KR100940598B1 - Ｄｎａ검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DNA의 트레이스 분석을 위한 농축, 분리 및 전기화학적 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 DNA 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking)단계 및 개질한 스태킹 완충액을 이용하여 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection)단계를 수행하는 농축채널과; 개질한 분리 완충액을 이용하여 마이크로칩 젤 전기영동을 통한 전기화학적 검출(MGE-ED)을 수행하는 검출채널을 포함하는 DNA 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 DNA 검출방법을 제공한다. 본 발명에 의하면 농축, 분리 및 전기화학적 검출을 함께 적용하여 고감도이고, 간단하며 직접적인 DNA 검출이 가능하다는 장점이 있다.

DNA, 전기화학적 검출, 농축방법, 마이크로칩

Description

ＤＮＡ검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 검출방법{Microchip for detecting trace of DNA and detection method using the same}

본 발명은 DNA검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 DNA 검출방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 DNA의 트레이스 분석을 위한 농축, 분리 및 전기화학적 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 DNA 검출방법에 관한 것이다.

최근 들어 민감하고, 선택적인 DNA의 검출방법이 법정, 의학적 진단 및 진화연구 등에 매우 중요한 사항이 되고 있어, 휴대하기 편리하고 적정한 가격의 마이크로칩 장치를 만들기 위한 많은 노력이 있었다.

마이크로칩은 생물학 및 생물화학적 검사에 있어서 급격한 변화를 가져왔지만, 작은 시료주입부피 및 광학측정에 이용되는 짧은 경로 길이로 인하여 트레이스분석에서 마이크로칩의 사용은 다소 제한적이었다.

상기 문제점을 극복하기 위한 방안으로 검출에 앞서서 DNA시료를 농축(Preconcentration)하는 방법이 제시되었고, 현재까지 동전기적 트래핑(electrokinetic trapping)(Dai, J.; Ito, T.; Sun, L.; Crooks, R.M., J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 13026), 유류에서의 캡쳐장치(capture device in flowing stream)(Park, S.R.; Swerdlow, H., Anal . Chem . 2003, 75, 4467), 다공성 입자(size exclusion)(Khandurina, J.; Jacobson, S.C.; Waters, L.C.; Foote, R.S.; Ramsey, J.M., Anal . Chem. 1999, 71, 1815), 막-매개 장착기술(membrane-mediated loading techniques)(Guttman, A. Anal. Chem . 1999, 71, 3598), 등속전기영동(isotachophoresis), 염기 쌓임(base stacking) 및 전기삼투흐름(electroosmotic flow; EOF) 등을 이용한 다양한 DNA 농축 방법이 종래 마이크로칩 및 모세관 전기영동에 적용되었다.

그러나 DNA의 트레이스분석을 하는데 있어서 종래 방법들의 감도는 만족스럽지 못하였다. 이와 같이 DNA를 분석하기 위해 소형화되고 간단하며, 고감도의 농축 방법의 필요성이 커지고 있다.

여러 농축방법들 중에서도 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking; FASS) 및 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection; FASI)은 마이크로 칩 전기영동 시스템에서 전통적으로 가장 널리 사용되어 오던 방법이다. 그러나 상기 방법들을 마이크로칩 시스템에 적용하는 것은 마이크로칩 내의 다양한 채널들 사이에 열린 커뮤니케이션(open communication)으로 인하여 미세채널 내 분석대상물의 움직임 및 그 흐름을 컨트롤하는데 어려움이 있었다.

상기 문제점을 해결하기 위하여 종래에는 게이티드 주입(gated injection), 복잡한 채널구조형성 및 다공성의 고분자필름을 사용하는 방법 등이 있었고, 최근에는 열린 시스템으로 T-cross채널을 이용한 온-칩 농축 방법이 제시되어 약 160배의 감도향상을 가져올 수 있게 되었으며, 페놀분석을 위한 전기화학적 검출방 법(ED)과 결부된 온-칩 농축기술이 개발되고 있어 마이크로칩 구조의 복잡성을 줄이고, 칩 조작과 결합되어 약 5200배의 감도향상을 가져올 것으로 기대되고 있다.

여기에 현재까지 가장 좋은 방법으로 알려진 FASS 및 FASI 단계를 이용하면서 보다 간단하고 직접적인 고감도의 DNA 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 검출방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 따라 창출된 것으로서, 마이크로칩 젤 전기영동을 위한 전기화학적 검출방법과 함께 FASS 및 변형된 FASI 농축단계를 이용하여 간단하고 재생성이 향상된 고감도의 DNA 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 DNA 검출방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 DNA 검출용 마이크로칩은, 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking; FASS)단계 및 개질한 스태킹 완충액을 이용하여 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection; FASI)단계를 수행하는 농축채널과; 개질한 분리 완충액을 이용하여 마이크로칩 젤 전기영동을 통한 전기화학적 검출(MGE-ED)을 수행하는 검출채널을 포함한다.

상기 개질한 스태킹 완충액은 구연산 안정화된 금 나노입자 및 구연산나트륨을 함유하는 아세테이트 완충액에 흡착성의 코팅분리모체로 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC)를 부가하여 혼합한 것이고, 상기 개질한 분리 완충액은 구연산 안정화된 금 나노입자 및 구연산나트륨을 함유하는 트리스-염산 완충액에 코팅분리모체로 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC)를 부가하여 혼합한 것이 바람직하다.

여기서 상기 농축채널은, 시료가 주입되는 시료주입부; 및 염기성 완충액이 저장되고, 상기 시료주입부로부터 공급된 시료의 일부가 배출되는 제1시료배출부를 포함하는 제1채널; 및 필드 증폭 시료 스태킹을 이용하여 전위 차이에 따라 시료를 농축하는 제1농축부; 필드 증폭 시료 주입을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축하는 제2농축부; 및 물이 주입되고, 상기 개질한 스태킹 완충액이 저장되는 제1완충액저장부를 포함하는 제2채널을 구비하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 검출채널은, 상기 개질한 분리 완충액이 저장되는 제2완충액저장부; 개질한 분리 완충액이 저장되고, 시료의 일부가 배출되는 제2시료배출부; 및 내부에 전극부가 구비되고 시료를 검출하는 검출부를 포함하는 것이 바람직하다.

아울러 상기 전극부는 기준전극, 반대전극 및 전도성고분자/금 나노입자 변형작동전극을 포함하며, 상기 전도성고분자/금 나노입자 변형작동전극은 전도성고분자 및 금 나노입자의 혼합물을 이용하여 전극 표면을 화학적으로 개질한 전극인 것이 바람직하다.

또한, 상기 전도성고분자는 폴리-5,2':5,2"-터셔리티오펜-3‘-카르복시산(poly-5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid; pTTCA), 폴리-3'-브로모-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-bromo-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3',4'-디아미노-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3',4'-diamino-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3'-살리실알데히드-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-salicylaldehyde-2,2':5',2"-terthiophene) 및 폴리-3'-보론-디히드록시-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-boron-dihydroxy-2,2':5',2"-terthiophene)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하다.

뿐만 아니라, 본 발명의 DNA 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 DNA 검출방법은 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking)을 수행하여 시료를 농축하는 제1농축단계; 개질한 스태킹 완충액을 이용하여 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection)을 수행하여 시료를 농축하는 제2농축단계; 및 개질한 분리 완충액을 이용하여 마이크로칩 젤 전기영동을 통한 전기화학적 검출(MGE-ED)을 수행하는 분리 및 검출단계를 포함한다.

여기서 상기 제1농축단계는, 시료주입부에 시료를 주입하는 시료주입단계;

상기 시료주입부에 양극전압을 인가하고 제1시료배출부를 접지시켜, 시료가 상기 제1시료배출부 측으로 이동되도록 하는 제1시료배출부 이동단계; 및 상기 시료주입부를 플로팅시키며 제1시료배출부에 양극전압을 인가하고 제1농축부를 접지시켜, 필드 증폭 시료 스태킹을 수행하여 전위 차이에 따라 시료를 농축시키고 농축된 시료가 제1농축부 측으로 이동되도록 하는 제1농축부 이동단계를 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 제2농축단계는, 제1완충액저장부에 물을 주입한 다음, 개질한 스태킹 완충액을 주입하는 제1완충액저장부 주입단계; 및 상기 제1농축부에 음극전압을 인가하고 상기 제1완충액저장부를 접지시켜, 필드 증폭 시료 주입을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축시키고 농축된 시료가 제2농축부 측으로 이동되도록 하는 제2농축부 이동단계를 포함하는 것이 바람직하다.

게다가, 상기 분리 및 검출단계는, 제2농축부에 음극전압을 인가하고, 제2시료배출부를 접지시켜, 시료가 제2시료배출부 측으로 이동되도록 하는 제2시료배출부 이동단계; 상기 제2농축부와 상기 제2시료배출부를 플로팅시키고, 개질한 분리 완충액이 저장된 제2완충액저장부에 음극전압을 인가하고, 검출부를 접지시켜 시료 가 검출부 측으로 이동되도록 하는 검출부 이동단계; 및 마이크로칩 젤 전기영동을 수행하여 시료를 분리하고, 전도성고분자/금 나노입자 변형전극을 이용하여 상기 분리된 시료를 검출하는 검출단계를 포함하는 것이 바람직하다.

