CN116144812A - 一种分类鉴定子宫内膜微生物的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分类鉴定子宫内膜微生物的方法及试剂盒。本发明提供了一种分类鉴定子宫内膜微生物的方法，该方法包括：采用第三代单分子测序技术进行子宫内膜样本微生物16S rRNA全长测序，从而分类鉴定子宫内膜微生物。本发明以RNA为起始研究材料，联合三代纳米孔测序技术，既可以获得的大量起始微生物RNA，真实反应活菌的微生物组成，又可以利用读长优势精确微生物的种属鉴定，同时为临床鉴定是否存在引起慢性子宫内膜炎的致病菌提供更加精准的技术支撑，便于临床医生综合考虑用药指导。
Description
技术领域
本发明是关于一种三代单分子测序分析领域，涉及到一种应用三代单分子测序技术进行分类鉴定子宫内膜微生物的方法及所用试剂和试剂盒。
背景技术
细菌占据了人体的大部分部位，女性生殖道也不例外。胚胎-母体界面的子宫内膜微生物群在妊娠早期的作用是生殖医学研究的重点，但目前关于子宫内膜微生物群的组成仍未达成一致意见。Moreno等(Moreno I，
FM，Vilella F，et al.Evidence thatthe endometrial microbiota has an effect on implantation success or failure[J].Am J Obstet Gynecol，2016，215：684-703)通过检测育龄妇女和不孕妇女的子宫内膜液菌群组成，且根据子宫内膜液中细菌的特性和相对丰度，将子宫内膜微生物定义为乳酸杆菌为主的微生物群(＞90％乳酸杆菌属)或非乳酸杆菌为主的微生物群(＜90％的乳酸杆菌属和＞10％的其他细菌)，结果提示非乳酸杆菌的数量与妊娠结局显著相关，非乳酸杆菌属数量的增加会降低植入率(60.7％vs23.1％)、妊娠率(70.6％vs33.3％)、持续妊娠率(58.8％vs13.3％)和分娩率(58.8％vs6.7％)。在另一项研究中，Franasiak等(FranasiakJM，Werner MD，Juneau CR，et al.Endometrial microbiome at the time of embryotransfer：next-generation sequencing of the16S ribosomal subunit[J].J AssistReprod Genet，2016，33：129-136)对单胚胎移植患者进行胚胎移植规范操作后，检测其胚胎移植导管顶端5mm处的细菌含量并随访妊娠结局，纳入的33例妇女中18例获得临床妊娠，样本测序结果共有278个不同的细菌种属，结果发现妊娠和未妊娠妇女的菌群主要构成都是乳酸杆菌。然而，由于大多数取样方式是经阴道向子宫，使得宫腔与阴道及子宫颈微生物群的交叉污染难以避免。
子宫内膜微生物群的乳酸菌优势一直是关注的焦点，并被证明与体外受精后的妊娠结局显著相关，进一步发现，在寻求生育治疗的妇女中，这一比例不足。此外，子宫内膜微生物组测序可提高慢性子宫内膜炎引起的反复着床失败患者的诊断准确性。
利用Illumina平台的NGS是迄今为止最广泛采用的细菌群落分析方法之一，测序深度高，原始读取精度好。然而，这种方法最大序列长度约500bp以及较长的文库准备和测序时间。关于子宫内膜微生物群的鉴定技术，目前对细菌16S rRNA基因的一个或多个高可变区(如V3/V4区)进行短读测序是研究细菌组成最常用的方法。它的几个V区用于测序，常常导致分类学分类的模糊性。
整体而言，现有技术通常子宫内膜微生物鉴定的采用的方法是基于NGS测序，目前NGS由于读长短的原因对其分类鉴定只能到属的水平。同时，目前大部分的实验材料都是提取内膜组织的总DNA后进行微生物16SRNA基因的V区扩增，该方案存在两个问题，第一，人源DNA的干扰比较严重，微生物的DNA含量比较低；第二微生物总DNA包含活菌和死菌的总DNA，无法真实反应当前子宫微生物的活菌状态。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种新的分类鉴定子宫内膜微生物的方法。
本发明的另一目的在于提供一种分类鉴定子宫内膜微生物的试剂组合物。
本发明的另一目的在于提供一种分类鉴定子宫内膜微生物的试剂盒。
一方面，本发明提供了一种分类鉴定子宫内膜微生物的方法，该方法包括：
