CN116426668A - 一种基于核酸质谱技术检测毛霉菌的引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于核酸质谱技术检测毛霉菌的引物组及其应用，属于分子生物学技术领域。该引物组的序列如SEQ ID NO.1‑21所示，包括扩增和检测毛霉菌的引物对和特异性的单碱基延伸引物，利用该引物组，将样本经过DNA提取、富集扩增、消化和延伸反应处理后可直接用于核酸质谱检测。本发明可以同时检测包括根霉属、毛霉属、横梗霉属、根毛霉属、小克银汉霉属、鳞质霉属、瓶霉属、共头霉属和科克霉属在内的9种人类毛霉病中常见的病原菌，具有较高的检测特异性，且操作简单，对于毛霉病的早期诊断具有重大意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种基于核酸质谱技术检测毛霉菌的引物组及其应用。
背景技术
毛霉菌病(mucormycosis)是一种罕见的血管侵袭性真菌病，是由毛霉菌目真菌引起的严重感染性疾病，其发展迅速，病死率高(可达50％以上)，主要影响免疫受损或具有基础性疾病的患者，如糖尿病、器官移植、恶性肿瘤、艾滋病等患者以及长期使用糖皮质激素人群，而健康人群中毛霉病感染发病的几率很低。
毛霉菌广泛存在于土壤、空气、霉变材料以及腐烂食物中，引起毛霉病的主要致病菌包括根霉属(Rhizopus sp.)、毛霉属(Mucor sp.)、横梗霉属(Lichtheimia sp.)、根毛霉属(Rhizomucor sp.)、小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)、鳞质霉属(Apophysomycessp.)、瓶霉属(Saksenaea sp.)、共头霉属(Syncephalastrum sp.)和科克霉属(Cokeromycessp.)等。毛霉病的主要特征为毛霉菌菌丝侵袭和破坏血管，从而导致组织坏死，根据感染部位的不同，毛霉病可分为鼻脑眶型、肺型、皮肤型、肠胃型、肾脏型和播散型6种类型，其中鼻脑眶型最为常见，其次为肺型。
目前，毛霉病的诊断依然是一个难题，临床诊断率较低，现有的诊断方法主要有影像学、组织病理学、培养及镜检和分子检测等。检测毛霉病的影像学方法主要为CT和磁共振成像(MRT)，该种方法可以确定疾病程度，但是无法鉴定具体感染的病原菌。毛霉病的组织病理具有一定的特征，即可见透明菌丝且菌丝宽大无间隔或极少间隔，分枝呈90°直角，但在机械加工下会出现45°角，这导致有时很难与曲霉区分开来。真菌培养的方法可进行属和种的鉴定以及抗药敏实验，但此方法周期较长且鉴定的阳性结果率低，通过组织病理学已确认的毛霉病，真菌培养结果50％为阴性。相对于形态学鉴定，分子生物学检测方法对于病原菌的鉴定和分类具有更高的准确度，目前，检测毛霉病的分子生物学方法主要包括传统PCR、PCR-EFLP、qPCR等，这些方法主要以内部转录间隔区(ITS)、18S rRNA或者28S rRNA基因为靶点。已有较多学者公开了利用多重qPCR检测毛霉目真菌的方法，其中润鹏生物2021年申请的专利《检测毛霉菌病病原体的试剂盒及方法》(CN114574609A)采用qPCR的方法可以鉴定毛霉菌的6个属和1个种，即根霉属、毛霉属、横梗霉属、根毛霉属、小克银汉霉属、鳞质霉属以及伞状犁头霉，该专利检测种类较多，对常见的几种毛霉病致病菌均能检测，但对于几种罕见的致病菌，如瓶霉属、科克霉属以及共头霉属却没有涉及；采用基因组第二代测序(mNGS)技术也可从样本中检测多种病原菌，但其检测成本较高。
近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术也常被用于微生物的检测与鉴定中，已有学者采用MALDI-TOF-MS技术实现了毛霉菌在属和种水平上的准确鉴定。核酸质谱技术具有操作简便、灵敏度高、样本用量少等特点，且相比于qPCR，又具有多重、准确和高通量的优势，核酸质谱技术同时弥补了qPCR通量不足和NGS检测时间长以及成本高的缺陷，在微生物的分型和检测中具有良好的应用前景，可作为微生物感染疾病的一种诊断方法。
发明内容
本发明提供了一种基于核酸质谱技术检测毛霉菌的引物组及其应用，以实现对毛霉菌在属水平上的准确分型，其主要包括以下步骤：
(1)本发明根据国际上毛霉菌病致病菌流行病学研究资料，确定人类毛霉病中常见的9种病原菌，包括根霉属(Rhizopus sp.)、毛霉属(Mucor sp.)、横梗霉属(Lichtheimiasp.)、根毛霉属(Rhizomucor sp.)、小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)、鳞质霉属(Apophysomycessp.)、瓶霉属(Saksenaea sp.)、共头霉属(Syncephalastrum sp.)和科克霉属(Cokeromycessp.)。