앞서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 검출방법을 이용하면 금 나노입자를 이용하여 개질한 분리 완충액, 스태킹 완충액 및 전도성고분자/금 나노입자 변형전극을 사용하여 MGE-ED를 수행함으로써 높은 감도와 재생성을 나타내는 DNA 분석을 위한 전기화학적 검출방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 DNA 검출용 마이크로칩 및 이를 이용한 검출방법을 이용하면 민감도, 효율성, 선택성, 재생성, 소형화 및 반응물 소비의 감소를 가져올 수 있어 질병의 초기단계에서 트레이스단계의 질병징후를 검출함으로써 필드 분석 및 질병의 진단을 수행할 수 있다는 장점이 있다.

이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

이하, 도1을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 DNA 화합물 검출용 마이크로칩을 설명하도록 한다. 도1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출용 마이크로칩의 채널 패턴도이다.

본 발명에 따른 DNA 검출용 마이크로칩(10)은 제1채널(110) 및 제2채널(130)을 포함하는 농축채널(100) 및 검출채널(200)을 구비한다.

상기 제1채널(110)은 시료주입부(111), 제1시료배출부(113) 및 좁은 시료채널(NSC) T자 인젝터를 구비하고, 상기 제2채널(130)은 제1농축부(115), 제2농축부(133) 및 제1완충액저장부(135)을 구비하고, 상기 검출채널(200)은 제2완충액저장부(201), 제2시료배출부(203), 검출부(205) 및 이중 T자 인젝터를 구비한다.

상기 시료주입부(111)를 통해 시료가 주입되고, 상기 시료주입부(111)에서 공급된 시료의 일부는 상기 제1시료배출부(113)로 배출된다. 또한, 상기 제1농축부(131)는 필드 증폭 시료 스태킹(FASS)방법을 이용하여 전위 차이에 따라 시료를 농축한다.

상기 제1채널(110)은 제1시료배출부(113) 및 제1농축부(131)가 연통되도록 형성되고, 상기 제1시료배출부(113) 및 제1농축부를 연통시켜주는 채널의 일측에 분기되어 상기 시료주입부(111)를 연통시켜주는 좁은 시료채널(NSC) T자 인젝터를 구비한다.

상기 제2농축부(133)는 필드 증폭 시료 주입(FASI)방법을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축하고, 상기 제1완충액저장부(135)를 통해 물 플러그 및 개질한 스태킹 완충액이 주입되고 상기 개질한 스태킹 완충액이 저장된다. 상기 제2채널(130)은 제1농축부(131), 상기 제2농축부(133) 및 상기 제1완충액저장부(135)가 서로 연통되도록 형성된다.

또한, 상기 제2완충액저장부(201)에는 개질한 분리 완충액이 저장되고, 상기 제2시료배출부(203)에는 개질한 분리 완충액이 저장되며, 시료의 일부가 배출된다. 또한, 상기 검출부(205)는 내부에 전극부를 구비하고, 상기 전극부를 통하여 분리된 시료를 검출한다.

상기 스태킹 완충액을 개질하기 위해서는 구연산-안정화된 금 나노입자(citrate-stabilized AuNPs) 및 구연산삼나트륨(trisodium citrate)을 포함하는 아세테이트 완충액에 2~3%(w/v)의 하이드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose; HPC)를 부가하여 혼합한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 분리 완충액을 개질하기 위해서는 구연산-안정화된 금 나노입자 및 구연산삼나트륨을 포함하는 트리스-염산(Tris-HCl) 완충액에 2~3%(w/v)의 HPC를 부가하여 혼합한 것을 사용하는 것이 바람직하다.

여기서, 상기 스태킹 완충액 및 분리 완충액을 개질하는 경우 미세채널을 쉽게 채울 수 있어야 하므로 낮은 점도를 가진 흡착성의 코팅 분리모체로서 HPC를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 HPC를 사용하면 어떤 표면 개질이나 채널 표면의 조 절이 필요하지 않고, 코팅의 불균등, 채널 부착물 및 한정된 안정성과 같은 문제가 생기지 않는다는 장점이 있다.

상기 HPC를 2%(w/v)미만으로 사용하는 경우 이동시간은 짧아지지만, 분해능이 떨어진다는 문제점이 있고, 3%(w/v)를 초과하여 사용하는 경우 분해능의 관점에서는 보다 바람직할 수 있으나, 이동시간을 길게 하므로 문제가 있다. 따라서 이동시간과 분해능을 모두 고려한 2~3%(w/v)의 HPC를 사용하고, 보다 바람직하게는 2%(w/v)의 HPC를 사용한다.

상기 검출채널(200)은 도1에 나타난 바와 같이, 상기 제2완충액저장부(201) 및 검출부(205)가 연통되도록 형성되며, 상기 제2완충액저장부(201) 및 검출부(205)를 연통시키는 채널의 일측에서 이중-T자 인젝터에 의해 상기 제2농축부(133) 및 제2시료배출부(203)가 서로 연통되도록 형성된다.

상기 전극부는 기준전극, 반대전극 및 작동전극을 구비하며, 상기 기준전극은 은/염화은을 사용하고, 상기 반대전극은 백금선 와이어를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 작동전극은 전도성고분자를 전기중합에 의해 코팅시키고, 상기 전도성고분자가 코팅된 전극에 선형주사 전압전류법(linear sweep voltammetry)에 의해 금 나노입자를 전기침전(electrodeposition)시켜 전도성고분자/금 나노입자 변형작동전극으로 사용하는 것이 바람직하다.

상기와 같은 전도성고분자는 바이오센서 시스템에서 생물분자를 고정시키는 모체 및 DNA 혼성화를 포함하는 생물분자의 검출을 위한 촉매로 주목받고 있다. 전 도성 고분자를 포함하는 나노입자는 공유결합을 통해서 많은 양의 생물분자들을 고정시키는데 유리하도록 높은 표면적을 갖고, 결과적으로 안정하고 정밀한 바이오센서를 제공한다.

본 발명에 사용되는 전도성고분자는 폴리-5,2':5,2"-터셔리티오펜-3‘-카르복시산, 폴리-3'-브로모-2,2':5',2"-터셔리티오펜, 폴리-3',4'-디아미노-2,2':5',2"-터셔리티오펜, 폴리-3'-살리실알데히드-2,2':5',2"-터셔리티오펜 및 폴리-3'-보론-디히드록시-2,2':5',2"-터셔리티오펜으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 폴리-5,2':5,2"-터셔리티오펜-3‘-카르복시산(pTTCA)을 사용한다.

상기 pTTCA를 사용하는 경우 3번 위치에 COOH가 치환된 terthiophene 모노머를 이용하여 전도성고분자를 만들었을 때, 다른 군들에 비해 고분자 형성시 작용기에 의한 입체 장애가 작기 때문에 고분자를 잘 형성 할 수 있는 이점을 가지고 있으며, 특히 전도성고분자에 작용기로 도입된 COOH는 바이오 물질과 매우 탁월한 반응을 가지므로 전도성고분자를 이용한 바이오센스 연구에 매우 유용한 효과를 나타낸다.

또한, 금속나노입자들은 감도 높고, 선택적인 바이오분석기를 고안하는데 효과적이어서 전기화학적 반응을 위한 전기촉매로서 큰 주목을 받아 왔다. 이와 같이 전기화학적 검출기의 감도를 향상시키기 위해서 바이오분석에 사용되어 오던 금속나노입자들을 사용함으로써 신호의 향상을 가져올 수 있다.

금속나노입자 중에서도 금 나노입자(AuNPs)는 크기의존적인 전기적 특성, 높 은 표면적과 부피비율, 전기촉매적인 활동, 화학적 변형의 용이성 및 바이오분자들과의 구조적, 기능적 양립성으로 인하여 바이오분석 중 특히 DNA분석에 유용할 수 있다.

이와 같이 용액 상에서 dsDNA산화에 기초한 DNA의 직접검출을 위한 금 나노입자들의 전기촉매적인 활동을 향상시키기 위해서는 전도성고분자 변형전극에 전기 침전되는 것이 바람직하다.

상기와 같은 검출구성으로 인하여 나노입자들 및 핵산들에 표식을 할 필요가 없어졌고, DNA의 검출을 증폭시키기 위하여 효소를 이용할 필요성도 없어졌다.

분리과학에서 나노입자의 유용성은 매우 큰데, 마이크로칩 시스템에서 콜로이달 금 나노입자는 방향족들의 구조적 이성질체들을 분석하는데 처음 사용되었다.

최근에는 금 나노입자를 포함하는 폴리(에틸렌옥사이드)(PEO) 및 금 나노입자에 흡착된 PEO가 모세관 전기이동(CE)을 이용한 8 내지 수천 bp범위에 있는 DNA의 분리에 사용되고 있으며, DNA와 구연산염철, DNA와 고분자/금 나노입자 모체 및 금 나노입자와 채널 벽 사이의 상호작용들은 DNA의 분해능을 향상시켰다. 상기 상호작용들은 마이크로칩 전기영동을 이용한 DNA의 농축에도 유용할 수 있다.

따라서 온-칩 DNA 농축에서 스태킹 및 분해 능력을 향상시키기 위해 분리 완충액 및 스태킹 완충액에 대한 개질제로서 금 나노입자를 사용하는 것이 바람직하다.

pTTCA/AuNPs 변형작동전극은 전도성고분자 및 금 나노입자의 혼합물을 이용하여 전극 표면을 화학적으로 개질한 전극으로 DNA에 대한 감도 높고, 직접적인 검 출을 가능하게 한다.

