CN101880729A - 微流控高通量致病性真菌检测方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及建立一套检测致病性真菌的有无和/或真菌菌种的PCR微流控芯片检测体系，其包括(1)菌株基因组DNA抽提；(2)设计特异性引物，对基因组DNA进行特异性扩增；(3)使用随机引物进一步对真菌基因组DNA进行PCR扩增；(4)运用微流控芯片检测技术对PCR产物进行快速检测鉴定。可用于医院对念珠菌、曲霉、隐球菌等医院内深部真菌的早期诊断，降低器官移植、肿瘤化疗等免疫低下人群病死率。
Description
技术领域
本发明属于真菌检测技术领域，具体涉及检测和/或鉴定一个或多个样品中致病性真菌的有无和/或菌种种类的方法及其试剂盒。
背景技术
目前，医院内的新发和突发致病性真菌感染已成为21世纪全球面临的重大挑战，发病率和死亡率均呈显著上升趋势。在美国，死亡率最高的感染性疾病中，致病性真菌病名列第7位；在败血症最常见病因中，真菌名列第4位。据不完全统计资料显示，在我国医院内致病性真菌感染也已成为免疫低下患者的一个主要杀手，特别是近年来由于艾滋病、严重器官移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂的使用等因素，念珠菌、曲霉、隐球菌等医院内致病性真菌感染的发生率和死亡率呈明显上升趋势，严重影响器官移植、肿瘤等重大疾病的治疗成功率。国内外大量临床资料均显示，早期诊断和及时治疗是降低病死率最为有效的措施，然而目前对医院内深部以及潜在的周边环境中的真菌的鉴定与检测研究却严重滞后，普遍使用的真菌“培养法”尽管准确，但是耗时往往需要一周以上，期间需要占用大量培养空间，迫切需要一种快速、高效、准确而且成本较低的鉴定与检测方法。
当前聚合酶链式反应(PCR)和核酸杂交技术已经运用到了真菌的鉴定与检测之中，但是很不完善，无法达到快速、高效、准确而且成本较低的综合效果。例如，符美华等(中国真菌学杂志.2009，4(1)：8)中为了检测白念珠菌，使用引物对(GACTCCTTGGTCCGTGTT和GAAATTGTTGAAAGGGA)以及白念珠菌特异引物对进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。但是该技术局限于白念珠菌这一特定真菌菌种，对其他真菌需要设计其他特异性引物，而且缺乏与其他潜在感染的菌种的比对，难以判断是否能区分出其他种类的致病性真菌，导致无法因病施治；
路西林等(疑难病杂志.2009，8(2)：80)设计了引物对ATTCCTCGTTGAAGAGC和ACTCAACACGGGGAAACT，用于真菌的鉴定与检测，尽管通用性较强，避免了针对不同真菌设计不同引物的麻烦，但是结果准确性不够高，尤其是出现了比例较大的假阴性结果(通常假阳性结果会在随后的鉴定和检测中被排除，但是假阴性结果往往导致鉴定和检测的终止，危害尤其大)，而且也无法区分出其他种类的致病性真菌，导致无法因病施治；
王莉等(中国真菌学杂志.2009，4(5)：261)采用引物对GTG AAA TTG TTGAAA GGG AA和GAC TCC TTG GTC CGT GTT对真菌DNA进行PCR扩增，并利用曲霉属中各菌种的特异性探针进行杂交检测，该技术虽然能够区分不同种的真菌，但是需要专门设计不同的探针，而且在需要扩大鉴定范围的时候，需要更新检测探针，且难以进行高通量筛选；
与以上文献相似，朱利平等(中华皮肤科杂志.2002，35(5)：340)采用引物对GCATCGATGAAGAACGCAGC和TCCTCCGCTTATTGATATGC对真菌DNA进行PCR扩增，并利用分别针对白念珠菌和都柏林念珠菌的特异性探针进行杂交检测；黄媛等(中华微生物学和免疫学杂志.2001，21(3)：345)采用引物对GTGAAATTGT TGAAAGGGAA和GACTCCTTGG TCCGTGTT对真菌DNA进行PCR扩增，并利用分别针对不同种真菌的特异性探针进行杂交检测，这些技术也像上文一样无法避免设计探针的步骤，难以高通量化使用。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供如下的解决方案：
一种鉴定和/或检测致病性真菌的有无和/或真菌种类的方法：在第一步中，优化了真菌通用引物对以及PCR扩增条件，有效排除掉非真菌类生物体的核酸，能够准确地概括发现大量不同属的真菌以供第二步深入鉴定，并且该检测步骤能以成本低且方便操作与观察的方式进行；在第二步中，采用随机引物进行统一的PCR扩增，并用易于实现高通量检测的微流控芯片技术进行检测。
本发明还进一步提供上述方法所使用的试剂盒。
