CN109837331B - 检测Vero细胞DNA片段大小分布的引物对和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测Vero细胞基因组DNA的引物对、包含本发明引物对的检测试剂或试剂盒以及利用所述引物对检测Vero细胞基因组DNA的方法，所述引物对特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15所示区段。利用所述引物对的PCR检测方法操作简便快捷、灵敏度高、能区分CHO细胞、毕赤酵母或人类等干扰性DNA，能够检测Vero细胞DNA片段大小分布。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及检测Vero细胞DNA片段大小分布的引物对和方法。
背景技术
现在，病毒类疫苗常用一些永生的细胞系，如Vero细胞来生产。这些细胞系的使用给疫苗生产提供了很多优势，如生产规模的扩大和开发速度的加快，产品质量和安全的更可控，生产成本的降低等。然而对于这些产品仍然需要关注一些安全性问题，主要是指来自宿主细胞的残留物，如残留DNA可能带来的风险，如感染性、免疫原性或致癌性等。宿主细胞残留DNA在成品中作为杂质存在。自1980s以来，国际上的主要的监管机构对于疫苗中的残留DNA的量和残留片段的大小分布等有强烈的关注。对于残留DNA的最大可承受量为10ng/剂，而对于DNA大小片段的要求则为小于一个功能基因的长度。按照现有证据表明一个功能基因最小长度为200bp，大于200bp以上的片段其潜在风险较大。因此，疫苗生产企业应该测试在成品中的残留DNA片段大小的分布情况(FDA.Guidance for industry:characterization and qualification of cell substrates and other biologicalmaterials used in the production of viral vaccines for infectious diseaseindications.February 2010)，并以合适的定量分析方法验证生产过程中对残留DNA的清除率。因为疫苗是给健康人使用的，测试分析DNA大小片段的分布对于疫苗产品来说相对是比较重要的。
常见的残留DNA的检测方法有杂交法，阈值法和qPCR法。根据技术和监管趋势，qPCR方法逐渐被各个主要监管机构所推荐和接受。基于灵敏度的考虑，针对特定的宿主细胞采用的qPCR目标序列主要为高度保守的管家基因序列，如β-actin，或者是重复序列，如鼠的L1序列，卫星序列，16S或18S rRNA基因等。
目前，所建立的qPCR方法主要是检测疫苗中残留DNA的含量，但是无法提供疫苗成品中残留DNA片段大小分布情况。目前可见报道的来分析疫苗成品中残留DNA片段分析的方法主要有毛细管电泳和qPCR方法。根据文献报道，毛细管电泳的检测范围为0.25ng/剂到250ng/剂(Xuan Shen,Xiaomu Chen,et al.Size analysis of residual host cell DNAin cell cμlture-produced vaccines by capillary gelelectrophoresis.Biologicals 41(2013)201-208)；而qPCR方法基于保守序列如18S rRNA或β-Actin设计的检测方法，其检测范围为50ng到5pg/反应(Murielle Andre,SylvianeReghin,et al.Universal real-time PCR assay for quantitation and sizeevaluation of residual cell DNA in human viral vaccines.Biologicals 44(2016)139-149)。考虑到疫苗成品制剂每剂最少为0.5ml，其对应的实际样本检测最低限为125pg/剂。而我国药典中对于Vero细胞生产的疫苗制剂的残留量为100pg/剂，上述建立的方法都无法满足实际疫苗成品样本的检测需求。
因此，本领域急需能够检测Vero细胞DNA片段大小分布的物质手段和方法。
发明内容
本发明的目的在于提供能够检测Vero细胞DNA片段大小分布的引物对及其组合以及利用本发明的引物对组合检测Vero细胞DNA片段大小分布的方法
在第一方面，本发明提供一种检测Vero细胞基因组DNA片段大小分布的引物对的组合，其中，所述引物对的组合包括至少3组引物对，并且所述各引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100-200bp以及200bp以上；
其中，所述各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:15所示区段。
在具体的实施方式中，所述引物对的组合中的引物对选自以下引物对：
第一引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:1所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示区段的第90-132位，优选第100-122位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示区段的第147-186位，优选第157-176位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为67-87bp，优选77bp；
第二引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:6所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第94-133位，优选第104-123位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第229-264位，优选第239-254位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为141-161bp，优选151bp；
第三引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:6所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第24-63位，优选第34-53位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第229-264位，优选第239-254位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为211-231bp，优选221bp；
第四引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:15所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第5-51位，优选第15-41位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第82-123位，优选第92-113位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为89-109bp，优选99bp；
第五引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:15所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第1-35位，优选第2-25位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第119-165位，优选第129-155位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为144-164bp，优选154bp。
在优选的实施方式中，所述第一引物对中的正向引物和反向引物的长度为20-23bp；优选23和20bp。
在优选的实施方式中，所述第一引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为54-56℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述第二引物对中的正向引物和反向引物的长度为16-20bp，优选20和16bp。
在优选的实施方式中，所述第二引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述第三引物对中的正向引物和反向引物的长度为16-20bp，优选20和16bp。
