Prior art keywords
trypanosoma brucei
kit
detection
lamp
trypanosoma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910604416.7A
Other languages
English (en)
Inventor
高江梅
伦照荣
张丛曦
徐智深
吴忠道
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
National Sun Yat Sen University
Original Assignee
National Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Sun Yat Sen University filed Critical National Sun Yat Sen University
Priority to CN201910604416.7A priority Critical patent/CN110541043A/zh
Publication of CN110541043A publication Critical patent/CN110541043A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用。本发明根据非洲布氏锥虫的18S核糖体RNA基因得到一个用于非洲布氏锥虫检测的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示，并进一步建立了基于LAMP的检测方法和检测试剂盒，本方法检测的灵敏度高，检测速度快；不仅能将被检血液中的布氏锥虫检测出来，同时适用于布氏锥虫传播媒介的监测。本发明具有很好的应用价值和推广前景。

Description

一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及寄生虫分子检测技术领域，更具体地，涉及一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用。
背景技术
非洲锥虫病是流行非洲大陆最重要的疾病之一，其病原体包括布氏锥虫的两个亚种：即布氏锥虫冈比亚亚种和和布氏锥虫罗得西亚亚种，两者均需通过吸血昆虫采采蝇(tsetse fly)进行传播。
目前，非洲锥虫病仍威胁着南撒哈拉非洲36个国家中的约6千万人口。在流行时期，非洲锥虫病在刚果民主共和国、安哥拉和苏丹南部的若干村庄中的患病率达到50％，个别区域的死亡率甚至超过艾滋病。虽然在世界卫生组织(WHO) 以及当地政府的努力下，非洲锥虫病得到了有效的控制，但2009年仍然有1万多的新病例报道。世界卫生组织认为由于流行区的条件限制导致实际数据采集不全，估计目前每年仍有约5～7万的新增感染病例。
近年来非洲地区旅游业快速发展及国际合作与交流频繁，使得非洲锥虫病存在传播至其他非流行区的可能性。我国也已出现多例输入性非洲锥虫病病例：2 014年8月，上海确诊一例男性赴非务工人员感染冈比亚亚种锥虫病；同年9月，江苏省人民医院收治一例男性赴非务工人员，后经南京医科大学附属医院确诊感染冈比亚亚种锥虫病；另外，2017年8月，福建确诊一例女性赴非旅游人员感染罗得西亚亚种锥虫病。这意味着输入性非洲布氏锥虫病将对我国人民健康构成威胁。
因此，对于非洲锥虫病的诊断及治疗非常重要。但是目前尚无一种针对非洲锥虫病快速有效的检测手段。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术尚无一种针对非洲锥虫病快速有效的检测手段的不足，提供一种基于LAMP的非洲锥虫病检测方法，本方法消除了LAMP体系中PCR抑制因子对扩增的影响，提供一种灵敏高效的快速检测方法。
本发明的第一个目的是一个用于非洲布氏锥虫检测的引物组合。
本发明的第二个目的是所述的引物在制备检测非洲布氏锥虫的试剂盒中的应用。
本发明的第三个目的是一个检测非洲布氏锥虫的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明通过设计一套布氏锥虫的特异性引物，提取待检DNA，进行LAMP 扩增，采用显色反应、沉淀反应或琼脂糖凝胶电泳方法对扩增产物进行鉴定分析，判定所述样品中布氏锥虫是否为阳性或阴性；通过在LAMP反应体系中添加了 0.048％牛血清白蛋白(BSA)，从而降低了血液样本中PCR抑制因子对LAMP 反应的干扰，提高了检测的准确率。
因此本发明要求保护一个用于非洲布氏锥虫检测的引物组合，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示。
所述的引物在制备检测非洲布氏锥虫的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
一个检测非洲布氏锥虫的试剂盒，其特征在于，含有所述引物组合。
优选地，还包括LAMP试剂。
优选地，所述LAMP试剂为10×Reaction buffer、MgSO4、dNTP Mix、ddH2O、 Bst DNApolymerase。
优选地，MgSO4浓度为100mM。
优选地，dNTP Mix的浓度为10mM。
优选地，所述LAMP反应体系为2.5μl的10×Reaction buffer、1.5μl的MgSO4(100mM)、3.5μl dNTP Mix(10mM)、2μl引物组合的混合物、13.5μl的ddH2O、 1μl的Bst DNApolymerase和1μl的DNA。
优选地，所述LAMP反应程序为60℃反应60min。
