CN114480744B - 基于CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒、使用方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，包括，步骤S1，将待检测样本在恒温环境中裂解；步骤S2，对裂解后的样本进行RT‑RPA扩增；步骤S3，扩增后的样本加入装有CRISPR混合液的试管中进行荧光反应，经过预设时间，中控单元读取荧光强度；步骤S4，将荧光反应后的样本注入试纸条，根据纸条条带判定检测结果；中控单元获取的荧光强度小于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度不符合预设标准，中控单元获取的荧光强度大于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度符合预设标准，中控单元启动步骤S4,对荧光反应后的样本进行试纸条检测。

Description

基于CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒、使用方法 及应用

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，尤其涉及一种基于cRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法。

背景技术

快速和准确地在早期筛查和诊断COYID-19是防止其在人群蔓延和治疗感染关键的步骤，常规诊断手段有分子测试、血清学测试和计算机断层扫描 (CT)，其中定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测被认为是确诊COVID-19 的金标准，但该技术假阴性率高(41％)，需要专业的技术人员和昂贵的实验设备可能会导致确诊延迟，增加疑似患者的焦虑。为了改善这一情况，目前急需要开发一款灵敏度高、高效便捷、不需要昂贵的设备的诊断工具用于COVID-19的检测。

近年来，恒温扩增技术与CRISPR基因编辑技术结合为核酸恒温扩增检测技术的发展创建了一个新的平台。目前等温扩增和基因编辑检测病原体的步骤包括核酸提取、恒温扩增、Cas蛋白编辑以及产物检测。

核酸提取是核酸扩增技术中的关键步骤，但因实验室提取核酸的方法通常比较繁琐，需要一种简便、快速、高效、低耗能的核酸提取方法。常用的快速提取核酸的方法有固相提取试剂盒快速提取法，磁珠法，氧化铝膜法和裂解液处理法等。但固相提取法需要依靠仪器操作如离心机，磁珠法处理成本高，氧化铝膜法制造工艺复杂，限制了其在核酸快速检测中得到更实际有效的应用。裂解液恒温快速提取法操作简单、价格便宜、获取方便，是十分理想的核酸提取方法。

核酸扩增是关系到检测准确性的一个必要步骤，能够避免由于样品浓度过低或受到背景值影响较大而被判断为假阴性的情况。近几年，一些等温扩增技术已有商业化的产品，如环介导等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、链置换扩增(SDA)、依赖核酸序列型扩增(NASBA)等。其中RPA反应时间只需 20min且在恒温下即能进行实验，特异性强、灵敏度高，相比之下，RPA非常适用于疾病诊断和现场检测。

中国专利ZL202011179251.2公开了抗新型冠状病毒的抗体和检测新型冠状病毒的试剂盒，该抗体可以特异性结合新型冠状病毒的N蛋白，对其具有较高的亲和力，用该抗体检测新型冠状病毒具有较好的灵敏度和特异性。本发明为新型冠状病毒的检测提供了更为丰富的抗体选择，但该技术方案检测时间过长，效率过低，且准确性无法把握。

发明内容

为此，本发明提供一种基于CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，可以解决无法根据实时荧光强度判定待检测目标产物浓度，进而提高检测效率的技术问题。

为实现上述目的，一方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，包括：

步骤S1，将待检测样本在恒温环境中裂解；

步骤S2，对裂解后的样本进行RT-RPA扩增；

步骤S3，扩增后的样本加入装有CRISPR混合液的试管中进行荧光反应，经过预设时间，中控单元读取荧光强度；

步骤S4，将荧光反应后的样本注入试纸条，根据纸条条带判定检测结果；

在所述步骤S3中，所述中控单元根据荧光强度与预设荧光强度相比较，对当前目标产物浓度进行判定，其中，中控单元获取的荧光强度小于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度不符合预设标准，中控单元获取的荧光强度大于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度符合预设标准，中控单元启动步骤S4，对荧光反应后的样本进行试纸条检测。

进一步地，步骤S5，校验，所述步骤S3中，将扩增后的样本分为两份，分别注入第一反应管和第二反应管内，其中，第一反应管用于预设时间荧光反应后参与试纸条检测，第二反应管用于参与全程荧光反应检测，中控单元根据所述第二反应管内样本的循环阈值判定当前样本阴性或阳性，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果一致，中控单元判定校验成功，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果不一致，中控单元判定校验失败。

进一步地，在所述步骤S3中，所述中控单元预设荧光强度D，所述中控单元根据反应液的荧光强度d与预设荧光强度相比较，判定当前目标产物浓度是否符合预设标准，其中，

当d≤D1，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤S2的扩增时间以及所述步骤S3的荧光反应时间；

当D1＜d＜D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准；

当d≥D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度符合标准，中控单元启动步骤S4；

其中，所述中控单元预设荧光强度D，设定第一预设荧光强度D1，第二预设荧光强度D2。

进一步地，当所述中控单元获取当前荧光强度小于等于第一预设荧光强度，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤 S2的扩增时间TZ至TZ1，设定TZ1＝TZ×(1+(D1-d)/D1)，延长所述步骤S3的荧光反应时间TY至TY1，设定TY1＝TY×(1+(D1-d)/D1)。