이하, 도2 내지 도3E를 참고하여 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법을 상세하게 설명하도록 한다.

도2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출용 마이크로칩을 이용한 DNA 검출방법의 흐름도이고, 도3A는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 제1시료배출부 이동단계를 나타낸 개념도이고, 도3B는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 제1농축부 이동단계를 나타낸 개념도이고, 도3C는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 제2농축부 이동단계를 나타낸 개념도이고, 도3D는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 제2시료배출부 이동단계를 나타낸 개념도이고, 도3E는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 검출부 이동단계를 나타낸 개념도이다.

우선 도2를 참조하면, 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법은 제1농축단계(S140), 제2농축단계(S150) 및 분리 및 검출단계(S160)를 포함한다.

상기 검출방법을 수행하기에 앞서, 염화금-산, 염화금 및 브롬화금-산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나와 구연산삼나트륨, 구연산칼슘 및 구연산삼암모늄으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 함유하는 수용액에 수소화붕소나트륨용액, 수소화알루미늄리튬 및 다이이소프로필아민 리튬으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 용액을 부가하여 콜로이달 금 나노입자를 합성한다.

그리고 구연산-안정화된 금 나노입자 및 구연산삼나트륨을 함유하는 아세테이트 완충액에 코팅분리모체로 2~3%(w/v)의 HPC를 부가하고 교반한 후에 진공상태 로 만들어주어 개질한 스태킹 완충액을 준비하고, 상기 개질한 스태킹 완충액과 동일한 방법으로 구연산-안정화된 금 나노입자 및 구연산삼나트륨을 함유하는 트리스-염산 완충액에 2~3%(w/v)의 HPC를 부가하고 교반한 후에 진공상태로 만들어주어 개질한 분리 완충액을 준비한다.

또한, 미세전극을 황산용액(H₂SO₄)에 세척하여 테트라부틸암모늄 염/디클로로메탄(TBAP/CH₂Cl₂)용액에서 전도성고분자의 전기중합을 수행하고, 상기 전극에 존재하는 과량의 단량체를 제거하기 위하여 디클로로메탄을 이용하여 전극을 다시 세척한다. 다음으로 상기 전도성고분자가 코팅된 전극에 금 나노입자를 선형주사 전압전류법(linear sweep voltammetry)을 이용하여 전기 침전시킨다.

상기와 같이 금 나노입자를 이용하여 개질한 스태킹 완충액, 개질한 분리 완충액 및 전도성고분자/금 나노입자 변형전극을 준비한 후, 이를 이용하여 DNA검출을 수행한다.

본 발명의 DNA 검출방법에 있어서 각 단계는 보다 구체적으로 세분화되는데, 상기 제1농축단계는 시료주입단계(S141), 제1시료배출부 이동단계(S142) 및 제1농축부 이동단계(S143)를 포함한다.

상기 시료주입단계(S141)는 시료주입부(111)에 시료를 주입하는 단계이다.

제1농축부(131)를 진공으로 만들어주어 제1채널(110)을 염기성 완충액으로 채우고, 시료주입부(111)에 시료를 채운다(S141).

상기 제1시료배출부 이동단계(S142)는 도3A를 참고하면, 시료를 주입한 시료 주입부(111)에 양극전압을 인가하고 제1시료배출부(113)를 접지시키는 단계이다.

제1농축부(131)를 플로팅(floating)시키고 전류가 안정될 때까지 시료주입부(111)에 양극전압을 인가하여 시료주입부(111)에 주입된 시료를 제1시료배출부(113)측으로 이동시킨다(S142).

상기 제1농축부 이동단계(S142)는 도3B를 참고하면, 시료주입부(111)를 플로팅(floating)시키고 제1시료배출부(113)에 양극전압을 인가하고 제1농축부(131)를 접지시키는 단계이다.

FASS단계에서 시료주입부(111)에 양극전압을 인가하여 시료가 이동되면 이어서 FASS단계를 시작하기 위해 제1시료배출부(113)에 양극전압을 인가한다. FASS단계 동안 시료는 제1채널에 나타난 강한 전기삼투흐름(electroosmotic flow; EOF)에 의하여 음극쪽으로 이동한다. 이때, 상기 시료의 이동경계에서 상기 시료의 이동속도는 감속되고 좁은 시료영역이 형성되어 시료농축이 일어난다.

즉, 시료는 필드 증폭 시료 스태킹방법(FASS)에 따라 농축되고, 농축된 시료가 제1농축부 측으로 이동한다(S143).

또한, 상기 제2농축단계(S150)는 제1완충액저장부 주입단계(S151) 및 제2농축부 이동단계(S152)를 포함한다.

상기 제1완충액저장부 주입단계(S151)는 제1완충액저장부(135)에 전도성이 낮은 물을 주입한 다음 낮은 pH를 갖는 스태킹 완충액을 주입하는 단계이다.

이때, 보다 높은 전극의 분리효율을 위하여 제2채널(130)에 채워지는 물의 길이가 15 내지 55mm인 것이 바람직하며, 이어서 주입하는 스태킹 완충액은 낮은 pH를 갖는 개질한 스태킹 완충액을 사용한다. 이 단계는 pH 구배에 따라 시료를 농축하는 필드 증폭 시료 주입방법을 이용하기 위한 단계이다(S151).

상기 제2농축부 이동단계(S152)는 도3C를 참조하면, 제1농축부(131)에 음극전압을 인가하고 제1완충액저장부(135)를 접지시키는 단계이다. 이에 따라, 시료는 필드 증폭 시료 주입방법에 따라 농축되고, 농축된 시료가 제2농축부(133) 측으로 이동된다.

이때, 시료의 농축은 100 내지 150초 동안 수행되며, 상기 농축시간 미만인 경우에는 제2농축부(133)에 충분한 농축영역이 형성되지 않는 반면, 상기 농축시간을 초과하는 경우에는 제2농축부(133)로부터 농축영역을 펌프질할 수 있다.

그리고 상기 분리 및 검출단계(S160)는 제2시료배출부 이동단계(S161), 검출부이동단계(S162) 및 검출단계(S163)을 포함한다.

상기 제2시료배출부 이동단계(S106)는 도3D를 참조하면, 제2농축부(133)에 음극전압을 인가하고 제2시료배출부(203)를 접지시키는 단계이다. 이에 따라 시료가 제2시료배출부(203) 측으로 이동된다.

상기 검출부이동단계(S162)는 도3E를 참조하면, 제2농축부(133)와 제2시료배출부(203)를 플로팅시키고 제2완충액저장부(201)에 음극전압을 인가하고 검출부(205)를 접지시키는 단계이다. 이에 따라. 시료는 검출부(205)측으로 이동된다.

상기 검출단계(S163)는 검출부(108)측으로 이동된 시료를 마이크로칩 젤 전기영동을 이용하여 시료를 분리하고, 전극 표면이 화학적으로 개질한 작동전극을 이용하여 상기 분리된 시료를 검출하는 단계이다.

여기서, 상기 개질한 작동전극은 폴리-5,2':5,2"-터셔리티오펜-3‘-카르복시산(poly-5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid; pTTCA), 폴리-3'-브로모-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-bromo-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3',4'-디아미노-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3',4'-diamino-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3'-살리실알데히드-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-salicylaldehyde-2,2':5',2"-terthiophene) 및 폴리-3'-보론-디히드록시-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-boron-dihydroxy-2,2':5',2"-terthiophene)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 전도성고분자 및 금 나노입자의 혼합물을 이용하여 전극 표면을 화학적으로 개질한 전도성고분자/금 나노입자 변형작동전극인 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 DNA 검출용 마이크로칩을 이용한 DNA 검출방법을 실시예 1에 나타내었다.

[ 실시예1 ]

1) 실험재료의 준비

하이드록시프로필 셀룰로오스(hydroxypropyl cellulose; HPC)(1000000 MW), 디클로로메탄(didchloromethane)(99.8%, 무수, N₂가스에 봉인됨), 금 염화삼수화물(gold chloride trihydrate), 구연산삼나트륨(trisodium citrate), 수소화붕소나트륨(sodium borohydride) 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

테트라부틸암모늄 염(tetrabutylammonium; TBAP, 전기화학등급)은 Fluka로부 터 구입하고, 10^-5 Torr에서 진공으로 건조하였다. 터셔리티오펜-3‘-카르복시산(terthiophene-3'-carboxylic acid)는 앞선 연구(Lee, T.Y.;Shim, S.C., Synth . Met . 2002, 126, 105.)에서 보고된 방법에 의해 합성되었다. 아세트산나트륨(sodium acetate), 아세트산(acetic acid), 수산화나트륨(sodium hydroxide) 및 황산(sulfuric acid)은 Aldrich로부터 얻었다.

20bp(서열목록 1), 42bp(서열목록 2) 및 100bp(Bioneer Co., D-1030)의 증가분에서 100 내지 1000bp의 dsDNA단편 13개와 1200, 1600 및 2000bp의 추가적인 단편을 포함하는 100bp DNA ladder(135 ng/㎕)의 표준 DNA샘플들은 Bioneer Co.로부터 얻었다.

상기 100bp DNA ladder는 10mM, pH 8.0의 트리스-염산(Tris-HCL), 3mM 염화칼슘(CaCl₂) 및 몇몇 유기염료를 함유한 1mM의 EDTA를 포함한다. 1.0mM, pH 8.4의 트리스-염산 완충액에서 DNA시료의 저장액 및 표준 100bp DNA ladder(1.0ng/ml)를 준비하였고, 이어서 1.0mM 트리스-염산 완충액에서 매일 희석하였다.

