CN115927747B - 新型冠状病毒检测试剂、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型冠状病毒检测试剂、检测试剂盒和检测方法。本发明通过对检测试剂中的恒温扩增引物、crRNA和探针的整体设计，有效提升检测的灵敏度。并且，用本发明的检测试剂检测新型冠状病毒，还具有特异性好、灵敏度高和稳定好的特点。本发明将恒温扩增技术与CRISPR基因编辑技术相结合，无需提取RNA，能够在常温恒温条件下实现多重扩增的核酸检测，且检测结果能够可视化检测，无需专门的核酸扩增仪和专业的操作人员，结果判读相对简单与直观，检测效率高，特别适合现场检测。本发明的检测试剂，能够将恒温扩增与CRISPR检测放入同一反应管中进行，实现病毒核酸的一体化检测，减少扩增后开盖所带来的气溶胶污染。
Description
技术领域
本发明涉及本发明属于分子生物学与体外分子诊断技术领域，特别涉及一种新型冠状病毒检测试剂、检测试剂盒和检测方法。
背景技术
分子诊断主要是应用分子生物学方法检测生物体内遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的诊断技术，可以从基因层次进行检测，因此在检测的灵敏度和准确性上的优势较为明显，能够在感染初期识别病毒或者提早确认基因缺陷，从而提供个性化的医疗诊断服务(如肿瘤缺陷基因检测)。目前，全球主要的分子诊断技术可以分为核酸检测和生物芯片两大类。核酸检测包括聚合酶链式反应(PCR)、荧光原位杂交技术(FISH)和基因测序技术；生物芯片技术，又分为基因芯片和蛋白芯片技术，其中，和基因相关的检测是分子诊断的最重要组成部分，往往是医院对传染病诊断的“金标准”。
PCR是使用最为广泛的核酸扩增技术，因其灵敏性高和特异性强得到广泛应用，然而PCR需要反复的热变性，无法摆脱依赖仪器设备的局限，从而限制了其在临床现场检测中的应用。近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中。与其他的核酸扩增技术相比，等温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备，所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。20世纪90年代初以来，已开发出：依赖核酸序列扩增技术(Nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)，主要依赖AMV逆转录酶、RNase H和T7 RNA聚合酶和一对引物来完成等温扩增；借鉴微生物环状DNA复制过程的滚环扩增技术(Rollingcircle amplification，RCA)；环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)；模拟动物体内DNA复制机制的依赖解旋酶扩增技术(Helicase-dependent amplification，HDA)；参照了T4噬菌体DNA复制系统的重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)；重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)；实时荧光核酸恒温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)；交叉引物扩增技术(CrossingPriming Amplification，CPA)；链置换扩增技术(Strand displacement amplification，SDA)等。其中应用最广泛的是LAMP和RPA，但是LAMP仍然需要在60℃-65℃温度条件下进行反应，需要特殊的温控设备，在非最适温度条件下，其扩增效率会大大降低甚至无法扩增。RPA方法成分复杂、稳定性欠佳、操作难度较大。
成簇规律性间隔短回文重复序列(CRISPR)和相关核酸内切酶(Cas)是古细菌和细菌中的适应性免疫系统，可在序列特异性RNA分子(gRNA)的指导下降解外源核酸。一些Cas酶(包括Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b和Cas14)在与其特定靶点结合后表现出侧向切割活性，这已被充分评估并用于检测核酸的诊断方法。目标识别后，激活的Cas核酸酶额外地切割单链DNA(ssDNA)。近年来，基于成簇规律性间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas)靶向识别和核酸酶切割活性的体外核酸检测技术已被广泛报道。