CN110656037B - 一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法，所述微流控芯片包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有能扩增靶基因特异碱基序列的引物组，所述引物组包含一种病原体的两个或两个以上基因位点、或两个或两个以上病原体的两个或两个以上基因位点检测用引物组，所述引物组的引物与待检测病原体的靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。采用本发明的技术方案，可检出的病原体具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，同时，还有试剂消耗量小，污染小等优点，该实验全程为闭盖式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。

Description

一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法。
背景技术
引起人类感染性疾病的病原微生物有病毒、螺旋体、细菌、真菌、立克次体、衣原体、支原体和寄生菌，以病毒和细菌最为常见。病症包括血流感染、呼吸道感染、细菌性脑膜炎及脑脓肿等。对于感染性疾病，临床常规的血液等生化指标分析仅能通过免疫细胞及球蛋白水平初步判断病因，无法确定病原菌的种属。临床上感染性疾病非典型性和混合感染的趋势逐渐增加，很难通过病原鉴定以外的方法进行诊治。
目前临床上对病原菌鉴定的方法主要是培养法。其主要步骤取样、培养、鉴定。培养法本身存在较多缺陷，不能满足临床需要。首先培养法检测耗时长，培养时间与所感染的细菌种类有关，至少用时2-3天，真菌更长，当临床出现急性病症时，培养法无法适用；其次该方法准确性低，尤其是批量鉴定时，样品之间很容易互相感染；再次受国内实验室安全防护条件的限制，实验室工作人员在分离培养病原菌时存在着高风险被感染的可能；最后培养法对实验条件要求较高，需要的培养基种类较多，乡镇医院、社区医疗单位和户外等均无法使用细菌培养的检测方法，很容易对病人造成贻误。
对于普通PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术鉴定病原微生物的方法，因其检测基因位点单一，而病原菌的基因有多态性和可变异性，在检测准确性方面有一定的弊端。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法，同时检测一种病原体的多个基因或多个病原体的多个基因，检测迅速。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种用于病原体核酸检测的微流控芯片，其包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有能扩增靶基因特异碱基序列的引物组，所述引物组包含一种病原体的两个或两个以上基因位点、或两个或两个以上病原体的两个或两个以上基因位点检测用引物组，所述引物组的引物与待检测病原体的靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。
采用本发明的技术方案，基因位点的检测通过包被固定在芯片反应池中的引物组来实现，本发明的技术方案结合了核酸扩增技术和微流控芯片技术，同时检测一种病原体的多个基因或多个病原体的多个基因，通过病原体的多个基因的检测，从而减小误检，特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速。
作为本发明的进一步改进，所述微流控芯片内设有对照组，所述微流控芯片包括进样孔、反应孔和出气孔。
作为本发明的进一步改进，所述对照组包括扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。引物探针与目标检测病原体无关的DNA片段模板同时固定在芯片反应池内，可以质控扩增反应体系。提取对照固定的引物探针可扩增样本中与目标检测病原体无关的DNA片段模板可质控样本提取质量。
作为本发明的进一步改进，所述病原体为细菌、真菌、病毒、支原体或衣原体等任何病原微生物。
作为本发明的进一步改进，所述病原体为烟曲霉，所述烟曲霉的基因位点包括cytb基因位点、ITS基因位点、beta-tubulin基因位点；所述引物组包括cytb基因位点引物组、ITS基因位点引物组、beta-tubulin基因位点引物组；
所述cytb基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.1~5的引物，所述ITS基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.6~10的引物，所述beta-tubulin基因位点的引物组包括如SEQ IDNO.11~15的引物。
作为本发明的进一步改进，所述病原体为肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌，所述肺炎克雷伯菌的基因位点包括ubiF基因位点、miaB基因位点、ybeY基因位点，所述阴沟肠杆菌的基因位点包括dnaA基因位点、nepI基因位点、11dD基因位点；
所述引物组包括ubiF基因位点引物组、miaB基因位点引物组、ybeY基因位点引物组、
dnaA基因位点引物组、nepI基因位点引物组、11dD基因位点引物组；
