JP2002372533A - 血液の検査方法、検査用チップ、並びに検査装置 - Google Patents

血液の検査方法、検査用チップ、並びに検査装置

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JP2002372533A JP2001179119A JP2001179119A JP2002372533A JP 2002372533 A JP2002372533 A JP 2002372533A JP 2001179119 A JP2001179119 A JP 2001179119A JP 2001179119 A JP2001179119 A JP 2001179119A JP 2002372533 A JP2002372533 A JP 2002372533A
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Kiwamu Akagi
究 赤木
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Tum Gene Inc
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer

Abstract

(57)【要約】 【課題】 患者への負担をかけずに、正確かつ簡便
に、腫瘍の進展状況や治療反応性を定量的に解析可能な
血液の検査方法を提供する。 【解決手段】 腫瘍細胞由来の変異因子を有するヒト血
漿を含むサンプル中の、該変異因子及び変異を有しない
正常因子を検出し、前記変異因子の量及び前記正常因子
の量の相対比を算出する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍の進展状況や
治療効果を把握するために人体から採取した血液を検査
する方法、及びその方法を実現するための検査用チップ
並びに検査装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】悪性腫瘍（がん）の進展状況を把握する
検査方法として、画像診断や腫瘍マーカーが用いられて
きたが、これらの検査で判定できないケースも多い。
【０００３】しかしながら、臨床においては、がんの進
展状況や治療効果を評価することは、治療方針を決定す
る上で重要であり、患者への負担が少なく、簡易に検査
する方法の確立が望まれている。
【０００４】このような背景から、血液中の微量物質を
検出する検査方法が提案されている。この方法は、がん
がゲノム（ＤＮＡ）上に変異を蓄積することに着目し
て、がん細胞由来のＤＮＡを検出するものである。これ
までに、がんの患者の血漿ないし血清中のＤＮＡ量が正
常人に比べて増加することから、血漿ないし血清中のＤ
ＮＡ濃度を測定することにより検査する方法が提案され
ている（Stroun M. et al. Isolation and characteriz
ation of DNA from the plasma of cancer patients. E
ur J Cancer Clin Oncol 1987 Jun 23(6) 707-712,
林友美他 血漿ＤＮＡの特定とＫ-ras gene変異検出へ
の応用 臨床病理 2000年 547-553）。また、がん固
有の変異ＤＮＡを血漿中に認めることにより、がん細胞
由来のＤＮＡが血漿中に存在することも報告されている
（de Kok JB, et al. Detection oftumour DNA in seru
m of colorectal cancer patients. Scand J Clin Lab
Invest 1997 Nov 57(7) 601, Esteller M, et al. De
tection of aberrant promoter hypermethylation of t
umor suppressor genes in serum DNA from non-small
cell lung cancer patients. Cancer Res 1999 Aug 1 5
9(1) 67-70）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記のように