更加具体的，本发明提供如下的技术方案：
一种鉴定和/或检测一种或几种样品中致病性真菌的有无和/或真菌种类的方法，包括如下步骤：
(1)提取样品中菌株的DNA；
(2)用真菌通用引物对对上述DNA进行PCR扩增，所述的通用引物对为：
NL-1：5’-GCATATCGGTAAGCGGA GGAAAAG-3’(SEQ ID NO：1)
NL-4：5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’(SEQ ID NO：2)
保留大小介于500～700bp的扩增产物所对应的样品；
(3)用一条随机引物，对步骤(2)所保留的样品DNA进行PCR扩增并通过微流控芯片检测扩增产物，根据微流控芯片检测图谱所示的谱带与标准致病性真菌图谱比对来分别确定致病性真菌的有无和/或真菌种类；所述的随机引物为：
M13：5’-gag ggt ggc ggt tct-3’(SEQ ID NO：3)或
(GACA)4：5’-gac aga cag aca gac a-3’(SEQ ID NO：4)。
其中步骤(1)提取DNA的方法优选是通过磁珠提取。
其中步骤(2)的PCR扩增的优选条件为：95℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环为94℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸1min，末次循环于72℃延伸7min，4℃下保存。
其中步骤(3)的PCR扩增的优选条件为：94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环为94℃变性20s、50℃退火1min、72℃延伸20s，末次循环于72℃延伸6min，4℃下保存。
其中步骤(2)的扩增产物优选通过电泳检测或是采用微流控芯片技术检测，更优选是通过琼脂糖凝胶电泳检测，进一步优选是通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。
一种获得致病性真菌标准微流控芯片检测图谱的方法，包括如下步骤：
(1)提取标准真菌的DNA；
(2)用真菌通用引物对对上述DNA进行PCR扩增，所述的通用引物对为：
NL-1：5’-GCATATCGGTAAGCGGA GGAAAAG-3’(SEQ ID NO：1)
NL-4：5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’(SEQ ID NO：2)
保留大小介于500～700bp的扩增产物所对应的DNA样品；
(3)用一条随机引物，对步骤(2)所保留的样品DNA进行PCR扩增并通过微流控芯片检测扩增产物，获得真菌标准微流控芯片检测图谱；所述的随机引物为：
M13：5’-gag ggt ggc ggt tct-3’(SEQ ID NO：3)或
(GACA)4：5’-gac aga cag aca gac a-3’(SEQ ID NO：4)。
其中步骤(1)提取DNA的方法优选是通过磁珠提取。
其中步骤(2)的PCR扩增的优选条件为：95℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环为94℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸1min，末次循环于72℃延伸7min，4℃下保存。
其中步骤(3)的PCR扩增的优选条件为：94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环为94℃变性20s、50℃退火1min、72℃延伸20s，末次循环于72℃延伸6min，4℃下保存。
其中步骤(2)的扩增产物优选通过电泳检测或是采用微流控芯片技术检测，更优选是通过琼脂糖凝胶电泳检测，进一步优选是通过2％琼脂糖凝胶电泳检测。
上述致病性真菌优选为深部真菌，优选来自于脑脊液。
上述致病性真菌优选为白念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、皱落念珠菌(Candida rugosa)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、季也蒙念珠菌(Candida guilliermo)、黑曲霉(Aspergillus niger)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus thom)、红酵母(Rhodotorula)、马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)中的一种或多种。