在优选的实施方式中，所述第三引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述第四引物对中的正向引物和反向引物的长度为22-27bp，优选27和22bp。
在优选的实施方式中，所述第四引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为59-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。
在优选的实施方式中，所述第五引物对中的正向引物和反向引物的长度为24-27bp，优选24和27bp。
在优选的实施方式中，所述第五引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，所述第一引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:3所示；
所述第二引物对的正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示；
所述第三引物对的正向引物如SEQ ID NO:11所示，反向引物如SEQ ID NO:12所示；
所述第四引物对的正向引物如SEQ ID NO:16所示，反向引物如SEQ ID NO:17所示；
所述第五引物对的正向引物如SEQ ID NO:20所示，所述反向引物如SEQ ID NO:21所示。
在具体的实施方式中，所述引物对的组合至少包括下述组合：
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对；
所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对+所述第五引物对。
在第二方面，本发明提供一种检测Vero细胞基因组DNA的引物对，所述引物对选自以下引物对：
第一引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:1所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:1所示区段的第90-132位，优选第100-122位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:1所示区段的第147-186位，优选第157-176位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为67-87bp，优选77bp；
第二引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:6所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第94-133位，优选第104-123位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第229-264位，优选第239-254位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为141-161bp，优选151bp；
第三引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:6所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第24-63位，优选第34-53位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第229-264位，优选第239-254位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为211-231bp，优选221bp；
第四引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:15所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第5-51位，优选第15-41位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第82-123位，优选第92-113位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为89-109bp，优选99bp；
第五引物对，其中的正向引物和反向引物特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQID NO:15所示区段，所述正向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第1-35位，优选第2-25位；所述反向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第119-165位，优选第129-155位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为144-164bp，优选154bp。
在具体的实施方式中，所述第一引物对中的正向引物如SEQ ID NO:2所示，反向引物如SEQ ID NO:3所示；
所述第二引物对的正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示；
所述第三引物对的正向引物如SEQ ID NO:11所示，反向引物如SEQ ID NO:12所示；
所述第四引物对的正向引物如SEQ ID NO:16所示，反向引物如SEQ ID NO:17所示；
所述第五引物对的正向引物如SEQ ID NO:20所示，所述反向引物如SEQ ID NO:21所示。
在第三方面，本发明提供一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的引物对的组合或第二方面所述的引物对。
在优选的实施方式中，所述检测试剂还包含探针。
在优选的实施方式中，所述探针如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQID NO:18或SEQ ID NO:22所示。
在第四方面，本发明提供一种检测Vero细胞残留DNA片段大小分布的方法，所述方法包括：
利用本发明第一方面所述的引物对的组合或第三方面所述的包含第一方面所述的引物对的组合的检测试剂对待测样品进行PCR；和
检测PCR扩增产物，从而得到Vero细胞残留DNA片段大小分布的结果。
在第五方面，本发明提供一种检测Vero细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：
利用本发明第二方面所述的引物对或第三方面所述的包含第二方面所述的引物对的检测试剂对待测样品进行PCR；和
检测PCR扩增产物。
在优选的实施方式中，所述Vero细胞基因组DNA是Vero细胞残留的基因组DNA。
在第五方面，本发明提供一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的本发明第一方面所述的引物对的组合或第二方面所述的引物对。
在第六方面，本发明提供一种PCR方法，包括步骤：
在一PCR检测体系中，利用本发明第一方面所述的引物对的组合或第二方面所述的引物对扩增目标产物。
在第七方面，本发明提供第一方面所述的引物对的组合或第三方面所述的包含第一方面所述的引物对的组合的检测试剂的用途，用于检测待测对象中Vero细胞残留DNA片段大小分布。
在优选的实施方式中，所述待测对象是生物制品，优选重组蛋白制品。
在第八方面，本发明提供第二方面所述的引物对或第三方面所述的包含第二方面所述的引物对的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在Vero细胞基因组DNA。
在优选的实施方式中，所述Vero细胞基因组DNA是Vero细胞残留的基因组DNA。
在优选的实施方式中，所述待测对象是生物制品，优选重组蛋白制品。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了参考品的扩增曲线。从图1可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图2显示了参考品的标准曲线。由图2可知，当参考品浓度为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.49，相关系数(R2)＝0.999，扩增效率为93.4％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到3fg/μl，其中利用的引物对如SEQ ID NO:2和3所示。
图3显示了利用300pg CHO、300pg大肠杆菌、300pg毕赤酵母、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠的DNA作为干扰DNA进行的体系干扰实验的结果，其中利用的引物对如SEQ IDNO:2和3所示。