그리고 100mM, pH 8.4의 트리스-염산 완충액이 FASS단계에서 스태킹 완충액으로 사용되었고, 20mM, pH 7.0의 트리스-염산 완충액이 마이크로칩 젤 전기영동을 이용한 전기화학적 검출(MGE-ED)단계에서 분리 완충액으로 사용되었다.

2) 실험기구의 준비

모든 전기화학적 실험들은 일정전위기/일정전류기(potentiostat/galvanostat)(Kosentech 모델 KST-P1™)를 이용하여 수행하였다. 고전압을 제공하는 데는 Spellman CZE 1000R™(NY)를 사용하고, AFM사진들은 0.04Nm^-1의 힘의 상수를 가지며 상업적으로 유용한 Si₃N₄캔틸레버를 이용한 Topometrix Discover System TMX 2010™로 얻었으며, SEM사진들은 KBSI의 Cambridge Stereoscan 240™로 얻었다.

자외선-가시광선 스펙트럼들은 UV-3101PC™, Schimadzu를 이용하여 얻었고, TEM사진들을 얻는 데는 200kV의 가속전압을 가진 JEOL JEM-2010™ 전자현미경(Jeol High-Tech Co.)을 사용하였다.

3) 마이크로칩의 제조

마이크로칩의 채널패턴을 보여주는 도3A 내지 도3E를 참고하면, DNA 검출용 마이크로칩은 앞선 연구(Shiddiky, M.J.A.; Kim, R.E.; Shim, Y.B., Electrophoresis 2005, 26, 3043)와 유사한 과정에 의해 제조하였다. 검출채널(길이=92mm)은 너비 150㎛의 이중 T자 인젝터를 구비한다.

제1채널(길이=60mm)은 좁은 샘플채널(NSC) T자 인젝터를 구비하였다(Jana, N.; Gearheart, L.; Murphy, C.J., Langmuir 2001, 17, 6782). NSC의 너비는 제1채널 너비의 1/6에 해당하는 25㎛이었다. 주입교점과 제1시료배출부(R2) 사이의 거리는 시료 플러그의 길이를 한정하였다. 제1채널에는 2.0mm 미만의 길이를 가진 시료 플러그만이 주입 가능하다.

제2채널의 길이는 80mm이다. 모든 채널의 깊이는 23㎛미만이고, 제1채널, 제2채널 및 검출채널의 너비는 각각 150㎛, 150㎛ 및 100㎛이다. 자가제작의 테프론 저장기(내경 1.0mm)를 에폭시 글루를 이용하여 마이크로칩의 각 홀에 끼워 넣었다.

미세주사기 바늘(microsyringe needle)은 에폭시 글루를 이용하여 주문제작한 오링(O-ring)을 가진 테프론 스크류로 용융실리카 모세관(내경 250㎛; 외경 350㎛)을 통하여 제1완충액저장부(R5)에 접촉하였다. 백금 와이어는 전압접촉을 위하여 개별저장기로 주입하였다.

100㎛ 백금 미세전극의 상세한 제조과정은 앞선 연구(Rahman, M.A.; Kwon, N.H.; Won, M.S.; Choe, E.S.; Shim, Y.B. Anal . Chem . 2005, 77, 4854)에서 기술한 것과 같은 과정을 수행하였다. 테프론 베이스는 마이크로칩을 고정하고, 전류측정 검출기를 수용하기 위하여 제조하였다.

상기 검출기는 은/염화은 기준전극, 백금 와이어 반대전극 및 pTTCA/AuNPs 변형작동전극을 구비하고, 상기 작동전극은 검출채널의 출구에 수평으로 정렬되어 있는 검출부(R8)에 위치하도록 하였다. 상기 검출채널의 출구와 작동전극 표면사이의 거리는 스크류를 이용하여 조절하였고, 상기 스크류는 현미경(iTPRO™, 모델 3.0)으로 관찰하였다.

4) 콜로이달 금 나노입자의 합성

금 나노입자는 앞선 연구(Jana, N.; Gearheart, L.; Murphy, C.J., Langmuir 2001, 17, 6782)에서 보고된 방법에 의해 합성하였다. 첫째, 2.5×10^-4M의 염화금-산(HAuCl₄)의 2.5×10^-4M의 구연산삼나트륨을 함유한 20ml 수용액을 원뿔 플라스크에 준비하였다.

이어서, 0.6mL의 얼음같이 차고 신선하게 준비된 0.1M의 수소화붕소나트륨용액을 상기 혼합용액에 부가하여 교반하였다.

상기 수소화붕소나트륨용액이 부가되자마자 용액은 입자형성을 나타내는 분홍빛으로 변하였다. 도4의 A에 나타낸 자외-가시부 스펙트럼의 521nm에서 흡착결합 및 도4의 B에 나타낸 TEM사진은 상기 용액의 입자크기가 3.5nm 미만이라는 것을 보여준다.

나노입자의 농도는 앞선 연구(Neiman, B.; Grushka, E.; Lev, O., Anal . Chem . 2001, 73, 5220)에서 나타낸 방법에 의해 계산하였고, 3.5nm미만의 금 나노입자에 대해 188nM로 측정하였고, 매일 적당한 완충용액에서 희석하였다.

5) 금 나노입자를 이용한 스태킹 및 분리 완충액의 변형

하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC)는 마이크로채널을 쉽게 채울 수 있도록 낮은 점도를 갖고 있기 때문에 흡착성의 코팅분리모체로서 사용하였다(Sanders, J.C.; Breadmore, M.C.; Kwok, Y.C.; Horsman, K.M.; Landers, J.P., Anal . Chem . 2003, 75, 986).

스태킹 완충액을 개질하기 위해서, 20nM의 구연산-안정화된 금 나노입자 및 0.1mM 구연산삼나트륨을 포함하는 100mM, pH 5.5의 아세테이트 완충액을 준비하고, 이때, 2%(w/v)의 HPC를 부가하고, 교반하는 동안 점진적으로 혼합용액을 부가하였다. 상기 혼합용액을 완전히 부가한 후에 현탁물은 실내온도에서 1일 동안 교반하고, 진공상태로 만들어주었다.

상기 스태킹 완충액과 같은 방법으로 20mM, pH 5.5의 트리스-염산 완충액, 20.0nM 구연산-안정화된 금 나노입자, 0.1mM 구연산삼나트륨 및 2%(w/v) HPC를 포함하는 분리 완충액을 준비하였다.

6) 백금 미세전극에서 pTTCA /금 나노입자 층의 준비

우선 백금 미세전극을 0.1M 황산(H₂SO₄)용액에서 100mV/s 주사속도로 1.6 내지 0.16V 사이의 전위를 여러 번 순환시킴으로써 세척하였다. 0.1mM 테트라부틸암모늄 염/디클로로메탄용액에서 1.6 내지 0.16V 사이의 전위를 1000mV/s 주사속도로 세 번 순환시킴으로써 폴리(5,2':5,2"-터셔리티오펜-3‘-카르복시산)(pTTCA)의 전기중합(electropolymerization)을 수행하였다.

상기 전극에 존재하는 과량의 단량체를 제거하기 위해서 디클로로메탄으로 세척하였다. 세척 후의 전극표면에 위치한 폴리(5,2':5,2"-터셔리티오펜-3‘-카르복시산)(pTTCA)의 입자크기는 10~40nm이었고, 세 번의 순환을 통해 얻어진 두께는 90nm미만으로 측정되었다.

상기 측정값은 SEM사진 및 고해상도의 AFM사진을 통하여 얻었다(Rahman, M.A.; Kwon, N.H.; Won, M.S.; Choe, E.S.; Shim, Y.B. Anal . Chem . 2005, 77, 4854). 금 나노입자는 1.5 내지 0.5V의 선형주사 전압전류법(linear sweep voltammetry)을 이용하여 0.25mM 염화금산을 함유하는 0.5M 황산용액으로부터 pTTCA가 코팅된 전극에 전기 침전되었다.

이때, 전착시간은 30s이고, 전착전위는 0.6V이고, 주사속도는 100mV/s이다. pTTCA 층에 전기 침전된 금 나노입자의 크기는 25~40nm의 범위로 SEM사진에 의해 측정되었다.

7) 농축 및 MGE - ED 과정

마이크로칩의 채널을 프리클리닝한 후에(Shiddiky, M.J.A.; Park, H.; Shim, Y.B., Anal . Chem . 2006, 78, 6809), 30℃에서 1시간 동안 건조하였다. 그 후 제1채널은 제1농축부를 진공으로 하여 트리스-염산 완충액(100mM, pH 8.4)으로 채우고, 시료주입부에는 50㎕의 DNA시료를 채우고, NSC T자 인젝터에는 제1농축부가 플로팅(floating)된 동안 전류가 안정될 때까지 시료주입부와 제1시료배출부 사이에 500V를 인가하여 시료를 채웠다.

FASS단계에서 시료주입부에 30초 동안 +100V/cm를 인가하여 시료를 주입하고, FASS를 진행하기 위해 200V/cm의 전위를 제1시료배출부에 130초 동안 가하였다. FASS 단계에서 시료는 채널 내부에 나타난 강한 전류삼투흐름(EOF)에 의하여 음극으로 이동하였다(Beard, N.P.; Zhang, C.X.; de Mello, A.J., Electrophoresis 2003, 24, 732).