上述致病性真菌更优选的是白念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candidaparapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei)、季也蒙念珠菌(Candidaguilliermo)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、皱落念珠菌(Candida rugosa)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、红酵母(Rhodotorula)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、土曲霉(Aspergillus terreus thom)、马尔尼菲青霉(Penicilliummarneffei)中的一种或多种。
上述致病性真菌进一步优选的是马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)。
本发明还提供了用于上述方法的试剂盒，其包含：
(1)通用引物对：
NL-1：5’-GCATATCGGTAAGCGGA GGAAAAG-3’(SEQ ID NO：1)
NL-4：5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’(SEQ ID NO：2)
(2)随机引物：
M13：5’-gag ggt ggc ggt tct-3’(SEQ ID NO：3)和/或
(GACA)4：5’-gac aga cag aca gac a-3’(SEQ ID NO：4)
本发明还进一步提供了上述试剂盒的用途，用于致病性真菌的鉴定和/或检测，或者用于获得致病性真菌标准微流控芯片检测图谱。
本发明的有益效果包括：
1、本发明将通用引物和随机引物相结合，采用两步法，避免了直接使用成本较高的微流控芯片，尤其是避免将成本较高的微流控芯片浪费在可能的非真菌类生物体的核酸样品上；由于各种引物固定不变，因此在处理样品数量多的时候，可以减少交叉污染的机会，准确率高，而且可以使用简单的样品、试剂转移设备，节约成本，易于实现高通量的自动化检测；另外，由于各种引物以及操作条件固定不变，因此可以实现软件升级，而不必随着检测产物的增加而更改该方法所用试剂盒的化学实体和该方法的执行条件，大大方便用户的使用和升级，并易于实现自动化。
2、在现有技术中，也有利用真菌通用引物对真菌进行鉴定(Ashok Srinivasan etal.Cutaneous Infection Caused by Macrophomina phaseolina in a Childwith AcuteMyeloid Leukemia，JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，June 2009，p.1969-1972)。与现有技术相比，本发明优化了通用引物，优化的引物通用性强、准确率高，能够有效检测出十几种不同的真菌，特别是深部真菌，对来自于脑脊液的致病性真菌有更好的效果，特别是白念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、皱落念珠菌、都柏林念珠菌、季也蒙念珠菌、黑曲霉、烟曲霉、构巢曲霉、土曲霉、红酵母、马尔尼菲青霉等。并且阳性结果不易受革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和人体细胞的干扰，由此不会让无需深入进行真菌检测和/或鉴定的样品进入成本较高的第二步检测，节约了成本。
3、第一步检测成本低、操作简便且统一，而且其中所需设备为大量基层医院和科研机构所配备，即使不配备第二步检测所需设备的基层医疗人员可以根据不同检测精度的要求选择决定是否转送进行第二步检测。因此，不会造成结果浪费，适于我国的国情，容易推广。
4、两步检测的引物、试剂和设备确定性强，不需大量更换，实施较快速，而且易于实现自动化和高通量的检测，仅通过软件升级方式即可改进，可以降低使用成本。
5、高通量检测不但能够大大减少分摊到每一样品上的检测和鉴定的平均时间，还可以有效将成本分摊到大量样品上，客观上节约了成本。
6、本发明还对通用引物和随机引物的扩增条件做了进一步的优化，使得扩增产物量大，更易用于产物分离和检测。
附图说明