图4显示了参考品的扩增曲线。从图4可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如SEQ ID NO:7和8所示。
图5显示了参考品的标准曲线。由图5可知，当参考品浓度为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.44，相关系数(R2)＝1.000，扩增效率为95.4％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到3fg/μl，其中利用的引物对如SEQ ID NO:7和8所示。
图6显示了利用300pg Vero、300pg CHO、300pg大肠杆菌、300pg毕赤酵母、300pg人、300pg大鼠、300pg小鼠DNA作为干扰DNA进行的体系干扰实验的结果，其中利用的引物对如SEQ ID NO:7和8所示。
图7显示了参考品的扩增曲线。从图7可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如SEQ ID NO:11和12所示。
图8显示了参考品的标准曲线。由图8可知，当参考品浓度为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.55，相关系数(R2)＝0.999，扩增效率为91.2％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到3fg/μl，其中利用的引物对如SEQ ID NO:11和12所示。
图9显示了利用300pg CHO、300pg大肠杆菌、300pg毕赤酵母、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠的DNA作为干扰DNA进行的体系干扰实验的结果，其中利用的引物对如SEQ IDNO:11和12所示。
图10显示了参考品的扩增曲线。从图10可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如SEQ ID NO:16和17所示。
图11显示了参考品的标准曲线。由图11可知，当参考品浓度为30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl、0.3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.50，相关系数(R2)＝0.998，扩增效率为92.9％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到0.3fg/μl，其中利用的引物对如SEQ ID NO:16和17所示。
图12显示了利用300pg CHO、300pg大肠杆菌、300pg毕赤酵母、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠作为干扰DNA进行的体系干扰实验的结果，其中利用的引物对如SEQ ID NO:16和17所示。
图13显示了参考品的扩增曲线。从图13可以看出扩增曲线有明显的指数增长期，其中利用的引物对如SEQ ID NO:20和21所示。
图14显示了参考品的标准曲线。由图14可知，当参考品浓度为30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl、0.3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.63，相关系数(R2)＝0.998，扩增效率为88.7％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到0.3fg/μl，其中利用的引物对如SEQ ID NO:20和21所示。
图15显示了利用300pg CHO、300pg大肠杆菌、300pg毕赤酵母、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠的DNA作为干扰DNA进行的体系干扰实验的结果，其中利用的引物对如SEQ IDNO:20和21所示。
图16-17显示了SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对检测碎片化DNA的能力，证明DNA的破碎化不会对检测结果造成负面影响。
图18-19显示了SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对检测碎片化DNA的能力，证明DNA的破碎化不会对检测结果造成负面影响。
图16和20显示了SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示引物对检测碎片化DNA的能力，证明DNA的破碎化不会对检测结果造成负面影响。
图21显示了30μl的30ng/μl的Vero DNA参考品经超声30min后的电泳结果。
图22显示了实施例16所述的利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对(产物77bp)进行检测的结果。
图23显示了实施例16所述的利用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对(产物151bp)进行检测的结果。
图24显示了实施例16所述的利用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对(产物221bp)进行检测的结果。
图25显示了利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示引物对和SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对检测Vero DNA超声处理后的片段大小分布的结果。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现利用针对Vero细胞基因组DNA的SEQ ID NO:1(GATCCGTCTTGTGGAATTGGCAAAGGGATATTTGGAAGCCCATAGAGGGCTATGGTGAACAACGAAATATCTTCCGTTCAAAACTGGAAAGAAGCTTTCTGAGAAACTGCTCTGTGTTCTGTTAATTCATCTCACAGAGTTACATCTTTACCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAGGCTGTTCTTGTGGAATTGGCAAAGTTATATTTGGAAGTCCATAGAGGGCTATGGTGAAAAAGGTTATATCTTCCGTTCAAAACTGGAAAGAAGCATCG)所示区段和/或SEQ IDNO:6(GCTTTGAGGCCGGGCGGGATGGCTCCAGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCCGAGACGGGCGGATCACAAGGTCAGGAGATCGAGACCATCCTGGCTAACACGGTGAAACCCCGTCTCTAGTAAAAAATACAAAAAACTAGCCGGGCGAGGTGGCAGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGCATAAACCCGGGAGGCGGAGCTTGCAGTGAGCTGAGATCCGGCCACCGCACTCCAGCCTGGGCCACAGAGCAAGACTCTAAGAGAGAG)所示区段和/或SEQ ID NO:15(AGCTTTCTGAGAAACTGCTCTGTGTTCTGTTAATTCATCTCACAGAGTTACATCTTTCCCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAGGCTGTTCTTGTGGAATTGGCAAAGGGATATTTGGAAGCCCATAGAGGGCTATGGTGAAAAAGGAAATATCTTCCGTTCAAAACTGGAAAGA)所示区段设计的引物，不仅能够高度灵敏地检测Vero细胞基因组DNA，还能够检测Vero细胞DNA片段大小分布，并且能够区分CHO、大肠杆菌、毕赤酵母、人、大鼠和小鼠等干扰性DNA。在此基础上完成了本发明。
本发明的残留DNA片段大小分布的引物
正如上文所述，目前国际主要的监管机构强烈关注疫苗中的残留DNA的量和残留片段的大小分布，因此急需对疫苗中的残留DNA量和残留片段的大小分布等进行有效检测的方法。
然而，相比于残留DNA的总量，疫苗中大片段的DNA残留对于产品质量的影响更大；此外，能够检测残留DNA量的引物并不代表该引物能够检测残留片段的大小分布。