进一步地，所述中控单元获取荧光强度变化率s，设定s＝Δd/t0，，Δd为预设间隔时间t0荧光强度变化值，当所述中控单元获取当前荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间时，中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率s与预设荧光强度变化率 S相比较，判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准，其中，

当s≤S1，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间符合标准，中控单元延长步骤S2的扩增时间至TZ2，设定TZ2＝TZ×(1+(S1-s)/S1)；

当S1＜s＜S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY2，设定TY2＝TY×(1+(S2-s)×(s-S2)/ (S1×S2))；

当s≥S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY3，设定TY3＝TZ×(1+1.5×(s-S2)/S2)；

其中，所述中控单元预设荧光强度变化率S，设定第一预设荧光强度变化率 S1，第二预设荧光强度变化率S2。

进一步地，在所述步骤S4中，所述中控单元根据试纸条上检测条带数判定样本阴性或阳性，其中，试纸条上检测条带数为两条时，该样本为阳性，若试纸条上检测条带数为一条时，该样本为阴性。

进一步地，所述中控单元根据第二反应管的荧光定量曲线获取循环阈值ct 与预设循环阈值Y判定当前样本阴性或阳性，其中，

当Ct≤Y1，所述中控单元判定第二反应管样本阴性，当第一反应管样本为阴性时，中控单元判定校验成功，当第一反应管样本为阳性时，中控单元判定校验失败，对样本进行复检；

当Y1＜Ct＜Y2，所述中控单元判定对当前样本进行复检，无论第一反应管样本为阴性或阳性，均对样本进行复检；

当Ct≥Y2，所述中控单元判定当前样本阳性，当第一反应管样本为阴性时，中控单元判定校验失败，当第一反应管样本为阳性时，中控单元判定校验成功；

其中，所述中控单元预设循环阈值Y，设定第一预设循环阈值Y1，第二预设循环阈值Y2。

进一步地，在所述步骤S5中，所述中控单元判定校验失败时，中控单元根据第二反应管荧光定量曲线获取第二反应管荧光强度变化均匀度h与预设均匀度相比较，对所述步骤S2和所述步骤S3的荧光反应时间进行调节，其中，

当h≤H1，所述中控单元判定不对所述步骤S2和所述步骤S3的反应时间进行调节；

当H1＜h＜H2，所述中控单元判定将步骤S2的扩增时间延长TZi至TZi1，设定TZi1＝TZi×(1+(H2-h)×(h-H1)/(H1×H2))；

当h≥H2，所述中控单元判定将步骤S2的扩增时间延长TZi至TZi2，设定 TZi2＝TZi×(1+(h-H2)/(H2×0.8))，将步骤S3的荧光反应时间延长TYj至TYj1，设定TYj1＝TYj×(1+(h-H2)/(H2×0.9))；

其中，所述中控单元预设均匀度H，设定第一预设均匀度H1，第二预设均匀度H2，i＝1，2，j＝1，2，3。

另一方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒，包括恒温核酸提取裂解液、RT-RPA试剂、靶基因N阳性模板、Cas12蛋白、 Cas12 Buffer、crRNA、DNA报告基因、试纸条buffer及胶体金试纸条，其中， LbaCas12a为1uM，10X Cas12Buffer为2ul，crRNA为500nM，DNA报告基因为5uM。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明设计的试剂盒针对新冠病毒的迅速传播所需的快速筛查方法，具有极强的临床应用价值。结合本发明开发的技术系统，可实现新冠病毒的有效检测，提高灵敏度、准确性，协助医务人员快速筛查，节省人力和防疫资源，整个体系在常温条件下进行，实现了全程恒温操作，突破传统检测方法对温度的要求，为病原微生物检测领域提供了全新的检测方法，对病原体微生物诊断行业具有重大的意义；本发明创新性开创4T系统 (4 thermostatic system)，即恒温提取核酸，恒温扩增序列，恒温剪切靶标，恒温检测片段通过提供便捷、快速、廉价、高敏感和特异的方法，而无需复杂设备及操作的要求，从而使疾病的诊断更容易获得。能够解决目前技术中如下的缺陷，其一，检测指标qPCR等假阴性率高(41％)，需要专业的技术人员和昂贵的实验设备，可能会导致确诊延迟；其二，常规核酸提取需借助仪器操作，成本高，工艺复杂，限制了其在核酸快速检测中得到更实际有效的应用；其三，常规扩增技术耗时长，操作过程容易出现污染导致假阴性，对仪器温度要求高；其四，目前整个病毒检测流程耗时长，成本高，操作复杂，在疫情反复情况下造成医务人员大规模检测压力，增加社会人力资源负担。本发明利用CRISPR-Cas系统，配制在恒温37℃下能裂解核酸的裂解液，该裂解液经实验可使病毒失活并提取核酸，根据新冠病毒N基因的特异性设计筛选适合进行RPA扩增的引物，在 CRISPR-Cas12体系下借助荧光PCR仪和商业化胶体金试纸条使检测信号直观输出。本发明检测方法灵敏度高，最低病毒检测下限可达到10copies/ul，并能准确特异识别新冠病毒，操作简单，整个流程在恒温37℃下40min内即可完成，在初期筛查检测新冠病毒阶段具有重大意义。