图1、图2、图3：常见致病性真菌通用引物PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图。
M：marker；0：阴性对照；1：白念珠菌；2：近平滑念珠菌；3：克柔念珠菌；4：热带念珠菌；5：皱落念珠菌；6：都柏林念珠菌；7：季也蒙念珠菌；8：黑曲霉；9：烟曲霉；10：构巢曲霉；11：土曲霉；12：红酵母；13：马尔尼菲青霉
图4：常见致病性真菌通用引物PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果图。
M：marker；0：阴性对照；1：白念珠菌；2：大肠埃希菌(Escherichia coli)；3：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；4：肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumonia)；5：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)；6：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；7：粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)；8：肺炎双球菌(Pneumococcus)；9：人血白细胞
图5：常见致病性真菌通用引物PCR扩增产物微流控芯片检测结果图。
L：Ladder；1：白念珠菌；2：近平滑念珠菌；3：克柔念珠菌；4：热带念珠菌；5：阴性对照；6：都柏林念珠菌；7：黑曲霉；8：构巢曲霉；9：土曲霉；10：红酵母；11：马尔尼菲青霉；12：阴性对照
图6、图7、图8、图9：各种酵母类真菌随机引物M13的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
M：marker；1：白念珠菌；2：近平滑念珠菌；3：克柔念珠菌；4：近平滑念珠菌；5：季也蒙念珠菌；6：红酵母；7：都柏林念珠菌；8：都柏林念珠菌；9：热带念珠菌；10：皱落念珠菌
图10：各种酵母类真菌随机引物M13的PCR扩增产物微流控芯片检测图谱。
L：Ladder；1：白念珠菌；2：近平滑念珠菌；3：克柔念珠菌；4：近平滑念珠菌；5：季也蒙念珠菌；6：热带念珠菌；7：皱落念珠菌；8：都柏林念珠菌；9：红酵母；10：烟曲霉；11：土曲霉；12：马尔尼菲青霉
图11：各种曲霉属真菌随机引物M13的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
M：marker；1：黑曲霉；2：黑曲霉；3：土曲霉；4：土曲霉；5：杂色曲霉(Aspergillusversicolor)；6：亮白曲霉(Aspergillus candidus)
图12：各种曲霉属真菌随机引物M13的PCR扩增产物微流控芯片检测图谱。
L：Ladder；1：烟曲霉；2：土曲霉
图13：其他致病性真菌随机引物M13的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
M：marker；1：镰刀菌(Fusarium)；2：马尔尼菲青霉；3：尖端塞多孢子菌(Scedosporiumapiospermum)
图14：其他致病性真菌随机引物M13的PCR扩增产物微流控芯片检测图谱。
L：Ladder；1：马尔尼菲青霉
图15：对照组随机引物M13的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱。
M：Marker；0：阴性对照；1：白念珠菌；2：大肠埃希菌；3：肺炎克雷伯杆菌；4：鲍曼不动杆菌；5：肠球菌；6：肺炎双球菌；7：人血白细胞
图16：对照组随机引物M13的PCR扩增产物微流控芯片检测图谱。
L：Ladder；1：白念珠菌；2：近平滑念珠菌；3：都柏林念珠菌；4：大肠埃希菌；5：鲍曼不动杆菌；6：铜绿假单胞菌；7：肺炎克雷伯杆菌；8：金黄色葡萄球菌；9：肠球菌；10：肺炎双球菌；11：人血白细胞；12：阴性对照
图17、图18、图19、图20：各种酵母类真菌随机引物(GACA)4的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱
M：marker；1：白念珠菌；2：近平滑念珠菌；3：克柔念珠菌；4：近平滑念珠菌；5：季也蒙念珠菌；6：红酵母；7：都柏林念珠菌；8：都柏林念珠菌；9：热带念珠菌；10：皱落念珠菌
图21：各种酵母类真菌随机引物(GACA)4的PCR扩增产物微流控芯片检测图谱