针对本领域中的该需求，本发明提供了一种多靶标序列的qPCR方法以及相关的引物对来评估分析疫苗成品中残留DNA片段的分布，其检测灵敏度可以达到30fg/反应，对应300fg/剂，大大低于我国药典规定Vero细胞DNA残留限制100pg/剂，可以满足对重组疫苗中残留DNA片段大小分布的实际检测需求。当然，基于本发明的教导，本领域技术人员应该知道，本发明的方法以及相关的引物对也可以用于生物制品中Vero细胞DNA残留含量的检测。这些方法和引物对均具有良好的检测灵敏度和特异性。
在本文中，所用的术语“引物”具有本领域技术人员常规理解的意义。本发明的引物不是针对外源基因本身或病毒载体本身设计，而是针对Vero细胞基因组DNA上SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15所示区段设计的。换言之，本发明的引物可以特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15所示区段。
根据FDA对生物制品，特别是重组蛋白制品中Vero细胞残留基因组DNA片段大小的指导原则，由于终产品中残留的DNA会使其存在风险，因此必须终产品中DNA残留量和DNA残留片段大小进行检测，并且要设法减少DNA残留量和DNA残留片段大小至功能基因片段大小以下，使其小于200bp。因此，本发明提供的检测Vero细胞基因组DNA片段大小分布的引物对的组合包括至少3个引物对，并且所述各引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100-200bp以及200bp以上；
其中，所述各引物对中的正向引物和反向引物分别特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:6和/或SEQ ID NO:15所示区段。
在具体的实施方式中，特异性结合于Vero细胞基因组DNA上SEQ ID NO:1所示区段的所述引物构成第一引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于SEQ ID NO:1所示区段的第90-132位，优选第100-122位；其中的反向引物结合于SEQ ID NO:1所示区段的第147-186位，优选第157-176位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为67-87bp，优选77bp。
在优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的长度为20-23bp；优选23和20bp。
在另一优选的实施方式中，所述正向引物和反向引物的Tm温度为54-56℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在优选的实施方式中，所述正向引物如SEQ ID NO:2(TGAGAAACTGCTCTGTGTTCTGT)所示，所述反向引物如SEQ ID NO:3(AGCCTAAGCGATAGGCTTCT)所示。
在具体的实施方式中，特异性结合于SEQ ID NO:6所示区段的所述引物构成第二引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第94-133位，优选第104-123位；反向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第229-264位，优选第239-254位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为141-161bp，优选151bp。
在另一优选实施方式中，所述第二引物对中的正向引物和反向引物的长度为16-20bp，优选20和16bp。
在另一优选实施方式中，所述第二引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，第二引物对的所述正向引物如SEQ ID NO:7(ACGGTGAAACCCCGTCTCTA)所示，所述反向引物如SEQ ID NO:8(GCGGTGGCCGGATCTC)所示。
在具体的实施方式中，特异性结合于SEQ ID NO:6所示区段的所述引物构成第三引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第24-63位，优选第34-53位；反向引物结合于SEQ ID NO:6所示区段的第229-264位，优选第239-254位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为211-231bp，优选221bp。
在另一优选实施方式中，所述第三引物对中的正向引物和反向引物的长度为16-20bp，优选20和16bp。
在另一优选实施方式中，所述第三引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，第三引物对的所述正向引物如SEQ ID NO:11(AATCCCAGCACTTTGGGAGG)所示，所述反向引物如SEQ ID NO:12(GCGGTGGCCGGATCTC)所示。
在具体的实施方式中，特异性结合于SEQ ID NO:15所示区段的所述引物构成第四引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第5-51位，优选第15-41位；反向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第82-123位，优选第92-113位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为89-109bp，优选99bp。
在另一优选实施方式中，所述第四引物对中的正向引物和反向引物的长度为22-27bp，优选27和22bp。
在另一优选实施方式中，所述第四引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为59-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤1℃。
在具体的实施方式中，第四引物对的所述正向引物如SEQ ID NO:16(CTGCTCTGTGTTCTGTTAATTCATCTC)所示，所述反向引物如SEQ ID NO:17(AAATATCCCTTTGCCAATTCCA)所示。
在具体的实施方式中，特异性结合于SEQ ID NO:15所示区段的所述引物构成第五引物对，包括正向引物和反向引物，其中正向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第1-35位，优选第2-25位；反向引物结合于SEQ ID NO:15所示区段的第119-165位，优选第129-155位，并且所述引物对所扩增获得的扩增产物的长度为144-164bp，优选154bp。
在另一优选实施方式中，所述第五引物对中的正向引物和反向引物的长度为24-27bp，优选24和27bp。
在另一优选实施方式中，所述第五引物对中的正向引物和反向引物的Tm温度为58-60℃，并且正向引物的Tm与反向引物的Tm的差值的绝对值≤2℃。
在具体的实施方式中，第五引物对的所述正向引物如SEQ ID NO:20(GCTTTCTGAGAAACTGCTCTGTGT)所示，所述反向引物如SEQ ID NO:21(GGAAGATATTTCCTTTTTCACCATAGC)所示。
Vero细胞残留DNA片段大小分布的检测方法
本领域技术人员知晓，为检测Vero细胞残留DNA片段大小分布情况，可以分别采用本发明的引物对进行qPCR；也可以将本发明的引物对用于同一PCR反应中，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，即，进行多重PCR反应。多重PCR反应的原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。但是相比于一般PCR，多重PCR具有以下优点：1.高效性，在同一PCR反应管内同时检出多个目标序列，或对有多个型别的目的基因进行分型；2.系统性，多重PCR很适宜于成组对象的检测；3.经济简便性，多种对象在同一反应管内同时检出，大大节省时间，节省试剂，节约经费开支，从而提供更多更准确的诊断信息。
基于本发明的教导和本领域关于多重PCR的常规知识，本领域普通技术人员明白，如果将本发明的引物对应用于“多重PCR”或“多重荧光PCR”需要不同的荧光染料或荧光标记；而如果分别采用本发明的引物对进行qPCR，可以采用相同，也可以采用不同的荧光染料或荧光标记。
具体地说，本发明的检测Vero细胞残留DNA片段大小分布的方法包括：利用本发明的上述引物对的组合或包含所述引物对的组合的检测试剂对待测样品进行PCR；并检测PCR扩增产物，从而得到Vero细胞残留DNA片段大小分布的结果。
