CN110643498A - 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110643498A
CN110643498A CN201910921568.XA CN201910921568A CN110643498A CN 110643498 A CN110643498 A CN 110643498A CN 201910921568 A CN201910921568 A CN 201910921568A CN 110643498 A CN110643498 A CN 110643498A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
primer
candida krusei
gene
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910921568.XA
Other languages
English (en)
Inventor
郑锐
金明兰
张洪涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shengjing Hospital of China Medical University
Original Assignee
Shengjing Hospital of China Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shengjing Hospital of China Medical University filed Critical Shengjing Hospital of China Medical University
Priority to CN201910921568.XA priority Critical patent/CN110643498A/zh
Publication of CN110643498A publication Critical patent/CN110643498A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法，其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有引物组，所述引物组包含克柔念珠菌的至少两个不同基因位点的特异性引物组。本发明提供的检测试剂盒和检测方法可检出的克柔念珠菌具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，同时，还有试剂消耗量小，污染小等优点，该实验全程为闭盖式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。

Description

一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
念珠菌分布广泛，人体内念珠菌多寄生于皮肤、口腔、呼吸道和下尿道等部位，在人体抵抗力下降时，可引起皮肤、粘膜和深部器官的感染。可引起人类疾病的至少有17种念珠菌，其中白色念珠菌引起的感染最常见，但是近年来，随着器官移植，免疫抑制剂、广谱抗生素以及糖皮质激素的应用日益增多，临床常见念珠菌菌谱已经发生了变化，克柔念珠菌等非白念珠菌感染越来越多见。克柔念珠菌是常见的非白色念珠菌，广泛存在于自然界中，尤其多见于奶制品和容易发酵的食物。常见病症包括肺部念珠菌感染，泌尿系念珠菌感染，腹腔念珠菌感染和念珠菌血症等。临床常规的血液等生化指标分析仅能初步判断病因，无法确定病原菌的种属。
目前临床上对病原菌鉴定的方法主要是培养法。其主要步骤取样、培养、鉴定。培养法本身存在较多缺陷，不能满足临床需要。首先培养法检测耗时长，培养时间与所感染的微生物种类有关，至少用时2-3天，真菌更长，当临床出现急性病症时，培养法无法适用；其次该方法准确性低，尤其是批量鉴定时，样品之间很容易交叉污染；再次受国内实验室安全防护条件的限制，实验室工作人员在分离培养病原菌时存在着高风险被感染的可能；最后培养法对实验条件要求较高，需要的培养基种类较多，乡镇医院、社区医疗单位和户外等均无法使用细菌培养的检测方法，很容易对病人造成贻误。对于普通PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶链式反应)技术鉴定病原微生物的方法，因其检测基因位点单一，而病原菌的基因有多态性和可变异性，在检测准确性方面有一定的弊端。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法，同时检测克柔念珠菌的多个基因位点，检测迅速。
对此，本发明采用的技术方案为：
一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒，其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有引物组，所述引物组包含克柔念珠菌的至少两个不同基因位点的特异性引物组。其中，引物组的引物与所述靶基因核苷酸序列的一部分或其互补链互补。
采用本发明的技术方案，基因位点的检测通过包被固定在芯片反应池中的引物组来实现，本发明的技术方案结合了核酸扩增技术和微流控芯片技术，同时检测克柔念珠菌的多个基因位点，特异性好，灵敏度高，操作简单，检测迅速。
作为本发明的进一步改进，所述微流控芯片内设有对照组，所述微流控芯片包括进样孔、反应孔和出气孔。
作为本发明的进一步改进，所述对照组包括扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。所述的扩增对照使用与克柔念珠菌无关的DNA片段为模板扩增、空白对照无引物组、提取对照使用提取质控菌核酸为模板扩增。设置了内对照，可有效质控产品使用的整个过程。
作为本发明的进一步改进，所述克柔念珠菌的至少两个不同基因位点包括cytb基因、ITS基因、ERG11基因中的至少两个。