采用第三代单分子测序技术进行子宫内膜样本微生物16S rRNA全长测序，从而分类鉴定子宫内膜微生物。
第三代测序在单分子水平读取核苷酸序列，因此也被称为单分子测序，主要技术路线有HeliScope的tSMS测序技术、Nanopore的纳米孔测序技术和PacBio的SMRT测序技术等等。与传统的第一代和第二代测序技术相比，第三代测序最大的优势是能够产生更长的碱基读长，除此之外，还能直接对RNA进行测序，无需逆转录，测序速度极快，同时其中某些技术所涉及的设备可以小型化，可便携至野外现场测序。纳米孔测序技术具备单分子分辨率，读长长，操作便携等独特优势。在宏基因组测序，病原体测序，新物种基因组测序与表观遗传学测序等多个具体的应用领域中渐渐展示出不可替代的地位。一个主要的例子是牛津纳米孔技术公司的MinIONTM测序仪，能够在没有理论读取长度限制的情况下产生长序列。此外，MinIONTM实时生成测序数据，减少了数据处理的周转时间。
本发明中，以RNA为起始研究材料，联合三代测序技术，既可以获得的大量起始微生物RNA，真实反应活菌的微生物组成，又可以利用读长优势精确微生物的种属鉴定，可达到微生物鉴定到种水平的分类；同时为临床鉴定是否存在引起慢性子宫内膜炎的致病菌提供更加精准的技术支撑，便于临床医生综合考虑用药指导。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法包括：
提取子宫内膜组织样本的总RNA，并进行逆转录与扩增；
对扩增产物进行检测；
构建16S全长扩增产物三代文库，进行测序。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，提取子宫内膜组织样本的总RNA的过程可以采用本领域中任何可行的方法进行，例如可以包括：采用总RNA提取试剂盒对子宫内膜组织样本进行总RNA的提取并定量。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，进行逆转录与扩增的过程包括：
采用针对16S RNA基因全长的反向特异性引物进行逆转录从而可以获得微生物16S全长的cDNA；
采用16S RNA基因全长的特异性引物对逆转录cDNA进行指数式扩增反应。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，所述16S RNA基因全长的反向特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法还包括：对16S RNA基因全长扩增产物的浓度和长度进行测定以验证反转录和指数PCR扩增是否成功，进而进行后续三代文库的构建。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，测定过程包括：
扩增产物纯化与定量：采用Ampure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化，洗脱产物进行Qubit定量；和/或
扩增产物进行凝胶电泳检测：PCR扩增产物纯化后取洗脱产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度分布为1400-1600bp。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，扩增产物纯化与定量采用0.8×(40μL)Ampure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化，洗脱产物取1μl的体积进行Qubit定量。产量为20-500ng。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，扩增产物进行凝胶电泳检测时，PCR扩增产物纯化后取洗脱产物1μl进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，构建16S全长扩增产物三代文库的过程包括：
16S全长PCR扩增产物进行DNA末端修复反应与加A；
进行三代barcode连接反应：对经过末端修复与加A的PCR纯化产物添加barcode，以用于区分不同来源样本；
