CN115232866A - 一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法 - Google Patents

一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法 Download PDF

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Abstract

本发明专利公开了一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其方法包括如下步骤：提取临床样本中的总基因组、总基因组末端去磷酸化封闭、通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列、选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴、并连接测序接头、根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种；本发明专利使用了稳定16S rRNA的V2‑V3保守基因进行靶向富集，以V2‑V3为测序起点，检测获得16S rRNA两端基因覆盖率更高，检测范围更广，分类结果更可信，本发明特异性靶向细菌16S rRNA基因建库，有效避免了宿主基因组的干扰，降低背景宿主的人源比例，提高病原体检测灵敏度和检出效率，缩短检测时间，提高纳米孔检测效率。

Description

一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法
技术领域
本发明专利涉及微生物检测技术领域，具体为一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法。
背景技术
16S rDNA主要编码细菌核糖体16S rRNA，全长约1500bp，因其部分片段在进化过程中的保守性而作为细菌进化的生物钟，亦有“细菌化石”之称，16S rDNA的序列中包含9个可变区和11个保守区，通过检测高变区序列来识别细菌是目前测序的主要手段，而可变区序列则因种属而异，且变异程度与细菌的系统发生位置(分类学上的种、属、科等)密切相关，因此，使用16SrRNA基因序列分析，可快速对细菌进行鉴定分类，纳米孔测序基于其读取长和结果快速输出的特点已逐渐应用在临床检测领域，目前也有商品化的16SrRNA基因建库试剂盒用于纳米孔测序。
然而，读取16S rRNA全长基因序列并不能完全确认细菌的种属，因此需要获取16SrRNA基因延伸的序列提高细菌检测鉴别的准确性，除此以外，通过检测16S rRNA基因延伸序列还能检测细菌的耐药基因，为临床用药提供更全面的用药指导建议。
因此，需要开发一种基于纳米孔测序平台检测细菌病原体的新方法。
发明专利内容
本发明专利的目的在于提供一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，为实现上述目的，本发明专利提供如下技术方案：一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其制备方法包括如下步骤：
S1，提取临床样本中的总基因组；
S2，总基因组末端去磷酸化封闭；
S3，通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列；
S4，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，并连接测序接头；
S5，根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种。
优选的，所述总基因组末端去磷酸化封闭的方法，包括根据末端去磷酸化反应体系，将磷酸酶混合液加入总基因组中，振荡混匀瞬时离心，放入设定末端去磷酸化程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品基因组。
优选的，所述临床样本包括但不限于痰液、尿液、伤口分泌物、阴道分泌物等。
优选的，所述通用sgRNA靶向酶切方法包括根据CRISPR/Cas9酶和sgRNA形成复合物反应体系，将CRISPR/Cas9酶、通用sgRNA和10X rCutsmart缓冲液按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好RNP程序的PCR基因扩增仪中运行程序。
优选的，所述通用sgRNA靶向酶切方法包括根据酶切反应体系，将RNP和样品基因组按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的酶切程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品A。
优选的，所述选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴的方法中，包括：所述样品基因组两端去磷酸化被封闭无法连接dATP而选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，根据添加A黏性末端尾巴反应体系，将所述样品A、dATP、Taq酶按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的添加A黏性末端尾巴程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品B。
优选的，所述连接测序接头的方法中，包括：根据连接测序接头反应体系，将所述样品B、AMX、快速T4连接酶、LNB、无酶水按体系震荡混匀，瞬时离心，室温孵育。
优选的，所述测序数据与基因数据库进行序列对比，依据比对结果获得检测样品中病原细菌微生物信息。
优选的，所述细菌通用sgRNA为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、玫瑰单胞菌、人型葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、淋病奈瑟球菌。
与现有技术相比，本发明专利的有益效果如下：
1、本发明专利使用了稳定16S rRNA的V2-V3保守基因进行靶向富集，以V2-V3为测序起点，检测获得16S rRNA两端基因覆盖率更高，检测范围更广，分类结果更可信；
2、本发明特异性靶向细菌16S rRNA基因建库，有效避免了宿主基因组的干扰，降低背景宿主的人源比例，提高病原体检测灵敏度和检出效率，缩短检测时间，提高纳米孔检测效率；
3、本发明所述方法对病原细菌微生物的鉴定具有无需培养、鉴定覆盖病原细菌微生物范围广、检测速度快、灵敏度高、准确率高等优势，能够一次快速地从样品种检测病原细菌微生物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的实验流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明专利中的实施例，对本发明专利实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明专利一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明专利中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明专利保护的范围。