がん患者の血漿ないし血清中のＤＮＡ濃度を測定する方
法は、細胞崩壊により血中へＤＮＡが流出することによ
ってＤＮＡ濃度が上昇するのを検出するものであるが、
このＤＮＡ濃度はもともと個人差があり、また、がん以
外の要因によっても変化するものであるため、実際に腫
瘍マーカーとして定量的に検査することが難しいという
問題がある。
【０００６】また、上記のようにがん細胞由来の変異Ｄ
ＮＡを検出する方法は、がんの有無を判定することはで
きるが、変異ＤＮＡの定性的検査にすぎない。
【０００７】本発明は、上記問題点を解決することを目
的とするものであり、腫瘍細胞由来の変異ＤＮＡの量や
単位体積当たりのコピー数等を把握することができるよ
うにし、患者への負担をかけずに、正確かつ簡便に、腫
瘍の進展状況や治療反応性を定量的に解析可能な血液の
検査方法等を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、鋭意研究の
結果、腫瘍細胞に特異的なＤＮＡの変化を目印（マーカ
ー）として、血漿中に存在するＤＮＡのうち腫瘍細胞由
来の変異因子の量及び変異を有しない正常因子の量の相
対比を算出することにより、正確かつ定量的に腫瘍の進
展状況を診断し得ることを見出した。
【０００９】すなわち、本発明の血液の検査方法は、腫
瘍細胞由来の変異因子を有するヒト血漿を含むサンプル
中の、該変異因子及び変異を有しない正常因子を検出
し、前記変異因子の量及び前記正常因子の量の相対比を
算出することを特徴とする。
【００１０】また、本発明の血液の検査方法は、腫瘍細
胞由来の変異因子を有するヒト血漿を含むサンプルを、
ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により該変異因子と変異を有しない
正常因子とに分離した後、該変異因子及び該正常因子を
検出し、該変異因子の量と該正常因子の量の相対比を算
出することを特徴とする。
【００１１】また、本発明の血液の検査方法は、腫瘍細
胞由来の変異因子を有するヒト血漿を含むサンプルを、
標識したプライマーを用いて競合的ＰＣＲ法により増幅
させた後、ＳＳＣＰ法により前記変異因子と変異を有し
ない正常因子とに分離し、前記標識した部分を検出し、
前記変異因子の量及び前記正常因子の量の相対比を算出
することを特徴とする。
【００１２】また、本発明の血液の検査方法は、腫瘍細
胞由来の変異因子を有するヒト血漿を含むサンプルと、
該腫瘍細胞由来の変異を含むＤＮＡ断片と相補的な塩基
対部分を有するプローブと、をハイブリダイゼーション
させて得られた反応生成物を電気化学的又は光学的に検
出する工程と、 前記サンプルと、前記変異を含まない
ＤＮＡ断片と相補的な塩基対部分を有するプローブと、
をハイブリダイゼーションさせて得られた反応生成物を
電気化学的又は光学的に検出する工程と、前記変異因子
の量及び前記正常因子の量の相対比を算出する工程と、
を含むものである。
【００１３】前記変異因子の量は、腫瘍細胞に特異的な
変異ＤＮＡ断片の個数であってもよい。この変異ＤＮＡ
断片は腫瘍細胞に特異的なものであれば特に限定されず
いかなるものであってもよく、例えば、がんで高頻度に
認めるＫ−ｒａｓ遺伝子の変異やｐ５３遺伝子の変異等
の変異ＤＮＡ断片が挙げられる。
【００１４】前記正常因子の量は、正常細胞由来のＤＮ
Ａ断片及び腫瘍細胞由来ではあるが変異を有しないＤＮ
Ａ断片の個数であってもよい。
【００１５】本発明の血液の検査方法は、腫瘍細胞由来
の変異因子を有するヒト血漿を含むサンプルの単位体積
中の、該腫瘍細胞由来の変異を含むＤＮＡ断片の個数を
検出することを特徴とする。
【００１６】また、本発明は、前記腫瘍細胞由来の変異
を含むＤＮＡ断片と相補的な塩基対部分を有するプロー
ブと、該変異を含まないＤＮＡ断片と相補的な塩基対部
分を有するプローブと、が固定された検査用チップを提
供する。
【００１７】本発明は上記の検査用チップを備えた検査
装置を提供する。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明に係る血液の検査方法、検
査用チップ及び検査装置の実施の形態を図面を参照しな
がら以下に説明する。なお、図面は本発明の一実施の形
態にすぎず、これに限定されるものではない。