尤其，本发明设计的一种用于恒温检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas12系统的试剂盒，所述试剂盒由恒温核酸提取裂解液、RT-RPA试剂、靶基因N阳性模板、Cas12蛋白、Cas12Buffer、crRNA、DNA报告基因、试纸条buffer及胶体金试纸条组成。配比浓度为1uMLbaCas12a，2uI 10X Cas12 Buffer、500nM crRNA， 5uM DNA报告基因。RPA引物是针对新型冠状病毒N基因序列设计的扩增序列； crRNA是针对新型冠状病毒N基因设计的向导序列；DNA报告基因在5’端修饰 FAM荧光基团，3’端修饰BHQ猝灭基团。CRISPR-Cas12反应原理：Cas12蛋白与crRNA结合，通过crRNA识别靶基因后被激活切割靶基因，并对DNA报告基因反式切割，释放荧光信号进行荧光检测，将这些基团通过商业化胶体金试纸条富集并输出直观的条带。

尤其，本发明将荧光强度划分为两个标准，中控单元通过在步骤S3中获取的荧光强度与预设荧光强度相比较，对当前荧光反应液中的目标产物浓度是否符合预设标准进行判定，其中，若当前荧光反应液中荧光强度小于等于第一预设荧光强度，说明当前目标产物浓度过低，造成目标产物浓度过低的原因在于步骤 S2的扩增时间不符合标准，和当前步骤S3的荧光反应时间的时间不足，中控单元通过实时荧光强度与第一预设荧光强度的差值延长步骤S2的扩增时间，以使下一样本的扩增时间符合标准，同时延长步骤S3的荧光反应时间，以使当前目标产物浓度符合标准，若当前荧光反应液中荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间，说明当前目标产物浓度较低，为明确当前荧光反应程度是否完全，即，是否准确获取该荧光反应中全部目标产物浓度的荧光强度，中控单元通过荧光强度变化率进一步地判定步骤S3中荧光反应时间是否符合标准，若当前荧光反应液中荧光强度大于等于第二预设荧光强度，说明当前目标产物浓度符合预设标准，即当前目标产物浓度以足够步骤S4的检测，中控单元启动步骤S4。

尤其，本发明中控单元在获取当前荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间时，中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元根据预设间隔时间荧光强度变化值获取荧光强度变化率，并将获取的荧光强度变化率与预设荧光强度变化率相比较，用以判定步骤S3荧光反应时间是否符合标准，其中，若中控单元获取荧光强度变化率小于等于第一预设荧光强度变化率，当前步骤S3中目标产物大多以完成荧光反应，说明造成当前目标产物浓度不足的原因并未是步骤S3荧光反应时间不符合标准，而是由于步骤S2扩增反应时间过短，因此中控单元判定将扩增时间延长，以提高样本扩增量，若荧光强度变化率在第一预设荧光强度变化率和第二预设荧光强度变化率，说明当前荧光反应未完全，中控单元判定延长所述步骤S3的荧光反应时间，以提高反应管内的目标产物浓度，若中控单元获取荧光强度变化率大于等于第二预设荧光强度变化率，说明当前荧光反应未完全而且还有极大的目标产物仍未参与反应，中控单元大幅度的延长步骤S3的荧光反应时间。

尤其，本发明使用胶体金试纸条使检测信号直观输出，DNA报告使用FAM荧光基团和生物素分别标记其两端，质控带固定了链霉亲和素，检测带则使用了 Protein A以捕获FAM抗体。当检测结果为阴性时，报告ssRNA未被Cas蛋白切割而保持完整，ssRNA上的生物素与质控带上的链霉亲和素结合使其在质控带上积累显色，检测带不能显色；而当检测结果为阳性时，ssRNA被Cas蛋白切割为带FAM标记和带生物素标记的两部分，因而在试纸层析时质控带和检测带均能积累显色。

尤其，本发明将样本设置有两个反应管用于校验检测方法的准确性，其中，第一反应管用于经过预设时间的荧光反应后用于试纸条进行直观检测，第二反应管用于荧光反应全程检测，获取荧光定量曲线，中控单元设置有循环阈值，中控单元根据第二反应管获取的当前样本循环阈值与预设循环阈值相比较，判定第二反应管样本是否为阳性，其中，若第二反应管的循环阈值在第一预设循环阈值和第二预设循环阈值之间，说明第二反应管内的样本数据不可靠，此时，无论试纸条的结果是什么，均需要对样本进行复检，以确保其准确结果，若第二反应管为循环阈值大于预设值，说明第二反应管样本为阴性，若试纸条显示的结果也为阴性，校验为合格，说明当前检测方法正确，若试纸条显示结果为阳性，校验结果失败，说明当前检测方法出现错误，若第二反应管的循环阈值小于预设值，说明第二反应管样本为阳性，若试纸条显示结果为阳性，校验结果成功，若试纸条显示结果为阴性，说明校验结果失败。