比如：结合环介导方法的CRISPR/Cas12等温放大或使用CRISPR/Cas13的RPA来检测SARS-CoV-2病毒；通过结合RPA预扩增，Cas13和Cas12a核酸酶分别被用于开发SHERLOCK(Specifific High-sensitivityEnzymatic Reporter UnLOCKing)系统和AIOD-CRISPR系统，用于高灵敏度和特异性SARS-CoV-2病毒核酸的及时检测；除了RPA预扩增法，基于CRISPR-Cas的核酸检测和LAMP预扩增方法，如SARS-CoV-2DETECTR(DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter)系统，尽管SHERLOCK和DETECTR可通过测流层析试纸条进行结果输出用于SARS-CoV-2POCT检测，但由于均是使用单一crRNA介导的CRISPR检测、其酶切效率较低，从扩增到结果输出大约需要一个小时才能完成；结合RAA扩增和CRISPR-Cas12a来检测新型冠状病毒，例如CN114350854A、CN113881806A、CN113549618A、CN113481327A等。然而，传统的结合核酸等温扩增和CRISPR/Cas的检测技术在应用于经裂解液处理的样本中的新型冠状病毒的检测的过程中，灵敏度有待提升。
发明内容
基于此，本申请实施例的目的包括提供一种新型冠状病毒检测试剂，采用该检测试剂对经裂解液处理的样本中的新型冠状病毒的检测，灵敏度高。
在本申请的第一方面，提供一种新型冠状病毒检测试剂，所述检测试剂包括RAA扩增引物对、RAA扩增酶、Cas12a核酸内切酶、crRNA和探针，
所述检测试剂检测的靶基因包括ORF1ab基因和N基因中的一种或者多种；
所述ORF1ab基因对应的所述RAA扩增引物对包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物；
所述N基因对应的所述RAA扩增引物对包括如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物；
所述探针的序列如SEQ ID No.9所示，一端连接荧光标记物，一端连接淬灭基团。
在本申请的一些实施例中，所述检测试剂还包括病毒裂解液，所述病毒裂解液包含5mM-50mM Tris缓冲液、0.5％-2％(v/v)甘油、0.05-1.0％(v/v)Tween-20、30mM-100mMNaOH、50mM-150mM KCl。
在本申请的一些实施例中，所述检测试剂还包括RAA扩增缓冲液，所述RAA扩增试剂包含3wt％-6wt％PEG20000、40mM-100mM氯化钾、8mM-20mM醋酸镁、1.0mM-2.5mM二硫苏糖醇、2.0mM-4.0mM ATP、0.2mM-0.55mM dNTPs、10mM-120mM磷酸肌酸以及30mM-60mM、pH7.5-8.5的Tris-Ac缓冲液。
在本申请的一些实施例中，所述RAA扩增酶包括逆转录酶、核糖核酸酶、磷酸肌酸激酶、重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白和DNA聚合酶；可选地，所述检测试剂还包括核糖核酸酶抑制剂。
在本申请的一些实施例中，所述检测试剂具有如下书特征中的一个或者多个：
(1)所述逆转录酶为AMV和M-MLV中的一种或者多种；
(2)所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A、核糖核酸酶H和核糖核酸酶T1中的一种或者多种；
(3)所述重组酶为T4 UvsX和Rec A中的一种或者多种；
(4)所述重组酶辅助蛋白为T4 UvsY；
(5)所述单链结合蛋白为大肠杆菌单链DNA结合蛋白或者T4噬菌体基因32蛋白；
(6)所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶I或者Bsu DNA聚合酶I；
(7)所述核糖核酸酶抑制剂为Rnasin；
(8)所述Cas12a核酸内切酶为LbCas12a核酸内切酶。
在本申请的第二方面，提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包含第一方面中所述的检测试剂以及与其配套使用的显色部件。
在本申请的一些实施例中，所述显色部件为胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括背板以及依次搭接粘贴在所述背板上的样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述检测膜设有检测线和质控线，