所述ubiF基因位点引物组包括如SEQ ID NO.17所示的正向引物、如SEQ ID NO.18所示的反向引物、如SEQ ID NO.19所示的探针；
所述miaB基因位点引物组包括如SEQ ID NO.20所示的正向引物、如SEQ ID NO.21所示的反向引物、如SEQ ID NO.22所示的探针；
所述ybeY基因位点引物组包括如SEQ ID NO.23所示的正向引物、如SEQ ID NO.24所示的反向引物、如SEQ ID NO.25所示的探针；
所述dnaA基因位点引物组包括如SEQ ID NO.26所示的正向引物、如SEQ ID NO.27所示的反向引物、如SEQ ID NO.28所示的探针；
所述nepI基因位点引物组包括如SEQ ID NO.29所示的正向引物、如SEQ ID NO.30所示的反向引物、如SEQ ID NO.31所示的探针；
所述11dD基因位点引物组包括如SEQ ID NO.32所示的正向引物、如SEQ ID NO.33所示的反向引物、如SEQ ID NO.34所示的探针。
本发明还公开了一种用于病原体核酸检测的检测方法，包括以下步骤：
步骤S1，样本处理和模板提取，得到待检模板；
步骤S2，将引物组中的单引物进行溶解、稀释并混合得到混合后的引物组，将混合后的引物组固定在微流控芯片的芯片反应池内；
步骤S3，将扩增对照DNA和引物混合之后，固定在芯片反应池内；
步骤S4，核酸扩增，取扩增反应液，加入待检模板；
步骤S5，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入微流控芯片内，将微流控芯片放入核酸扩增分析仪中进行扩增。
步骤S6，在核酸扩增分析仪下进行核酸扩增反应产物的检测。根据显色反应，与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线为阴性。
其中，扩增包括恒温扩增和变温扩增。
采用次技术方案，通过针对上述一种病原体的多个基因位点或多个病原体的多个基因位点设计引物，并利用核酸扩增技术，以微流控芯片为载体，进行扩增，并根据显色反应进行结果判读，方法简单，检验快速。
作为本发明的进一步改进，所述样本包括咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹、血液、脑脊液、尿液、脓液、人体组织。
作为本发明的进一步改进，所述模板提取为在芯片外进行手动提取或将样本直接注入微流控芯片进行自动提取。
作为本发明的进一步改进，所述手动提取包括：取待检菌液和灭活的提取质控菌加入离心管中，离心后，弃上清，加入清洗液清洗一次，再次离心后，弃上清，在离心管中加入提取液混匀后加至装有玻璃珠的离心管中进行震荡，然后再恒温金属浴100℃加热5min，离心，取上清做待检模板。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，通过使用包含一种病原体的多个基因位点或多种病原体的多个基因位点设计的引物组，以及固定有上述引物组微流控芯片的检测方法对样本中一种病原体的多个基因位点或多种病原体的多个基因位点进行检测。本发明提供的微流控芯片可检出的病原体具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，同时，还有试剂消耗量小，污染小等优点，该实验全程为闭盖式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。
附图说明
图1 为本发明的微流控芯片的排布示意图。
图2为本发明实施例1中烟曲霉部分基因突变的样本1进行检测的结果图，结果显示ITS基因阳性。
图3为本发明实施例1对烟曲霉部分基因突变的样本2进行检测的结果图，结果显示ITS基因和cytb基因阳性。
图4为本发明实施例1对烟曲霉样本3进行检测的结果图，结果显示3个基因位点阳性。
图5为本发明实施例2对肺炎克雷伯菌部分基因突变的样本1进行检测的结果图，结果显示ubif基因阳性。
图6为本发明实施例2对肺炎克雷伯菌部分基因突变的样本2进行检测的结果图，结果显示 miaB基因和ybeY基因阳性。
图7为本发明实施例2对肺炎克雷伯菌正常样本进行检测的结果图，结果显示3个不同的基因位点均为阳性。
图8为本发明实施例2对阴沟肠杆菌部分基因突变的样本1进行检测的结果图，结果显示dnaA基因阳性。
图9为本发明实施例2对阴沟肠杆菌部分基因突变的样本2进行检测的结果图，结果显示11dD基因和dnaA基因阳性。
图10为本发明实施例2对阴沟肠杆菌正常样本进行检测的结果图，结果显示3个不同的基因位点均为阳性。
图11为本发明实施例2对肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌混合样本进行检测的结果图，结果显示各基因位点均为阳性。
上述附图2~图11中，图中横坐标单位是分钟（min），纵坐标没有单位，“+”表示相应指标检出，“-”表示相应指标未检出。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
以烟曲霉cytb基因、ITS基因、beta-tubulin基因位点检测过程通过基因芯片来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。
1、引物制备
通过筛选出烟曲霉cytb基因、ITS基因、beta-tubulin基因片段设计出核酸扩增引物并合成，得到如下的引物：
烟曲霉cytb基因引物组
序列编号1
正向外引物 F3 GAAGCATTTAATTCAGTAGAACAT
序列编号2
反向外引物 B3 GACCATAAGGTAAAACATAACCT