尤其，本发明设置荧光反应仪生成的第二反应管荧光定量曲线，并根据荧光定量曲线预设间隔时间荧光强度变化率获取荧光强度变化均匀度与预设均匀度相比较，根据校验失败的原因调节扩增时间及荧光反应时间，其中，若第二反应管荧光强度均匀度小于等于第一预设均匀度，说明第二反应管荧光定量曲线与预设荧光定量曲线相差不大，中控单元判定不对步骤S2和S3的反应时间进行调节，若第二反应管荧光强度均匀度在第一预设均匀度和第二预设均匀度之间，说明第二反应管荧光定量曲线与预设荧光定量曲线有一定差距，中控单元判定将所述步骤S2的扩增时间延长，以提高目标产物浓度，若第二反应管荧光强度均匀度大于等于第二预设均匀度，说明第二反应管荧光定量曲线与预设荧光定量曲线有较大的差距，中控单元判定延长步骤S2的扩增时间及步骤S3的荧光反应时间，综合提高CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法的准确性。

附图说明

图1为发明实施例碱提取RNA后RT-RAA扩增时间的实验结果图；

图2为发明实施例扩增产物的Cas12反应靶标SARS-CoV-2N基因特异性检测结果图，其中，图2中1为SARS-CoV-2N基因、2为流感病毒、3为无靶标阴性对照；

图3为发明实施例扩增产物的Cas12反应靶标SARS-CoV-2N基因胶体金试纸条检测结果图，其中，图3中1为SARS-CoV-2N基因、2为流感病毒、3为无靶标阴性对照。

具体实施方式

为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

下面参照附图来描述本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当理解的是，这些实施方式仅仅用于解释本发明的技术原理，并非在限制本发明的保护范围。

需要说明的是，在本发明的描述中，术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”等指示的方向或位置关系的术语是基于附图所示的方向或位置关系，这仅仅是为了便于描述，而不是指示或暗示所述装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，还需要说明的是，在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域技术人员而言，可根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

请参阅图1所示，其为本发明实施例基于cRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法，包括，

步骤S1，将待检测样本在恒温环境中裂解；

步骤S2，对裂解后的样本进行RT-RPA扩增；

步骤S3，扩增后的样本加入装有CRISPR混合液的试管中进行荧光反应，经过预设时间，中控单元读取荧光强度；

步骤S4，将荧光反应后的样本注入试纸条，根据纸条条带判定检测结果；

在所述步骤S3中，所述中控单元根据荧光强度与预设荧光强度相比较，对当前目标产物浓度进行判定，其中，中控单元获取的荧光强度小于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度不符合预设标准，中控单元获取的荧光强度大于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度符合预设标准，中控单元启动步骤S4，对荧光反应后的样本进行试纸条检测。

步骤S5，校验，所述步骤S3中，将扩增后的样本分为两份，分别注入第一反应管和第二反应管内，其中，第一反应管用于预设时间荧光反应后参与试纸条检测，第二反应管用于参与全程荧光反应检测，中控单元根据所述第二反应管内样本的循环阈值判定当前样本阴性或阳性，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3 的结果一致，中控单元判定校验成功，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果不一致，中控单元判定校验失败。

具体而言，本发明实施例提供一种优选的CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒操作步骤，包括，

步骤S01，恒温样本核酸提取：使用恒温裂解液提取如鼻咽拭子等RNA样本；

步骤S02，RT-RPA扩增：根据新冠病毒N基因序列设计上游引物F及下游引物R，针对(1)中提取的RNA进行逆转录成cDNA并进行RPA扩增，得到扩增产物；

步骤S03，CRISPR-Cas12反应：将(2)中扩增产物加入装有CRISPR混合液的试管中进行反应，混合液包括Cas12蛋白、Cas12 Buffer、crRNA、DNA报告基因，读取荧光信号；

步骤S04，往(3)反应管中加入试纸条及试纸条buffer，根据试纸条条带判定结果。

以上整个反应在37℃恒温进行，时间在40min-60min，经实验测试进一步优化后为40min。

本发明实施例系统性开发一套全程恒温检测的4T系统，所述恒温核酸提取、恒温序列扩增、恒温靶标剪切、恒温产物检测，可应用于新型冠状病毒的现场检测。其中CRISRP-Cas系统除了本发明中使用的LbaCas12a，还包括Cas12家族其他蛋白，所述MbCas12a，Mb3Cas12a，FnCas12a，AsCas12a，Lb5Cas12a，HKCas12a， OsCas12a，TsCas12a和BoCas12a中的任意一种。CRISRP-Cas除了本发明中使用的Cas12a，还包括Cas13家族蛋白，所述LwCas13a，LbuCas13a，LbaCas13a、 LshCas13a中的任意一种。

具体而言，请参阅图2所示，其为本发明实施例扩增产物的Cas12反应靶标 SARS-CoV-2N基因特异性检测结果图，本发明实施例提供一种恒温裂解液提取核酸RNA及RT-RAA扩增的方法，所述上游引物F和下游引物R针对新冠病毒N 基因进行设计的序列，序列如SEQID No.1和SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.1：F 5’-CTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGC-3’

SEQ ID No.2：R 5’-CTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAG-3’

本实施例检测方法：以含目的基因的假病毒为实验组，以PCR结果为阳性对照，使用核酸裂解液在37℃左右与样品充分混匀，静置几分钟裂解病毒，提取核酸，根据等温重组酶聚合酶扩增原理(RPA)，对新冠病毒的N基因进行恒温扩增，RT-RAA反应体系如下表1所示；在常温37℃下进行逆转录RPA反应体系对目的基因片段进行逆转录，分别扩增60min、30min、15min、5min并对扩增产物进行凝胶电泳，鉴定目的基因条带。