L：Ladder；1：近平滑念珠菌；2：克柔念珠菌；3：近平滑念珠菌；4：季也蒙念珠菌；5：热带念珠菌；6：皱落念珠菌；7：都柏林念珠菌；8：红酵母
图22：各种曲霉属真菌随机引物(GACA)4的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱
M：marker；1：黑曲霉；2：黑曲霉；3：土曲霉；4：土曲霉；5：杂色曲霉；6：亮白曲霉
图23：各种曲霉属真菌随机引物(GACA)4的PCR扩增产物微控流芯片检测图谱
L：Ladder；1：土曲霉
图24：其他致病性真菌随机引物(GACA)4的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图谱
M：marker；1：镰刀菌；2：马尔尼菲青霉；3：尖端赛多孢菌
图25：其他致病性真菌随机引物(GACA)4的PCR扩增产物微流控芯片检测图谱
L：Ladder；1：马尔尼菲青霉
图26：对照组随机引物(GACA)4的PCR扩增产物微流控芯片检测结果
L：Ladder；1：人血白细胞；2：金黄色葡萄球菌；3：肺炎链球菌；4：痢疾杆菌；5：大肠杆菌；6：变形杆菌；7：绿脓杆菌；8：淋病奈瑟氏菌；9：霍乱弧菌；10：枯草杆菌；11：空白对照；12：阳性对照
具体实施方式
以下将通过具体的实施例来描述本发明。如未特别指明，则根据本领域技术人员所熟悉的《分子克隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。
实施例一
DNA制备
试剂盒：QIAGEN QIAamp DNAMini Kit(购自德国QIAGEN公司)自备试剂：山梨醇缓冲液(1mmol/L山梨醇，100mmol/L EDTA，14mmol/L β-巯基乙醇，溶于水；其中β-巯基乙醇可即用即配)、溶细胞酶(购自天根生化科技有限公司，10U/ul)。
试验步骤：
(1)准备水浴箱，温度：30℃(破壁)，56℃(裂解)，70℃(纯化)。
(2)样品与溶细胞酶放置于室温解冻，至完全溶解。
(3)分别取150μl下述菌株培养液，以7500rpm条件离心15min。
来自ATCC(美国标准生物品收藏中心，布达佩斯条约下保藏机构)标准菌株(均可购自ATCC)：白念珠菌(保藏号，ATCC90028)1株、近平滑念珠菌(保藏号：ATCC22019)1株、克柔念珠菌(保藏号：ATCC6258)1株；
自备菌株(均来自复旦大学附属华山医院，各1株)：热带念珠菌、皱落念珠菌、都柏林念珠菌、季也蒙念珠菌、黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、杂色曲霉、亮白曲霉、烟曲霉、马尔尼菲青霉、红酵母、尖端赛多孢菌。
对照组：革兰阳性菌(肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、肺炎双球菌、枯草杆菌)、革兰阴性菌(霍乱弧菌、淋病奈瑟氏菌、绿脓杆菌、变形杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌)、人血白细胞、空白对照(阴性对照)(双蒸水)
(4)移除上清液，加入600μl山梨醇缓冲液，混匀，加入200U溶细胞酶(10U/μl×20μl)，混匀。
(5)水浴：30℃，30min。
(6)离心：7500rpm，5min。
(7)根据QIAGEN QIAamp DNA Mini Kit的厂商说明书分别提取各菌株DNA，稀释至20ng/ml，保存于-20℃，用于下述实施例。
实施例二
致病性真菌菌株通用引物(rRNA D1/D2区)PCR扩增
PCR仪器：GeneAmp PCR system 9700(美国ABI公司)
PCR扩增试剂盒(SK702，购自上海生工生物工程公司)
引物(浓度均为5μmol/L)：
NL-15’-GCATATCGGTAAGCGGA GGAAAAG-3’(SEQ ID NO：1)
NL-45’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’(SEQ ID NO：2)
25μl PCR体系：
NL-1：0.5μl
NL-4：0.5μl
2×PCR Master mix：12.5μl
样品DNA模板：4μl
H2O补足25μl
扩增条件：预变性：95℃，5min
保存：4℃
采用琼脂糖凝胶电泳和微流控芯片技术对PCR产物进行分离检测，验证通用引物的有效性。