序列编号3
正向内引FIP CACTAAAAAGAAGAAAGCTGAAGCTCGTAAATAATGGTTGATTAGTTCG
序列编号4
反向内引物 BIP AATCACCTAGAACATTAACATGAGCAAGAAAGCTGTAGCCATCA
序列编号5
反向环引物 LB TATTGGTACAATAATTCTTATTGTT
烟曲霉ITS基因引物组
序列编号6
正向外引物 F3 CCCGTCCCCCTCTCC
序列编号7
反向外引物 B3 TTAAGTTCAGCGGGTATCC
序列编号8
正向内引物 FIP ACGCTCGAGGACCGGACGACGGGCCCGAAAGGC
序列编号9
反向内引物 BIP GCTTTGTCACCTGCTCTGTAGGTACCTGATCCGAGGTCAACC
序列编号10
反向环引物 LB GCCAGCCGACACCCAACTTTATTT
烟曲霉beta-tubulin基因引物组
序列编号11
正向外引物 F3 TTCGCTCCTCTGACCAGC
序列编号12
反向外引物 B3 ATTGAAACCTTACCACGGCT
序列编号13
正向内引物 FIP GCCATCATGTTCTTGGGGTCGACGGTGCTCACTCTTTCCG
序列编号14
反向内引物 BIP CCGACTTCCGCAATGGACGTTAGAGATCGTGCATAATGGCC
序列编号15
正向环引物 LF CTCAGGAACGGAGACAGCA
序列编号16
反向环引物 LB CCATTTTGTATGTTACTACACCTGC
2、微流控芯片制备
微流控芯片的结构如图1所示，芯片反应池包被固定有由烟曲霉cytb基因、烟曲霉ITS基因、烟曲霉beta-tubulin基因、扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。
烟曲霉cytb基因，分别取24μL内引物FIP/BIP（SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4），3μL外引物F3/B（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）, 10μL环引物LB（SEQ ID NO.5）三对引物混合（不足6个引物的用超纯水替代），取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
烟曲霉ITS基因，分别取24μL内引物FIP/BIP（SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9），3μL外引物F3/B（SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7）, 10μL环引物LB（SEQ ID NO.10）三对引物混合（不足6个引物的用超纯水替代），取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
烟曲霉beta-tubulin基因，分别取24μL内引物FIP/BIP（SEQ ID NO.13和SEQ IDNO.14），3μL外引物F3/B（SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12）, 10μL环引物LF/LB（SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16）三对引物混合，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
提取对照，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B, 10μL环引物LF/LB三对引物混合（不足6个引物的用超纯水替代），取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
扩增对照，取0.3μL混合引物和0.2μL扩增对照DNA及超纯水0.5μL混合，点在相应位置，自然晾干。
3、样品处理和模板提取，以痰液样本为例；取1mL待检菌液和50μL灭活的提取质控菌加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL清洗液清洗一次，12000rpm离心2min后，弃上清，在离心管中加入200ul提取液充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。
4、核酸扩增
取扩增反应液55μL，加入15μL待检模板，充分混匀后注入芯片。
在温度为65℃的核酸扩增分析仪上反应50min。
5、扩增产物的检测
与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪设备上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线判定为阴性。
实验结果为：
图2为采用上述微流控芯片和方法对烟曲霉部分基因突变的样本1进行检测的结果，结果显示ITS基因阳性；图3为采用上述微流控芯片和方法对烟曲霉部分基因突变的样本2进行检测的结果，结果显示ITS基因和cytb基因阳性；图4为采用上述微流控芯片和方法对烟曲霉样本3进行检测的结果，结果显示3个基因位点阳性。通过对比分析，上述结果符合实际。
实施例2
以肺炎克雷伯菌ubiF基因、miaB基因、ybeY基因和阴沟肠杆菌dnaA基因、nepI基因、11dD基因位点检测过程通过基因芯片来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。