一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其制备方法包括如下步骤：
S1，提取临床样本中的总基因组；
S2，总基因组末端去磷酸化封闭；
S3，通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列；
S4，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，并连接测序接头；
S5，根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种。
具体的，总基因组末端去磷酸化封闭的方法，包括根据末端去磷酸化反应体系，将磷酸酶混合液加入总基因组中，振荡混匀瞬时离心，放入设定末端去磷酸化程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品基因组。
具体的，临床样本包括但不限于痰液、尿液、伤口分泌物、阴道分泌物等。
具体的，通用sgRNA靶向酶切方法包括根据CRISPR/Cas9酶和sgRNA形成复合物反应体系，将CRISPR/Cas9酶、通用sgRNA和10X rCutsmart缓冲液按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好RNP程序的PCR基因扩增仪中运行程序。
具体的，通用sgRNA靶向酶切方法包括根据酶切反应体系，将RNP和样品基因组按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的酶切程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品A。
具体的，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴的方法中，包括：样品基因组两端去磷酸化被封闭无法连接dATP而选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，根据添加A黏性末端尾巴反应体系，将样品A、dATP、Taq酶按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的添加A黏性末端尾巴程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品B。
具体的，连接测序接头的方法中，包括：根据连接测序接头反应体系，将样品B、AMX、快速T4连接酶、LNB、无酶水按体系震荡混匀，瞬时离心，室温孵育。
具体的，测序数据与基因数据库进行序列对比，依据比对结果获得检测样品中病原细菌微生物信息。
具体的，细菌通用sgRNA为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、玫瑰单胞菌、人型葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、淋病奈瑟球菌。
实施例一：
一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其制备方法包括如下步骤：
S1，提取临床样本中的总基因组；
S2，总基因组末端去磷酸化封闭；
S3，通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列；
S4，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，并连接测序接头；
S5，根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种。
该实施例中：步骤一，临床样品收集：收集由医院或社区诊所提供的细菌感染临床样品，包括但不限于(痰液、尿液、伤口分泌物、阴道分泌物等)；步骤二，基因组提取：使用高质量基因组提取试剂盒(NEB,#T3050)和溶菌酶提取样品中的总DNA；步骤三，DNA片段末端去磷酸化：将DNA片段进行5’端去磷酸化；末端去磷酸化的目的是阻止在后续步骤中3’端末尾加上腺嘌呤尾巴，从而避免连接测序接头，以此达到去宿主基因组效果；步骤四，CRISPR/Cas9靶向酶切16S rRNA基因组V2-V3区域：通用sgRNA与CRISPR/Cas9酶切共孵育后靶向酶切细菌基因组中16S rRNA基因组V2-V3区域；步骤五，酶切端口修复：将被酶切的端口进行修复和向加上腺嘌呤尾巴；酶切端口修补的目的是将不完全的酶切端口修复完整，以便后续连接测序接头；步骤六，特定接头连接：将步骤五中修复产物连接上测序接头，接头主要是为了测序，接头上含有马达蛋白和与待测片段互补结合的胸腺嘧啶末端，通过目的片段连接进行测序；步骤七，上机测序：将样品加载至测序芯片(Oxford Nanopore，#Flow Cell(R9.4.1))，启动测序仪(Oxford Nanopore，#MinION)和ONT MinKNOW测序软件；步骤八，数据分析：基于Guppy软件生成的fastq序列，与数据库比对鉴定样品中含有的细菌病原体。
实施例二：
提取样品中的DNA
1.1本发明采用NEB的
Figure BDA0003786500790000061
高分子量DNA提取试剂盒(细胞和血液)和50mg/ml的溶菌酶溶液对临床样品进行提取总DNA。
具体操作步骤：
a.将临床样品收集与生理盐水或PBS缓冲液中，震荡混匀，12,000g/2min，去上清；
b.加入180ul Nuclei Prep Solution(105ul Nuclei Prep Buffer，5ul RNaseA，70ul溶菌酶溶液(50mg/ml))震荡重悬沉淀，转移至2ml离心管中，37℃处理30min以上；
c.加入180ul Nuclei Lysis Solution(167ul Nuclei Lysis Buffer，13ulProteinase K)，上下颠倒混匀，70℃/300rpm孵育10min；
d.快速离心，加入90ul Precipitation Enhancer，上下颠倒混匀，室温孵育10min；
e.加入2颗DNA Capture Beads；
f.加入330ul异丙醇，10rpm/4min；
g.小心吸走上清；
h.加入500ul gDNA Wash Buffer，上下颠倒2-3次；
i.小心吸走上清；
j.重复h-i步骤；
k.将DNA Capture Beads倒入用2ml离心管装载的Monarch Collection TubeⅡ中；
l.简短离心(≤1秒)，弃置2ml废液收集管；
m.将DNA Capture Beads倒入2ml离心管中，加入≤30ul Elution BufferⅡ或无酶水，56℃/300rpm孵育5min，保留Monarch Collection TubeⅡ；