(2)针对根霉属、毛霉属、横梗霉属、根毛霉属、小克银汉霉属、鳞质霉属、共头霉属、科克霉属和瓶霉属这9个属的18s rRNA基因序列设计扩增引物和特异性单碱基延伸引物。为了确保引物的特异性和方法的准确性，从NCBI数据库上尽可能多的下载不同种的18srRNA的基因序列，运用Clustalx软件对下载的基因序列进行多序列比对，找出不同属之间各自的特异性区间和保守区间，在同时满足这两个条件的基础上设计特异性单碱基延伸引物。下载的基因序列中，其中根霉属包含Rhizopus oryzae(KF515994.1)、Rhizopusarrhizus(KJ408539.1)、Rhizopus microsporus(HM357885.1)、Rhizopus azygosporus(NG_062618.1)；毛霉属包含Mucor circinelloides(JF723655.2)、Mucor racemosus(JF723693.2)、Mucor irregularis(KT148633.1)、Mucor fuscus(JF723690.2)；横梗霉属包含Lichtheimia ramosa(MG772628.1)、Lichtheimia corymbifera(MG772625.1)；根毛霉属包含Rhizomucor pusillus(NG_063355.1)；小克银汉霉属包含Cunninghamella elegans(EU484213.1)、Cunninghamella echinulata(KJ652022.1)；鳞质霉属包含Apophysomyceselegans(AF113412.1)；共头霉属包含Syncephalastrum racemosum(EU484224.1)、Syncephalastrum monosporum(KY047155.1)；科克霉属包含Cokeromyces recurvatus(NG_076755.1)；瓶霉属包含Saksenaea vasiformis(ON307074.1)。
(3)考虑到引物数量越多，引物之间形成的引物二聚体的可能性越大。在设计扩增引物时，寻找不同属之间相对保守的序列，在此基础上设计几组通用的上下游扩增引物，从而减少引物数量。
(4)除了上述每种毛霉菌的特异性区间外，还需增加一个质控片段，即人基因组片段，由于检测的样本中携带有人基因组背景，因此新增一个人基因组片段用于样本质量以及实验操作的质控。
(5)使用Multiple Primer Analyzer网站对设计好的所有引物进行多重引物分析，去除存在严重的引物二聚体或引物3＇端非特异性结合的引物，并重新设计，每种毛霉菌属的特异性引物可多设计几组，方便后续的筛选和验证。
(6)以购买的菌株所提取的DNA以及合成的质粒为模板，对设计好的扩增引物和单碱基延伸引物进行筛选和验证。其中扩增引物的质量采用毛细管电泳技术进行验证，检测扩增产物中是否有目的扩增片段，是否有明显的非特异产物；延伸引物则以核酸质谱技术为检测方法，检测是否生成目的延伸产物，检测延伸转化效率的高低，以及是否存在非特异性延伸产物；综合以上所有检测后，最终确定的引物序列如下。
所述引物组中，上下游引物SEQ ID NO.1-9为9个毛霉菌属的通用扩增引物序列；SEQ ID NO.10-11为HPRT1内参基因的扩增引物序列；SEQ ID NO.12-20分别为根霉属、毛霉属、横梗霉属、根毛霉属、小克银汉霉属、鳞质霉属、瓶霉属、共头霉属和科克霉属的特异性单碱基延伸引物序列；SEQ ID NO.21为HPRT1内参基因的特异性单碱基延伸引物序列。
所述一种基于核酸质谱技术检测毛霉菌的样本处理方法对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品的短片段DNA依然具有与新鲜组织样品、痰液样品、细胞样品DNA同样的扩增和检测能力。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术，本发明设计的特异性引物组能够同时鉴定引起人类毛霉病的9种常见的毛霉菌属；
(2)本发明基于核酸质谱平台，整个流程主要包括三轮PCR扩增和最终的质谱上机检测，其中质谱上机流程由仪器自动化检测。因此本发明操作简便，手动操作时间短，当天即可得到检测结果，且结果分析简单。
附图说明
图1为实施例1中米根霉(Rhizopus oryzae)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图2为实施例1中少根根霉(Rhizopus arrhizus)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图3为实施例1中小孢根霉(Rhizopus microsporus)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图4为实施例1中卷枝毛霉(Mucor circinelloides)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图5为实施例1中总状毛霉(Mucor racemosus)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图6为实施例1中不规则毛霉(Mucor irregularis)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图7为实施例1中总状横梗霉(Lichtheimia