优选地，所述试剂盒的检测对象包括但不限于人等其他非洲布氏锥虫宿主。
最优选地，一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示的引物组和LAMP反应试剂：10×Reaction buffer、MgSO4、dNTP Mix、ddH2O、Bst DNApolymerase。
其使用方法包括以下步骤：
1、待检样本DNA的提取：
2、环介导的等温扩增
扩增体系为：2.5μl 10×Reaction buffer、1.5μl 100mM MgSO4、3.5μl 10mMdNTP Mix、2μl引物混合物、13.5μl ddH2O、1μl Bst DNA polymerase和1μl DNA。
扩增程序为：60℃恒温反应60min。
3、扩增产物分析：
采用显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
沉淀法：由于LAMP反应有DNA大量拷贝生成，所产生的焦磷酸根与镁离子发生反应，生成焦磷酸镁沉淀，所以阳性样本LAMP反应可造成反应体系的浑浊，经短暂离心看到明显白色沉淀，阴性样本没有白色沉淀。
采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，其步骤为：取扩增产物5μl，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭染料的2％的琼脂糖凝胶中，180～200v电泳1h，在凝胶成相系统上成像观察结果，阳性样本呈梯形条带，阴性样本无条带。
以上任一所述试剂盒在检测日本血吸虫感染中的应用也属于本发明的保护范围
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过设计一套布氏锥虫的特异性引物建立了基于LAMP的加测方法和检测试剂盒，本方法检测的灵敏度高，检测速度快；不仅能将被检血液中的布氏锥虫检测出来，同时适用于布氏锥虫传播媒介的监测。本发明具有很好的应用价值和推广前景。
附图说明
图1为LAMP扩增目的片段，下划线英文字母标注的序列为引物结合区域。
图2为LAMP方法检测布氏锥虫的方法流程图。
图3为对布氏锥虫DNA扩增产物进行沉淀法检测。
图4为对布氏锥虫DNA样品LAMP检测反应温度及时间优化结果。
图5为本发明对布氏锥虫LAMP检测方法敏感性检测结果；M：DL2000，1： 100ng/μL，2：10ng/μL，3：1ng/μL，4：100pg/μL，5：10pg/μL，6：1pg/ μL，7：100fg/μL，8：10fg/μL，9：1fg/μL，10：0fg/μL。
图6为本发明对布氏锥虫PCR检测方法敏感性检测结果；M：DL2000，1： 100ng/μL，2：10ng/μL，3：1ng/μL，4：100pg/μL，5：10pg/μL，6：1pg/ μL，7：100fg/μL，8：10fg/μL，9：1fg/μL，10：0fg/μL。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
蛋白酶K裂解液的组分及配比：先配置SNET缓冲液：pH为8.0的20mmol/L Tris5mmol/L的EDTA，400mmol/L的NaCl，1％十二烷基硫酸钠。再用SNET 缓冲液溶解蛋白酶K，使其最终工作浓度为400μg/ml。
实施例1引物设计
一、实验方法
根据非洲布氏锥虫的18S核糖体RNA序列(AB301939.1，核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示)设计适用于LAMP的特异引物组合，并进行特异性、灵敏度和扩增效率的筛选。
二、实验结果
根据特异性、灵敏度和扩增效率的筛选确定了一组检测非洲布氏锥虫感染的LAMP的特异引物组合，其序列如下：
外引物对F3(SEQ ID NO:1)：5’-GGGTGAGGATTGACAGATGG-3’
外引物对B3(SEQ ID NO:2)：5’-AGCAAGGAATCCCGCAGA-3’
内引物对BIP(SEQ ID NO:3)：
5'-ATTGTCCACACAGGACAGCAGT-GGGGCCTGTAAAAAGAAGGA-3'；
内引物对FIP(SEQ ID NO:4)：
5'-TCGTCCGTTGACGGAATCAACC-TGAATGGTGGTGCATGGC-3'；
促环形成引物对Loop F(SEQ ID NO:5)：
5'-CTCCACCGACCAAAAGCG-3'；
促环形成引物对Loop B(SEQ ID NO:6)：
5'-CCCTCCGGCGGGGATTTTTT-3'；
其引物与扩增目标片段的结合区域间图1。
实施例2一种检测布氏锥虫感染的试剂盒
一、组成
核苷酸序列如SEQ ID NO:1～6所示的引物组和LAMP反应试剂：10×Reactionbuffer、MgSO4(100mM)、dNTP Mix(10mM)、ddH2O、Bst DNA polymerase。
二、使用方法(如图2所示)
1、待检样本DNA的提取：
1)收集待测样本；
2)向步骤1)的待测样品加入200μl蛋白酶K裂解液，于55℃水浴锅消化 4-8h；
3)将步骤2)的样品取出，加入体积比为25：24：1的等体积的酚：氯仿：异戊醇，室温下震荡混匀成乳状液后静置2-5min；
4)将步骤3)的混合液用8000rpm离心8min，转移上层水相到新的离心管中；
5)向步骤4)的水相中加入等体积的异丙醇沉淀DNA，8000rpm离心5分钟后弃上清；
6)将步骤5)收集到的沉淀，用100μl的70％乙醇洗涤，再用8000rpm 高速离心8min，弃上清，自然晾干DNA样品；