作为本发明的进一步改进，所述引物组包括cytb基因位点引物组、ITS基因位点引物组、ERG11基因位点引物组；
所述cytb基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.1～5的引物，所述ITS基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.6～10的引物，所述ERG11基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.11～16的引物。
作为本发明的进一步改进，试剂盒包括核酸扩增反应液，所述核酸扩增反应液包括10×Thermomal Buffer，MgSO4 2-10mmol/L，BSA 0.2-2mg/ml，dATP 0.2-3mmol/L，dGTP0.2-3mmol/L，dCTP0.2-1.5mmol/L，dTTP 0.2-1.5mmol/L，Betaine 0.2-1mol/L，EvaGreen 0.2-2×，Bst polymerase0.05-2U/μl。
本发明还公开了一种用于克柔念珠菌核酸检测的检测方法，包括以下步骤：
步骤S1，样本处理和模板提取，得到待检模板；
步骤S2，将引物组中的单引物进行溶解、稀释并混合得到混合后的引物组，将混合后的引物组固定在微流控芯片的芯片反应池内；
步骤S3，将扩增对照DNA和引物混合之后，固定在芯片反应池内；
步骤S4，核酸扩增，取扩增反应液，加入待检模板；
步骤S5，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入微流控芯片内，将微流控芯片放入核酸扩增分析仪中进行扩增。
步骤S6，在核酸扩增分析仪下进行核酸扩增反应产物的检测。根据显色反应，与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线为阴性。
其中，扩增包括恒温扩增和变温扩增。
采用次技术方案，通过针对上述一种病原体的多个基因位点或多个病原体的多个基因位点设计引物，并利用核酸扩增技术，以微流控芯片为载体，进行扩增，并根据显色反应进行结果判读，方法简单，检验快速。
作为本发明的进一步改进，所述样本包括咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹、血液、脑脊液、尿液、脓液、人体组织。
作为本发明的进一步改进，所述模板提取为在芯片外进行手动提取或将样本直接注入微流控芯片进行自动提取。
作为本发明的进一步改进，所述手动提取包括：取待检菌液和灭活的提取质控菌加入离心管中，离心后，弃上清，加入清洗液清洗一次，再次离心后，弃上清，在离心管中加入提取液混匀后加至装有玻璃珠的离心管中进行震荡，然后再恒温金属浴100℃加热5min，离心，取上清做待检模板。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
采用本发明的技术方案，本发明通过提供3种针对克柔念珠菌不同基因位点设计的引物组，固定有上述引物组微流控芯片，及包含有上述扩增反应液的试剂盒对样本中克柔念珠菌的cytb基因、ITS基因、ERG11基因位点进行检测。本发明提供的检测试剂盒和检测方法可检出的克柔念珠菌具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、适用范围广等优点，同时，还有试剂消耗量小，污染小等优点，该实验全程为闭盖式反应，减少了污染的可能性，成本低、且便携。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片的排布示意图。
图2为本发明实施例1中对克柔念株菌样本进行检测的结果图，3个不同基因位点都得到检出。
图3为本发明实施例1对部分位点突变的克柔念株菌样本1进行检测的结果图，ERG11基因和cytb基因得以检出。
图4为本发明实施例1对部分位点突变的克柔念株菌样本2进行检测的结果图，cytb基因得以检出。
上述附图2～图4中，图中横坐标单位是分钟(min)，纵坐标没有单位，“+”表示相应指标检出，“-”表示相应指标未检出。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
以克柔念株菌cytb基因、ITS基因、ERG11基因位点检测来对本发明进行说明，如无特别说明，均为常规方法。
1、引物制备
通过筛选出克柔念株菌cytb基因、ITS基因、ERG11基因片段设计出核酸扩增引物并合成，得到如下的引物：
克柔念株菌cytb基因
序列编号1
正向外引物F3 CATGCAAATGGAGCATCA
序列编号2
反向外引物B3 ACCAATAAAAGGTATAGCTGAT
序列编号3
正向内引物FIP ACTCTTGGTTTACGATATGATCCATTGGATGTATGTATATACATG TAGG
序列编号4
反向内引物BIP AGCAACAATGGCAACAGCATAGCTCCTCAATGAGACATT
序列编号5
反向环引物LB ATGGGATATTGTCTTGTATATGGAC
克柔念株菌ITS基因
序列编号6
正向外引物F3 CGGATCTCTTGGTTCTCGC
序列编号7
反向外引物B3 CAGCTTCGCTCCCTTTCAG
序列编号8
正向内引物FIP GGCGCAATGTGCGTTCAAGAACGATGAAGAGCGCAGCGAAAT
序列编号9
反向内引物BIP TGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCCCTCTTTACACGTCGTCCGC
序列编号10
正向环引物LF TGCAATTCACACTAGGTATCGC
克柔念株菌ERG11基因
序列编号11
正向外引物F3 CAACTTTAGGGGGGACTC
序列编号12
反向外引物B3 GGCAATGGCAAATAGGAGAA
序列编号13
正向内引物FIP GTCACCAAAGAGAGAACGAGATGAAACCGATGTTTTGAAATCGC
序列编号14