ramosa)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图8为实施例1中伞枝横梗霉(Lichtheimia corymbifera)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图9为实施例1中微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图10为实施例1中雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图11为实施例1中刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图12为实施例1中雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)阳性质粒的检测质谱峰图；
图13为实施例1中瓶样瓶霉(Saksenaea vasiformis)阳性质粒的检测质谱峰图；
图14为实施例1中总状共头霉(Syncephalastrum racemosum)菌株DNA样本的检测质谱峰图；
图15为实施例1中屈弯科克霉(Cokeromyces recurvatus)阳性质粒的检测质谱峰图。
图16为实施例2米根霉(Cokeromyces recurvatus)菌株DNA样本在不同浓度梯度下的检测质谱峰图。
具体实施方式
实施例1
本实施例使用购买的12种菌株(米根霉、少根根霉、小孢根霉、卷枝毛霉、总状毛霉、不规则毛霉、总状横梗霉、伞枝横梗霉、微小根毛霉、雅致小克银汉霉、刺孢小克银汉霉和总状共头霉)和合成的3种阳性质粒(雅致鳞质霉、瓶样瓶霉和屈弯科克霉)进行性能的检测。含有阳性片段的质粒中，雅致鳞质霉(Apophysomyces elegans)(AF113412.1)序列(SEQID NO.22)：TTAGCATGGAATAATGAAATATGGCTTGGGTCCTTATTTCGTTGGTTTATACGACCTTTGCAATGATAAATAGGAACGGTTGGGGGGATTTGTATTTGGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTAGATTGGCTAAAGACACACTACTGCGAAAGCATTTTACCCAGGACGTTTCCGTTGATCAAGGTCTAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGTTTGCTCTATGGCTTACTCGGAACCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGCTCTGGGGGGAGTATGGTACGCAAGA
其中瓶样瓶霉(Saksenaea vasiformis)(AF113442.1)序列(SEQ ID NO.23)：TTACCATGAGCAAATCAGAGTGTTTAAAGCAGGCCAATGGCTTGAATGTGTTAGCATGGAATAATGAAATATGGCTTGGGTCCTTATTTCGTTGGTTTAATACCGACCTTTGCAATGATAAATAGGAACGGTTGGGGGGATTTGTATTTGGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTAGATTGGCTAAAGACACACTACTGCGAAAGCATTTTACCCAGGACGTTTCCGTTGATCAAGGTCTAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCCTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCTTGCTTACTGGCTTGCTCGGAACCTTAGCGAAAGTAAAGTTTTTGGGCTCTGGGGGGAGTATGGTACGCAAGA
其中屈弯科克霉(Cokeromyces recurvatus)(NG076755.1)序列(SEQ ID NO.24)：AATTTTAGTCTTTTAGGTGATGCGGTTTGGCCTTCATTGGTCAAGCAAGTTGTTACCAAGACTCTGGCTGATTTCTGCTTTTTTCTCTCTTCGGGGGGGAAAGAGTAGATAATTAAGCCATTACCATGAGCAAATCAGAGTGTTTAAAGCAGGCTTTTTAAGCTTGAATGTGTTAGCATGGAATAATGAAATATGACTTTATGTTCTATTTTGTTGGTTTTAAGAACAAAGTAATGATGAATAGAAACGGTTGGGGGCATTTGTATTTGGTCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTGACCGAAGACAAACTACTGCGAAAGCATTTGACCCAGGACGTTTTCATTGATCAAGGT