微流控芯片技术是以微流控技术为基础，既具备毛细管电泳的基本功能，同时又具备高通量和大规模集成的芯片特点，已作为一个技术平台广泛应用于核酸、蛋白质的分析以及高通量药物筛选的研究。该方法操作相对简便、快捷，样品分离和量化检测，均在一张芯片上完成，每个芯片可自动分析12个样品，仅30分钟，大大缩短了电泳时间。当样品注入样品孔的微管中运行时，样品组分通过电泳被分离，各组分通过自身荧光被检测并被转变为胶样影像(条带)和层析谱(峰)。由于内置的试剂和标准化的试验流程，该芯片仪能自动识别PCR产物的每一个DNA片段，准确给出各产物的大小及摩尔浓度。其层析谱能相互比较，直观、清晰，并可数字化直接显示各条带大小，更具较好的可比性。因此，更适用于临床标本的定量检测。此外，每一样品用量仅需1μl，芯片还可重复使用，成本较低，且无需照相、手动数据分析，以及避免了溴乙锭染色的污染。因此，更适合用于快速、大量样本检测。
实验结果：
1.常见致病性真菌通用引物PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图1、图2、图3、图4)
琼脂糖凝胶电泳结果表明，本发明的NL-1和NL-4引物的PCR扩增对真菌的通用性好，能够顺利检测出各种真菌(尽管无法区分种类)，在500～700bp处都有单一的条带；而且对于阴性空白对照以及革兰阳性菌、革兰阴性菌、人血白细胞，琼脂糖电泳图中的500～700kb处没有条带，对常见致病性真菌有高的特异性。
2.常见致病性真菌通用引物PCR扩增产物微流控芯片检测结果(见图5)：
微流控芯片检测结果表明，高成本和高灵敏度的微流控芯片检测也可以检测NL-1和NL-4引物的PCR扩增产物，而且还可以区分某些特定真菌菌种种类(如，克柔念珠菌和黑曲霉)，但出于成本等因素考虑，优选使用琼脂糖电泳检测NL-1和NL-4引物的PCR扩增产物。
实施例三
微流控芯片分子指纹图谱分析
1、随机引物PCR扩增
PCR仪器：GeneAmp PCR system 9700(美国ABI公司)
PCR扩增试剂盒(TaKaRa Taq Hot Start Version(DR007A))：10×PCR Buffer含有100mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，500mmol/L KCl，15mmol/LMgCl2。dNTP浓度为2.5mmol/L。
醋酸镁溶液，浓度3mmol/L。
引物(浓度：30ng/μl)：M13：5’-gag ggt ggc ggt tct-3’(SEQ ID NO：3)
(GACA)4：5’-gac aga cag aca gac a-3’(SEQ ID NO：4)
50μl PCR体系：
10×PCR Buffer：5μl
dNTP：0.2mmol/L
醋酸镁：3mmol/L
引物M13或(GACA)4：30ng
Taq酶：2.5U
DNA模板：25ng
H2O：补齐至50μl
扩增条件：预变性：94℃，5min
保存：4℃
2、微流控芯片分析
应用微流DNA芯片分析仪(Agilent 2100Bioanalyzer，安捷伦科技公司)，按照7500LabChip试剂盒(购自上海浩源生物技术有限公司)操作程序进行：
(1)染色胶制备：吸取25μl DNA 7500荧光染料，加入DNA 7500胶中，充分混匀后加到离心过滤柱上，6000rpm离心20～30min，离心半径84mm。
(2)加样：在两个标有“G”孔样品孔中分别加入9μl制备好的染色胶，在右下角的孔中加入4μl染色胶；在芯片左侧3排12个样品孔中加入5μl DNA 7500定量标记；在芯片右下角的孔中加入2μl DNA 7500定位标记；取1μl PCR扩增产物加入样品孔中。
(3)检测：把加样完成的芯片放到振荡器上，2200～2300g条件下振荡1min。将芯片放在微流DNA芯片分析仪上进行结果分析，通过计算机软件得出PCR扩增产物大小及摩尔浓度。
实验结果：
一、随机引物M13PCR扩增
1.各种酵母类真菌PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图6、图7、图8、图9)，微流控芯片检测结果(见图10)
结果表明，仅仅使用琼脂糖电泳检测随机引物的PCR扩增产物，无法有效检测诸如都柏林念珠菌等的特征条带，而用微流控芯片检测，可以有效区分不同的真菌菌种。
2.各种曲霉属真菌PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图11)，微流控芯片检测结果(见图12)
上述各种真菌检测的结果表明，虽然使用琼脂糖电泳能检测随机引物的PCR扩增产物，但对一些得率不高的扩增条带无法有效检测，而用微流控芯片检测，可以有效显示各种扩增条带，并能由此区分不同的真菌菌种。