1、引物制备
通过筛选出肺炎克雷伯菌ubiF基因、miaB基因、ybeY基因和阴沟肠杆菌dnaA基因、nepI基因、11dD基因片段设计出核酸扩增引物并合成，得到如下的引物：
肺炎克雷伯菌ubiF基因
序列编号17
正向引物 F GTGACTGGCGATCTCCTGCT
序列编号18
反向引物 R AGTTTACTCCCAGCGGCCCA
序列编号19
探针 P CATGGTCATGCTCTGCAGCTGACGGA
肺炎克雷伯菌miaB基因
序列编号20
正向引物 F TGCGCGGCAACCGCAGTCC
序列编号21
反向引物 R GGACGGCTAACTTCTTCTCC
序列编号22
探针 P AGCCGCGCGCCGAAGGGCCGACCGC
肺炎克雷伯菌ybeY基因
序列编号23
正向引物 F CGTTGCAGAAAGCCATGAGC
序列编号24
反向引物 R ATGCGCCCAGTGCGCCTCCA
序列编号25
探针 P CCGTTTGAAGCGCCGCCGGGAATTG
阴沟肠杆菌dnaA基因
序列编号26
正向引物 F CCTCTATGGCGGCACGGGTCTG
序列编号27
反向引物 R CTTTACCATGTCCTGAACGA
序列编号28
探针 P CGGTGGGTAACGGCATTATGGCGCGC
阴沟肠杆菌nepI基因
序列编号29
正向引物 F GTCTGGGGCTGGGGTTGGGCGGT
序列编号30
反向引物 R CCAGCCGATGATTCCCCCAAGG
序列编号31
探针 P CAGTCTCCATCGCGCTGGTGATTGC
阴沟肠杆菌11dD基因
序列编号32
正向引物 F ATCCCTTTGATCACCATTGG
序列编号33
反向引物 R GCCTACCGGGCTGGAAGATT
序列编号34
探针 P CCAGGTCTTTCCAGGAGATGGACG
2、基因芯片制备
微流控芯片的结构如图1所示，芯片反应池包被固定有由肺炎克雷伯菌ubiF基因、miaB基因、ybeY基因和阴沟肠杆菌dnaA基因、nepI基因、11dD基因、扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。
肺炎克雷伯菌ubiF基因，分别取20μL正向引物F（序列为SEQ ID NO.17）， 20 μL反向引物R（序列为SEQ ID NO.18）和15μL探针P（序列为SEQ ID NO.19）混合，取0.55μL混合引物和0.45μL超纯水混合，点在相应位置，自然晾干。
肺炎克雷伯菌miaB基因，分别取20μL正向引物F（序列为SEQ ID NO.20）， 20 μL反向引物R（序列为SEQ ID NO.21）和15μL探针P（序列为SEQ ID NO.22）混合，取0.55μL混合引物和0.45μL超纯水混合，点在相应位置，自然晾干。
肺炎克雷伯菌ybeY基因，分别取20μL正向引物F（序列为SEQ ID NO.23）， 20 μL反向引物R（序列为SEQ ID NO.24）和15μL探针P（序列为SEQ ID NO.25）混合，取0.55μL混合引物和0.45μL超纯水混合，点在相应位置，自然晾干。
阴沟肠杆菌dnaA基因，分别取20μL正向引物F（序列为SEQ ID NO.26），20μL反向引物R（序列为SEQ ID NO.27）和15μL探针P（序列为SEQ ID NO.28）混合，取0.55μL混合引物和0.45μL超纯水混合，点在相应位置，自然晾干。
阴沟肠杆菌nepI基因，分别取20μL正向引物F（序列为SEQ ID NO.29），20μL反向引物R（序列为SEQ ID NO.30）和15μL探针P（序列为SEQ ID NO.31）混合，取0.55μL混合引物和0.45μL超纯水混合，点在相应位置，自然晾干。
阴沟肠杆菌11dD基因，分别取20μL正向引物F（序列为SEQ ID NO.32），20μL反向引物R（序列为SEQ ID NO.33）和15μL探针P（序列为SEQ ID NO.34）混合，取0.55μL混合引物和0.45μL超纯水混合，点在相应位置，自然晾干。
提取对照，分别取20μL正向引物F， 20μL反向引物R和15μL探针P混合，取0.55μL混合引物和0.45μL超纯水混合，点在相应位置，自然晾干。
扩增对照，分别取20μL正向引物F， 20μL反向引物R和15μL探针P混合，取0.55μL混合引物和0.45μL扩增对照DNA混合，点在相应位置，自然晾干。
3、样品处理和模板提取，以痰液样本为例；取1mL待检菌液和50μL灭活的提取质控菌加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL清洗液清洗一次，12000rpm离心2min后，弃上清，在离心管中加入200ul提取液充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。
4、核酸扩增
取扩增反应液63μL，加入7μL待检模板，充分混匀后注入芯片。
在核酸扩增仪上进行反应：95℃，2min；95℃，30s，60℃，30s，40cycles。
5、扩增产物的检测
与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪设备上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线判定为阴性。
6、扩增产物的检测