对barcode连接纯化产物进行三代测序长读长文库的制备。具体文库制备的操作步骤，可根据不同测序平台所推荐的标准操作流程进行。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，进行DNA末端修复反应时，采用NEB的Next Ultra II End repair/dA-tailing Module(NEB；E7546S)试剂盒对100ng的16S全长PCR扩增产物进行末端修复与加A。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，进行三代barcode连接反应时，采用NEB的平末端/TA连接酶预混液(NEB；M0367L)和ONT的无扩增条形码扩展试剂盒(ONT；EXP-NBD114)对上一步经过末端修复与加A的PCR纯化产物添加barcode。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，进行三代barcode连接反应时，采用NEB的Quick Ligation Module(NEB；E6056S)和ONT连接测序试剂盒(ONT；LSK110)对barcode连接纯化产物进行三代带有马达蛋白接头的连接。
根据本发明的具体实施方案，本发明的分类鉴定子宫内膜微生物的方法中，对三代文库进行测序的过程包括：
利用三代测序平台对制备好的待上机三代文库溶液进行测序，获得数据。
具体地，适用的测序平台包括但不限于固态纳米孔测序平台(例如PacBio Sequel测序仪)、蛋白质纳米孔测序平台(例如Oxford Nanopore Technologies MinION测序仪和PromethION测序仪，齐碳科技QNome测序仪)、固态-蛋白质纳米孔复合型测序平台(例如安序源生物科技AXP100测序仪)等。
优选地，按照MINION测序仪的操作要求，取75μl制备好的待上机三代文库溶液，悬滴到R9.4 flow cell(FLO-MIN106；Oxford Nanopore Technologies)上，开启MinIONTMMk1B测序获得数据。优选地，其中，测序时间参数选择2-6hr。
另一方面，本发明还提供了一种用于分类鉴定子宫内膜微生物的试剂组合物，其包括：
用于提取子宫内膜组织样本的总RNA的试剂材料；
用于进行逆转录与扩增的试剂材料；
用于对扩增产物进行检测的试剂材料；以及
用于构建16S全长扩增产物三代文库并进行测序的试剂材料。
另一方面，本发明还提供了一种用于分类鉴定子宫内膜微生物的试剂盒，其包括本发明所述的试剂组合物。
综上所述，本发明提供了一种新的分类鉴定子宫内膜微生物的方法及相关检测试剂盒，本发明以RNA为起始研究材料，联合三代纳米孔测序技术，既可以获得的大量起始微生物RNA，真实反应活菌的微生物组成，又可以利用读长优势精确微生物的种属鉴定；同时为临床鉴定是否存在引起慢性子宫内膜炎的致病菌提供更加精准的技术支撑，便于临床医生综合考虑用药指导。
附图说明
图1显示实施例1中纯菌种微生物的TGS测序下机数据质控信息。
图2显示实施例2中临床样本的TGS测序下机数据质控信息。
图3显示实施例3中NGS数据分类鉴定临床样本的微生物属水平组成比例结果。
图4显示实施例3中临床样本的TGS测序下机数据质控信息。
图5显示实施例3中TGS数据分类鉴定临床样本的微生物种属水平组成比例结果。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例及附图对本发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。实施例中未特别注明的方法操作，按照所属领域现有技术的常规操作或厂商说明书建议的操作进行。
本发明提供了一种分类鉴定子宫内膜微生物的方法，该方法主要包括子宫内膜组织总RNA提取逆转录与扩增、扩增产物检测、16S cDNA全长扩增产物三代文库的构建与测序。
一、子宫内膜组织总RNA提取逆转录与扩增
步骤一：提取子宫内膜样本的总RNA
采用RNA提取试剂盒(美吉，R4012)提取子宫内膜样本的总RNA，操作按照试剂盒说明书进行，主要过程包括：
1.参照RNA提取试剂盒瓶身或说明书上的说明加入相应体积的乙醇。
2.RTL Lysis Buffer中加入1/50的β-ME混合后标记为“RTL Lysis Buffer/β-ME混合液”。
3.用洁净的吸头挑取绿豆大小的子宫内膜组织放入研磨管。加入一定量的组织保存液浸没过组织。