下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
1、样本提取
使用核酸提取试剂进行菌株DNA的提取，洗脱体积为30μL；将合成的阳性质粒进行酶切定量，依据数字PCR赋值结果稀释至200copies/μL。以10ng/μL的293T细胞系DNA样本为背景，与上述菌株DNA、200copies/μL阳性质粒等比例混合作为测试样本，模拟实际临床样本，用于后续实验。
2、反应液配制
依据以下配方表配置富集反应液、消化反应液和延伸反应液。
表1富集反应液配方
表2消化反应液配方
表3延伸反应液配方
3、富集扩增
按照“3μL的富集反应液+0.2μL的Taq酶”的比例配置16人份的富集反应体系，混匀离心后按照每人份3.2μL的体积分装至八连管中，依次加入2μL测试样本，小心盖上管盖，快速离心后进行PCR扩增，PCR扩增程序如表4所示。
表4富集反应PCR扩增程序
4、消化反应
按照“1.7μL消化反应液+0.3μL SAP酶”的比例分别配置16人份的消化反应体系，混匀离心后按照每孔2μL的体积加入上述反应结束后的八连管中，小心盖上管盖，快速离心后按照表5的PCR程序进行消化反应。
表5消化反应PCR扩增程序
5、延伸反应
按照“3μL延伸反应液+0.04μL UEP酶”的比例分别配置16人份的延伸反应体系，混匀离心后按照每孔3μL的体积加入上述反应结束后的八连管中，小心盖上管盖，快速离心后按照表6的PCR程序进行延伸反应。
表6延伸反应PCR扩增程序
6、上机检测与结果判读
反应结束后取出八连管，向每个反应孔中依次加入40μL无核酸酶水并转移至96孔板中，注意避免产生气泡；将96孔板转移至DR MassARRAY全自动化系统上，进行上机检测分析；运行结束后，查看生成的质谱峰图。
表7检测位点信息
| 菌种名称 | 学名 | 分析项目 | 引物分子量 | 延伸碱基 | 产物分子量 |
| 根霉属 | Rhizopus sp. | Rhi | 8321.4 | A | 8592.6 |
| 毛霉属 | Mucor sp. | Muc | 6746.4 | A | 7017.6 |
| 横梗霉属 | Lichtheimia sp. | Lic | 6800.4 | G | 7087.6 |
| 根毛霉属 | Rhizomucor sp. | RhMu | 7739 | A | 8010.2 |
| 小克银汉霉 | Cunninghamella sp. | Cun | 5523.6 | C | 5770.8 |
| 鳞质霉属 | Apophysomyces sp. | Apo | 5840.8 | A | 6112 |
| 瓶霉属 | Saksenaea sp. | Sak | 6066 | G | 6353.2 |
| 共头霉属 | Syncephalastrum sp. | Syn | 7347.8 | G | 7635 |
| 科克霉属 | Cokeromyces sp. | Cok | 7249.8 | T | 7576.9 |
| 内参基因 | HPRT1 | HPRT1 | 6438.2 | C | 6685.4 |
当内参单碱基延伸引物(HPRT1-M1)存在延伸产物峰且转化效率大于0.2时，进行下一步结果分析，否则实验结果无效；若某一单碱基延伸引物(内参除外)出现产物峰且转化效率大于0.2，则对应的菌种类型判读为阳性，否则判读为阴性。
7、结果分析
表8为15种毛霉菌样本的核酸质谱检测结果，此次检测结果中，每个样本的内参基因HPRT1-M1均有延伸产物峰且转化率均大于0.2，即所有实验结果有效。检测结果显示，15个样本对应的单碱基延伸引物均有产物峰生成(详见附图1-15)，且转化率均大于0.2，说明本专利所设计的引物组可以精确检测出毛霉菌的9个属，且相互间不存在干扰。
表8核酸质谱检测结果统计
实施例2
1、样本处理
对实施例1中的15个测试样本进行数字PCR检测，确定菌株DNA的拷贝数；依据实验结果，以5ng/μL浓度的293T细胞系DNA样本为背景将测试样本分别稀释至200copies/μL、100copies/μL、50copies/μL、20copies/μL和10copies/μL，用于最低检测线的验证，每个测试样本重复检测三次。
2、扩增反应
按照实施例1中的配方表1-3配置富集反应液、消化反应液和延伸反应液。
按照“3μL的富集反应液+0.2μL的Taq酶”的比例配置富集反应体系，并分别取2μL上述不同浓度梯度的样本加入到富集反应体系中，按照实施例1中表4设置扩增程序，进行富集扩增。
按照“1.7μL的消化反应液+0.3μL的SAP酶”的比例分别配置消化反应体系，分别取2μL加入到富集扩增产物中，按照实施例1中表5设置扩增程序，进行消化反应。
按照“3μL的延伸反应液+0.04μL的UEP酶”的比别配置延伸反应体系，并分别取3μL加入到消化产物中，按照实施例1中表6设置扩增程序，进行单碱基延伸反应。
3、上机检测
依据实施例1中的方法进行上机检测，运行结束后查看生成的质谱峰图，依据表7的检测位点进行结果判读。
4、结果分析