反向内引物BIP GCTCTACGTAACAGATTGGACGGACGAAATTCAGAGGGGTA
序列编号15
正向环引物LF GTAAAGAGCGTCATTTCCGACT
序列编号16
反向环引物LB CTTCTTATGCTGAGATGTACAGCG
2、微流控芯片制备
微流控芯片的结构排布示意图如图1所示，芯片反应池内包被固定有由克柔念珠菌cytb基因引物组、克柔念珠菌ITS基因引物组、克柔念珠菌ERG11基因引物组、扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。
克柔念珠菌cytb基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示)，10μL环引物LB(序列如SEQ ID NO.5所示)三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
克柔念珠菌ITS基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示),10μL环引物LF(序列如SEQ ID NO.10所示)三三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
克柔念珠菌ERG11基因，分别取24μL内引物FIP/BIP(序列如SEQ ID NO.13和SEQID NO.14所示)，3μL外引物F3/B(序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示),10μL环引物LF/LB(序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示)三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
提取对照，分别取24μL内引物FIP/BIP，3μL外引物F3/B,10μL环引物LF/LB三对引物混合(不足6个引物的用超纯水替代)，取0.3μL混合引物和超纯水0.5μL及0.2μL琼脂糖溶液混合，点在相应位置，自然晾干。
扩增对照，取0.3μL混合引物和0.5μL扩增对照DNA及琼脂糖0.2μL混合，点在相应位置，自然晾干。
3、样品处理和模板提取，以痰液样本为例；取1mL待检菌液和50μL灭活的提取质控菌加入1.5mL离心管中，12000rpm离心2min后，弃上清，加入600μL清洗液清洗一次，12000rpm离心2min后，弃上清，在离心管中加入200ul提取液充分混匀后加至装有玻璃珠的离心管中，震荡5min后，恒温金属浴100℃加热5min，12000rpm离心2min，取上清做待检模板。
4核酸扩增
取扩增反应液55μL，加入15μL待检模板，充分混匀后注入芯片。
所述扩增反应液中包括如下试剂：
序号 试剂组分 终浓度
1 10×Thermomal Buffer 1×
2 MgSO<sub>4</sub> 2-10mmol/L
3 BSA 0.2-2mg/ml
4 dATP 0.2-3mmol/L
5 dGTP 0.2-3mmol/L
6 dCTP 0.2-1.5mmol/L
7 dTTP 0.2-1.5mmol/L
8 Betaine 0.2-1mol/L
9 EvaGreen 0.2-2×
10 Bst polymerase 0.05-2U/μl
所述酶为每微升含8-16个活性单位的Bst DNA聚合酶。
在温度为65℃的核酸扩增分析仪上反应50min。
5扩增产物的检测
与空白对照孔比较，检测孔在核酸扩增分析仪设备上有S形曲线判定为阳性，未见S形曲线判定为阴性。
实验结果为：
图2为对克柔念株菌样本进行检测，cytb，ITS，ERG11基因位点均得到有效扩增，克柔念珠菌得以有效检出。图3为对部分位点突变的克柔念株菌样本1进行检测的结果图，ERG11基因和cytb基因得到有效扩增，ITS基因位点发生突变未得到扩增，克柔念珠菌得以有效检出，检测结果不受个别基因位点突变影响；
图4为用图1所示的基因芯片对对部分位点突变的克柔念株菌样本2进行检测的结果图，cytb基因得到有效扩增，ITS基因和ERG11基因位点发生突变未得到扩增，克柔念珠菌仍得以有效检出，检测结果不受部分基因位点突变影响。
通过上述结果可知，本发明提供的检测试剂盒和检测方法可在同一张芯片内，同时检测克柔念珠菌的多个基因位点，当某一基因发生突变时，则该基因位点检测结果为阴性；但是当该菌株的任一基因被检出，则说明克柔念珠菌呈阳性，因此提高了检测的灵敏度和特异性。另外，可解决克柔念株菌的现场快速检测的难题，还拥有试剂消耗量小、污染小、成本低、且便携带等诸多优点。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国医科大学附属盛京医院
<120> 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catgcaaatg gagcatca 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accaataaaa ggtatagctg at 22
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actcttggtt tacgatatga tccattggat gtatgtatat acatgtagg 49
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcaacaatg gcaacagcat agctcctcaa tgagacatt 39
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgggatatt gtcttgtata tggac 25
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggatctctt ggttctcgc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagcttcgct ccctttcag 19