n.将DNA Capture Beads用1.5ml离心管装载的Monarch Collection TubeⅡ(上一步保留)中；
m-n中的样品12,000g离心30秒，上清合并于同一离心管中。
实施例三：
文库构建
2.1本发明采用NEB的rSAP酶对样品进行末端去磷酸化处理。
a.反应体系如下
Figure BDA0003786500790000071
b.65℃/5min使rSAP灭活。
2.2本发明采用北京科昕CRISPR/Cas9酶和金斯瑞合成sgRNA对样品进行酶切处理。
a.CRISPR/Cas9和sgRNA形成RNP复合物反应体系如下
Figure BDA0003786500790000072
Figure BDA0003786500790000081
b.RNP复合物酶切反应体系如下
Figure BDA0003786500790000082
c.80℃/20min使CRISPR/Cas9酶失活。
2.3本发明采用NEB的Taq酶对样品进行添加A黏性末端尾巴。
a.添加A黏性末端尾巴反应体系如下
Figure BDA0003786500790000083
2.4本发明采用ONT的LSK-109试剂盒和NEB的快速T4连接酶连接测序接头。
a.添加测序接头反应体系如下
Figure BDA0003786500790000084
2.5本发明采用贝克曼的AMPure磁珠和ONT的LSK-109试剂盒进行样品纯化。
a.取2.4步骤样品，加入80ul TE(pH＝8.0)，上下颠倒混匀；
b.加入160ul AMPure磁珠，上下颠倒混匀，室温孵育10min；
c.将样品置于磁铁架上，等待5min；
d.吸走上清，加入250ul LFB洗涤磁珠；
e.重复c-d步骤；
f.加入15ul EB重悬磁珠，室温孵育5min；
g.将样品置于磁铁架上，小心吸取上清至新离心管中。
实施例四：
上机测序
3.1本发明采用ONT的LSK-109试剂盒和R9.4.1芯片按照标纳米孔测序上机流程上机测序。
a.将已经通过质检的芯片，放置室温平衡；
b.将30ul FLT加到FB中，震荡混合备用；
c.将Priming Port打开，小体积吸取出去气泡；
d.将800ul b步骤溶液缓慢打入芯片中，不要将全部打进去，剩余少量于枪头中，以免引入气泡，室温静置5min；
e.配置文库稀释液。
文库稀释液体系如下表
组分 体积
SQB 34ul
LB 25.5ul
步骤(二)文库 ≤15.5ul
无酶水 补足75ul
f.打开“Spot ON”端口，将200ul b步骤溶液缓慢加至priming port中，注意不要全部打进去，以免引入气泡；
g.通过Spot ON样品口以逐滴方式将75ul文库稀释液滴加至芯片中；
h.将priming port和Spot ON阀门复位。
3.2本发明应用ONT软件Minknow进行测序。
a.运行Minkonw开始测序。
3.3本发明应用Guppy软件对下机数据进行分析。
a.将下机数据导入至Guppy，执行分析包。
尽管已经示出和描述了本发明专利的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明专利的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明专利的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：其方法包括如下步骤：
S1，提取临床样本中的总基因组；
S2，总基因组末端去磷酸化封闭；
S3，通用sgRNA靶向酶切病原细菌微生物16S rRNA基因组保守序列；
S4，选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，并连接测序接头；
S5，根据测序数据与基因数据库进行序列对比，得到待鉴定细菌的菌种。
2.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述总基因组末端去磷酸化封闭的方法，包括根据末端去磷酸化反应体系，将磷酸酶混合液加入总基因组中，振荡混匀瞬时离心，放入设定末端去磷酸化程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品基因组。
3.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述临床样本包括但不限于痰液、尿液、伤口分泌物、阴道分泌物等。
4.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述通用sgRNA靶向酶切方法包括根据CRISPR/Cas9酶和sgRNA形成复合物反应体系，将CRISPR/Cas9酶、通用sgRNA和10X rCutsmart缓冲液按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好RNP程序的PCR基因扩增仪中运行程序。
5.根据权利要求2所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述通用sgRNA靶向酶切方法包括根据酶切反应体系，将RNP和样品基因组按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的酶切程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品A。
6.根据权利要求5所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴的方法中，包括：所述样品基因组两端去磷酸化被封闭无法连接dATP而选择性在酶切位点添加A黏性末端尾巴，根据添加A黏性末端尾巴反应体系，将所述样品A、dATP、Taq酶按体系震荡混匀，瞬时离心，放入已设定好的添加A黏性末端尾巴程序的PCR基因扩增仪中运行程序，得到样品B。
7.根据权利要求6所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述连接测序接头的方法中，包括：根据连接测序接头反应体系，将所述样品B、AMX、快速T4连接酶、LNB、无酶水按体系震荡混匀，瞬时离心，室温孵育。
8.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述测序数据与基因数据库进行序列对比，依据比对结果获得检测样品中病原细菌微生物信息。
9.根据权利要求1所述的一种基于纳米孔测序靶向富集细菌16S rRNA基因的测序方法，其特征在于：所述细菌通用sgRNA为大肠杆菌、铜绿假单胞菌、玫瑰单胞菌、人型葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、淋病奈瑟球菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117551746A (zh) * 2023-12-01 2024-02-13 北京博奥医学检验所有限公司 一种检测目标核酸及其邻近区域核酸序列的方法

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