4.将上一步研磨管放入研磨仪中，研磨，工作参数：60HZ，40S。
5.研磨结束后，吸取20μL研磨后的匀浆液到加有350μL RTL Lysis Buffer/β-ME混合液的1.5ml离心管中，涡旋振荡30s，瞬时离心。
6.在上一步1.5ml管中加入等倍体积(350μL)RNABinding Buffer(已加乙醇)，涡旋混匀15秒，瞬时离心。
7.在上一步的液体加入HiPure RNAMini Column I柱子(装在2ml收集管)中，8,000g 30s，10,000g 15s。
8.加入350μL的Buffer RW1 10000g 1min。
9.取50μl Digestion Buffer加入10μl Dnase 1solution，混匀，标记为“DNase1Mix”。
10.将上一步配置好的60μl DNase1 Mix悬空加至RNA吸附柱的吸附膜中央，室温静置20min。
11.加入500μl的Buffer RW1，8,000g 30s。
12.加入500μl的Buffer RW2，8,000g 30s。
13.重复上一步骤1次。
14.13,000×g 3min甩干吸附柱。
15.加入30μl RNase Free Water至吸附膜中央，室温静置1min。
16.13000rpm离心2min。
17.Qubit定量RNA。
步骤二：逆转录获得微生物16S RNA基因全长cDNA
采用针对16s RNA基因全长的特异性反向引物1492R-JB(引物序列SEQ ID NO:1：CGGYTACCTTGTTACGACTT)进行逆转录。具体过程包括：
1.分别按照表1配置反应液：
表1
| 需在冰上配制，反应液1： | 体积 | X |
| RNA(100-250ng/μl) | 1 | μL |
| 10μM 1492R-JB | 0.6 | μL |
| 10mM dNTP | 0.5 | μL |
| NF水 | 10.9 | μL |
| Total | 13 | μL |
2.反应液涡旋混匀后瞬时离心，置于PCR仪上。
3.65℃5min后立即至于冰上至少1min。
4.按照表2配置反应液后混匀：
使用Thermo公司的SuperScript III Reverse Transcriptase(Thermo Fisher；18080085)试剂盒，RNaseOUTTMRecombinant RNase Inhibitor(Thermo Fisher；10777-019)试剂盒进行逆转录反应，具体方法用量参考产品使用说明书。
表2
| 需在冰上配制： | 体积 | X |
| 5X First-Strand Buffer | 4 | μL |
| 0.1M DTT | 1 | μL |
| RNase Inhibitor | 1 | μL |
| SuperScriptTMIII RT | 1 | μL |
| Total | 7 | μL |
5.步骤3的每管分别加入上一步反应液7μl并混匀。
6.PCR仪器上进行如下反应：50℃-15min，55℃-15min。反应得到逆转录产物。
步骤三：指数式扩增反应
1.取2μL步骤二的逆转录产物加入到如表3的PCR反应体系中(此时溶液体积为50μL)。采用的PCR试剂为2×GoldStar Best Master Mix(康为世纪，CW0656M)。
表3
| 50μl反应体系 | 体积 | X |
| 2×GoldStar Best MasterMix | 25 | μL |
| 8F-JB/1492R-JB Primer，10μM each | 4 | μL |
| H2O | 19 | μL |
| 上一步反应产物 | 2 | μL |
| Total | 50 | μL |
表3中，8F-JB引物序列SEQ ID NO:2：AGRGTTYGATYMTGGCTCAG。
2.在PCR仪中扩增，反应条件如表4：
表4
PCR扩增得到扩增产物。
二、扩增产物检测
步骤一：纯化与定量
1)将扩增产物转移至离心管中，取0.8×(40μL)Ampure XP磁珠磁珠，与扩增产物混匀后室温静置10min后置于磁力架上5min；
2)待磁珠全部吸附到管壁上(约5min)，弃上清后用新配制的80％乙醇清洗磁珠两次，弃上清；
3)室温静置5min，待磁珠干燥后(请注意不要过分干燥致使磁珠开裂，以免影响回收效率)，根据下游需要以302uL TE buffer、EB buffer或去核酸水重悬磁珠；