所述金标垫喷涂有胶体金和抗所述荧光标记物的单克隆抗体的配合物，所述检测线上包被羊抗兔抗体，所述质控线包被SA链霉亲和素。
在本申请的第三方面，提供一种检测或者辅助检测新型冠状病毒的核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
采用第二方面中所述的检测试剂盒对待测样本进行检测，并根据所述得检测结果判定所述待测样本中是否含有新型冠状病毒的核酸。
在本申请的一些实施例中，根据所述的检测结果判定所述待测样本中是否含有新型冠状病毒的核酸包括：
若仅所述胶体金试纸条的质控线显色，则所述测待测样本中不含有所述新型冠状病毒核酸；
若所述胶体金试纸条的检测线和质控线同时显色，则所述测待测样本中含有所述新型冠状病毒核酸；
若所述胶体金试纸条的质控线不显色但检测线显色，则所述测待测样本中含有所述新型冠状病毒核酸。
在本申请的一些实施例中，检测的条件包括：温度为23℃-42℃，时间为5min-30min。
相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：
本发明提供的新型冠状病毒检测试剂，能够针对ORF1ab基因和N基因进行两重检测，针对裂解液裂解待测样本释放的新冠病毒RNA核酸，在RAA扩增酶包括逆转录酶、重组酶、重组酶辅助蛋白、核酸酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶的共同作用合成双链DNA，并实现对合成双链DNA的指数放大；对扩增产物双链DNA利用依赖原间隔邻近基序的双重crRNA介导下结合Cas12a核酸内切酶并特异性结合双链DNA同源序列上，指导Cas12a核酸内切酶高效侧向切割单链DNA探针，最终能够通过试纸条是否显色从而判定待测样本中是否含有新冠病毒核酸。
本发明通过对检测试剂中的恒温扩增引物、正、负链的crRNA和探针的整体设计，有效提升检测的灵敏度。并且，用本发明的检测试剂检测新型冠状病毒，还具有特异性好、灵敏度高的特点。
本发明将恒温扩增技术与CRISPR基因编辑技术相结合，无需提取RNA，能够在常温恒温条件下实现多重扩增的核酸检测，且检测结果能够可视化检测，无需专门的核酸扩增仪和专业的操作人员，结果判读相对简单与直观，检测效率高，特别适合现场检测。
本发明的检测试剂，能够将恒温扩增与CRISPR检测放入同一反应管中进行，实现病毒核酸的一体化检测，减少扩增后开盖所带来的气溶胶污染。同时，能满足将多个扩增靶点引物加入同一反应管中的需求，实现多靶点的同时扩增，省试剂、省成本、省人力、耗时短。
本发明的检测试剂，稳定性强，可在37℃条件存放8天仍保持其检测性能。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例RNA恒温扩增-双重CRSIPR检测机制示意图；
图2为实施例1中样本裂解液裂解效果验证结果图；
图3为实施例2中一体化多重检测结果；
图4为实施例3中灵敏度分析结果；
图5为实施例5加速8天试剂稳定性研究结果。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请的第一方面
本申请供一种新型冠状病毒检测试剂，所述检测试剂包括RAA扩增引物对、RAA扩增酶、Cas12a核酸内切酶、crRNA和探针，
所述检测试剂检测的靶基因包括ORF1ab基因和N基因中的一种或者多种；
所述ORF1ab基因对应的所述RAA扩增引物对包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物；
所述N基因对应的所述RAA扩增引物对包括如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物；
所述探针的序列如SEQ ID No.9所示，一端连接荧光标记物，一端连接淬灭基团。
本申请实施例中，ORF1ab基因对应的所述crRNA包括根据SARS-CoV-2病毒ORF1ab结构基因序列正链和负链设计的依赖原间隔邻近基序(PAM)位点的crRNAs，每条crRNA都包含两个结构，包括5’端的20个核苷酸的发夹结构序列和3’端靶向基因的同源序列如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示。
本申请实施例中，N基因对应的所述crRNA包括根据SARS-CoV-2病毒N基因序列正链和负链设计开发的依赖原间隔邻近基序(PAM)位点的crRNAs，每条crRNA都包含两个结构，包括5’端的20个核苷酸的发夹结构序列和3’端靶向基因的同源序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。