7)用50μlTE溶解DNA样品。
2、环介导的等温扩增
扩增体系为：2.5μl 10×Reaction buffer、1.5μl MgSO4(100mM)、3.5μl 10mMdNTP Mix、2μl引物混合物、13.5μl ddH2O、1μl Bst DNA polymerase和1μl DNA。。
扩增程序为：60℃金属恒温浴反应60min。
3、扩增产物分析：
采用沉淀法或琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
沉淀法：阳性样本可造成反应体系的浑浊，经短暂离心看到明显白色沉淀，阴性样本没有白色沉淀。
琼脂糖凝胶电泳：取扩增产物5μl，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭染料的2％的琼脂糖凝胶中，180～200v电泳1h，在凝胶成相系统上成像观察结果，阳性样本呈梯形条带，阴性样本无条带。
实施例3阳性样本的检测
一、实验方法
使用权利要求2的试剂盒对布氏锥虫DNA进行检测。
二、实验结果
结果如图3所示，阳性样本经LAMP扩增可造成反应体系的浑浊，经短暂离心看到明显白色沉淀，阴性样本没有白色沉淀。
实施例4检测反应温度及时间优化
一、实验方法
使用权利要求2的试剂盒对布氏锥虫DNA进行检测，并探索反应温度及时间对于检测效果的影响。
其中，LAMP反应温度为60～65℃，扩增时间为60min和70min。
二、实验结果
结果如图4所示，最优反应条件是65℃，60分钟。
实施例5试剂盒的敏感性检测
一、实验方法
使用权利要求2的试剂盒对布氏锥虫DNA，DNA浓度分别为100ng/μL、 10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、10fg/μL、1fg/ μL和0fg/μL。
二、实验结果
结果如图5所示，LAMP检测灵敏度1pg/μl。
对照例PCR检测布氏锥虫
一、实验方法
用PCR方法检测实施例5中浓度的布氏锥虫DNA，
扩增引物为：使用LAMP引物对中的F3/B3对引物进行扩增。
扩增体系为：12.5μl的2×PCR Mix buffer,各1μl的primer F3/B3,9.5μl 的ddH2O，1μl的DNA样品。
扩增程序为：94℃10min，35Cycles(94℃30sec，55℃30sec，72℃1min)， 72℃10min。
二、实验结果
结果如图6所示，PCR扩增灵敏度仅为100pg/μl。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggtgaggat tgacagatgg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcaaggaat cccgcaga 18
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attgtccaca caggacagca gtggggcctg taaaaagaag ga 42
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgtccgttg acggaatcaa cctgaatggt ggtgcatggc 40
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctccaccgac caaaagcg 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccctccggcg gggatttttt 20
<210> 7
<211> 659
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacgatgac acccatgaat tggggaacat cattgggtgc ccgtgtggcg gccttttgtg 60
cngaccctcg gccccaattt atttatcaat ttacgtgcct attctatcac ccccggttcc 120
ctcttttgag gttcttccgg ggttttttac gggaatatcc tcagcacgtt tcttacttct 180
tcacgcgaaa gcttggaggt tacagtctca ggggggagta cgttcgcaag agtgaaactt 240
aaagaaattg acggaatggc accacaagac gtggagcgtg cggtttaatt tgactcaaca 300
cggggaactt taccagatcc ggacagggtg aggattgaca gatggagtgt tctttctcga 360
tcccctgaat ggtggtgcat ggccgctttt ggtcggtgga gtgatttgtt tggttgattc 420
cgtcaacgga cgagatccaa gctgcccagt aggtgccggg attgtccaca caggacagca 480
gtccctccgg cggggatttt ttccccaacg gtggtcgtca tccttctttt tacaggcccc 540
ttctctgcgg gattccttgc ttttcgcgca aggtgagatt ttgggcaaca gcaggtctgt 600
gatgctcctc aatgttctgg gcgacacgcg cactacaatg tcagtgagaa caagacaca 659