【００１９】（血液の検査方法）本発明の血液の検査方
法は、腫瘍細胞由来の変異因子を有するヒト血漿を含む
サンプル中の、該変異因子及び変異を有しない正常因子
を検出し、前記変異因子の量及び前記正常因子の量の相
対比を算出することを特徴とする。
【００２０】腫瘍細胞とは、ヒトの体細胞の一部が過剰
に増殖したものであり、胃がん、肝臓がん等のがん、リ
ンパ腫、骨肉腫等の肉腫、白血病等の悪性腫瘍や、良性
腫瘍が該当する。
【００２１】変異とは、腫瘍細胞に特異的なＤＮＡの変
化を有する部分である。具体的には、腫瘍細胞に特異的
にゲノムの塩基配列が変異（欠損、挿入、置換等）した
ものを指すが、ＤＮＡのメチル化（メチレーション）等
の変化を有するものでもよい。
【００２２】ヒト血漿とは、ヒトの血液中から血球を取
り除いた部分をいう。本検査方法においては、血液、血
漿、血清、これらを所定条件で前処理したもの、のいず
れを検出の対象（サンプル）としてもよい。例えば、血
漿中の変異因子及び正常因子を検出しても、血漿からさ
らに血液凝固因子を取り除いた血清中の変異因子及び正
常因子を検出しても、血液中の変異因子及び正常因子を
検出してもよい。あるいは、血漿ないしは血清を所定条
件で前処理した後、当該処理液中に含まれる変異因子及
び正常因子を検出してもよい。
【００２３】変異因子の量及び正常因子の量の相対比
は、例えば、以下の（１）式により求められる。以下の
式において、変異ＤＮＡ断片の個数とは、腫瘍細胞由来
であって変異を有するＤＮＡ断片の個数であり、正常Ｄ
ＮＡ断片の個数とは、正常細胞由来のＤＮＡ断片の個数
＋腫瘍細胞由来ではあるが変異を有しないＤＮＡ断片の
個数の和である。
【００２４】 相対比＝変異ＤＮＡ断片の個数／正常ＤＮＡ断片の個数 …（１） 腫瘍細胞が増大したり、治療による腫瘍細胞の崩壊が起
こった場合には、上記比率は大きくなり、一方、腫瘍細
胞が退縮して血漿中へのＤＮＡの放出量が減少した場合
には、上記比率は小さくなる。
【００２５】このように、変異因子の量及び正常因子の
量の相対比を数値として算出するので、血漿中ＤＮＡ濃
度に個人差があっても正確にがんの進展状況を検査する
ことができる。
【００２６】前記腫瘍細胞由来の変異は、腫瘍細胞のゲ
ノム中に存在する変異のすべてが対象となる。例えば、
変異としては、がん患者に高頻度に認められるＫ−ｒａ
ｓ遺伝子の変異又はｐ５３遺伝子の変異が挙げられる。
これらの変異を有する腫瘍細胞由来ＤＮＡ断片の量及び
変異を有しないＤＮＡ断片の量の相対比を算出すること
により、定量的かつ正確に瀕回にわたりがんの進展状況
を検査することができる。
【００２７】上記検査方法においては、腫瘍細胞由来の
変異因子を有するヒト血漿を含むサンプルを、ＰＣＲ−
ＳＳＣＰ法により該変異因子と変異を有しない正常因子
とに分離した後、該変異因子及び該正常因子を検出し、
該変異因子の量と該正常因子の量の相対比を算出しても
よい。
【００２８】例えば、腫瘍細胞由来の変異因子を有する
ヒト血漿を含むサンプルを、蛍光物質等で標識したプラ
イマーを用いて競合的ＰＣＲ法により増幅させた後、Ｓ
ＳＣＰ法により前記変異因子と変異を有しない正常因子
とに分離し、前記標識した部分を検出し、前記変異因子
の量及び前記正常因子の量の相対比を算出してもよい。
変異因子と正常因子とが共存した状態において、同一の
プライマーを用いて競合的ＰＣＲ法により増幅させた
後、それぞれの量を測定して相対比を算出してもよい。
本方法が有効なのは、競合的ＰＣＲ法により増幅させる
前の両因子の存在比率、及び増幅後の存在比率は同一で
あるためである。
【００２９】あるいは、標識したプライマーを用いるの
ではなくＳＳＣＰ法により変異因子と正常因子とを分離
する前又は後に、変異因子及び正常因子を標識し、これ
らを検出して変異因子及び正常因子の相対比を算出して
もよい。
【００３０】さらには、腫瘍細胞由来の変異因子を有す
るヒト血漿を含むサンプルと、該腫瘍細胞由来の変異を
含むＤＮＡ断片と相補的な塩基対部分を有するプローブ
と、をハイブリダイゼーションさせて得られた反応生成
物を電気化学的又は光学的に検出する工程と、前記サン
プルと、前記変異を含まないＤＮＡ断片と相補的な塩基
対部分を有するプローブと、をハイブリダイゼーション
させて得られた反応生成物を電気化学的又は光学的に検