本申请实施例中，所述探针为单链DNA探针，碱基长度为5，序列为TTATT，一端含有荧光基团修饰：5’端6-FAM或FITC，3’端含有生物素biotin修饰，如SEQ ID No.9所示。
在其中一个示例中，所述检测试剂包括病毒裂解液，所述病毒裂解液包含5mM-50mM Tris缓冲液、0.5％-2％(v/v)甘油、0.05-1.0％(v/v)Tween-20、30mM-150mM NaOH、50mM-150mM KCl。采用病毒裂解液对样本裂解之后直接进行检测，操作简单，速度快。本申请中的病毒裂解液中，Tris缓冲液的浓度例如为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mM，甘油的浓度例如为0.5％、1％、1.5％、2％，Tween-20的浓度例如为0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％，NaOH的浓度例如为30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150mM，KCl的浓度例如为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150mM。
在其中一个实施例中，所述检测试剂还包括RAA扩增缓冲液，所述RAA扩增缓冲液包含3wt％-6wt％PEG20000、40mM-100mM氯化钾、8mM-20mM醋酸镁、1.0mM-2.5mM二硫苏糖醇、2.0mM-4.0mM ATP、0.45mM-0.55mM dNTPs、10mM-120mM磷酸肌酸以及30mM-60mM、pH7.5-8.5的Tris-Ac缓冲液。本申请的扩增缓冲液中，PEG20000的浓度例如为3wt％、4wt％、5wt％、6wt％，氯化钾的浓度例如为40、50、60、70、80、90、100mM，醋酸镁的浓度例如为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mM，二硫苏糖醇的浓度例如为1、1.5、2、2.5mM，ATP的浓度例如为2、2.5、3、3.5、4mM，dNTPs的浓度例如为0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5、0.51、0.52、0.53、0.54、0.55mM，磷酸肌酸的浓度例如为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120mM，缓冲液的浓度例如为30、40、50、60mM，pH例如为7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5。
在其中一个示例中，所述RAA扩增酶包括逆转录酶、核糖核酸酶、磷酸激酶、重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白和DNA聚合酶；可选地，所述检测试剂还包括核糖核酸酶抑制剂。
在其中一个示例中，所述逆转录酶为AMV和M-MLV中的一种或者多种。
在其中一个示例中，所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A、核糖核酸酶H和核糖核酸酶T1中的一种或者多种。
在其中一个示例中，所述重组酶为T4 UvsX和Rec A中的一种或者多种。
在其中一个示例中，所述重组酶辅助蛋白为T4 UvsY。
在其中一个示例中，所述单链结合蛋白为大肠杆菌单链DNA结合蛋白或者T4噬菌体基因32蛋白。
在其中一个示例中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶I或者Bsu DNA聚合酶I。
在其中一个示例中，所述核糖核酸酶抑制剂为Rnasin。
在其中一个示例中，所述Cas12a核酸内切酶为LbCas12a核酸内切酶。
本申请的第二方面
本申请提供一种新型冠状病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包含第一方面所述的检测试剂以及与其配套使用的显色部件。
在其中一个示例中，所述显色部件为胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括背板以及依次搭接粘贴在所述背板上的样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述检测膜设有检测线和质控线；
所述金标垫喷涂有胶体金和抗所述荧光标记物的单克隆抗体的配合物，所述检测线上包被羊抗兔抗体，所述质控线包被SA链霉亲和素。
在其中一个示例中，所述方法分别采用基于ORF1ab或N基因正、负两条链的双重crRNA介导的CRISPR切割，实现ORF1ab和N基因的高效一体化检测。