Claims (8)

1.一个用于非洲布氏锥虫检测的引物组合，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～6所示。
2.权利要求1所述的引物在制备检测非洲布氏锥虫的试剂盒中的应用。
3.一个检测非洲布氏锥虫的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述引物组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括LAMP试剂。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP试剂为10×Reactionbuffer、MgSO4、dNTP Mix、ddH2O、Bst DNA polymerase。
6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应体系为2.5μl 10×Reaction buffer、1.5μl 100mM MgSO4、3.5μl 10mM dNTP Mix、2μl权利要求1所述引物组合的混合物、13.5μl ddH2O、1μl Bst DNA polymerase和1μl DNA。
7.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP反应程序为60℃反应60min。
8.权利要求3到7任一所述试剂盒在检测非洲布氏锥虫中的应用。
CN201910604416.7A 2019-07-05 2019-07-05 一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用 Pending CN110541043A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910604416.7A CN110541043A (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910604416.7A CN110541043A (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110541043A true CN110541043A (zh) 2019-12-06

Family

ID=68710284

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910604416.7A Pending CN110541043A (zh) 2019-07-05 2019-07-05 一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110541043A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113846175A (zh) * 2021-09-03 2021-12-28 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 等温扩增检测布氏锥虫种及布氏锥虫亚种的试剂、试剂盒及其应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113846175A (zh) * 2021-09-03 2021-12-28 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所(国家热带病研究中心) 等温扩增检测布氏锥虫种及布氏锥虫亚种的试剂、试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111073989B (zh) 志贺氏菌核酸快速恒温检测方法及应用
CN110541043A (zh) 一种检测非洲布氏锥虫的试剂盒及其应用
CN106434900B (zh) 同时快速恒温检测创伤弧菌和霍乱弧菌的方法、引物及试剂盒
CN111088377B (zh) 金黄色葡萄球菌的快速恒温检测方法、引物组及应用
CN110578012A (zh) 一种快速检测铜绿假单胞菌的试剂盒
CN111004856B (zh) 创伤弧菌的快速恒温检测方法、引物组及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191206

RJ01 Rejection of invention patent application after publication