3.其他致病性真菌(尖端塞多孢子菌、镰刀菌、马尔尼菲青霉菌等)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图13)，微流控芯片检测结果(见图14)
上述各种真菌检测的结果表明，虽然使用琼脂糖电泳能检测随机引物的PCR扩增产物，但对一些得率不高的扩增条带无法有效检测，而用微流控芯片检测，可以有效显示各种扩增条带，并能由此区分不同的真菌菌种。
4.对照组(革兰阳性菌、革兰阴性菌、人血白细胞、空白对照)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图15)，微流控芯片检测结果(见图16)
对各种革兰阳性和阴性菌的对照组检测结果表明，采用随机引物M13检测，无论是凝胶电泳法还是微流控芯片法，均为阴性，因此能区分真菌和细菌，从而确保其特异性。
二、随机引物(GACA)4PCR扩增
1.各种酵母类真菌PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图17、图18、图19、图20)，微流控芯片检测结果(见图21)
上述各种真菌检测的结果表明，微流控芯片法较凝胶电泳法在技术操作、检测效果及后续分析方面，都有着很大的优越性。此外，同时采用随机引物(GACA)4平行检测，能起到一个双鉴定的作用，从而能充分保证鉴定的可靠性，尤其是对于一些极其相似的菌种，结合两种方法来判读结果，其特异性将会大大提高。
2.各种曲霉属真菌PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图22)，微流控芯片检测结果(见图23)
上述各种真菌检测的结果表明，微流控芯片法较凝胶电泳法在技术操作、检测效果及后续分析方面，都有着很大的优越性。此外，同时采用随机引物(GACA)4平行检测，能起到一个双鉴定的作用，从而能充分保证鉴定的可靠性，尤其是对于一些极其相似的菌种，结合两种方法来判读结果，其特异性将会大大提高。
3.其他致病性真菌(尖端赛多孢菌、镰刀菌、马尔尼菲青霉等)PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果(见图24)，微流控芯片检测结果(见图25)
上述各种真菌检测的结果也表明，微流控芯片法较凝胶电泳法在技术操作、检测效果及后续分析方面，都有着很大的优越性。此外，同时采用随机引物(GACA)4平行检测，能起到一个双鉴定的作用，从而能充分保证鉴定的可靠性，尤其是对于一些极其相似的菌种，结合两种方法来判读结果，其特异性将会大大提高。
4.对照组(革兰阳性菌、革兰阴性菌、人血白细胞、空白对照)PCR扩增产物微流控芯片检测结果(见图26)
对各种革兰阳性和阴性菌的对照组检测结果表明，采用随机引物(GACA)4检测，无论是凝胶电泳法还是微流控芯片法，均为阴性，因此能区分真菌和细菌，从而确保其特异性。
此外，微流控芯片法还避免了凝胶电泳法的诸多弊端，如凝胶电泳法需要长达7个小时电泳，才能有效分辨各个扩增条带，耗时长，而微流控芯片法仅需15分钟就可获得阳性结果；凝胶电泳法对电泳的技术要求高，且重复性差；又因扩增条带产量大小不一，凝胶电泳法对于低扩增产量的条带易被忽视，或完全不显示。而微流控芯片法由于可以通过计算机系统数字化显示各种扩增条带，并且可以将每次的结果存储，对不同时间所测结果也可以对比，这是凝胶电泳法所做不到的。
Claims (12)
1.一种鉴定和/或检测一种或几种样品中致病性真菌的有无和/或真菌种类的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取样品中菌株的DNA；
(2)用真菌通用引物对对上述DNA进行PCR扩增，所述的通用引物对为：
NL-1：5’-GCATATCGGTAAGCGGA GGAAAAG-3’
NL-4：5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’
保留大小介于500～700bp的扩增产物所对应的样品；
(3)用一条随机引物，对步骤(2)所保留的样品DNA进行PCR扩增并通过微流控芯片检测扩增产物，根据微流控芯片检测图谱所示的谱带与标准致病性真菌图谱比对来分别确定致病性真菌的有无和/或真菌种类；所述的随机引物为：
M13：5’-gag ggt ggc ggt tct-3’或
(GACA)4：5’-gac aga cag aca gac a-3’。
2.一种获得致病性真菌标准微流控芯片检测图谱的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取标准真菌的DNA；
(2)用真菌通用引物对对上述DNA进行PCR扩增，所述的通用引物对为：