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcgcaatgt gcgttcaaga acgatgaaga gcgcagcgaa at 42
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tgcctgtttg agcgtcgttt ccctctttac acgtcgtccg c 41
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgcaattcac actaggtatc gc 22
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caactttagg ggggactc 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcaatggca aataggagaa 20
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtcaccaaag agagaacgag atgaaaccga tgttttgaaa tcgc 44
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gctctacgta acagattgga cggacgaaat tcagaggggt a 41
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gtaaagagcg tcatttccga ct 22
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cttcttatgc tgagatgtac agcg 24

Claims (10)

1.一种用于克柔念珠菌核酸检测试剂盒，其特征在于：其包括微流控芯片，所述微流控芯片包括芯片反应池，所述芯片反应池内包被固定有引物组，所述引物组包含克柔念珠菌的至少两个不同基因位点的特异性引物组。
2.根据权利要求1所述的用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述微流控芯片内设有对照组，所述微流控芯片包括进样孔、反应孔和出气孔。
3.根据权利要求2所述的用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述对照组包括扩增对照、空白对照和提取对照组成的阵列。
4.根据权利要求3所述的用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述克柔念珠菌的至少两个不同基因位点包括cytb基因、ITS基因、ERG11基因中的至少两个。
5.根据权利要求4所述的用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：所述引物组包括cytb基因位点引物组、ITS基因位点引物组、ERG11基因位点引物组；
所述cytb基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.1~5的引物，所述ITS基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.6~10的引物，所述ERG11基因位点的引物组包括如SEQ ID NO.11~16的引物。
6.根据权利要求4所述的用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒，其特征在于：其包括核酸扩增反应液，所述核酸扩增反应液包括10×Thermomal Buffer，MgSO4 2-10mmol/L，BSA0.2-2mg/ml，dATP 0.2-3mmol/L，dGTP 0.2-3mmol/L，dCTP 0.2-1.5mmol/L，dTTP 0.2-1.5mmol/L，Betaine 0.2-1mol/L，EvaGreen 0.2-2×，Bst polymerase 0.05-2U/μl。
7.一种用于克柔念珠菌核酸检测的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤S1，样本处理和模板提取，得到待检模板；
步骤S2，将引物组中的单引物进行溶解、稀释并混合得到混合后的引物组，将混合后的引物组固定在微流控芯片的芯片反应池内；
步骤S3，将扩增对照DNA和引物混合之后，固定在芯片反应池内；
步骤S4，核酸扩增，取扩增反应液，加入待检模板；
步骤S5，振荡混匀后离心，将离心后的液体注入微流控芯片内，将微流控芯片放入核酸扩增分析仪中进行扩增；
步骤S6，在核酸扩增分析仪下进行核酸扩增反应产物的检测。
8.根据权利要求7所述的用于克柔念珠菌核酸检测的检测方法，其特征在于：所述样本包括咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、胸腹、血液、脑脊液、尿液、脓液、人体组织。
9.根据权利要求7所述的用于克柔念珠菌核酸检测的检测方法，其特征在于：所述模板提取为在芯片外进行手动提取或将样本直接注入微流控芯片进行自动提取。
10.根据权利要求9所述的用于克柔念珠菌核酸检测的检测方法，其特征在于：所述手动提取包括：取待检菌液和灭活的提取质控菌加入离心管中，离心后，弃上清，加入清洗液清洗一次，再次离心后，弃上清，在离心管中加入提取液混匀后加至装有玻璃珠的离心管中进行震荡，然后再恒温金属浴100℃加热5min，离心，取上清做待检模板。