本申请的第三方面
本申请提供一种检测或者辅助检测新型冠状病毒的核酸的方法，所述方法包括如下步骤：
采用第二方面所述的检测试剂盒对待测样本进行检测，并根据所述得检测结果判定所述待测样本中是否含有新型冠状病毒的核酸。
在其中一个示例中，根据所述的检测结果判定所述待测样本中是否含有新型冠状病毒的核酸包括：
若仅所述胶体金试纸条的质控线显色，则所述测待测样本中不含有所述新型冠状病毒核酸；
若所述胶体金试纸条的检测线和质控线同时显色，则所述测待测样本中含有所述新型冠状病毒核酸；
若所述胶体金试纸条的质控线不显色但检测线显色，则所述测待测样本中含有所述新型冠状病毒核酸。
在本申请的一些实施例中，检测的条件包括：温度为23℃-42℃，时间为5min-30min。检测的温度例如为23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42℃，时间例如为5、10、15、20、25、30min。
本发明所述的“检测或者辅助检测”不以有生命体的动物为对象，也不以获得疾病诊断结果或健康状况为直接目的。
本发明提供检测或者辅助检测新型冠状病毒核酸的方法中，恒温扩增与CRISPR检测可以单独进行，也可将两者混在同一反应管中同时进行。
本发明提供检测或者辅助检测新型冠状病毒核酸的方法中，实现ORF1ab基因和N基因双重扩增。
本发明提供检测或者辅助检测新型冠状病毒核酸的方法中，检测的条件包括：温度为23℃-42℃，时间为5min-30min。温度例如为20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃。优选地，温度为37℃-42℃。时间例如为5min、10min、15min、20min、25min、30min。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1、病毒裂解液效果分析
在恒温扩增高灵敏度的基础下，为了能更经济、省时、省力地实现SARS-CoV-2新冠病毒RNA的检测，我们利用强碱溶液破坏蛋白质的结构，从而使蛋白质失去活性的原理，选择了包含NaOH的溶液作为病毒裂解液，优化各成分浓度，以研究可以用于裂解SARS-CoV-2核酸病毒蛋白质外壳释放RNA核酸的病毒裂解液，同时，该裂解液还不影响后续的恒温扩增体系中的蛋白酶的活性。
为了模拟临床情况，我们将含有ORF1ab基因片段的假病毒(购自上海翌圣生物)加入健康志愿者的样本中，实现人为构建含目标核酸的假病毒样本。
用如下病毒裂解液与假病毒样本体积比为1：1混合后，在室温条件下处理假病毒样本5min，用恒温扩增试剂进行扩增反应。
表1、病毒裂解液
| 序号 | 组分 | 组分1 | 组分2 | 组分3 | 组分4 |
| 1 | Tris(pH8.3) | 10mM | 10mM | 10mM | 10mM |
| 2 | 甘油(v/v) | 1.00％ | 1.00％ | 1.00％ | 1.00％ |
| 3 | Tween-20(v/v) | 0.10％ | 0.10％ | 0.10％ | 0.10％ |
| 4 | NaOH | 30mM | 50mM | 100mM | 150mM |
| 5 | KCl | 100mM | 100mM | 100mM | 100mM |
RAA扩增反应缓冲液：50mM Tris-Ac缓冲液(pH8.0)，5.5wt％PEG20000、100mM氯化钾、12mM醋酸镁、2mM二硫苏糖醇(DTT)、3mM ATP、0.2mM dNTPs、50mM磷酸肌酸。
RAA恒温扩增引物对为针对ORF1ab结构基因的引物对，每条引物的浓度为0.2μM，序列信息如下：
ORF1ab-F1(SEQ ID No.1)：GCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTG；
ORF1ab-R1(SEQ ID No.2)：CAGTACTAGTGCCTGTGCCGCACGGTGTAAGAC；
恒温检测酶：100ng/μL磷酸肌酸激酶，0.3U/μL M-MLV，0.1U/μL核糖核酸酶H，50ng/μL Bsu DNA 聚合酶I，300ng/μL T4 UvsX，60ng/μL T4 UvsY，500ng/μL T4 GP32，1U/μL Rnasin。
荧光染料：1×SYBR Green I。
取3μL裂解后的样本进行检测，在qPCR仪上扩增50min，期间每30sec采集一次荧光信号。
结果见图2。四个组分的病毒裂解液所裂解的假病毒均有荧光扩增曲线，其中，组分2的荧光信号最强，说明该病毒裂解液裂解效率高，释放RNA核酸更充分。组分4病毒裂解液对应的荧光曲线起峰较晚，且荧光信号较弱，这可能是核酸释放效果不佳或高浓度的NaOH抑制酶反应体系中的酶活导致。