RT-RPA的反应体系包括逆转录酶、dNTP、重组酶uvsX，辅助因子uvsY，结合蛋白T4gp32，Bsu DNA聚合酶，RPA引物，反应缓冲液组成。

表1 RT-RPA反应体系

首先准备1.5ml EP管，将提取的核酸、正反向引物按配制比例充分混匀后，将混匀的反应体系加入含有4种酶蛋白的反应管中，吹打混匀后开始扩增反应，在37℃孵育不同时间，为了保证能成功扩增目的条带及节省时间，使用凝胶电泳检测确定15min为最佳扩增时间。

具体而言，本实施例提供一种基于CRlSPR-Cas12恒温检测新型冠状病毒试剂盒，其中CRISPR-Cas12反应体系包括LbaCas12a蛋白，Cas12Buffer，crRNA， DNA报告基因，配比浓度1uM LbaCas12a，2ul 10X Cas12 Buffer、500nM crRNA， 5uM DNA报告基因，检测方法如下：

样本准备：以含目的基因的假病毒为新型冠状病毒N基因阳性对照，以流感病毒作为特异性参考对照组，以无靶标的生理盐水作为阴性对照。

Cas12蛋白与crRNA结合，通过crRNA识别靶基因后被激活切割靶基因，并对DNA报告基因反式切割，释放荧光信号进行荧光检测，按分组将扩增产物与 Cas12蛋白，crRNA，DNA荧光报告基因均匀混合后放入荧光PCR仪中检测20min，其中crRNA序列如SEQ ID No.3所示，NA荧光报告基因如SEQ ID No.4所示，观察不同分组的荧光曲线检测体系的特异性。

SEQ ID No.3--

5’GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATTTCAACTCCAGGCAGCAGTA-3’

SEQ ID No.4--5’-ATTAATTT-3’

具体而言，请参阅图3所示，其为本发明实施例扩增产物的Cas12反应靶标 SARS-CoV-2N基因胶体金试纸条检测结果图，本发明实施例胶体金试纸条检测方法，取阴性对照、特异性对照、阳性对照各5ul，按照反应体系反应后将Cas12 蛋白和crRNA对2019-nCoV新冠病毒靶基因特异识别切割后的产物放置在胶体金免疫试纸条的检测端侧流试纸条上进行特异性检测。孵育2分钟后，观察试纸条带显示，如果试纸条出现条带即为阳性，反之为阴性，结果表明，阳性对照测试结果出现两条红线为阳性，其他病毒及阴性对照结果为阴性。由于DNA报告使用 FAM荧光基团和生物素分别标记其两端，质控带固定了链霉亲和素，检测带则使用了Protein A以捕获FAM抗体。当检测结果为阴性时，报告ssRNA未被Cas 蛋白切割而保持完整，ssRNA上的生物素与质控带上的链霉亲和素结合使其在质控带上积累显色，检测带不能显色；而当检测结果为阳性时，ssRNA被Cas蛋白切割为带FAM标记和带生物素标记的两部分，因而在试纸层析时质控带和检测带均能积累显色。

具体而言，本发明实施例提供灵敏度检测方法，分别由浓度为1X10⁸ copies/ml、1X10⁷ copies/ml、1X10⁶ copies/ml、1X10⁵ copies/ml、1X10⁴ copies/ml、1X10³ copies/ml、1X10² copies/ml、1X10¹ copies/ml的新型冠状假病毒阳性标准品，进行荧光PCR定量反应，以荧光值为纵坐标，反应时间为横坐标，确定检测下限，结果表明本发明实施例提供的试剂盒能检测到10¹ copies/ml的病毒数。

在所述步骤S3中，所述中控单元预设荧光强度D，所述中控单元根据反应液的荧光强度d与预设荧光强度相比较，判定当前目标产物浓度是否符合预设标准，其中，

当d≤D1，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤S2的扩增时间以及所述步骤S3的荧光反应时间；

当D1＜d＜D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准；

当d≥D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度符合标准，中控单元启动步骤S4；

其中，所述中控单元预设荧光强度D，设定第一预设荧光强度D1，第二预设荧光强度D2。

具体而言，本发明将荧光强度划分为两个标准，中控单元通过在步骤S3中获取的荧光强度与预设荧光强度相比较，对当前荧光反应液中的目标产物浓度是否符合预设标准进行判定，其中，若当前荧光反应液中荧光强度小于等于第一预设荧光强度，说明当前目标产物浓度过低，造成目标产物浓度过低的原因在于步骤S2的扩增时间不符合标准，和当前步骤S3的荧光反应时间的时间不足，中控单元通过实时荧光强度与第一预设荧光强度的差值延长步骤S2的扩增时间，以使下一样本的扩增时间符合标准，同时延长步骤S3的荧光反应时间，以使当前目标产物浓度符合标准，若当前荧光反应液中荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间，说明当前目标产物浓度较低，为明确当前荧光反应程度是否完全，即，是否准确获取该荧光反应中全部目标产物浓度的荧光强度，中控单元通过荧光强度变化率进一步地判定步骤S3中荧光反应时间是否符合标准，若当前荧光反应液中荧光强度大于等于第二预设荧光强度，说明当前目标产物浓度符合预设标准，即当前目标产物浓度以足够步骤S4的检测，中控单元启动步骤 S4。