根据质谱峰图计算每个样本不同浓度梯度下的延伸引物产物峰的转化率，结果显示测试样本在大于100copies/μL的浓度下均能精确检测出，且产物峰转化率达到1.0；在50copies/μL和20copies/μL的浓度下也能被检测出，且产物转化率大于0.2；在10copies/μL的浓度下个别测试样本虽有产物峰的生成，但转化率低于0.2，判读为阴性。综上所述，本专利引物组要求的样本浓度的最低检测线为20copies/μL。
表9最低检测限检测结果统计
实施例3
1、样本提取
本实施例收集2例临床阳性样本，为伞枝横梗霉、米根霉感染的石蜡包埋组织样本；3例检测范围外临床结核分枝杆菌、烟曲霉、新型隐球菌感染的石蜡包埋组织样本；考察同一样本不同浓度的检测结果，验证本发明方法的石蜡包埋组织样本加样量。
使用美基的石蜡切片DNA提取试剂盒对石蜡包埋组织样本进行核酸提取。所提取的样本DNA使用紫外分光光度计测定样本纯度，要求OD260/OD280应在1.7-2.1范围内；使用荧光计(染料法)测定样本浓度，要求大于10ng/μL。然后根据样本浓度将每个样本分别稀释至10ng/μL、5ng/μL、2ng/μL、1ng/μL、0.5ng/μL；共25个样本进行本发明方法的检测，每个样本重复检测三次。
2、扩增反应与上机检测
依据实施例1中配方表1-3配置富集反应液、消化反应液和延伸反应液，按照实施例2的扩增方法进行扩增反应与上机检测。
4、结果分析
检测结果显示在0.5ng/μL的条件下，临床阳性样本只检测出了人基因组内参产物峰，没有目标产物峰，检测结果为阴性。表明样本浓度越低，单位体积中存在的伞枝横梗霉阳性拷贝数越低，当阳性拷贝数低于试剂盒检测下限时，就会出现假阴性结果。同时当样本浓度高达10ng/μL的情况下，大量的人基因组背景并不会影响样本的检测结果，3次重复均检测出阳性结果。此外；高浓度的检测范围外分枝杆菌、烟曲霉、新型隐球菌感染的样本检测结果均为阴性，不存在干扰。因此，在使用本发明方法对石蜡包埋组织样本进行检测时，应尽量提高样本的上样浓度，建议浓度为5-10ng/μL。
表10石蜡包埋组织样本检测结果统计
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种基于核酸质谱技术检测毛霉菌用的引物组，其特征在于，所述引物组序列如SEQID NO.1-21所示。
2.一种基于核酸质谱技术检测毛霉菌用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中的引物组。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括反应液和酶制剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述反应液包括：PCR缓冲液、MgCl2、dNTPMix、消化缓冲液、延伸缓冲液和acyNTPMix。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包括100mM(NH4)2SO4、500mMKCl、200mMHEPES；
所述消化缓冲液包括200mMTris-HCl、100mMMgCl2；
所述延伸缓冲液含包括200mMTris-HCl、100mM(NH4)2SO4、100mMKCl、20mMMgSO4、1％TritonX-100；
所述酶制剂包括：Taq酶、SAP酶和UEP酶。
6.一种基于核酸质谱技术检测毛霉菌的样本处理方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1中的引物组对样本DNA进行PCR扩增的步骤。
7.如权利要求6所述的基于核酸质谱技术检测毛霉菌的样本处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)富集扩增：按照“3μL的富集反应液+0.2μL的Taq酶”的比例配置若干人份的富集反应体系，混匀离心后按照每人份3.2μL的体积分装至八连管中，再加入2μL样本DNA，后进行PCR扩增；
所述富集反应液的组分如下：
(2)消化反应：按照“1.7μL的消化反应液(SAPBuffer)+0.3μL的SAP酶”的比例配置若干人份的消化反应体系，取出上一步反应结束的八连管，向每个反应孔中依次加入2μL上述消化反应体系，后进行PCR消化反应；
所述消化反应液的组分如下：
(3)延伸反应：按照“3μL的延伸反应液+0.04μL的UEP酶”的比例配置若干人份的延伸反应体系；取出上一步反应结束的八连管，向每个反应孔中依次加入3μL延伸反应体系，后进行PCR延伸反应；
所述延伸反应液的组分如下：
(4)上机检测：将八连管中的反应产物加入40μL无核酸酶水，混匀后转移至96孔板中，后进行核酸质谱上机实验。
8.如权利要求7所述的基于核酸质谱技术检测毛霉菌的样本处理方法，其特征在于，所述步骤(1)之前还包括样本DNA的提取。
9.如权利要求8所述的基于核酸质谱技术检测毛霉菌的样本处理方法，其特征在于，所述样本包括来自甲醛固定石蜡包埋的样本、新鲜组织样本、痰液样品或细胞样本中的任一种。
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