在具体的实施方式中，本发明的引物对的组合包括至少3组上述引物对，并且所述各引物对扩增获得的扩增产物的长度分别为100bp以下、100-200bp以及200bp以上。例如，本发明的所述引物对的组合至少包括所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对的组合；所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对+所述第五引物对的组合。在优选的实施方式中，所述引物对的组合至少包括所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对+所述第五引物对的组合。
本发明的检测体系
本发明还提供一种检测Vero细胞残留DNA片段大小分布的检测体系，所述体系包含上述的本发明引物对以及探针等实施PCR所需的其它成分，例如Taq酶、dNTP、Mg2+等等。
基于本发明的教导和本领域的常规知识，本领域普通技术人员可根据需要基于具体的引物对设计探针，所述探针可以处于液相中，也可以固定于固相上；可以在扩增前结合，也可以在扩增后结合。在具体的实施方式中，所述探针如ATTCATCTCACAGAGTTACATCTTTACCTTCAAG(SEQ ID NO:4)或CTAGCCGGGCGAGGTGGCAG(SEQ ID NO:9)或CTAGCCGGGCGAGGTGGCAG(SEQ ID NO:13)或CCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAG(SEQ ID NO:18)或CCTTCAAGAAGCCTTTCGCTAAG(SEQ ID NO:22)所示。
基于本发明的教导以及本领域的常规知识，本领域技术人员知晓本发明的引物对也可以用于检测Vero细胞残留DNA的量。因此，本发明还提供利用本发明的引物对或本发明的检测体系检测Vero细胞残留DNA的量的方法。在具体的实施方式中，本发明的引物对检测Vero细胞残留DNA的检测灵敏度达到0.3fg/μl。在优选的实施方式中，本发明的引物对检测Vero细胞残留DNA的检测灵敏度达到0.3fg/μl。
在其它实施方式中，本发明还提供PCR试剂盒，所述PCR试剂盒装有本发明引物对和用于实施PCR的其它所需成分以及使用该试剂盒作PCR检测的使用说明书。
在优选的实施方式中，为排除假阴性结果，本发明的PCR试剂盒还装有标准品对照。
在进一步的优选实施方式中，所述标准品对照包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15所示片段。
在其它实施方式中，本发明还提供利用本发明引物对实施的PCR方法。
本发明还提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15所示片段。
在优选的实施方式中，所述多核苷酸如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:15所示。
本领域技术人员知道，所述多核苷酸是一种特异性的Vero细胞基因组DNA残留检测标志物，即，可通过扩增该标志物特异性地检测体系中Vero细胞基因组DNA是否存在。
因此，本领域技术人员不难理解，上述多核苷酸可用于Vero细胞基因组DNA的检测。例如，如果具体的检测环境存在可能影响PCR扩增的因素，就有可能产生假阴性结果，因此，本发明的多核苷酸可在检测中用作标准品对照，以排除特定体系下产生的假阴性结果。
本发明的引物和方法的优点包括:
1.本发明的引物对检测Vero细胞残留DNA片段大小分布；
2.本发明的引物对本身检测Vero细胞残留DNA的灵敏度高，能够检测出3fg/μl，甚至0.3fg/μl的DNA浓度；
3.本发明的引物特异性好，能够区分Vero细胞基因组DNA与其它干扰性DNA；
4.本发明的方法操作简便快捷。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明的材料与方法
1.样本处理试剂：
(柱纯化回收)包括蛋白酶K 20mg/ml，预处理缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，洗脱缓冲液，结合柱，收集管，1.5ml离心管。
2.DNA检测体系：
2x Taqman mix：含有Taq酶、dNTP、Mg2+、本发明引物及探针等成分。
掺加标准品，阴性质控，DNA稀释液
3.检测仪器：ABI 7500、Biorad CFX96。
4.实验操作及过程
4.1样本处理
4.1.1准备工作：
在洗涤缓冲液中加入80ml无水乙醇
4.1.2样本处理：
1)取100μl检测样品，加入1.5ml离心管中，加入5μl蛋白酶K，55℃1小时；
2)将结合柱内放入收集管，加入200μl预处理缓冲液，室温放置5min；12000g离心2min，弃废液；
3)在检测样品中加入600μl的结合缓冲液，震荡混匀；
4)将溶液加入结合柱中，8000g离心1min，弃废液；
5)结合柱中加入700μl洗涤缓冲液(已加乙醇)，10000g离心1min，弃废液；
6)重复第五步；
7)将空的结合柱与收集管，13000g离心2min，丢弃收集管；
8)将柱子放入干净的1.5ml离心管中，开盖，晾干10min，除去乙醇；
9)柱子中加入50μl洗脱缓冲液(预先55℃水浴)，放置2min；
10)13000g离心1min，所得滤液即为纯化产物。
4.2检测体系
4.2.1准备工作：
参考品：参考品为Vero细胞基因组DNA(Vero细胞来源于ATCC，具体提取DNA方法参考中国药典附录IX B中提供的阳性对照DNA制备方法)，标准参考品经校正后使用，其浓度为30ng/μl，冰冻保存。使用时用DNA稀释液稀释成7个浓度梯度，分别为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl，30fg/μl，3fg/μl及0.3fg/μl。NTC为无样本阴性质控。
检测体系：30μl
15μl 2X Taqman mix+10μl样品+5μl水＝30μl
实时荧光定量PCR反应程序优选为：95℃预变性2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。根据所获得的标准曲线，计算得到待检样本中Vero细胞DNA的量。
实施例
实施例1.评价SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的性能
根据上文“本发明所用的材料与方法”，利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对进行PCR检测。实验结果如图1和图2所示。其中图1是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图2是参考品标准曲线。由图2可知，当参考品浓度为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.49，相关系数(R2)＝0.999，扩增效率为93.4％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到3fg/μl。
实施例2.评价SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的特异性
为评价SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的特异性，选取300pg Vero、300pgCHO、300pg大肠杆菌(E.coli)、300pg毕赤酵母(Pichia)、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠的DNA作为干扰DNA作体系干扰实验。具体为：
步骤：
将CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse六种干扰DNA稀释成浓度为30pg/μl。(CHO DNA来源中国食品药品检定研究院；E.coli DNA来源中国食品药品检定研究院；人非小细胞肺癌细胞HCC827来源中国科学院上海生命科学研究院；毕赤酵母菌来源Invitrogen，用Takara基因提取试剂盒提取)
qPCR体系：
18.2μl mix+0.6μl正向引物+0.6μl反向引物+0.6μl探针+10μl Vero/CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse DNA
实验结果如图3所示。从产生的曲线可以看出，CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse DNA污染对该引物对的检测结果不会造成影响。该引物对具备优异的特异性。
实施例3.评价SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对检测碎片化DNA的能力
实验步骤：