4)室温静置5min后将离心管置于磁力架上，吸取30uL上清，此上清为扩增完毕后纯化的双链cDNA。
5)Qubit定量。
步骤二：凝胶电泳检测
cDNA扩增产物的产量与长度是判断其是否合格扩增的重要指标，采用琼脂糖凝胶电泳对产物长度进行检测。取2μl纯化后的cDNA扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，130V电压，运行30分钟，产物条带长度分布于1400-1600bp之间。
三、16S cDNA全长扩增产物三代文库的构建与测序
使用NEB公司的Next-Oxford Nanopore Technologies连接测序配套试剂(NEB；E7180S)试剂盒进行三代文库的构建，具体方法用量参考产品使用说明书。
步骤一：DNA末端修复反应
1.向200μl PCR管中加入表5所示试剂：
表5
| 试剂名称 | 体积 |
| Ultra II End-prep reaction buffer | 3.5μl |
| Ultra II End-prep enzyme mix | 3μl |
| Amplicon DNA | 48μl |
| Total | 54.5μl |
2.用枪头轻轻吹吸上述溶液，短暂离心，使所有组分收集到管底。
3.将上述PCR管置于PCR仪中，热盖85℃打开，反应程序如表6：
表6
4.产物纯化：使用55μl磁珠纯化(1X磁珠纯化)，回溶于25μL水中，Qubit定量。
步骤二：Barcode连接反应
1.按照如表7所示体积加入试剂，进行三代barcode连接，采用的barcode试剂盒为Nanopore的Native Barcoding Expansion 1-12(EXP-NBD104)。
表7
| 试剂名称 | 体积 |
| 100–200fmol end-prepped DNA | 22.5μl |
| Native Barcode | 2.5μl |
| Blunt/TA Ligase Master Mix | 25μl |
| Total | 50μl |
2.用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。
3.室温孵育10分钟后，使用50μl磁珠纯化(1X磁珠纯化)，回溶于26μL水中，Qubit定量。
4.于新的1.5ml离心管中混合等摩尔量的barcoded样本，确保有足够的样品组合，以产生总100-200fmol的混合样品。
5.取1μl pooling好的样本进行Qubit定量，将100-200fmol的样品稀释到65μl的无核酸酶水中。
步骤三：三代接头连接反应
1.取出EB，Short Fragment Buffer(SFB)置于室温，涡旋混匀后置于冰上。取出Adapter Mix II离心后置于冰上。
2.按照如表8所示体积加入试剂，进行三代接头连接。
表8
| 试剂名称 | 体积 |
| 100–200fmol for pooled barcoded sample | 60μl |
| Adapter Mix II(AMII) | 5μl |
| NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer(5X) | 25μl |
| Quick T4 DNALigase | 10μl |
| Total | 100μl |
3.用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。
4.室温孵育15分钟后，加入50μl磁珠纯化(0.5X磁珠纯化)，室温结合10min后置于磁力架上静置5min；待磁珠全部吸附到管壁上(约5min)，弃上清后用SFB buffer清洗磁珠两次，弃上清；室温晾干30seconds。
5.磁珠重悬于15μLEB中，室温孵育10min后置于磁力架上，待溶液澄清后取1μlQubit定量。回收率为50-100fmol。
步骤四：三代文库的上机测序
三代测序相关试剂：Flow Cell Priming Kit(EXP-FLP002)；Loading Beads(LB)；Sequencing Buffer(SQB)；操作步骤参考Nanopore公司的Native Barcoding Expansion1-12(EXP-NBD104)说明书。参照表9所示进行上机文库溶液的制备。