与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪设备上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线判定为阴性。
检测结果为：
图5为采用上述微流控芯片和检测方法对肺炎克雷伯菌部分基因突变的样本1进行检测的结果图，结果显示ubif基因阳性；图6为采用上述微流控芯片和检测方法对肺炎克雷伯菌部分基因突变的样本2进行检测， 结果显示miaB基因和ybeY基因阳性；图7为采用上述微流控芯片和检测方法对肺炎克雷伯菌正常样本进行检测，结果显示3个不同的基因位点均为阳性；图8为采用上述微流控芯片和检测方法对阴沟肠杆菌部分基因突变的样本1进行检测，结果显示dnaA基因阳性；图9为采用上述微流控芯片和检测方法对阴沟肠杆菌部分基因突变的样本2进行检测，结果显示11dD基因和dnaA基因阳性；图10为采用上述微流控芯片和检测方法对阴沟肠杆菌正常样本进行检测，结果显示3个不同的基因位点均为阳性；图11为采用上述微流控芯片和检测方法对肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌混合样本进行检测，结果显示各基因位点均为阳性。上述结果与实际相符。
通过上述结果可知，本发明提供的检测方法可在同一张芯片内，同时检测一种病原体的多个基因或多种病原体的多个基因，当该病原体某一基因发生突变时，则该位点检测结果为阴性；但是只要该病原体有一个基因位点被检出，则说明该病原体为阳性，因此提高了检测的灵敏度和特异性。另外，还可解决病原体的现场快速检测的难题，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携带等诸多优点。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京百康芯生物科技有限公司;百康芯（天津）生物科技有限公司
<120> 一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaagcattta attcagtaga acat 24
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaccataagg taaaacataa cct 23
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cactaaaaag aagaaagctg aagctcgtaa ataatggttg attagttcg 49
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatcacctag aacattaaca tgagcaagaa agctgtagcc atca 44
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tattggtaca ataattctta ttgtt 25
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cccgtccccc tctcc 15
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttaagttcag cgggtatcc 19
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgctcgagg accggacgac gggcccgaaa ggc 33
<210> 9
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctttgtcac ctgctctgta ggtacctgat ccgaggtcaa cc 42
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gccagccgac acccaacttt attt 24
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttcgctcctc tgaccagc 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
attgaaacct taccacggct 20
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gccatcatgt tcttggggtc gacggtgctc actctttccg 40
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgacttccg caatggacgt tagagatcgt gcataatggc c 41
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ctcaggaacg gagacagca 19
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ccattttgta tgttactaca cctgc 25
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtgactggcg atctcctgct 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
agtttactcc cagcggccca 20