이동경계에서 상기 시료의 이동속도는 감속되고, 샘플 농도의 증가를 가져오는 좁은 샘플영역이 형성되었고, 이와 동시에 물 플러그를 주사기펌프(KDS-200™, KDS Scientific)를 사용하여 제1완충액저장부로부터 제2농축부로 0.1㎕/min 미만의 유속으로 110초 동안 주입하였다.

이어서 FASI단계에서 개질한 스태킹 완충액을 60초 동안 상기 물 플러그와 같은 유속 및 조건으로 주입하였다. 상기 단계 후에 제2채널의 길이 중 55mm의 영역은 전도성이 낮은 물로 채우고, 나머지 28mm미만의 영역은 고전도성의 스태킹 완 충액 영역으로 남겼다.

다음으로, FASI를 진행하기 위해 제1농축부에 150V/cm미만의 전위를 125초미만으로 가하였다. 상기 조건하에서 DNA의 속도는 물 플러그 영역에서 높게 나타났고, 상기 DNA는 상기 물 플러그를 통과하여 이동경계로 이동하였고, 물과 완충액의 경계에 농축시료 영역이 형성되었다. 상기 단계가 수행되는 동안 상기 물 플러그는 전기장(electric field)에 의해 유도된 전기삼투흐름(EOF)에 의해 제1농축부를 통해 제2채널의 밖으로 배출되었고, 시료는 제2농축부에 도달하였다.

이어서 MGE-ED 실험을 하였다. 제2완충액저장부 및 제2시료배출부는 50㎕의 분리 완충액을 채우고, 검출부는 1.0ml의 분리 완충액을 채웠다. 검출채널은 제2농축부와 제2시료배출부가 플로팅된 동안 전류가 안정화될 때까지 제2완충액저장부 및 검출부 사이에 500V를 인가하여 분리 완충액을 채웠다.

제2농축부에 5초 동안 200V/cm의 전위를 가하여 안정한 기선을 얻은 후에 시료를 주입하였고, 검출부는 제2완충액저장부와 제2시료배출부가 플로팅 되어있는 동안에 접지하였다. 이후 분리는 제2농축부 및 제2시료배출부가 그라운드에 머문 동안에 제2완충액저장부에 -340V의 전위를 가하고, 검출부로 +1500V의 전위를 가하여 수행하였다. 상기 과정에서 200V/cm 필드 강도(field strength)가 나타났다.

이하, 상기 실시예 1을 통해 본 발명의 DNA 검출용 마이크로칩이 갖는 효과를 실험예 1에 나타내었다.

[ 실험예 1]

1) pTTCA /금 나노입자 변형전극의 전기촉매활동

DNA산화에 대한 pTTCA/금 나노입자(AuNPs) 변형전극의 전기촉매적 활동을 설명하기 위해서 pTTCA 변형전극 및 MGE-ED에서의 비피전극(bare electrode)과 비교하였다. 도6은 농축 및 분리 후에, 각각 (a)비피전극, (b)pTTCA 변형전극, (c)pTTCA/AuNPs 변형전극에서 20bp의 DNA를 통해 얻은 전기영동도를 나타낸다.

모든 전극에서 20bp DNA의 피크는 87.5초미만의 이동시간을 나타냈다. 피크전류의 증가 및 하프-피크 너비의 감소가 변형전극들에서 관찰되었다.

도6의 (a)에서 나타난 바와 같이 비피전극의 하프-피크 너비(약 7.12s)가 pTTCA 변형전극 및 pTTCA/AuNPs 변형전극보다 유의적으로 컸고, 피크전류는 pTTCA 변형전극 및 pTTCA/AuNPs 변형전극이 비피전극에 비하여 각각 약 4배 및 10배 증가하였다. pTTCA/AuNPs 변형전극에서 분리 효율(N)⁵은 12530미만으로 나타난 반면에 비피전극에서는 840미만이 측정되었다.

pTTCA/AuNPs 변형전극에서 날카로운 피크를 나타낸 피크전류의 증가는 DNA의 촉매산화과정에서 더욱 빠른 전자이동이 있음을 나타낸다. 변형전극의 전기촉매활동을 이해하기 위해서 [Fe(CN)₆]^3-/4- 산화환원시스템을 이용하여 순환 전압전류식 실험을 수행하였다.

비피전극에서는 확산-조절된 산화환원과정의 명확한 역 전압전류도 특성이 나타났다. pTTCA 변형전극에서는 피크분리(ΔE=70~118mV)의 유의적인 감소 및 약 4배의 피크전류 증가가 관찰되었다. 또한, pTTCA/AuNPs 변형전극에서는 피크분리(ΔE=60~118mV)의 감소와 함께 pTTCA 변형전극에서보다 큰 약 10배의 피크전류 증가가 관찰되었다.

표준 전자이동 속도상수(k_s)는 니콜슨(Nicholson)이론을 이용하여 측정하였다(Nicholson, R.S., Anal. Chem . 1965, 37, 1351). 고분자 및 금 나노입자에 의한 전극표면의 변형은 각각 7미만 및 50미만의 인자에 의해서 k_s의 값을 증가시켰다(k^bare=3.61×10^-3cm s^-1; k^pTTCA=24.7×10^-3cm s^-1; 및 k^{pTTCA / AuNPs}=193×10^-3cm s^-1).

전극표면의 금 나노입자에 의한 변형은 전극의 전도성을 향상시킬 수 있는 고분자와 금 나노입자간의 접촉을 증가시킴으로써 고분자의 활동영역을 넓히고(Cho, S.H.; Park, S.M. J. Phys . Chem . B 2006, 110 25656), 금 나노입자에 의한 pTTCA층의 향상된 전도성으로 인하여 dsDNA의 산화를 위한 빠른 전자이동이 이루어진다.

또한, 도5에 나타낸 유체역학적 전압전류도는 pTTCA/AuNPs 변형전극의 전기촉매활동을 보여주는데, pTTCA/AuNPs 변형전극에서 구성전위는 +200mV인 반면에, 비피전극에서는 +400mV이었다.

이는 pTTCA/AuNPs 변형전극을 사용하는 경우에 비피전극에서보다 높은 감도 및 낮은 검출전위를 가지고 DNA분석을 할 수 있다는 것을 나타낸다.

pTTCA/AuNPs 변형전극을 사용하였을 경우 0.8V의 전위에서 기선전류, 기울기 및 노이즈등급의 증가가 나타난 반면에 비피전극에서는 보다 높은 전위에서 기선전류, 기울기 및 노이즈등급의 증가가 나타났다. 이와 같이 비피전극에서의 높은 주변 전류는 불안정한 기선으로 이어져 고감도 및 안정한 검출에 장애가 될 수 있다.

2) DNA 의 농축

본 발명에 따른 DNA 검출방법에서 감도향상인자를 찾기 위하여 종래 사용하던 MGE-ED분석과 비교하였다. 종래 MGE-ED분석은 pTTCA/AuNPs 변형전극을 가지고 농축단계를 수행하지 않고, 단지 마이크로칩 3개의 채널을 이용하여 수행되었다.

종래의 MGE-ED분석에서는 20bp 및 42bp 시료를 사용한 경우 이동시간은 각각 87.5초미만 및 102.6초미만이고, 하프피크 너비는 각각 1.93 s미만 및 2.63 s미만이고, N값은 각각 8600미만 및 12500미만으로 나타났다.

반면에, 5×10³의 인자에 의해 희석된 시료혼합물에 대한 농축단계 이후에 마이크로칩 분리 및 전기화학적 검출을 수행하였고, 그 결과는 도7에 나타난 바와 같다.

도7은 상기 조건하에서 얻은 전형적인 전기영동도를 나타내는데, 도7을 참고하면, DNA시료를 동일한 이동시간, 하프피크 너비 및 분리효율로 검출하였고, 주선이 다른 선에 비해 5배 더 높은 피크높이가 나타난 것을 알 수 있다. 본 발명의 DNA 검출방법에 따른 감도향상은 FASS 및 FASI단계 적용 전과 후 시스템에 대한 선형 범위의 기울기로 측정한다.

선형 범위 40pg/㎕~2ng/㎕에서 농축단계를 적용하기 전 시스템에서 기울기는 8.1nA/(ng/㎕)인 반면에, 선형 범위 0.003~1.0pg/㎕에서는 0.201nA/(fg/㎕)이었다. 두 기울기를 비교하면 전체 감도향상은 24900배미만 이었다.

이와 같은 감도향상은 금 나노입자에 의한 스태킹/분리 완충액 및 전극표면 의 변형에 기인한다. FASS단계에서 DNA스태킹은 높은 전기장강도(저전도성 시료 완충액)로부터 상대적으로 낮은 전기장강도를 가진 영역(고전도성 스태킹 완충액)으로 이동시 DNA이동속도의 급격한 감소로 인한 저전도성 완충액과 고전도성 완충액간의 경계에서 발생한다.

FASI단계에서 첫째 쌓임(stacking)은 HPC/AuNPs 모체를 포함하는 낮은 pH/고전도성 스태킹 완충액에서 발생한다. DNA들은 상기 FASS단계에서 언급한 이유와 동일한 이유로 물과 낮은 pH/고전도성 완충액의 사이경계에서 쌓인다.