1.取30ng/μl的Vero gDNA 20μl放入干净的PCR管，共准备3管。1管作为对照，余下2管分别在超声清洗机(SPEC-DW-12028B型超声清洗机1200W)中进行1min、10min不同时长的超声破碎，获得一系列碎片化程度不同的DNA片段。
2.取这一系列碎片化程度不同的DNA片段10μl，进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳时长为25min，电压100V。
3.将这一系列碎片化程度不同的DNA片段分别进行梯度稀释，取300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl进行qPCR检测。
结果如图16-17所示，证明显示DNA的破碎化不会对检测结果造成负面影响。
实施例4.评价SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对的性能
按照实施例1所述的方法，评价SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对的性能。
实验结果如图4和图5所示。其中图4是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图5是参考品标准曲线。由图5可知，当参考品浓度为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.44，相关系数(R2)＝1.000，扩增效率为95.4％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到3fg/μl。
实施例5.评价SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对的特异性
为评价SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对的特异性，按照实施例2所述的方法，选取300pg Vero、300pg CHO、300pg大肠杆菌(E.coli)、300pg毕赤酵母(Pichia)、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠的DNA作为干扰DNA作体系干扰实验。具体为：
步骤：
将CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse/六种干扰DNA稀释成浓度为30pg/μl。(CHO DNA来源中国食品药品检定研究院；E.coli DNA来源中国食品药品检定研究院；人非小细胞肺癌细胞HCC827来源中国科学院上海生命科学研究院；毕赤酵母菌来源invitrogen，用takara基因提取试剂盒提取)
qPCR体系：
18.2μl mix+0.6μl正向引物+0.6μl反向引物+0.6μl探针+10μl Vero/CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse DNA
实验结果如图6所示。从产生的曲线可以看出，Vero/CHO/E.coli/Pichia/rat/mouse DNA污染对该引物对的检测结果不会造成影响。Human DNA污染对该引物对的检测结果会造成影响。该引物对具备优异的特异性。
实施例6.评价SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对检测碎片化DNA的能力
实验步骤：
1.取30ng/μl的vero gDNA 20μl放入干净的PCR管，共准备3管。1管作为对照，余下2管分别在超声清洗机(SPEC-DW-12028B型超声清洗机1200W)中进行10s、1min、10min、30min不同时长的超声破碎，获得一系列碎片化程度不同的DNA片段。
2.取这一系列碎片化程度不同的DNA片段10μl，进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳时长为25min，电压100V。
3.将这一系列碎片化程度不同的DNA片段分别进行梯度稀释，取300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl进行qPCR检测。
结果如图18-19所示，证明显示DNA的破碎化不会对检测结果造成负面影响。
实施例7.评价SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对的性能
按照实施例1所述的方法，评价SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对的性能。
实验结果如图7和图8所示。其中图7是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图8是参考品标准曲线。由图8可知，当参考品浓度为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.55，相关系数(R2)＝0.999，扩增效率为91.2％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到3fg/μl。
实施例8.评价SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对的特异性
为评价SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对的特异性，按照实施例2所述的方法，选取300pg Vero、300pg CHO、300pg大肠杆菌(E.coli)、300pg毕赤酵母(Pichia)、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠的DNA作为干扰DNA作体系干扰实验。具体为：
步骤：
将CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse六种干扰DNA稀释成浓度为30pg/μl。(CHO DNA来源中国食品药品检定研究院；E.coli DNA来源中国食品药品检定研究院；人非小细胞肺癌细胞HCC827来源中国科学院上海生命科学研究院；毕赤酵母菌来源invitrogen，用takara基因提取试剂盒提取)
qPCR体系：
18.2μl mix+0.6μl正向引物+0.6μl反向引物+0.6μl探针+10μl Vero/CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse DNA
实验结果如图9所示。从产生的曲线可以看出，CHO/E.coli/Pichia/rat/mouseDNA污染对该引物对的检测结果不会造成影响。Human DNA污染对该引物对的检测结果会造成影响。该引物对具备优异的特异性。
实施例9.评价SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示引物对的性能
按照实施例1所述的方法，评价SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示引物对的性能。
实验结果如图10和图11所示。其中图10是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图11是参考品标准曲线。由图11可知，当参考品浓度为30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl、0.3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.50，相关系数(R2)＝0.998，扩增效率为92.9％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到0.3fg/μl。
实施例10.评价SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示引物对的特异性
为评价SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示引物对的特异性，按照实施例2所述的方法，选取300pg Vero、300pg CHO、300pg大肠杆菌(E.coli)、300pg毕赤酵母(Pichia)、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠的DNA作为干扰DNA作体系干扰实验。具体为：
步骤：
将CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse六种干扰DNA稀释成浓度为30pg/μl。(CHO DNA来源中国食品药品检定研究院；E.coli DNA来源中国食品药品检定研究院；人非小细胞肺癌细胞HCC827来源中国科学院上海生命科学研究院；毕赤酵母菌来源invitrogen，用takara基因提取试剂盒提取)
qPCR体系：