具体而言，当所述中控单元获取当前荧光强度小于等于第一预设荧光强度，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤 S2的扩增时间TZ至TZ1，设定TZ1＝TZ×(1+(D1-d)/D1)，延长所述步骤S3的荧光反应时间TY至TY1，设定TY1＝TYx(1+(D1-d)/D1)。

其中，所述中控单元获取荧光强度变化率s，设定s＝Δd/t0，其中，Δd为预设间隔时间t0荧光强度变化值。

当所述中控单元获取当前荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间时，中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率s与预设荧光强度变化率S相比较，判定所述步骤S3 的荧光反应时间是否符合标准，其中，

当s≤S1，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间符合标准，中控单元延长步骤S2的扩增时间至TZ2，设定TZ2＝TZ×(1+(S1-s)/S1)；

当S1＜s＜S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY2，设定TY2＝TY×(1+(S2-s)×(s-S2)/ (S1×S2))；

当s≥S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY3，设定TY3＝TZ×(1+1.5×(s-S2)/S2)；

其中，所述中控单元预设荧光强度变化率S，设定第一预设荧光强度变化率S1，第二预设荧光强度变化率S2。

具体而言，本发明中控单元在获取当前荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间时，中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元根据预设间隔时间荧光强度变化值获取荧光强度变化率，并将获取的荧光强度变化率与预设荧光强度变化率相比较，用以判定步骤S3荧光反应时间是否符合标准，其中，若中控单元获取荧光强度变化率小于等于第一预设荧光强度变化率，当前步骤S3中目标产物大多以完成荧光反应，说明造成当前目标产物浓度不足的原因并未是步骤S3荧光反应时间不符合标准，而是由于步骤S2扩增反应时间过短，因此中控单元判定将扩增时间延长，以提高样本扩增量，若荧光强度变化率在第一预设荧光强度变化率和第二预设荧光强度变化率，说明当前荧光反应未完全，中控单元判定延长所述步骤S3的荧光反应时间，以提高反应管内的目标产物浓度，若中控单元获取荧光强度变化率大于等于第二预设荧光强度变化率，说明当前荧光反应未完全而且还有极大的目标产物仍未参与反应，中控单元大幅度的延长步骤S3的荧光反应时间。

其中，在所述步骤S4中，所述中控单元根据试纸条上检测条带数判定样本阴性或阳性，其中，试纸条上检测条带数为两条时，该样本为阳性，若试纸条上检测条带数为一条时，该样本为阴性。

具体而言，本发明使用胶体金试纸条使检测信号直观输出，DNA报告使用FAM 荧光基团和生物素分别标记其两端，质控带固定了链霉亲和素，检测带则使用了 Protein A以捕获FAM抗体。当检测结果为阴性时，报告ssRNA未被Cas蛋白切割而保持完整，ssRNA上的生物素与质控带上的链霉亲和素结合使其在质控带上积累显色，检测带不能显色；而当检测结果为阳性时，ssRNA被Cas蛋白切割为带FAM标记和带生物素标记的两部分，因而在试纸层析时质控带和检测带均能积累显色。

所述中控单元根据第二反应管的荧光定量曲线获取循环阈值Ct与预设循环阈值Y判定当前样本阴性或阳性，其中，

当Ct≤Y1，所述中控单元判定第二反应管样本阴性，当第一反应管样本为阴性时，中控单元判定校验成功，当第一反应管样本为阳性时，中控单元判定校验失败，对样本进行复检；

当Y1＜Ct＜Y2，所述中控单元判定对当前样本进行复检，无论第一反应管样本为阴性或阳性，均对样本进行复检；

当Ct≥Y2，所述中控单元判定当前样本阳性，当第一反应管样本为阴性时，中控单元判定校验失败，当第一反应管样本为阳性时，中控单元判定校验成功；

其中，所述中控单元预设循环阈值Y，设定第一预设循环阈值Y1，第二预设循环阈值Y2。

具体而言，本发明将样本设置有两个反应管用于校验检测方法的准确性，其中，第一反应管用于经过预设时间的荧光反应后用于试纸条进行直观检测，第二反应管用于荧光反应全程检测，获取荧光定量曲线，中控单元设置有循环阈值，中控单元根据第二反应管获取的当前样本循环阈值与预设循环阈值相比较，判定第二反应管样本是否为阳性，其中，若第二反应管的循环阈值在第一预设循环阈值和第二预设循环阈值之间，说明第二反应管内的样本数据不可靠，此时，无论试纸条的结果是什么，均需要对样本进行复检，以确保其准确结果，若第二反应管为循环阈值大于预设值，说明第二反应管样本为阴性，若试纸条显示的结果也为阴性，校验为合格，说明当前检测方法正确，若试纸条显示结果为阳性，校验结果失败，说明当前检测方法出现错误，若第二反应管的循环阈值小于预设值，说明第二反应管样本为阳性，若试纸条显示结果为阳性，校验结果成功，若试纸条显示结果为阴性，说明校验结果失败。

