WO2014027580A1 - 試料の分析方法 - Google Patents

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Abstract

　電極間の距離に関わらず、高感度にて試料を分析し得る分析方法を提供する。第１の電極対の間に、試料の移動方向と交わる方向へ向かう電界を形成するように、電圧を印加する工程と、第１の電極対の間に、当該電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置する工程と、試料を移動させる工程と、第１の電極対に流れる電流の変化量を測定する工程と、を用いる。

Description

試料の分析方法
　本発明は、試料の分析方法に関する。
　従来から、電流を測定することによって各種試料を分析し、当該試料の様々な特性を決定する方法が開発されている。
　例えば、ＤＮＡのヌクレオチド配列を分析する技術は、単に学術的な研究の分野に留まらず、医療、創薬、および犯罪捜査などの分野にまで応用されており、この技術の発展にますます関心が集まっている。それ故に、従来から、電流を測定することによってＤＮＡのヌクレオチド配列を分析する技術の開発が進められている。
　例えば、シクロデキストリンに埋め込まれたタンパク質からなるナノポア内を一本鎖ＤＮＡが通過する間に起こるイオン電流の一時的な遮断を探知することによって、１分子のＤＮＡを用いてシーケンシングを行う技術が開発されている（例えば、非特許文献１、２参照）。
　しかしながら、上記技術は、（１）ポアサイズを変更することができない、（２）ナノポアがタンパク質によって形成されているためにシステムが不安定である等の多くの問題点を有している。それ故に、上記技術とは別の技術の開発が求められていた。
　このような状況下で、横方向の電子輸送（transverse electron transport）に基づくシーケンシング理論が提案された。この理論は、一対の電極の間のナノスケールの空間内をヌクレオチドが通過するときに、各ヌクレオチドに特有の横方向の導電率を検出するという原理に基づいている。この導電率は各ヌクレオチドのＨＯＭＯとＬＵＭＯとの間のギャップの違いに関連する。
　具体的には、一本鎖ＤＮＡがナノポア内を通過する際に、ナノポアの端に設けられたナノスケールの電極間距離を有する電極対の間に、一本鎖ＤＮＡを構成している各ヌクレオチドを介したトンネル電流が生じる。そして、当該トンネル電流の電流値を測定することによって、一本鎖ＤＮＡを構成している各ヌクレオチドを、標識することなく直接同定することが可能になる（例えば、特許文献１参照）。
ＷＯ２０１１／１０８５４０Ａ１（２０１１年９月９日公開）
J. Clarke, H.-C. Wu, L. Jayasinghe, A. Patel, S. Reid, H. Bayley, Nat. Nanotechnol. 4, 265 (2009) D. Stoddart, A. J. Heron, E. Mikhailova, G. Maglia, H. Bayley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 7702 (2009)
　しかしながら、上述のような従来技術は、電極間の距離が大きくなると検出できる電流の値が非常に小さくなるので、高感度で試料を分析できないという問題点を有している。
　具体的には、電極間の距離が２ｎｍ以上になると、当該電極間に流れるトンネル電流の値は非常に小さくなる。それ故に、電極間の距離が２ｎｍ以上になると、トンネル電流に基づいて各種試料を分析する技術は、高感度にて試料を分析できないという問題点を有している。
　つまり、トンネル電流に基づいて各種試料を分析する技術は、電極間の距離（換言すれば、試料の大きさ）に応じて分析能力が大きく変動するという問題点を有している。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、電極間の距離に関わらず、高感度にて試料を分析し得る新たな分析方法を提供することにある。