18.2μl mix+0.6μl正向引物+0.6μl反向引物+0.6μl探针+10μl Vero/CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse DNA
实验结果如图12所示。从产生的曲线可以看出，CHO/E.coli/Pichia/rat/mouse/Human DNA污染对该引物对的检测结果不会造成影响。
实施例11.评价SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示引物对检测碎片化DNA的能力
实验步骤：
1.取30ng/μl的vero gDNA 20μl放入干净的PCR管，共准备3管。1管作为对照，余下2管分别在超声清洗机(SPEC-DW-12028B型超声清洗机1200W)中进行1min、10min不同时长的超声破碎，获得一系列碎片化程度不同的DNA片段。
2.取这一系列碎片化程度不同的DNA片段10μl，进行2％琼脂糖凝胶电泳，电泳时长为25min，电压100V。
3.将这一系列碎片化程度不同的DNA片段分别进行梯度稀释，取30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl、0.3fg/μl进行qPCR检测。
结果如图16和图20所示，证明显示DNA的破碎化不会对检测结果造成负面影响。
实施例12.评价SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示引物对的性能
按照实施例1所述的方法，评价SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示引物对的性能。
实验结果如图13和图14所示。其中图13是参考品扩增曲线，扩增曲线显示出明显的指数增长期。图14是参考品标准曲线。由图14可知，当参考品浓度为30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl、0.3fg/μl时，绘制得到的标准曲线斜率为-3.63，相关系数(R2)＝0.998，扩增效率为88.7％。标准曲线的线性良好，检测灵敏度可达到0.3fg/μl。
实施例13.评价SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示引物对的特异性
为评价SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示引物对的特异性，按照实施例2所述的方法，选取300pg Vero、300pg CHO、300pg大肠杆菌(E.coli)、300pg毕赤酵母(Pichia)、300pg人、300pg小鼠、300pg大鼠的DNA作为干扰DNA作体系干扰实验。具体为：
步骤：
将CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse六种干扰DNA稀释成浓度为30pg/μl。(CHO DNA来源中国食品药品检定研究院；E.coli DNA来源中国食品药品检定研究院；人非小细胞肺癌细胞HCC827来源中国科学院上海生命科学研究院；毕赤酵母菌来源invitrogen，用takara基因提取试剂盒提取)
qPCR体系：
18.2μl mix+0.6μl正向引物+0.6μl反向引物+0.6μl探针+10μl Vero/CHO/E.coli/human/Pichia/rat/mouse DNA
实验结果如图15所示。从产生的曲线可以看出，CHO/E.coli/Pichia/rat/mouse/Human DNA污染对该引物对的检测结果不会造成影响。
实施例14.利用本发明的三引物对检测Vero细胞残留DNA片段的大小分布
根据上文“本发明所用的材料与方法”，利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的引物对针对多个Vero细胞生产的样本进行PCR检测，分析同一样本中不同长度片段的DNA含量。
实验结果如下表所示。
上述结果表明，不同样本中DNA含量是不一样的；对于同一样本，采用不同长度的扩增片段其检测值也不一样。但是，这些样本都具有一个特点，扩增片段短，其DNA检测值高；扩增片段长，其DNA检测值低。这与实际情况相符。
实施例15.利用本发明的四引物对检测Vero细胞残留DNA片段的大小分布
根据上文“本发明所用的材料与方法”，利用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示的引物对针对多个Vero细胞生产的样本进行PCR检测。
实验结果如下表所示。
上述结果表明，不同样本中DNA含量是不一样的；对于同一样本，采用不同长度的扩增片段其检测值也不一样。但是，这些样本都具有一个特点，扩增片段短，其DNA检测值高；扩增片段长，其DNA检测值低。这与实际情况相符。
实施例16.利用本发明的三引物对检测Vero DNA超声处理后的片段的大小分布
取30μl的30ng/μl的vero DNA参考品加入0.2ml PCR管，超声30min，电泳。电泳结果如图21所示，可见泳道2中的样品DNA大小主要分布在100bp左右及以下。
根据上文“本发明所用的材料与方法”，利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的引物对针对Vero DNA超声处理后的DNA进行PCR检测，分析同一处理后的样本中不同长度片段的DNA含量。
稀释DNA参考品，3列标准曲线分别为：300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl。分别用以上三对引物对进行检测，建立相应的标准曲线。将超声30分钟的30ng/μl的vero DNA参考品稀释100倍至300pg/μl，分别用上述三对引物进行检测。
利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对(产物77bp)进行检测的结果如图22所示；
利用SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对(产物151bp)进行检测的结果如图23所示；
利用SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对(产物221bp)进行检测的结果如图24所示。
检测结果入图25所示。
上述结果表明，超声后的DNA参考品会断裂成小片段，当用三种扩增片段大小不同的引物对于同一样本进行扩增，其检测值是不一样的。扩增片段短，其DNA检测值高；扩增片段长，其DNA检测值低。这与实际情况相符。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖州申科生物技术有限公司
中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心
<120> 检测Vero细胞DNA片段大小分布的引物对和方法
<130> P2017-1014
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatccgtctt gtggaattgg caaagggata tttggaagcc catagagggc tatggtgaac 60
aacgaaatat cttccgttca aaactggaaa gaagctttct gagaaactgc tctgtgttct 120
gttaattcat ctcacagagt tacatcttta ccttcaagaa gcctttcgct aaggctgttc 180
ttgtggaatt ggcaaagtta tatttggaag tccatagagg gctatggtga aaaaggttat 240
atcttccgtt caaaactgga aagaagcatc g 271
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgagaaactg ctctgtgttc tgt 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agcctaagcg ataggcttct 20
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attcatctca cagagttaca tctttacctt caag 34
<210> 5
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgagaaactg ctctgtgttc tgttaattca tctcacagag ttacatcttt accttcaaga 60
agcctttcgc taaggct 77
<210> 6
<211> 293
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctttgaggc cgggcgggat ggctccagcc tgtaatccca gcactttggg aggccgagac 60