NL-1：5’-GCATATCGGTAAGCGGA GGAAAAG-3’
NL-4：5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’
保留大小介于500～700bp的扩增产物所对应的DNA样品；
(3)用一条随机引物，对步骤(2)所保留的样品DNA进行PCR扩增并通过微流控芯片检测扩增产物，获得真菌标准微流控芯片检测图谱；所述的随机引物为：
M13：5’-gag ggt ggc ggt tct-3’或
(GACA)4：5’-gac aga cag aca gac a-3’。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述步骤(2)的PCR扩增条件为：95℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环为94℃变性30s、61℃退火30s、72℃延伸1min，末次循环于72℃延伸7min，4℃下保存。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述步骤(3)的PCR扩增条件为：94℃预变性5min，然后进行35个循环，每个循环为94℃变性20s、50℃退火1min、72℃延伸20s，末次循环于72℃延伸6min，4℃下保存。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述步骤(2)的扩增产物通过电泳检测或是采用微流控芯片技术检测。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述步骤(2)的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述致病性真菌为深部真菌。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述致病性真菌为白念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、皱落念珠菌(Candida rugosa)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、季也蒙念珠菌(Candida guilliermo)、黑曲霉(Aspergillusniger)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillusterreus thom)、红酵母(Rhodotorula)、马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)中的一种或多种。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述致病性真菌是白念珠菌(Candida albicans)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、克柔念珠菌(Candida krusei)、季也蒙念珠菌(Candida guilliermo)、热带念珠菌(Candidatropicalis)、皱落念珠菌(Candida rugosa)、都柏林念珠菌(Candida dubliniensis)、红酵母(Rhodotorula)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、土曲霉(Aspergillus terreus thom)、马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)中的一种或多种。
10.如权利要求4所述的方法，其特征在于：
所述致病性真菌是马尔尼菲青霉(Penicillium marneffei)。
11.一种用于权利要求1-10任一所述方法的试剂盒，其特征在于其包含：
(1)通用引物对：
NL-1：5’-GCATATCGGTAAGCGGA GGAAAAG-3’
NL-4：5’-GGTCCGTGT TTCAAGACGG-3’
(2)随机引物：
M13：5’-gag ggt ggc ggttct-3’和/或
(GACA)4：5’-gac aga cag aca gac a-3’。
12.权利要求11所述试剂盒的用途，其特征在于用于致病性真菌的鉴定和/或检测，或者用于获得致病性真菌标准微流控芯片检测图谱。
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