具体而言，所述中控单元获取荧光强度变化均匀度h，设定h＝ ((h1-h0)²+(h2-h0)²+···+(hn-h0)²)/n，其中，h1为第一间隔时间荧光强度变化率、h2为第二间隔时间荧光强度变化率···hn为第n间隔时间荧光强度， h0为各间隔时间荧光强度平均值。

在所述步骤S5中，所述中控单元判定校验失败时，中控单元根据第二反应管荧光定量曲线获取第二反应管荧光强度变化均匀度h与预设均匀度相比较，对所述步骤S2和所述步骤S3的荧光反应时间进行调节，其中，

当h≤H1，所述中控单元判定不对所述步骤S2和所述步骤S3的反应时间进行调节；

当H1＜h＜H2，所述中控单元判定将步骤S2的扩增时间延长TZi至TZi1，设定TZi1＝TZi×(1+(H2-h)×(h-H1)/(H1×H2))；

当h≥H2，所述中控单元判定将步骤S2的扩增时间延长TZi至TZi2，设定 TZi2＝TZi×(1+(h-H2)/(H2×0.8))，将步骤S3的荧光反应时间延长TYj至TYj1，设定TYj1＝TYj×(1+(h-H2)/(H2×0.9))；

其中，所述中控单元预设均匀度H，设定第一预设均匀度H1，第二预设均匀度H2，i＝1，2，j＝1，2，3。

具体而言，本发明设置荧光反应仪生成的第二反应管荧光定量曲线，并根据荧光定量曲线预设间隔时间荧光强度变化率获取荧光强度变化均匀度与预设均匀度相比较，根据校验失败的原因调节扩增时间及荧光反应时间，其中，若第二反应管荧光强度均匀度小于等于第一预设均匀度，说明第二反应管荧光定量曲线与预设荧光定量曲线相差不大，中控单元判定不对步骤S2和S3的反应时间进行调节，若第二反应管荧光强度均匀度在第一预设均匀度和第二预设均匀度之间，说明第二反应管荧光定量曲线与预设荧光定量曲线有一定差距，中控单元判定将所述步骤S2的扩增时间延长，以提高目标产物浓度，若第二反应管荧光强度均匀度大于等于第二预设均匀度，说明第二反应管荧光定量曲线与预设荧光定量曲线有较大的差距，中控单元判定延长步骤S2的扩增时间及步骤S3的荧光反应时间，综合提高CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒使用方法的准确性。

具体而言，基于CRISPR-Cas系统的新冠病毒恒温检测试剂盒，包括，恒温核酸提取裂解液、RT-RPA试剂、靶基因N阳性模板、Cas12蛋白、Cas12 Buffer、 crRNA、DNA报告基因、试纸条buffer及胶体金试纸条，其中，LbaCas12a为1uM， 10X Cas12 Buffer为2ul.crRNA为500nM.DNA报告基因为5uM。

至此，已经结合附图所示的优选实施方式描述了本发明的技术方案，但是，本领域技术人员容易理解的是，本发明的保护范围显然不局限于这些具体实施方式。在不偏离本发明的原理的前提下，本领域技术人员可以对相关技术特征做出等同的更改或替换，这些更改或替换之后的技术方案都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种基于CRISPR-Cas系统的新型冠状病毒恒温检测试剂盒非疾病诊断目的使用方法，其特征在于，包括：

步骤S1，将待检测样本在恒温环境中裂解；

步骤S2，对裂解后的样本进行RT-RPA扩增，其中，所述上游引物F和下游引物R针对新型冠状病毒N基因进行设计的序列，序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，

SEQ ID No.1：F 5’-CTTCCTCAAGGAACAACATTGCCAAAAGGC-3’

SEQ ID No.2：R 5’-CTCAAGCTGGTTCAATCTGTCAAGCAGCAG-3’；

步骤S3，扩增后的样本加入装有CRISPR混合液的试管中进行荧光反应，经过预设时间，中控单元读取荧光强度，所述CRISPR混合液包括crRNA和荧光报告探针，其中，crRNA序列如SEQ ID No.3所示，荧光报告探针如SEQ ID No.4所示，

SEQ ID No.3：

5’GAAATTAATACGACTCACTATAGGGTAATTTCTACTAAGTGTAGATTTCAACTCCAGGCAGCAGTA-3’：

SEQ ID No.4：5’-ATTAATTT-3’；

步骤S4，将荧光反应后的样本注入试纸条，根据纸条条带判定检测结果；

在所述步骤S3中，所述中控单元根据荧光强度与预设荧光强度相比较，对当前目标产物浓度进行判定，其中，中控单元获取的荧光强度小于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度不符合预设标准，中控单元获取的荧光强度大于预设荧光强度，中控单元判定当前目标产物浓度符合预设标准，中控单元启动步骤S4,对荧光反应后的样本进行试纸条检测；

其中，CRISPR-Cas系统的新型冠状病毒恒温检测试剂盒包括恒温核酸提取裂解液、RT-RPA试剂、靶基因N阳性模板、Cas12蛋白、Cas12 Buffer、crRNA、DNA报告基因、试纸条buffer及胶体金试纸条，其中，LbaCas12a为1uM，10X Cas12 Buffer为2ul，crRNA为500nM，DNA报告基因为5uM；