实施例2、一体化多重检测验证
为了系统地评估本发明可以实现SARS-CoV-2新冠病毒ORF1ab和N基因的双重检测。在含有ORF1ab和N基因片段的假病毒(购自上海翌圣生物)样本中按体积比1：1比例加入病毒裂解液(组分2)，通过在反应管中添加不同的成分进行了5个反应，在42℃条件下反应15min，胶体金试纸条显色。
RAA扩增缓冲液：50mM Tris-Ac缓冲液(pH8.0)，5.5wt％PEG20000、100mM氯化钾、12mM醋酸镁、2mM二硫苏糖醇(DTT)、3mM ATP、0.2mM dNTPs、50mM磷酸肌酸。
RAA扩增引物对，包括两对：针对ORF1ab结构基因的引物对和针对N基因的引物对，SARS-CoV-2病毒ORF1ab结构基因的扩增引物：
ORF1ab-F1(SEQ ID No.1)：GCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTG；
ORF1ab-R1(SEQ ID No.2)：CAGTACTAGTGCCTGTGCCGCACGGTGTAAGAC；
SARS-CoV-2病毒N基因的扩增引物：
N-F1(SEQ ID No.3)：GAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCG；
N-R1(SEQ ID No.4)：TCTTAGTGACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGC。
每条引物的浓度为0.2μM。
RAA检测酶：100ng/μL磷酸肌酸激酶，0.3U/μL M-MLV，0.1U/μL核糖核酸酶H，50ng/μL Bsu DNA聚合酶I，300ng/μL T4 UvsX，60ng/μL T4 UvsY，500ng/μL T4 GP32，1U/μLRnasin，LbCas12a核酸内切酶。
crRNA和探针：包括根据SARS-CoV-2病毒ORF1ab结构基因和N基因序列正链和负链设计开发的依赖原间隔邻近基序(PAM)位点的crRNAs，每条crRNA都包含两个结构，包括5’端的20个核苷酸的发夹结构序列和3’端靶向基因的同源序列；探针为单链DNA探针，碱基长度为5，序列为TTATT，一端含有荧光基团修饰：5’端FITC，3’端含有BHQ1修饰。具体的：
ORF1ab基因对应的crRNAs，其序列为：
ORF1ab-crRNA1(SEQ ID No.5)：
AAUUUCUACUAAGUGUAGAUaacggguuugcgguguaagug；
ORF1ab-crRNA2(SEQ ID No.6)：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUuuuugcaacacguagucga。
N基因对应的crRNAs，其序列为：
N-crRNA1(SEQ ID No.7)：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUcugcugcuugacagauugaa；
N-crRNA2(SEQ ID No.8)：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUccagacauuuugcucucaag。
单链DNA探针(SEQ ID No.9)：5’-6-FAM-TTATT-3’biotin。
胶体金析试纸条：胶体金试纸条为胶体金试纸条，所述的胶体金试纸条包括背板、样本品、金标垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水纸。所述的背板沿纵向设置，背板上由下至上依次链接样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，各部分在相邻处重叠设置，所述的硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线(T线)和质控线(C线)，所述的检测线远离样本垫，质控线邻近样本垫，检测线处的硝酸纤维素膜上包被羊抗兔抗体，质控线处的硝酸纤维素膜上包被SA链霉亲和素，胶体金标记抗6-FAM单克隆抗体。
结果见图3。除了未加样本的阴性对照仅质控线显色以外，其他四个反应检测线均显色，这说明本发明实现了SARS-CoV-2新冠病毒ORF1ab和N基因的双重检测(图3中C图)。