出する工程と、前記変異因子の量及び前記正常因子の量
の相対比を算出する工程と、を含む検査方法であっても
よい。
【００３１】前記変異を含むＤＮＡ断片と相補的な塩基
対部分を有するプローブを用いた検出工程と、前記変異
を含まないＤＮＡ断片と相補的な塩基対部分を有するプ
ローブを用いた検出工程とは、いずれかの検出工程を先
に行ない他方を後に行なってもよく、あるいは、両検出
工程を同時に行なってもよい。すなわち、前者の検出工
程用のプローブを固定した検出用チップと、後者の検出
工程用のプローブを固定した検出用チップと、をそれぞ
れ用いて順次検出してもよいし、あるいは、両プローブ
を固定した検出用チップを用いて同時に検出してもよ
い。
【００３２】プローブとは、サンプル中のＤＮＡ断片を
探索する探索子の意味である。プローブとしては、ＤＮ
Ａ断片と相補的な塩基対部分を有するＤＮＡが用いら
れ、具体的には、ＰＣＲ産物、オリゴヌクレオチド、ｍ
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＮＡ（peptidic nucleic aci
d）、またはＬＮＡ（locked nucleic acid；Proligo
LLC社商標）等が用いられる。
【００３３】反応生成物を光化学的に検出する場合に
は、蛍光物質で修飾されたヌクレオチドからなるプライ
マー（蛍光プライマー）を用いてＰＣＲを行い、その産
物をオートＤＮＡシークエンサーにより解析することが
できる。
【００３４】また、サンプルとなるＤＮＡやＲＮＡを蛍
光標識し、ハイブリダイゼーション後、蛍光スキャナー
で読み取り、シグナル強度を解析することによっても光
学的に検出することができる。蛍光標識されたサンプル
は、相補的な配列を持つＤＮＡプローブに結合し、蛍光
画像として定量的に測定される。小片に多数のプローブ
をアレイ状に配置したＤＮＡチップを用いることで、測
定が簡単となる。
【００３５】一方、精度よく定量的に検出する上では、
電気化学的に検出することが好ましい。電気化学的検出
は、例えば、反応生成物に流れる電流値の変化を検出す
ることにより行う。
【００３６】電気化学的検出を行なう場合、反応生成物
にインターカレータを反応させ、検出電流値の変化を測
定することが好ましい。
【００３７】インターカレータとしては、フェロセン、
カテコールアミン、金属ピピリジン錯体、金属フェナン
スリン錯体、ピオローゲン、またはこれら化合物を導入
した縫い込み型インターカレータを有効成分とするもの
が挙げられ、特に好ましくは、フェロセン縫い込み型イ
ンターカレータである。
【００３８】インターカレータは、二本鎖の層間に侵入
し、一種の電荷移動錯体を形成する。インターカレーシ
ョンにより電極に流れる電流値が変化する。この電流は
二本鎖に結合したインターカレータの酸化還元反応によ
るものである。この電流値を検出することにより腫瘍細
胞由来の変異因子の量（例えば、腫瘍細胞由来ＤＮＡ断
片のモル濃度）が測定され得る。
【００３９】上記のように、サンプルとプローブとを反
応させ、得られた反応生成物を検出することにより、定
量的かつ正確に頻回にわたり腫瘍の進展状況を検査する
ことができる。
【００４０】本発明の異なる検査方法は、腫瘍細胞由来
の変異因子を有するヒト血漿を含むサンプルの単位体積
中の、該腫瘍細胞由来の変異を含むＤＮＡ断片の個数を
検出するものである。
【００４１】このように、サンプルの単位体積中（例え
ば、血漿１ｍｌ中）に含まれる変異ＤＮＡ断片の個数を
検出することにより、定量的かつ正確に腫瘍の進展状況
を検査することができる。すなわち、血漿中のＤＮＡ量
を単に測定するのではなく、変異ＤＮＡ断片の個数（濃
度）を測定するので、血漿中ＤＮＡ濃度に個人差がある
ことによる影響を受けず、正確に腫瘍の進展状況を検査
することができる。
【００４２】上述の検査方法においては、検査対象が組
織ではなく血液であり、患者から血液を採取して簡便か
つ定量的に検査することができるので、患者に負担をか
けることなく頻回にわたり検査を行ない、腫瘍の進展状
況を経時的に把握することができる。
【００４３】（プローブ）上述の検査方法に用いられる
プローブについて説明する。
【００４４】上述の検査方法に用いられるプローブは、
腫瘍細胞由来の変異因子に含まれるＤＮＡ断片と、相補