在所述步骤S3中，所述中控单元预设荧光强度D，所述中控单元根据反应液的荧光强度d与预设荧光强度相比较，判定当前目标产物浓度是否符合预设标准，其中，

当d≤D1，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤S2的扩增时间以及所述步骤S3的荧光反应时间；

当D1＜d＜D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准；

当d≥D2，所述中控单元判定当前目标产物浓度符合标准，中控单元启动步骤S4；

其中，所述中控单元预设荧光强度D，设定第一预设荧光强度D1,第二预设荧光强度D2；

所述中控单元获取荧光强度变化率s，设定s＝△d/t0，△d为荧光强度变化值，t0为预设间隔时间，当所述中控单元获取当前荧光强度在第一预设荧光强度和第二预设荧光强度之间时，中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元通过获取当前目标产物荧光强度变化率s与预设荧光强度变化率S相比较，判定所述步骤S3的荧光反应时间是否符合标准，其中，

当s≤S1，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间符合标准，中控单元延长步骤S2的扩增时间至TZ2,设定TZ2＝TZ×(1+(S1-s)/S1)；

当S1＜s＜S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY2，设定TY2＝TY×(1+(S2-s)×(s-S2)/(S1×S2))；

当s≥S2，所述中控单元判定所述步骤S3的荧光反应时间不符合标准，中控单元延长荧光反应时间TY至TY3，设定TY3＝TZ×(1+1.5×(s-S2)/S2)；

其中，所述中控单元预设荧光强度变化率S，设定第一预设荧光强度变化率S1，第二预设荧光强度变化率S2。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas系统的新型冠状病毒恒温检测试剂盒非疾病诊断目的使用方法，其特征在于，包括，步骤S5，校验，所述步骤S3中，将扩增后的样本分为两份，分别注入第一反应管和第二反应管内，其中，第一反应管用于预设时间荧光反应后参与试纸条检测，第二反应管用于参与全程荧光反应检测，中控单元根据所述第二反应管内样本的循环阈值判定当前样本阴性或阳性，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果一致，中控单元判定校验成功，若所述步骤S5的结果与所述步骤S3的结果不一致，中控单元判定校验失败。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas系统的新型冠状病毒恒温检测试剂盒非疾病诊断目的使用方法，其特征在于，当所述中控单元获取当前荧光强度小于等于第一预设荧光强度，所述中控单元判定当前目标产物浓度不符合标准，中控单元判定延长所述步骤S2的扩增时间TZ至TZ1,设定TZ1＝TZ×(1+(D1-d)/D1)，延长所述步骤S3的荧光反应时间TY至TY1,设定TY1＝TY×(1+(D1-d)/D1)。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas系统的新型冠状病毒恒温检测试剂盒非疾病诊断目的使用方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述中控单元根据试纸条上检测条带数判定样本阴性或阳性，其中，试纸条上检测条带数为两条时，该样本为阳性，若试纸条上检测条带数为一条时，该样本为阴性。

5.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas系统的新型冠状病毒恒温检测试剂盒非疾病诊断目的使用方法，其特征在于，所述中控单元根据第二反应管的荧光定量曲线获取循环阈值Ct与预设循环阈值Y判定当前样本阴性或阳性，其中，

当Ct≥Y2，所述中控单元判定第二反应管样本阴性，当第一反应管样本为阴性时，中控单元判定校验成功，当第一反应管样本为阳性时，中控单元判定校验失败，对样本进行复检；

当Y1＜Ct＜Y2,所述中控单元判定对当前样本进行复检，无论第一反应管样本为阴性或阳性，均对样本进行复检；

当Ct≤Y1，所述中控单元判定当前样本阳性，当第一反应管样本为阴性时，中控单元判定校验失败，当第一反应管样本为阳性时，中控单元判定校验成功；

其中，所述中控单元预设循环阈值Y，设定第一预设循环阈值Y1，第二预设循环阈值Y2。

6.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas系统的新型冠状病毒恒温检测试剂盒非疾病诊断目的使用方法，其特征在于，在所述步骤S5中，所述中控单元判定校验失败时，中控单元根据第二反应管荧光定量曲线获取第二反应管荧光强度变化均匀度h与预设均匀度相比较，对所述步骤S2和所述步骤S3的荧光反应时间进行调节，其中，所述中控单元获取荧光强度变化均匀度h，设定h＝((h1-h0)²+(h2-h0)²+···+(hn-h0)²)/n,其中，h1为第一间隔时间荧光强度变化率、h2为第二间隔时间荧光强度变化率···hn为第n间隔时间荧光强度，h0为各间隔时间荧光强度平均值，

当h≤H1，所述中控单元判定不对所述步骤S2和所述步骤S3的反应时间进行调节；

当H1＜h＜H2，所述中控单元判定将步骤S2的扩增时间延长TZi至TZi 1,设定TZi 1＝TZi×(1+(H2-h)×(h-H1)/(H1×H2))；

当h≥H2，所述中控单元判定将步骤S2的扩增时间延长TZi至TZi2,设定TZi2＝TZi×(1+(h-H2)/(H2×0.8))，将步骤S3的荧光反应时间延长TYj至TYj1,设定TYj1＝TYj×(1+(h-H2)/(H2×0.9))；

其中，所述中控单元预设均匀度H，设定第一预设均匀度H1，第二预设均匀度H2，i＝1,2,j＝1,2,3。

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