gggcggatca caaggtcagg agatcgagac catcctggct aacacggtga aaccccgtct 120
ctagtaaaaa atacaaaaaa ctagccgggc gaggtggcag gcgcctgtag tcccagctac 180
tcgggaggct gaggcaggag aatggcataa acccgggagg cggagcttgc agtgagctga 240
gatccggcca ccgcactcca gcctgggcca cagagcaaga ctctaagaga gag 293
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acggtgaaac cccgtctcta 20
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcggtggccg gatctc 16
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctagccgggc gaggtggcag 20
<210> 10
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acggtgaaac cccgtctcta gtaaaaaata caaaaaacta gccgggcgag gtggcaggcg 60
cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat ggcataaacc cgggaggcgg 120
agcttgcagt gagctgagat ccggccaccg c 151
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aatcccagca ctttgggagg 20
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gcggtggccg gatctc 16
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctagccgggc gaggtggcag 20
<210> 14
<211> 221
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aatcccagca ctttgggagg ccgagacggg cggatcacaa ggtcaggaga tcgagaccat 60
cctggctaac acggtgaaac cccgtctcta gtaaaaaata caaaaaacta gccgggcgag 120
gtggcaggcg cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat ggcataaacc 180
cgggaggcgg agcttgcagt gagctgagat ccggccaccg c 221
<210> 15
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agctttctga gaaactgctc tgtgttctgt taattcatct cacagagtta catctttccc 60
ttcaagaagc ctttcgctaa ggctgttctt gtggaattgg caaagggata tttggaagcc 120
catagagggc tatggtgaaa aaggaaatat cttccgttca aaactggaaa ga 172
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctgctctgtg ttctgttaat tcatctc 27
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aaatatccct ttgccaattc ca 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccttcaagaa gcctttcgct aag 23
<210> 19
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ctgctctgtg ttctgttaat tcatctcaca gagttacatc tttcccttca agaagccttt 60
cgctaaggct gttcttgtgg aattggcaaa gggatattt 99
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctttctgag aaactgctct gtgt 24
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggaagatatt tcctttttca ccatagc 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ccttcaagaa gcctttcgct aag 23
<210> 23
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctttctgag aaactgctct gtgttctgtt aattcatctc acagagttac atctttccct 60
tcaagaagcc tttcgctaag gctgttcttg tggaattggc aaagggatat ttggaagccc 120
atagagggct atggtgaaaa aggaaatatc ttcc 154
Claims (10)
1.一种检测Vero细胞基因组DNA片段大小分布的引物对的组合，其中，所述引物对的组合包括以下至少3组引物对；
第一引物对中的正向引物如SEQ ID NO: 2所示，反向引物如SEQ ID NO: 3所示；
第二引物对的正向引物如SEQ ID NO: 7所示，反向引物如SEQ ID NO: 8所示；
第三引物对的正向引物如SEQ ID NO: 11所示，反向引物如SEQ ID NO: 12所示；
第四引物对的正向引物如SEQ ID NO: 16所示，反向引物如SEQ ID NO: 17所示；
第五引物对的正向引物如SEQ ID NO: 20所示，反向引物如SEQ ID NO: 21所示。
2.如权利要求1所述的引物对的组合，其特征在于，所述引物对的组合至少包括下述组合：
所述第一引物对+所述第二引物对+所述第三引物对；
所述第二引物对+所述第三引物对+所述第四引物对+所述第五引物对。
3.一种检测Vero细胞基因组DNA的引物对，所述引物对选自以下引物对：
第一引物对中的正向引物如SEQ ID NO: 2所示，反向引物如SEQ ID NO: 3所示；
第二引物对的正向引物如SEQ ID NO: 7所示，反向引物如SEQ ID NO: 8所示；
第三引物对的正向引物如SEQ ID NO: 11所示，反向引物如SEQ ID NO: 12所示；
第四引物对的正向引物如SEQ ID NO: 16所示，反向引物如SEQ ID NO: 17所示；
第五引物对的正向引物如SEQ ID NO: 20所示，反向引物如SEQ ID NO: 21所示。
4.一种检测试剂，所述检测试剂包含权利要求1或2所述的引物对的组合或权利要求3所述的引物对。
5. 一种检测Vero细胞残留DNA片段大小分布的方法，所述方法包括：
利用权利要求1或2所述的引物对的组合或权利要求4所述的包含权利要求1或2所述的引物对的组合的检测试剂对待测样品进行PCR；和
检测PCR扩增产物，从而得到Vero细胞残留DNA片段大小分布的结果。
6. 一种检测Vero细胞基因组DNA的方法，所述方法包括：
利用权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的包含权利要求3所述的引物对的检测试剂对待测样品进行PCR；和
检测PCR扩增产物。
7.一种PCR试剂盒，所述试剂盒中包括容器以及位于所述容器中的权利要求1或2所述的引物对的组合或权利要求3所述的引物对。
8.一种PCR方法，包括步骤：
在一PCR检测体系中，利用权利要求1或2所述的引物对的组合或权利要求3所述的引物对扩增目标产物。
9.权利要求1或2所述的引物对的组合或权利要求4所述的包含权利要求1或2所述的引物对的组合的检测试剂的用途，用于检测待测对象中Vero细胞残留DNA片段大小分布。
10.权利要求3所述的引物对或权利要求4所述的包含权利要求3所述的引物对的检测试剂的用途，用于检测待测对象中是否存在Vero细胞基因组DNA。
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