CN201910921568.XA 2019-09-27 2019-09-27 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法 Pending CN110643498A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910921568.XA CN110643498A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910921568.XA CN110643498A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110643498A true CN110643498A (zh) 2020-01-03

Family

ID=69011535

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910921568.XA Pending CN110643498A (zh) 2019-09-27 2019-09-27 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110643498A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950740A (zh) * 2016-05-30 2016-09-21 中国人民解放军第二军医大学 一种用于早期诊断克柔念珠菌的lamp试剂盒及其专用引物
CN107119140A (zh) * 2017-06-16 2017-09-01 北京百康芯生物科技有限公司 呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105950740A (zh) * 2016-05-30 2016-09-21 中国人民解放军第二军医大学 一种用于早期诊断克柔念珠菌的lamp试剂盒及其专用引物
CN107119140A (zh) * 2017-06-16 2017-09-01 北京百康芯生物科技有限公司 呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
（美）JAMESH.JORGENSEN，MICHAELA.PFALLER著；王辉等主译: "《临床微生物学手册 第2卷 第11版[M]》", 30 June 2017, pages: 2565 *
JAY SHANKAR SINGH YADAV ET AL: "Candida krusei: biotechnological potentials and concerns about its safety", 《CAN. J. MICROBIOL.》, 23 July 2012 (2012-07-23), pages 939 *
石慧，陈启和主编；罗云波，何国庆主审: "食品分子微生物学[M]", 北京：中国农业大学出版社, pages: 296 - 297 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107119140A (zh) 呼吸道微流控芯片快速检测技术及试剂盒
CN101153326B (zh) 志贺氏菌检测用引物、检测方法、检测试剂盒
CN108192816A (zh) 一种样本自动处理和核酸扩增装置及使用方法
CN107988405B (zh) 一种印第安纳沙门氏菌pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法
CN113151522A (zh) 基于lfd-rpa技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用
CN115029459A (zh) 一种基于CRISPR-Cas12a可视化检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒及应用
CN106520923B (zh) 同时检测金黄色葡萄球菌及其5种肠毒素的试剂盒及方法
CN102010910A (zh) 基于环介导等温扩增技术的疟原虫属和种的核酸筛查方法
CN111378774A (zh) 一种用于快速检测单核细胞增生李斯特氏菌的引物组、试剂盒及方法
CN116042902A (zh) 一种同时检测六种念珠菌的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒及其专用引物和探针
CN110656037B (zh) 一种用于病原体核酸检测的微流控芯片及检测方法
CN110079622A (zh) 基于lamp法检测肺炎克雷伯菌的试剂盒
CN110578014A (zh) 一种用于近平滑念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法
CN110643498A (zh) 一种用于克柔念珠菌核酸检测的试剂盒及检测方法
CN116219064A (zh) 一种隐球菌的环介导等温扩增检测引物组及试剂盒
CN113337641A (zh) 猪圆环病毒2型lamp检测引物组及试剂盒
CN111235288A (zh) 一种快速检测创面病原菌的微流控芯片试剂盒
CN112063734A (zh) 一种采用实时荧光定量pcr技术定量检测人类血液中布鲁氏菌的引物、探针和方法
CN111719005A (zh) 一种猫嗜血支原体pcr检测方法
CN114164296B (zh) 一种用于检测寡雄腐霉菌的引物探针组合物、试剂盒及应用和检测方法
CN113493846B (zh) 柑桔黄龙病菌分子荧光raa检测引物探针组、试剂盒及方法
CN110499376B (zh) 以LppA基因为检测靶标进行牛支原体检测的组合物、试剂盒和方法
CN110564877B (zh) 以转酮醇酶基因为靶标检测绵羊肺炎支原体的组合物、试剂盒和方法
CN118600053A (zh) 一种用于检测隐球菌的引物及其应用
CN101736082A (zh) 军团菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200103

RJ01 Rejection of invention patent application after publication