的な塩基対部分を有してなる。固定されるプローブは、
Ｋ−ｒａｓやｐ５３遺伝子の変異を有するＤＮＡ断片と
相補的な塩基対部分を有していてもよい。
【００４５】プローブとしては、上記の相補的な塩基対
部分を有する限り特に制限されず、例えば、生物試料か
ら抽出したＤＮＡを制限酵素で切断し、電気泳動による
分離などで精製したＤＮＡ、あるいは化学合成したＤＮ
Ａのいずれもが用いられる。プローブの配列は上記変異
因子に含まれるＤＮＡ断片（目的断片）に応じて、予め
決定しておく。
【００４６】（検査用チップ及び検査装置）上述の電気
化学的な検査方法に用いられる、検出用チップ及び検出
装置について説明する。
【００４７】図１は、本発明の検査装置の全体構成を説
明する斜視図である。図１において、本発明に係る検査
装置１１は、検査用チップ１２と、この検査用チップ１
２を差し込み可能な装入口２９を有し、プローブを電気
化学的に検出可能であり、かつ、ハイブリダイゼーショ
ンにより生じる二本鎖を電気化学的に検出可能とする測
定装置１３と、パソコン３５とから構成される。
【００４８】電気化学的な検出手段としては、サイクリ
ックボルタモグラム、デファレンシヤルパルスボルタモ
グラム、ポテンシオスタット等を用いることができる。
【００４９】図２は、検査用チップ１２の構造を示す図
である。図２に示すように、検査用チップ１２は、前記
プローブが固定された電極１０と、当該電極の対極であ
る共通電極（図示は省略する）と、を有してなり、前記
プローブと前記ＤＮＡ断片とがハイブリダイゼーション
して形成された二本鎖を、前記電極１０と前記共通電極
との間に電圧を印加することにより電気化学的に検出す
ることが可能である。
【００５０】すなわち、検出用チップ１２は、中央部に
窪み１８が形成されたフレーム１４と、該フレーム１４
に着脱可能に装着される本体部１５とから構成される。
窪み１８内には、溶液（プローブ、サンプル、インター
カレータ、洗浄液等）を充填することができるようにな
っている。本体部１５には、フレーム１４の窪み１８に
対応する領域に、多数のピン電極１０が均等に突設され
ている。窪み１８にプローブを含む溶液を注入し、ピン
電極１０の表面にプローブをその分子内ＳＨ基を介して
固定する。
【００５１】次に、窪み１８に所定の溶液を順次注入し
たり洗浄したりする操作を行い、ハイブリダイゼーショ
ン、インターカレーション等を行った後、検査用チップ
１２を上記装入口２９へ差し込み、共通電極用ターミナ
ル端子２７及び各ピン電極用ターミナル端子２０を、測
定装置の受け端子に接続し、選択スイッチを介して電圧
回路に接続し、共通電極と各ピン電極１０の間に弱い電
圧をかけると、インターカレータによりラベル化された
部位と、ピン電極１０との間には、電圧回路及び共通電
極を通して微弱電流が流れる。この電流を検出すること
により検出を行う。
【００５２】本発明に用いられる電極としては、プロー
ブを固定できるものであればいずれをも使用でき、好適
には金、グラシーカーボン、炭素などが挙げられる。
【００５３】プローブを電極に固定化する方法として
は、公知の方法が用いられる。例えば、電極が金である
場合、プローブ本体にチオール基（ＳＨ基）を導入し、
金と硫黄との金―硫黄配位結合を介してプローブが電極
に結合される。プローブ本体にチオール基を導入する方
法としては、Mizuo MAEDA，Koji NAKANO，Shinji UC
HIDA，and Makoto TAKAGI，Chemistry Letters，180
5−1808（1994）あるいはB.A.Connolly，Nucleic Acid
s Rs.,13，4484（1985）に記載されている。
【００５４】本検査用チップ及び検査装置を用いて、採
取した血液を検査することにより、簡易に検査すること
ができる。
【００５５】〔実施例〕以下に、実施例を挙げて説明す
るが、本願発明が実施例に限定されないことはいうまで
もない。
【００５６】（実施例１）大腸がん患者より採取した血
液から、遠心により血漿を分離し、これをproteinase
K、フェノール、クロロホルムで処理し、ＤＮＡを精製
した。これらのＤＮＡは、生体内の正常細胞及び腫瘍細
胞に由来する。
【００５７】このＤＮＡをテンプレートとして、腫瘍細