　本発明の試料の分析方法は、上記課題を解決するために、試料の移動経路を挟むように形成されている第１の電極対の間に、上記試料の移動方向と交わる方向へ電界を形成するように、電圧を印加する第１工程と、上記第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路内に、上記第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置することによって、上記酸化還元反応に由来する第１の電流を上記第１の電極対へ流す第２工程と、上記第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路に沿って、上記試料を移動させる第３工程と、上記試料の移動によって生じる上記第１の電流の変化量を測定する第４工程と、を有することを特徴としている。
　上記構成によれば、第１の電極対の間に電圧を印加した状態で、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内に、第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置する。これによって、電気化学活性分子が、第１の電極対にて酸化還元反応を起こし、当該酸化還元反応に由来する第１の電流が第１の電極対へ流れることになる。つまり、試料が存在しない状態では、酸化還元反応に由来する第１の電流が第１の電極対へ流れ続け、当該電流が第１の電流のベースラインを形成することになる。
　しかも、このとき、第１の電極対では、電気化学活性分子が優先的に酸化還元反応を起すので、第１の電極対において気体が発生することを抑制することができる。もし第１の電極対にて気体が発生すれば、当該気体によって電気化学活性分子の酸化還元反応が阻害され、その結果、上述した第１の電流は値が変動する不安定な電流となる。例えば、第１の電極対の表面が気体によって覆われれば覆われるほど、第１の電流の値は小さくなり、第１の電極対の表面から気体が遊離すると、直ちに第１の電流の値は大きくなる。当該現象を繰り返すことによって、第１の電流は値が変動する不安定な電流となる。しかしながら、上記構成では気体が発生することが抑制されるので、第１の電流を安定化させることができる。
　次いで、第１の電極対の間に挟まれた移動経路に沿って、試料を移動させる。換言すれば、第１の電極対の間の空間へ、試料が導入される。このとき、試料の大きさ（体積）、試料が有する電荷の種類、または、試料が有する電荷量に応じて、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内に存在する電気化学活性分子の数に変化が生じる。移動経路内に存在する電気化学活性分子の数は、少なくなることもあれば、多くなることもある。
　第１の電極対の間に挟まれた移動経路内に存在する電気化学活性分子の数に変化が生じれば、第１の電極対にて酸化還元反応を起す電気化学活性分子の数にも変化が生じる。つまり、第１の電流の値に変化が生じることになる。
　上記第１の電流の値の変化量は、試料の様々な特性（例えば、体積、電荷の種類、または電荷量）と相関関係がある。従って、第１の電流の変化量を測定することによって、試料の存在を検知できることは勿論のこと、試料の様々な特性（例えば、体積、電荷の種類、または電荷量）を分析することができる。
　本発明の試料の分析方法では、標準試料の体積と第１の電流の変化量との相関関係に基づいて、上記第１の電流の変化量から、上記試料の体積を算出する第５工程を有することが好ましい。
　上記構成によれば、予め、体積が既知である標準試料を用いて、標準試料の体積と第１の電流の変化量との相関関係（例えば、関数）が求められている。したがって、体積が未知である試料の第１の電流の変化量を測定すれば、当該測定値と上記相関関係とから（換言すれば、体積が未知である試料の第１の電流の変化量を上記関数に代入することによって）、体積が未知である試料の体積を予測することができる。
　なお、相関関係は、標準試料の体積と第１の電流の変化量との直接的な相関関係に限定されず、第１の電流に応じた物理量の変化量を用いた相関関係を求めておいてもよい。第１の電流に応じた物理量は、例えば電流値、コンダクタンス、抵抗値等とすることができる。また、これらの値の対数、これらの値を正規化した値等としてもよい。
　本発明の試料の分析方法では、標準試料の電荷量と第１の電流の変化量との相関関係に基づいて、上記第１の電流の変化量から、上記試料の電荷量を算出する第６工程を有することが好ましい。
　上記構成によれば、予め、電荷量が既知である標準試料を用いて、標準試料の電荷量と第１の電流の変化量との相関関係（例えば、関数）が求められている。したがって、電荷量が未知である試料の第１の電流の変化量を測定すれば、当該測定値と上記相関関係とから（換言すれば、電荷量が未知である試料の第１の電流の変化量を上記関数に代入することによって）、電荷量が未知である試料の電荷量を予測することができる。