상기 쌓임의 향상에 영향을 줄 수 있는 3 가지 가능요소가 있다. 첫째, 초기 쌓인 DNA시료들은 두 번째 농축경계에서 나타난 HPC/AuNPs 모체와 상호작용하여 쌓임이 일어날 수 있다. 둘째, 두 번째 쌓임은 주로 HPC/AuNPs 모체에 의한 DNA이동의 방해로 인해 발생할 수 있다. 마지막으로 스태킹 완충액에서 구연산삼나트륨 및 구연산-안정화된 금 나노입자의 존재로 인하여 쌓임이 일어날 수 있다.

상기 3가지 가능요소는 스태킹 완충액의 상대적인 전도성의 증가, 금 나노입자 표면에 흡착된 HPC모체의 돌출부분을 통한 DNA의 HPC/AuNPs 표면흡착 및 강하게 흡착된 금 나노입자의 존재로 인한 채널 벽에 대한 극미량의 DNA흡착으로 인하여 발생된다(Lin, Y.W.; Huang, M.F.; Chang, H.T., Electrophoresis 2005, 26, 320).

상기 3가지 가능요소 중 첫째 및 둘째 가능요소는 24900배미만의 감도향상을 가져올 수 있고, 마지막 가능요소는 다른 DNA 농축방법에 의해 얻어진 것보다 더 높은 감도향상을 가져올 수 있다.

3) 최적의 농축조건

초기실험에서 마이크로칩의 3채널을 이용하여 20mM, pH 5.5의 트리스-염산 완충액을 20bp 및 42bp DNA를 분리하기 위한 분리 완충액으로 사용하였다. 광범위하게 깨진 피크를 통하여 개질하지 않은 상기 20mM 트리스-염산 완충액은 DNA 시료의 분리에 적합하지 않다는 것을 알 수 있었다.

이와 같이 깨진 피크가 생기는 원인은 채널 벽에 대한 DNA흡착에 기인하는데, DNA흡착을 제거하여 효과적으로 DNA시료를 분리하기 위해 HPC를 함유하는 완충액을 사용하였다.

도8에 나타난 것과 같이, 2.0% HPC를 함유하는 20mM 트리스-염산이 분리 완충액으로 사용되었을 때 양 피크는 잘 분리되었고, 이동시간은 20bp 및 42bp DNA가 각각 114± 0.6초미만 및 145± 0.5초미만 이었다.

그러나 분리 완충액에서 HPC의 농축은 분리에 영향을 미쳤고, 양 시료에 대한 피크들과 이동시간 사이의 분해능은 HPC의 농도가 높아지기 때문에 증가하였다. 상기와 같은 높은 HPC의 농도로 인한 긴 이동시간은 주로 HPC모체의 방해효과로 인한 것이다(Sanders, J.C.; Breadmore, M.C.; Kwok, Y.C.; Horsman, K.M.; Landers, J.P. Anal . Chem . 2003, 75, 986).

분해능의 관점에서는 3.0% HPC가 보다 바람직할 수 있으나, 이동시간이 더 길어지므로 2.0% HPC를 선택하는 것이 바람직하다.

상기 2.0% HPC의 경우 이동시간과 피크전류의 재생성은 각각 2.8%미만 및 4.2%미만이었다(n=4). 이와 같은 결과는 안정한 전기삼투흐름(EOF) 및 채널표면의 재생성으로 인한 HPC와 채널 벽간의 수소결합에 의해 나타난다.

금 나노입자의 분리에 대한 효과를 검사하기 위하여 다른 농도의 금 나노입자를 함유하는 분리 완충액들을 시험하였다(도9). 피크와 이동시간 간의 분해능은 1.0에서 20nM로 증가한 금 나노입자의 농도로 인해 20bp 및 42bp에서 점진적으로 감소하였다.

20nM의 농도에서 20bp 및 42bp의 시료의 이동시간은 각각 87.5초미만 및102.6초미만이였고, 이는 도8의 (b)에 나타난 이동시간에 비해 많이 낮았다. 하프피크 너비는 각각 5.49 s 및 5.82 s로부터 1.93 s 및 2.63 s로 감소하였고, N값은 각각 2300 및 12500에서 3440 및 8600으로 증가하였다.

완충액의 전기삼투흐름(EOF)의 변화 및 DNA의 분명한 이동성으로 인해 상기와 같은 결과가 나타났는데, 이는 구연산철(삼 양성자산)과 DNA분자들 간의 상호작용 및 HPC/AuNPs를 함유하는 완충액의 형태변화가 전기영동 분리가 일어나는 동안 금 나노입자의 응집을 일으켰기 때문이다.

다만, 상기 사항들은 동시에 일어나거나 독립적으로 일어날 수도 있다.

도9에 나타난 바와 같이, 피크전류는 분리 완충액에서 금 나노입자의 농도가 증가함에 따라 점진적으로 증가하였고, 이로 인해 분리 완충액의 금 나노입자양의 증가와 함께 센서표면의 전도성이 증가할 수 있다.

금 나노입자의 농도가 20nM보다 높아지면 이동시간(4.8%초과, n=5) 및 피크전류(8.55초과; n=5)의 재생성이 낮아진다. 이는 TEM사진을 통하여 확인한 불안정한 분리 완충액에서 금 나노입자의 농도가 더 높아짐으로써 금 나노입자의 응집이 더 넓게 일어나기 때문이다(Neiman, B.; Grushka, E.; Lev, O., Anal . Chem . 2001, 73, 5220).

감도향상에 대한 금 나노입자 농도의 효과는 1.0 내지 20nM의 농도로 스태킹 완충액에 금 나노입자를 부가하여 검사하였다(미도시). 20 및 42bp 샘플들에서 금 나노입자 농도가 증가할 때 각각 87.4초 및 102.7초 미만에서 두 개의 피크가 증가된 피크전류로 나타났다.

금 나노입자를 함유하는 스태킹 완충액에서 금 나노입자가 증가할 때 HPC의 돌출부분을 통해 HPC/AuNPs 표면에 대한 DNA의 상호작용 증가로 인하여 감도가 향상되는 것이다. 즉, FASI단계에서 스태킹 완충액의 전도성이 증가하고 금 나노입자의 존재로 인하여 채널 벽에 대한 시료흡착이 최소화됨으로써 상기와 같은 감도향상이 나타난다.

금 나노입자 농도가 20nM를 초과하면 피크전류의 증가가 감소되는데, 이는 20nM의 금 나노입자가 물 영역에서 DNA와 스태킹 완충액간의 최적 전도율 및 최대상호작용을 일으킨다는 것을 의미한다. 따라서 금 나노입자 농도는 20nM에서 최적의 값을 나타낸다.

이하, 도4의 C 내지 F는 분리 전기장강도(separation field strength)에서 나노입자들의 응집을 검사하기 위하여 분리 완충액에 대한 TEM사진을 나타낸 것으로, 상기 분리 완충액은 각각 다른 분리 전기장강도에서 MGE-ED를 수행한 후에 제2완충액저장부를 매개로하여 압력을 가함으로써 채널 3개의 배출구로부터 수집하였다.

도4의 D 내지 F는 각각 100, 200 및 400V/cm의 분리 전기장강도에서 MGE-ED 를 수행한 후에 수집한 분리 완충액에 대한 TEM사진이다. 도4의 C 및 D에 나타난 바와 같이, MGE-ED 수행 전 또는 낮은 분리 전기장강도에서 MGE-ED를 수행한 경우에는 입자의 분포에서 거의 변화가 없어 금 나노입자의 응집이 거의 없음을 알 수 있다.

반면에 분리 전기장강도가 100에서 375V/cm으로 증가함에 따라 금 나노입자의 응집은 점차 증가하였다(도4의 D 내지 F). 금 나노입자에 흡착된 고분자는 더 안정되고, 확장은 줄어들어(Nowicki, W., Macromolecules 2002, 35, 1424), 결과적으로 전기영동 분리로 인해 변형되었다(Huang, M.F.; Huang, C.C.; Chang, H.T., Electrophoresis 2003, 24, 2896).

HPC분자들 간의 상호작용의 향상에 의한 금 나노입자의 응집과 전기장강도를 가하여 생긴 HPC/AuNPs의 변형은 분리모체의 응집작용에 기여한다. 상기 분리모체의 응집으로 인해 이동시간 및 피크전류(n=3에 대하여 RSD는 각각 12.2 및 17.6%)의 재생성이 낮아진다.

FASS단계에서 스태킹 완충액에서 시료 완충액으로의 전도율의 효과를 검사한 결과, 전도율이 1인 경우에는 시료 및 스태킹 완충액의 전도성은 동일하므로(Gong, M.; Wehmeyer, K.R.; Limbach, P.A.; Arias, F.; Heineman, W.R. Anal . Chem . 2006, 78, 3730) 단지 FASS단계를 수행한 경우에는 농축을 확인할 수 없었다(미도시).

그러나 FASS 및 농축과정을 포함하는 FASI단계가 수행된 경우에는 전도율의 증가로 인해 pTTCA/AuNPs 변형전극에서의 피크전류는 증가하였다. 도10을 참고하 면, (a)전도율이 1일 때는 FASS단계를 거친 FASI단계에서 주로 농축이 일어났고, (d)전도율이 100일 때는 최대 신호향상이 나타났다.

그러나 스태킹 완충액의 농도가 100mM 이상으로 증가하자 피크전류는 감소하였는데, 높은 완충액 농도에서 나타난 줄 가열(Joule heating)로 인하여 피크전류가 감소한 것이다(Beard, N.P.; Zhang, C.X.; de Mello, A.J., Electrophoresis 2003, 24, 732).