为进一步评估双重crRNA介导的CRISPR酶切割效率，我们将单链DNA探针更换为5’端标记FAM荧光素、3’端标记淬灭基团BHQ1的荧光探针，采用凝胶成像系统的紫外光和智能手机LED灯进行结果分析。结果如图3的A图和B图：除未加样本的反应没有检测到荧光外，其余均有荧光。但，相比于只加入N基因检测引物，只加入单重crRNA介导的2号反应检测，加入了双重crRNAs介导的3和4两个反应的荧光信号较2强；更明显的是，双重crRNA介导的双靶点检测的5号反应，荧光信号较其他3个反应管都强。这充分说明，我们的双重crRNA加强了LbCas12a的剪切效率。
以上研究结果充分说明，我们的检测方法能加强检测效率，同时能实现对SARS-CoV-2病毒ORF1ab和N基因的双重扩增与检测。
实施例3、检测灵敏度分析
为了分析本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂的检测灵敏度，我们用SARS-CoV-2假病毒以及实施例2中的试剂组分进行ORF1ab和N基因的一体化双重检测试验。从-80℃冰箱取出冻存的SARS-CoV-2假病毒，加入一定体积的RNase-free water进行复溶，并用RNase-free water分别稀释成200copies/mL、500copies/mL、1000copies/mL、2000copies/mL的假病毒稀释液。分别取以上述稀释液5μL加入等体积的病毒裂解液(组分2)混匀后，室温裂解5min，得到100copies/mL、250copies/mL、500copies/mL、1000copies/mL的病毒裂解液，分别取3μL作模板，在42℃条件扩增15min，用凝胶电泳和胶体金测流层析试纸条显色进行结果分析。
结果见图5。凝胶电泳检测结果显示，均有目标大小的条带。同时，胶体金层析试纸条的T线显色。这说明，本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂至少能检测100copies/mL的病毒样本。
实施例4、特异性分析
为了分析本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂的特异性，我们选用实施例2中的试剂组分分析2个人类冠状病毒和15呼吸道病原菌，选用实施例1中的病毒裂解液(组分2)按1：1与分析物混合后，室温处理5min，取3μL裂解后的样本在42℃条件下检测30min。
结果见表2。扩增结果显示，仅新冠病毒扩增出目的条带，其他病毒或病原菌均无目的条带扩增出现，这说明基于SARS-CoV-2的恒温系统与本研究中提到的病原菌不会发生交叉反应，表现出很强的特异性。
表2、特异性分析结果
| 序号 | 质粒或病毒名称 | ORF1ab检测结果 | N gene检测结果 |
| 1 | SARS-CoV-2 | + | + |
| 2 | Coronavirus OC43 | - | - |
| 3 | Coronavirus 229E | - | - |
| 4 | Influenza A virus H1N1 | - | - |
| 5 | Influenza A virus H3N2 | - | - |
| 6 | Influenza B virus V | - | - |
| 7 | Influenza B virusY | - | - |
| 8 | Respiratory syncytial virus A | - | - |
| 9 | Respiratory syncytial virus B | - | - |
| 10 | Adenovirus 3 | - | - |
| 11 | Mycoplasma pneumoniae | - | - |
| 12 | Chlamydia pneumoniae | - | - |
| 13 | Streptococcus pneumoniae | - | - |
| 14 | Staphylococcus aureus | - | - |
| 15 | Haemophilus influenzae | - | - |
| 16 | EBV | - | - |
| 17 | Rubella virus | - | - |
| 18 | Measles virus | - | - |
注：“+”：表示有扩增目的条带；“-”：表示扩增目的条带。
实施例5、稳定性研究
为了分析本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂的稳定性。采用实施例2中的试剂组分进行实验。试剂组分分成两份，一份存放于-20℃及以下，一组放于37℃，分别存放8天，8天后取出试剂，按照实施例一的方式进行试验。
结果见图5。结果37℃和-20℃的研究结果一致，这说明本发明的新型冠状病毒核酸检测试剂至少可在37℃储存8天，仍能保持其性能。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (9)