胞でのみ認められるＤＮＡの変異（Ｋ−ｒａｓ遺伝子の
変異）を含む領域を競合的ＰＣＲ法にて増幅させた。プ
ライマーは蛍光でラベル化したものを用いた。ＰＣＲ
は、９５℃で１０分間変性させた後、９４℃で３０秒，
６０℃で３０秒を４５〜５０サイクル、その後７２℃で
５分間反応させて増幅を行った。
【００５８】得られたＰＣＲ産物には、変異を含む変異
型ＤＮＡ断片と、変異を含まない正常型ＤＮＡ断片とが
含まれていた。変異型ＤＮＡ断片は、腫瘍細胞由来のＤ
ＮＡから増幅されたものであり、正常型ＤＮＡ断片は、
正常細胞および腫瘍細胞の正常アレル由来のＤＮＡより
増幅されたものである。これらは競合的ＰＣＲ法により
増幅されたものであるので、増幅後のＰＣＲ産物中の変
異型ＤＮＡ断片及び正常型ＤＮＡ断片の存在比率は、用
いたテンプレートＤＮＡ中の変異型ＤＮＡ断片及び正常
型ＤＮＡ断片の存在比率を反映していた。
【００５９】増幅されたＤＮＡ断片はオートシークエン
サーを用い、ＳＳＣＰ法により変異型ＤＮＡ断片と正常
型ＤＮＡ断片とに分離して、そのシグナルの強度によっ
て変異型ＤＮＡ断片及び正常型ＤＮＡ断片の存在比率を
測定した。
【００６０】測定された変異型ＤＮＡ断片のシグナル強
度をＭ、正常型ＤＮＡ断片のシグナル強度をＷとした場
合、Ｍ／Ｍ＋Ｗ又はＭ／Ｗでそれぞれ数値化した。
【００６１】前記大腸がん患者について、抗がん剤によ
る化学療法を行った際のＣＥＡ（carcinoembryonic an
tigen：がん胎児性抗原）と血漿ＤＮＡのＭ／Ｍ＋Ｗシ
グナル比の推移を図３に示す。図３に示すように、数値
の推移を経時的に調べたところ、化学療法を行ってから
約１２０日経過するまで、Ｍ／Ｍ＋Ｗシグナル比が約
０．１以下まで減少したが、これはＣＥＡの推移とパラ
レルであった。
【００６２】１２０日を経過後、再び増大したがん細胞
に対して化学療法を行ったところ、これががん細胞に特
異的に効いたため、死滅したがん細胞のＤＮＡが血中に
流出し、Ｍ／Ｍ＋Ｗシグナル比が急激に増加した。
【００６３】このことから、Ｍ／Ｍ＋Ｗシグナル比が、
がんの進展経過や治療効果を反映することが確認され
た。
【００６４】なお、別の大腸がん患者について、腫瘍を
外科的に切除したところ、この数値は漸減することが確
認された。
【００６５】（実施例２）本実施例は、精製した血漿Ｄ
ＮＡをアレル特異的プライマーを用いリアルタイムＰＣ
Ｒで変異型ＤＮＡ断片の個数と正常型ＤＮＡ断片の個数
の相対比を測定した点が実施例１と異なる。本症例で
も、変異型ＤＮＡ断片の個数Ｍと正常型ＤＮＡ断片の個
数Ｗの比率（濃度比）を上記のごとく数値化することに
より、腫瘍の進展を推定することができた。
【００６６】（実施例３）本実施例は、精製したＤＮＡ
を、変異型ＤＮＡ断片と相補的な塩基対部分を有するプ
ローブを固定した電極と反応させた。当該容器にインタ
ーカレータを注入し、ハイブリダイズして二本鎖を形成
したＤＮＡ断片を特異的に反応させた。検出電流値量の
変化を測定し、変異型ＤＮＡ断片のモル濃度を求めた。
【００６７】本実施例でも、検出電流値の変化を測定す
ることによって、変異型ＤＮＡ断片の個数Ｍと正常型Ｄ
ＮＡ断片の個数Ｗの比率（濃度比）を求め、これにより
腫瘍の進展状況を推測することができた。
【００６８】
【発明の効果】本発明に係る血液の検査方法、検査用チ
ップ及び検査装置は、腫瘍細胞由来の変異因子を有する
ヒト血漿を含むサンプル中の該変異因子の量及び変異を
有しない正常因子の量の相対比又は、変異を含むＤＮＡ
断片の個数を検出するものであるので、定量的かつ正確
に瀕回にわたり腫瘍の進展状況、転移、治療の効果、再
発の検査をすることができる。
【００６９】本発明によれば、悪性腫瘍の早期発見、術
後の腫瘍のトレース、薬物投与や化学治療の効果の調
査、適切な治療法の選択等を、定量的に正確かつ簡易に
行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明に係る検査装置の全体構成を説明す
る斜視図である。
【図２】 本発明に係る検査用チップの全体構成を説
明する斜視図である。
【図３】 実施例１の大腸がん患者におけるＣＥＡと
血漿ＤＮＡの推移を示すグラフである。
【符号の説明】