表9
| 试剂名称 | 体积 |
| Sequencing Buffer(SQB) | 37.5μl |
| Loading Beads(LB),mixed immediately before use | 25.5μl |
| DNAlibrary | 12μl |
| Total | 75μl |
75ul的三代待测文库溶液悬滴到R9.4 flow cell(FLO-MIN106；Oxford NanoporeTechnologies)上，开启MinIONTMMk1B测序获得数据。其中，测序时间参数选择2-6hr。
实施例1：纯菌种微生物掺和样本三代文库构建与测序
1.提取子宫内膜相关的5种微生物(惰性乳杆菌，詹氏乳杆菌，大肠埃希氏菌、粪肠球菌、阴道加德纳菌)的Total RNA。
2.采用1492R-JB引物对RNA进行逆转录并扩增16sRNA基因的全长，具体操作参考上面的实验步骤说明。
3.等质量混合5种微生物PCR扩增纯化产物共100ng进行三代文库构建。具体操作参考上面的实验步骤说明。
4.取20fmol的三代文库进行MinIONTMMk1B测序，数据产出292.57K。
下机数据质控信息见图1。
微生物种水平组成及比例结果如表10：
表10
| Taxonomy | Num |
| Enterococcus faecalis | 0.193955214 |
| Gardnerella vaginalis | 0.208967166 |
| Lactobacillus iners | 0.19976597 |
| Lactobacillus jensenii | 0.219288508 |
| Shigella boydii | 0.174822727 |
| Sphingomonas sp.LK11 | 0.003200416 |
结果表明：采用ONT的纳米孔测序仪MinNON Mk1B对16sRNA基因的16s全长扩增产物测序，可以准确的分析鉴定出5种微生物，且检测到的5种微生物菌种的比例接近1:1:1:1:1，证明了ONT三代长度长测序用于微生物的分类鉴定的可行性。
实施例2：1例临床子宫内膜样本菌种鉴定
该实施例中，提供了1例临床样本同时提取DNA和RNA，DNA用于进行16sRNA基因的V3-V4区扩增，扩增产物用于二代测序文库构建与测序。RNA用于进行16sRNA基因的V1-V9区扩增，扩增产物用于三代测序文库构建与测序。分析比较基于不同的扩增方法和测序平台得到的微生物种类组成与比例。
基于NGS测序鉴定临床样本的微生物组成
二代文库的构建参照文献(Takagi T,Naito Y,Inoue R,Kashiwagi S,UchiyamaK,Mizushima K,et al.Differences in gut microbiota associated with age,sex,andstool consistency in healthy Japanese subjects.J Gastroenterol.2019；54(1):53–63.)；采用Takara的宏基因组文库构建试剂盒(Takara Bio Inc Kusatsu,Japan)进行16S(V3-V4)扩增建库；引物序列为：
341F(SEQ ID NO:3)：5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′；
806R(SEQ ID NO:4)：5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。
第二轮PCR用
XT Index(Illumina,SanDiego,CA,USA)试剂盒对第一轮PCR产物进行index标记。扩增产物上MiSeqTM平台测序。
NGS数据分类鉴定临床样本的微生物属水平组成比例结果如表11：
表11
基于TGS测序鉴定临床样本的微生物组成
1.提取子宫内膜样本的Total RNA。
2.采用1492R-JB引物对Total RNA进行逆转录并扩增16sRNA基因的全长，具体操作参考上面的实验步骤说明。
3.取扩增产物100ng构建三代上机文库，具体操作参考上面的实验步骤说明。
4.取20fmol三代文库进行MinIONTMMk1B测序，数据产出110K.