1.一种恒温扩增与CRISPR检测一体化的新型冠状病毒检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括RAA扩增引物对、RAA扩增酶、Cas12a核酸内切酶、crRNA和探针，
所述检测试剂检测的靶基因包括ORF1ab基因和N基因；
所述ORF1ab基因对应的所述RAA扩增引物对包括如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物；
所述N基因对应的所述RAA扩增引物对包括如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物；
所述探针的序列如SEQ ID No.9所示，一端连接荧光标记物，一端连接生物素；
所述crRNA如下：
ORF1ab-crRNA1如SEQ ID No.5所示；
ORF1ab-crRNA2如SEQ ID No.6所示；
N-crRNA1如SEQ ID No.7所示；
N-crRNA2如SEQ ID No.8所示。
2. 根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括病毒裂解液，所述病毒裂解液包含10mM Tris缓冲液、体积百分比为1%的甘油、体积百分比为0.1%的Tween-20、50mM NaOH、100mM KCl。
3. 根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括RAA扩增缓冲液，所述RAA扩增试剂包含5.5wt% PEG20000、100mM氯化钾、12mM醋酸镁、2mM二硫苏糖醇、3mM ATP、0.2mM dNTPs、50mM磷酸肌酸以及50mM、pH8的Tris-Ac缓冲液。
4.根据权利要求1至3任一项所述的新型冠状病毒检测试剂，其特征在于，所述RAA扩增酶包括逆转录酶、核糖核酸酶、磷酸肌酸激酶、重组酶、重组酶辅助蛋白、单链结合蛋白和DNA聚合酶。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒检测试剂，其特征在于，所述检测试剂还包括核糖核酸酶抑制剂。
6.根据权利要求4所述的新型冠状病毒检测试剂，其特征在于，所述检测试剂具有如下特征中的一个或者多个：
（1）所述逆转录酶为AMV和M-MLV中的一种或者多种；
（2）所述核糖核酸酶为核糖核酸酶A、核糖核酸酶H和核糖核酸酶T1中的一种或者多种；
（3）所述重组酶为T4 UvsX和Rec A中的一种或者多种；
（4）所述重组酶辅助蛋白为T4 UvsY；
（5）所述单链结合蛋白为大肠杆菌单链DNA结合蛋白或者T4噬菌体基因32蛋白；
（6）所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶I或者Bsu DNA聚合酶I；
（7）所述核糖核酸酶抑制剂为Rnasin；
（8）所述Cas12a核酸内切酶为LbCas12a核酸内切酶。
7.一种新型冠状病毒检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1至6任一项所述的检测试剂以及与其配套使用的显色部件；
所述显色部件为胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括背板以及依次搭接粘贴在所述背板上的样本垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，
所述金标垫喷涂有胶体金和抗所述荧光标记物的单克隆抗体的配合物，所述检测线上包被羊抗兔抗体，所述质控线包被SA链霉亲和素。
8.一种非诊断目的的检测或者辅助检测新型冠状病毒的核酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
采用权利要求7所述的检测试剂盒对待测样本进行检测，并根据检测结果判定所述待测样本中是否含有新型冠状病毒的核酸；
根据所述的检测结果判定所述待测样本中是否含有新型冠状病毒的核酸包括：
若仅所述胶体金试纸条的质控线显色，则所述待测样本中不含有所述新型冠状病毒核酸；
若所述胶体金试纸条的检测线和质控线同时显色，则所述待测样本中含有所述新型冠状病毒核酸；
若所述胶体金试纸条的质控线不显色但检测线显色，则所述待测样本中含有所述新型冠状病毒核酸。
9.根据权利要求8所述的非诊断目的的检测或者辅助检测新型冠状病毒的核酸的方法，其特征在于，检测的条件包括：温度为42℃，时间为15min。
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