１１ 検査装置 １２ 検査用チップ １３ 測定装置 １４ 検査用チップのフレーム １５ 検査用チップの本体部 １８ 窪み １０ ピン電極 ２９ 測定装置の装入口 ３５ パソコン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/416 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｅ 33/483 33/566 37/00 １０２ 33/566 27/46 ３３６Ｍ 37/00 １０２ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆ Ｆターム(参考） 2G045 AA01 AA35 BB10 CB01 DA13 FA11 FB02 FB05 4B024 AA11 CA01 CA02 HA12 HA20 4B029 AA07 AA23 BB20 CC03 CC08 FA12 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ42 QR32 QR41 QR55 QR62 QR84 QS25 QS34 QX04

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 腫瘍細胞由来の変異因子を有するヒト血
    漿を含むサンプル中の、該変異因子及び変異を有しない
    正常因子を検出し、 前記変異因子の量及び前記正常因子の量の相対比を算出
    することを特徴とする血液の検査方法。
  2. 【請求項２】 腫瘍細胞由来の変異因子を有するヒト血
    漿を含むサンプルを、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法により該変異
    因子と変異を有しない正常因子とに分離した後、該変異
    因子及び該正常因子を検出し、該変異因子の量と該正常
    因子の量の相対比を算出することを特徴とする血液の検
    査方法。
  3. 【請求項３】 腫瘍細胞由来の変異因子を有するヒト血
    漿を含むサンプルを、標識したプライマーを用いて競合
    的ＰＣＲ法により増幅させた後、ＳＳＣＰ法により前記
    変異因子と変異を有しない正常因子とに分離し、前記標
    識した部分を検出し、 前記変異因子の量及び前記正常因子の量の相対比を算出
    することを特徴とする血液の検査方法。
  4. 【請求項４】 腫瘍細胞由来の変異因子を有するヒト血
    漿を含むサンプルと、該腫瘍細胞由来の変異を含むＤＮ
    Ａ断片と相補的な塩基対部分を有するプローブと、をハ
    イブリダイゼーションさせて得られた反応生成物を電気
    化学的又は光学的に検出する工程と、 前記サンプルと、前記変異を含まないＤＮＡ断片と相補
    的な塩基対部分を有するプローブと、をハイブリダイゼ
    ーションさせて得られた反応生成物を電気化学的又は光
    学的に検出する工程と、 前記変異因子の量及び前記正常因子の量の相対比を算出
    する工程と、を含む血液の検査方法。
  5. 【請求項５】 前記変異因子の量は、Ｋ−ｒａｓ遺伝子
    の変異若しくはｐ５３遺伝子の変異を有するＤＮＡ断片
    の個数である請求項１ないし４のいずれか一項に記載の
    血液の検査方法。
  6. 【請求項６】 前記正常因子の量は、正常細胞由来のＤ
    ＮＡ断片及び腫瘍細胞由来ではあるが変異を有しないＤ
    ＮＡ断片の個数である請求項１ないし５のいずれか一項
    に記載の血液の検査方法。
  7. 【請求項７】 腫瘍細胞由来の変異因子を有するヒト血
    漿を含むサンプルの単位体積中の、該腫瘍細胞由来の変
    異を含むＤＮＡ断片の個数を検出することを特徴とする
    血液の検査方法。
  8. 【請求項８】 請求項４記載の血液の検査方法に用いら
    れる検査用チップであって、前記腫瘍細胞由来の変異を
    含むＤＮＡ断片と相補的な塩基対部分を有するプローブ
    と、該変異を含まないＤＮＡ断片と相補的な塩基対部分
    を有するプローブと、が固定された検査用チップ。
  9. 【請求項９】 請求項８記載の検査用チップを備えた検
    出装置。
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