따라서 FASS단계에서는 1.0 내지 100mM의 트리스-염산 완충액(pH 8.4)이 각각 스태킹 완충액 및 시료 완충액으로 사용하였다.

다음으로, 단지 FASS단계만을 적용하여 채널 3개에 농축시료를 직접 주입한 경우 감도에 대한 효과를 검사하였다. 전체 감도향상은 종래의 MGE-ED분석에 비해 450배 정도 증가하였다(미도시).

제1채널에서 제3채널로 전이하는 동안 초기 농축시료의 감소 및 희석을 검사하기 위하여 컨트롤 실험을 수행하였다. 200V/cm의 전위를 130초 동안 제1채널의 제1시료배출부에 가하였고, FASS단계에 의한 시료농축을 위해 제1농축부 대신에 제2농축부를 접지(grounded)시켰다.

이후 FASI단계 및 MGE-ED단계를 진행하였다. 50pg/㎕의 20bp 및 42bp DNA시료에 대한 피크전류는 유사한 피크너비(RSD 5.4%)에서 약 3.5% 감소하였고, 제1채널에서 제2채널로의 농축시료전이 시에 희석 및 손실은 크지 않았다.

물 플러그 길이는 감도 향상인자 및 FASI단계 수행 시 요구되는 시간에 영향을 미친다. 물 플러그 길이는 15 내지 55mm으로 길이를 다양하게 하였다.

도11은 pTTCA/AuNPs 변형전극을 가진 20bp 및 42bp DNA의 피크전류에서의 물 플러그 길이의 효과를 나타낸다.

상기 피크전류는 플러그 길이가 15에서 55mm로 증가됨에 따라 증가하였는데, 물 플러그 길이가 55mm일 때, 변형전극의 감도는 최대가 되고, 결과적으로 가장 높은 감도향상이 나타났다. 따라서 물 플러그의 길이는 55mm미만으로 사용하는 것이 바람직하다.

도12는 FASI단계에서 농축시간을 다르게 하여 얻어진 전압전류도를 나타낸다. 20bp 및 42bp 시료의 최대 피크전류는 농축시간이 125초미만인 경우에 나타났다.

20bp의 시료를 사용한 경우에 116초미만의 농축시간에서는 아무런 피크도 나타나지 않았는데, 116초미만의 농축시간은 제2농축부에 시료플러그를 가져오는 데 충분치 않았고, 128초를 초과한 농축시간에서는 제2농축부로부터 샘플플러그가 밖으로 배출되는 문제가 발생하였다.

따라서 116 내지 128초의 농축시간을 갖는 것이 바람직하고, 20bp의 시료를 사용한 경우 최대 피크전류를 나타낼 수 있도록 농축시간을 116 내지 125초로 하는 것이 보다 바람직하다.

(b)42bp의 시료를 사용한 경우에는 농축시간이 120초미만인 경우에 보다 높은 피크전류가 나타났다. 이는 제1완충액저장부로 이동하는데 있어서 42bp에 비해 20bp의 이동성이 급격하게 높기 때문이다. 작은 DNA단편은 HPC모체에 의해 방해를 덜 받았다. 즉, 작은 DNA단편은 시료영역의 근처에 쌓일 수 있다.

이와 같이 제2농축부에 도달하는 데는 현저하게 오랜 시간이 소요되고, 이로 인해 125초미만의 농축시간으로 100bp DNA ladder를 분석할 때는 짧은 DNA단편들만이 낮은 피크전류에서 검출되었다(미도시). 긴 단편들이 검출되지 않은 것은 125초미만의 시간동안 제2농축부로부터 상기 긴 단편들이 배출되었기 때문이다.

그러나 100bp DNA ladder에 나타난 모든 단편들은 110초미만의 시간동안 최고의 감도를 나타냈다. 따라서 100bp DNA ladder의 경우 상기 농축시간이 106초 내지 114초인 것이 보다 바람직하다.

4) MGE - ED 의 최적화상태

DNA분석에 있어서 이동시간, 피크전류 및 N값에서 분리 전기장강도의 효과를 검사하였다(미도시). 이동시간은 감소되었고, N값은 전기장강도가 125에서 200V/cm로 증가함에 따라 함께 증가하였다. 말단채널의 확장과 검출시스템 및 줄 가열의 불완전한 분리로 인한 분리효율의 감소로 인하여 전기장강도가 더 증가하였다(Pumera, M.; Wang, J.; Grushka, E.; Polsky, R., Anal . Chem . 2001, 73, 5625)(Shiddiky, M.J.A.; Won, M.S.; Shim, Y.B., Electrophoresis 2006, 27, 4545).

300V/cm를 초과하는 분리 전기장강도에서는 이동시간 및 피크전류의 재생성이 좋지 않았고, 불안정한 기선이 관찰되었다. 최적의 분리효율을 가진 최적의 민감도 및 분해능은 200V/cm에서 나타났다.

채널 출구와 작동전극 표면 사이의 거리는 피크전류 및 변형전극에서 분석물의 모양에 영향을 미친다(Shiddiky, M.J.A.; Park, H.; Shim, Y.B., Anal . Chem . 2006, 78, 6809)(Shiddiky, M.J.A.; Park, H.; Shim, Y.B., Electrophoresis 2005, 26, 4656)(Shiddiky, M.J.A.; Won, M.S.; Shim, Y.B., Electrophoresis 2006, 27, 4545).

작동전극에서 채널출구까지의 거리가 20㎛에서 200㎛로 증가했을 때, 피크전류의 점진적인 감소 및 하프피크 너비의 증가가 나타났다. 200㎛보다 더 넓은 간격에서 ED는 높은 주변 노이즈와 함께 불안정한 기선을 나타냈다. 그러나 20㎛미만의 작은 간격에서는 주변 노이즈의 등급이 증가하였다.

따라서 변형전극의 최적의 감도를 얻기 위해서는 검출채널로부터 작동전극의 거리가 20㎛인 것이 바람직하다.

5) 결과의 분석

상기 최적의 조건하에서 pTTCA/AuNPs 변형전극을 가지고 재생성, 선형역학범위 및 검출한계를 구하였다. 이동시간 및 피크전류에 대한 수행 후의 재생성은 각각 0.8 및 1.5%이었는데, 이동시간 및 피크전류가 실험수행에 따라 매우 다양하게 나타났지만 분석에 따른 재생성은 우수하였다.

변형전극을 가지고 여섯 번의 반복적 주입을 한 경우 이동시간 및 피크전류의 재생성은 각각 5.2%미만 및 2.9%미만으로 나타났다. 이동시간에서 매우 다양한 값이 나오는 것은 분리 완충액의 농도변화와 반복적인 시료주입에 따른 전극표면의 오염으로 인한 것이다(Shiddiky, M.J.A.; Kim, R.E.; Shim, Y.B., Electrophoresis 2005, 26, 3043).

pTTCA/AuNPs 변형전극의 안정성은 제3채널만을 사용한 금 나노입자 변형전극 을 포함하는 마이크로칩에 0.1ng/㎕의 42bp DNA시료를 30번 반복적으로 주입하여 검사하였다. 초기 피크전류에서 14%의 감소 및 n=30에서 RSD는 11.2%가 나타났다. 피크전류의 감소는 전극의 다용도에 따른 전극표면의 비활성화로 인한 것인데, 이와 같은 비활성화는 산화물에 의한 전극표면의 비활성화 및 시간에 따른 필름의 분리에 기여할 수 있다.

그리고 유체역학 범위의 측정을 위하여 20bp의 DNA시료를 사용하였다. 0.003에서 1.0pg/㎕에 이르는 4차 등급의 광역학적 선형범위가 나타났는데, 이는 다른 온-칩 농축방법의 범위보다 2차 등급만큼 넓다(Gong, M.; Wehmeyer, K.R.; Limbach, P.A.; Arias, F.; Heineman, W.R., Anal . Chem . 2006, 78, 3730).

20bp의 DNA시료에 대한 캘리브레이션 플롯은 테스트된 농도범위에서 0.9993의 상관계수로 선형적으로 나타났고, 42bp의 DNA시료에 대한 캘리브레이션 플롯은 내부표준으로 된 0.02pg/㎕에서 일정한 값으로 나타났다. 42bp의 DNA시료에 대한 피크전류는 이동시간 및 피크전류에서 각각 2.7%미만 및 5.6%미만의 좋은 재생성을 나타내며 검출되었다(n=6). 또한, S/N=3(95%의 신뢰등급, k=3, n=6)에 기초한 0.7fg/㎕의 검출한계에서 감도는 0.201nA(fg/㎕)이었다.

본 발명의 DNA 검출용 마이크로칩을 이용한 검출방법의 검출한계는 다른 DNA 농축방법보다 매우 낮은 값으로, 20bp의 DNA시료 50㎕에서 35fg(5.67 mol)을 나타냈다. 나아가, 상기 검출한계는 나노입자 및 양이온 폴리티오펜 변형전극을 이용한 종래 DNA분석방법을 통해 얻은 값보다 1000배 이상 낮은 값이다(Wang, J.; Liu, G.; Merkoci, A., J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 3214)(Polsky, R.; Gill, R.; Kaganvsky, L.; Willner, I., Anal . Chem . 2006, 78, 2268-2271).