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
catggtcatg ctctgcagct gacgga 26
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgcgcggcaa ccgcagtcc 19
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggacggctaa cttcttctcc 20
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agccgcgcgc cgaagggccg accgc 25
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgttgcagaa agccatgagc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
atgcgcccag tgcgcctcca 20
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ccgtttgaag cgccgccggg aattg 25
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cctctatggc ggcacgggtc tg 22
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctttaccatg tcctgaacga 20
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cggtgggtaa cggcattatg gcgcgc 26
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtctggggct ggggttgggc ggt 23
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccagccgatg attcccccaa gg 22
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cagtctccat cgcgctggtg attgc 25
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
atccctttga tcaccattgg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gcctaccggg ctggaagatt 20
<210> 34
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccaggtcttt ccaggagatg gacg 24

Claims (3)

1.一种用于病原体核酸检测的微流控芯片，其特征在于：其包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有能扩增靶基因特异碱基序列的引物组，所述引物组包含两个病原体的两个以上基因位点检测用引物组，所述引物组的引物与待检测病原体的靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补；
所述病原体为肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌，所述肺炎克雷伯菌的基因位点包括ubiF基因位点、miaB基因位点、ybeY基因位点，所述阴沟肠杆菌的基因位点包括dnaA基因位点、nepI基因位点、11dD基因位点；
所述引物组包括ubiF基因位点引物组、miaB基因位点引物组、ybeY基因位点引物组、
dnaA基因位点引物组、nepI基因位点引物组、11dD基因位点引物组；
所述ubiF基因位点引物组包括如SEQ ID NO.17所示的正向引物、如SEQ ID NO.18所示的反向引物、如SEQ ID NO.19所示的探针；
所述miaB基因位点引物组包括如SEQ ID NO.20所示的正向引物、如SEQ ID NO.21所示的反向引物、如SEQ ID NO.22所示的探针；
所述ybeY基因位点引物组包括如SEQ ID NO.23所示的正向引物、如SEQ ID NO.24所示的反向引物、如SEQ ID NO.25所示的探针；
所述dnaA基因位点引物组包括如SEQ ID NO.26所示的正向引物、如SEQ ID NO.27所示的反向引物、如SEQ ID NO.28所示的探针；
所述nepI基因位点引物组包括如SEQ ID NO.29所示的正向引物、如SEQ ID NO.30所示的反向引物、如SEQ ID NO.31所示的探针；
所述11dD基因位点引物组包括如SEQ ID NO.32所示的正向引物、如SEQ ID NO.33所示的反向引物、如SEQ ID NO.34所示的探针。
2.根据权利要求1所述的用于病原体核酸检测的微流控芯片，其特征在于：所述微流控芯片内设有对照组，所述微流控芯片包括进样孔、反应孔和出气孔。
3.根据权利要求2所述的用于病原体核酸检测的微流控芯片，其特征在于：所述对照组包括扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。
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