下机数据质控信息见图2。
样本种属水平组成比例结果见表12：
表12
实验结果表明：首先采用TGS平台，该例临床样本通过我们的基因特异性反转录引物转录和扩增后成功的进行了微生物的种水平和属水平鉴定；其次，对比NGS平台和TGS平台，两种测序结果的优势菌种均为乳酸菌，但占比不同，前者占比为93.6％，后者为50.3％，除了优势菌以外，其余的菌种组成和比例也是不同的。由于TGS的平台，实验测序的是16sRNA基因的全长，可以将微生物的种类区分到种水平，所以准确度更高。
实施例3：1例临床子宫内膜样本菌种鉴定
基于NGS测序鉴定临床样本的微生物组成
具体实验方案参考实施例2。
NGS数据分类鉴定临床样本的微生物属水平组成比例结果见图3。
基于TGS测序鉴定临床样本的微生物组成
具体实验方案参考实施例2。
下机数据质控信息见图4。
TGS数据分类鉴定临床样本的微生物种属水平组成比例结果见图5和表13：
表13
结果表明：对于临床样本的优势菌属鉴定，采用TGS测序的平台与NGS测序平台的方法结果一致，两者的优势菌属均为乳酸杆菌属，前者的比例为89.6％，后者的比例为98.9％，同时由于扩增方法和平台的不同，其余菌属的组成和比例是不同的，基于TGS的平台，实验测序的是16sRNA基因的全长，可以将微生物的种类区分到种水平，所以准确度更高。
Claims (10)
1.一种分类鉴定子宫内膜微生物的方法，该方法包括：
采用第三代单分子测序技术进行子宫内膜样本微生物16S rRNA全长测序，从而分类鉴定子宫内膜微生物。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：
提取子宫内膜组织样本的总RNA，并进行逆转录与扩增；
对扩增产物进行检测；
构建16S全长扩增产物三代文库，进行测序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，提取子宫内膜组织样本的总RNA的过程包括：采用总RNA提取试剂盒对子宫内膜组织样本进行总RNA的提取并定量。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，进行逆转录与扩增的过程包括：
采用针对16S RNA基因全长的反向特异性引物进行逆转录从而可以获得微生物16S全长的cDNA；
采用16S RNA基因全长的特异性引物对逆转录cDNA进行指数式扩增反应。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述16S RNA基因全长的反向特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
6.根据权利要求4所述的方法，该方法还包括：对16S RNA基因全长扩增产物的浓度和长度进行测定以验证反转录和指数PCR扩增是否成功，进而进行后续三代文库的构建；
优选地，测定过程包括：
扩增产物纯化与定量：采用Ampure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化，洗脱产物进行Qubit定量；和/或
扩增产物进行凝胶电泳检测：PCR扩增产物纯化后取洗脱产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，片段长度分布为1400-1600bp。
7.根据权利要求2所述的方法，其中，构建16S全长扩增产物三代文库的过程包括：
16S全长PCR扩增产物进行DNA末端修复反应与加A；
进行三代barcode连接反应：对经过末端修复与加A的PCR纯化产物添加barcode，以用于区分不同来源样本；
对barcode连接纯化产物进行三代测序长读长文库的制备；
具体文库制备的操作步骤，可根据不同测序平台所推荐的标准操作流程进行。
8.根据权利要求2或7所述的方法，其中，对三代文库进行测序的过程包括：
利用三代测序平台对制备好的待上机三代文库溶液进行测序，获得数据；
优选地，适用的测序平台包括固态纳米孔测序平台(例如PacBio Sequel测序仪)、蛋白质纳米孔测序平台(例如Oxford Nanopore Technologies MinION测序仪和PromethION测序仪，齐碳科技QNome测序仪)、固态-蛋白质纳米孔复合型测序平台(例如安序源生物科技AXP100测序仪)；
优选地，其中，测序时间参数选择2-6hr。
9.一种用于分类鉴定子宫内膜微生物的试剂组合物，其包括：
用于提取子宫内膜组织样本的总RNA的试剂材料；
用于进行逆转录与扩增的试剂材料；
用于对扩增产物进行检测的试剂材料；以及
用于构建16S全长扩增产物三代文库并进行测序的试剂材料。
10.一种用于分类鉴定子宫内膜微生物的试剂盒，其包括权利要求9所述的试剂组合物。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20230523 |
|
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