6) 100 bp DNA ladder 에 적용

본 발명의 DNA 검출용 마이크로칩을 이용한 검출방법의 장점을 찾기 위하여 13단편(fragment)을 포함하는 100bp DNA ladder를 분석하였다. 도13은 MGE-ED를 이용한 온-칩 농축 후에 얻은 100bp DNA ladder의 전형적인 전기영동도를 나타낸다.

ladder의 모든 단편들은 435초 내에서 잘 분리되고, 검출되었다. 이동시간 및 피크전류의 재생성은 각각 3.2%미만 및 5.8%미만이었다(n=6). 이웃단편간의 분해능은 600/700bp의 시료에서 3.5미만이었고, 900/1000bp의 시료에서 1.35미만의 범위이었다.

본 발명의 DNA검출용 마이크로칩을 이용한 검출방법을 통해 얻은 값을 종래 MGE-ED분석에 의해 얻어진 전기영동도와 비교하면, 본 발명의 DNA검출용 마이크로칩을 이용한 검출방법을 통해 얻은 감도향상인자는 400bp의 시료에 있어서는 23000배 이상이었고, 2000bp의 시료에 있어서는 25500배 이상으로 높게 나타났다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

도1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출용 마이크로칩의 채널 패턴도,

도2는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출용 마이크로칩을 이용한 DNA 검출방법의 흐름도,

도3A는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 제1시료배출부 이동단계를 나타낸 개념도,

도3B는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 제1농축부 이동단계를 나타낸 개념도,

도3C는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 제2농축부 이동단계를 나타낸 개념도,

도3D는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 제2시료배출부 이동단계를 나타낸 개념도,

도3E는 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 DNA 검출방법의 검출부 이동단계를 나타낸 개념도,

도4에서 A는 금 나노입자 용액의 자외-가시영역의 파장을 나타낸 그래프이고, B는 금 나노입자용액의 TEM사진, C는 MGE-ED 수행 전의 분리 완충액의 TEM 사진, D 내지 F는 MGE-ED를 수행한 분리 완충액의 TEM사진(각각 D: 100V/cm, E: 200V/cm, F: 400V/cm의 분리 전기장강도(separation field strength)로 수행한 경우),

도5는 0.05pg/㎕의 20bp 및 42bp DNA에 대한 유체역학적 전압전류도를 나타낸 그래프(a: 비피전극 b: pTTCA/AuNP-변형전극),

도6은 0.05pg/㎕의 20bp DNA의 전기영동도를 나타낸 그래프(a: 비피전극, b: pTTCA-전극, c: pTTCA/AuNP-변형전극),

도7은 pTTCA/AuNP-변형전극을 가지고 MGE-ED을 이용하여 FASS단계 및 변형된 FASI단계를 수행하기 전과 후의 20 및 42bp의 DNA시료의 전기영동도를 비교하여 나타낸 그래프,

도8은 HPC-변형분리 완충액의 효과를 나타낸 그래프(각각 a: 1.0%, b: 2.0%, c: 3.0%의 HPC를 함유한 경우),

도9는 HPC/AuNP-변형분리 완충액의 효과를 나타낸 그래프(각각 a: 1.0nM, b: 10nM, c: 20nM의 AuNP 함유한 경우),

도10은 FASS단계에서의 스태킹 완충액의 시료 완충액으로 전도율을 나타낸 그래프(스태킹 완충액 100mM인 경우, 시료 완충액 a: 100mM, b: 60mM. c: 30mM인 경우),

도11은 물 플러그의 길이를 나타낸 그래프,

도12는 0.05pg/㎕의 20bp 및 42bp DNA의 분석을 위한 FASI단계에서 시료농축시간을 나타낸 그래프(a: 116초미만, b: 120초미만, c:125초미만, d:128초미만),

도13은 pTTCA/AuNP-변형전극을 가진 100bp DNA 래더에 나타난 13단편들의 분리를 보여주는 전기영동도를 나타낸 것이다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

10 : DNA 검출용 마이크로칩 100 : 농축채널

110 : 제1채널 111 : 시료주입부

113 : 제1시료배출부 130 : 제2채널

131 : 제1농축부 133 : 제2농축부

135 : 제1완충액저장부 200 : 검출채널

201 : 제2완충액저장부 203 : 제2시료배출부

205 : 검출부

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Microchip for detecting trace of DNA and detection method using the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 1 attaccacat catccatata 20 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <400> 2 actgctagag attttccaca ctgactaaaa gggtctgagg ga 42

Claims (10)

1. 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking)단계 및

   구연산 안정화된 금 나노입자 및 구연산나트륨을 함유하는 아세테이트 완충액에 흡착성의 코팅분리모체로 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC)를 부가하여 혼합한 스태킹 완충액을 이용하여 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection)단계를 수행하는 농축채널과;

   구연산 안정화된 금 나노입자 및 구연산나트륨을 함유하는 트리스-염산 완충액에 코팅분리모체로 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC)를 부가하여 혼합한 분리 완충액이 저장되는 제2완충액저장부; 상기 분리 완충액이 저장되고, 시료의 일부가 배출되는 제2시료배출부; 및 내부에 전극부가 구비되고 시료를 검출하는 검출부를 포함하고,

   상기 전극부는 기준전극, 반대전극 및 전도성고분자/금 나노입자 변형작동전극을 포함하며, 상기 전도성고분자/금 나노입자 변형작동전극은 전도성고분자 및 금 나노입자의 혼합물을 이용하여 전극 표면을 화학적으로 개질한 전극이며,

   상기 분리 완충액을 이용하여 마이크로칩 젤 전기영동을 통한 전기화학적 검출(MGE-ED)을 수행하는 검출채널;

   을 포함하는 DNA 검출용 마이크로칩.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 농축채널은,

   시료가 주입되는 시료주입부; 및 염기성 완충액이 저장되고, 상기 시료주입부로부터 공급된 시료의 일부가 배출되는 제1시료배출부를 포함하는 제1채널; 및

   필드 증폭 시료 스태킹을 이용하여 전위 차이에 따라 시료를 농축하는 제1농 축부; 필드 증폭 시료 주입을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축하는 제2농축부; 및 물이 주입되고, 상기 개질한 스태킹 완충액이 저장되는 제1완충액저장부를 포함하는 제2채널을 구비하는 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로칩.
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서,

   상기 전도성고분자는 폴리-5,2':5,2"-터셔리티오펜-3‘-카르복시산(poly-5,2':5',2"-terthiophene-3'-carboxylic acid; pTTCA), 폴리-3'-브로모-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-bromo-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3',4'-디아미노-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3',4'-diamino-2,2':5',2"-terthiophene), 폴리-3'-살리실알데히드-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-salicylaldehyde-2,2':5',2"-terthiophene) 및 폴리-3'-보론-디히드록시-2,2':5',2"-터셔리티오펜(poly-3'-boron-dihydroxy-2,2':5',2"-terthiophene)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 DNA 검출용 마이크로칩.
7. 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking)을 수행하여 시료를 농축하는 제1농축단계;

   구연산 안정화된 금 나노입자 및 구연산나트륨을 함유하는 아세테이트 완충액에 흡착성의 코팅분리모체로 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC)를 부가하여 혼합한 스태킹 완충액을 이용하여 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection)을 수행하여 시료를 농축하는 제2농축단계; 및

   구연산 안정화된 금 나노입자 및 구연산나트륨을 함유하는 트리스-염산 완충액에 코팅분리모체로 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC)를 부가하여 혼합한 분리 완충액을 이용하여 마이크로칩 젤 전기영동을 통한 전기화학적 검출(MGE-ED)을 수행하는 것으로서,

   제2농축부에 음극전압을 인가하고, 제2시료배출부를 접지시켜, 시료가 제2시료부 측으로 이동되도록 하는 제2시료배출부 이동단계와

   상기 제2농축부와 상기 제2시료배출부를 플로팅시키고, 상기 분리완충액이 저장된 제2완충액저장부에 음극전압을 인가하고, 검출부를 접지시켜 시료가 검출부 측으로 이동되도록 하는 검출부 이동단계와

   마이크로칩 젤 전기영동을 수행하여 시료를 분리하고, 전도성고분자/금 나노입자 변형전극을 이용하여 상기 분리된 시료를 검출하는 검출단계를 포함하는 분리 및 검출단계;

   를 포함하는 DNA 검출용 마이크로칩을 이용한 DNA의 검출방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 제1농축단계는,

   시료주입부에 시료를 주입하는 시료주입단계;

   상기 시료주입부에 양극전압을 인가하고 제1시료배출부를 접지시켜, 시료가 상기 제1시료배출부 측으로 이동되도록 하는 제1시료배출부 이동단계; 및

   상기 시료주입부를 플로팅시키며 제1시료배출부에 양극전압을 인가하고 제1농축부를 접지시켜, 필드 증폭 시료 스태킹을 수행하여 전위 차이에 따라 시료를 농축시키고 농축된 시료가 제1농축부 측으로 이동되도록 하는 제1농축부 이동단계를 포함하는 DNA 검출용 마이크로칩을 이용한 DNA의 검출방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 제2농축단계는,

   제1완충액저장부에 물을 주입한 다음, 개질한 스태킹 완충액을 주입하는 제1완충액저장부 주입단계; 및

   상기 제1농축부에 음극전압을 인가하고 상기 제1완충액저장부를 접지시켜, 필드 증폭 시료 주입을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축시키고 농축된 시료가 제2농축부 측으로 이동되도록 하는 제2농축부 이동단계를 포함하는 DNA 검출용 마이크로칩을 이용한 DNA의 검출방법.
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