　なお、相関関係は、標準試料の電荷量と第１の電流の変化量との直接的な相関関係に限定されず、第１の電流に応じた物理量の変化量を用いた相関関係を求めておいてもよい。第１の電流に応じた物理量は、例えば電流値、コンダクタンス、抵抗値等とすることができる。また、これらの値の対数、これらの値を正規化した値等としてもよい。
　本発明の試料の分析方法では、上記第１工程は、更に、上記試料の移動経路を挟むように形成されている第２の電極対の間に、上記試料の移動方向と略平行な電界を形成するように、電圧を印加することを包含し、上記第２工程は、更に、上記第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路内に、上記第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置することによって、上記第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路内を上記移動方向に沿って移動するイオンに由来する第２の電流を上記第２の電極対へ流すことを包含し、上記第４工程は、更に、上記試料の移動によって生じる上記第２の電流の変化量を測定することを包含する、ことが好ましい。
　上記構成によれば、第２の電極対の間に電圧を印加した状態で、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内に、第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置する。これによって、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内を上記移動方向に沿って移動するイオンに由来する第２の電流を上記第２の電極対へ流すことができる。そして、当該電流が、第２の電流のベースラインを形成することになる。
　次いで、第１の電極対の間に挟まれた移動経路に沿って、試料を移動させる。換言すれば、第１の電極対の間の空間へ、試料を導入する。このとき、試料の大きさ（体積）に応じて、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内を上記移動方向に沿って移動するイオンの数に変化が生じる。具体的には、試料が大きくなればなるほど、イオンが移動し得る空間が狭くなって移動するイオンの数は少なくなり、その結果、第２の電流の値は小さくなる。そして、第２の電流の変化量を測定することによって、試料の存在を検知できることは勿論のこと、試料の大きさ（体積）を分析することができる。
　本発明の試料の分析方法では、標準試料の体積と第２の電流の変化量との相関関係に基づいて、上記第２の電流の変化量から、上記試料の体積を算出する第７工程を有することが好ましい。
　上記構成によれば、予め、体積が既知である標準試料を用いて、標準試料の体積と第２の電流の変化量との相関関係（例えば、関数）が求められている。したがって、体積が未知である試料の第２の電流の変化量を測定すれば、当該測定値と上記相関関係とから（換言すれば、体積が未知である試料の第２の電流の変化量を上記関数に代入することによって）、体積が未知である試料の体積を予測することができる。
　なお、相関関係は、標準試料の体積と第２の電流の変化量との直接的な相関関係に限定されず、第１の電流に応じた物理量の変化量を用いた相関関係を求めておいてもよい。第１の電流に応じた物理量は、例えば電流値、コンダクタンス、抵抗値等とすることができる。また、これらの値の対数、こららの値を正規化した値等としてもよい。
　本発明の試料の分析方法では、上記電気化学活性分子は、金属錯体、有機金属錯体、または有機分子であることが好ましい。
　上記構成によれば、低コストにて、本発明の分析方法を実現することができる。
　本発明の試料の分析方法では、上記電気化学活性分子は、ヘキサシアノ鉄酸カリウム錯体、塩化ヘキサアミンルテニウム錯体、またはヒドロキシフェロセンであることが好ましい。
　上記構成によれば、水溶液に溶けたときに電荷を有する金属錯体を形成するので、より精度良く、試料の体積に関する情報、試料の電荷の種類に関する情報、および試料の電荷量に関する情報を得ることができる。
　本発明の試料の分析方法では、上記電気化学活性分子は、－１Ｖ～１Ｖの電圧が印加されると酸化還元反応を起すものであることが好ましい。
　上記構成によれば、第１の電流を安定化させることができるとともに、大きな値の第１の電流のベースラインを実現することができる。その結果、試料の移動によって生じる上記第１の電流の変化量を大きくすることができるので、より感度良く、試料を分析することができる。
　本発明の試料の分析方法では、上記第１の電極対の陽極と陰極との間の距離は、２ｎｍ以上であってもよい。
　上記構成によれば、トンネル電流を測定することが困難な電極間距離であっても、感度良く、試料を分析することができる。
　本発明の試料の分析方法では、上記第１の電極対は、金電極または白金電極であり、上記第２の電極対は、銀／塩化銀電極であり、上記第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液には、塩化物イオンが含まれていることが好ましい。
　上記構成によれば、第１の電極対にて、優先的に電気化学活性分子の酸化還元反応を生じさせることができる。それ故に、上記構成によれば、第１の電極対に対して、酸化還元反応に由来する第１の電流を効率よく流すことができるとともに、第２の電極対に対して、第１の電極対の間に挟まれた移動経洛内を移動方向に沿って移動するイオン（塩化物イオン）に由来する第２の電流を効率よく流すことができる。
　本発明は、電極間の距離に関わらず、高感度にて試料を分析することができるという効果を奏する。具体的には、第１の電極対の間に挟まれた試料の移動経路内に、第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置し、移動経路に沿って試料を移動させる。これにより、試料の様々な特性と相関関係がある第１の電流の変化量を測定することができるため、電極間の距離に関わらず、高感度にて試料を分析することができる。
　本発明は、シグナルを増幅することができるという効果を奏する。具体的には、本発明では、予め、酸化還元反応に由来する第１の電流を第１の電極対へ流しているので、電気化学活性分子の種類や濃度に応じて、当該第１の電流（換言すれば、第１の電流のベースライン）を高くすることができる。そして、第１の電流の変化量が本発明において測定されるシグナルであるので、第１の電流を高く設定することによって、測定されるシグナルを増幅することができる。
　本発明は、シグナルを安定化させることができるという効果を奏する。具体的には、本発明では、予め、酸化還元反応に由来する第１の電流を第１の電極対へ流しているので、第１の電極対へ流れる第１の電流（換言すれば、第１の電流のベースライン）を安定化させることができる。そして、第１の電流の変化量が本発明において測定されるシグナルであるので、第１の電流を安定化させることによって、測定されるシグナルを安定化させることができる。
　具体的には、電気化学活性分子を用いない場合、第１の電極対にはランダムに電流が流れるために、当該第１の電流を安定化させることができない。更に具体的には、電気化学活性分子を用いない場合、第１の電極対では気体が発生し、当該気体が第１の電極対で生じる反応（酸化還元反応）を阻害するので、第１の電流を安定化させることができない。
　本発明は、試料の体積に関する情報、試料の電荷の種類に関する情報、および試料の電荷量（例えば、表面電荷量）に関する情報を得ることができる。
　本発明は、電気化学活性分子の種類を選択することによって、特異的に試料を検出することができる。
　本発明は、分析装置を構成する材料として生体分子（例えば、孔を形成するタンパク質）を用いる必要が無いので、分析装置の機械的強度および安定性を上げることができる。そして、その結果、過酷な条件下（例えば、タンパク質であれば変性するような高温条件下や、有機溶媒の存在下など）であっても、精度良く試料を分析することができる。
　従来技術では、ギャップ電極間に流れる電流を高感度にて検出するためには、試料を、高塩濃度の溶液中や高ｐＨの溶液中に溶解させる必要があった。それ故に、従来技術では、試料が細胞またはウイルスである場合には、細胞またはウイルスが凝集または死滅する危険性があり、試料が蛋白質である場合には、蛋白質が失活する危険性があった。一方、本発明では高塩濃度の溶液や高ｐＨの溶液を用いる必要がないので、生理的条件下（例えば、バッファーにてｐＨ６～８に調節した水溶液）で、細胞、ウイルス、蛋白質などの生物学的試料を分析することができる。
　本発明は、試料を基板などに固定化させる必要が無く、試料を移動させながら連続的に分析を行うことができるので、分析能力（例えば、分析速度など）を飛躍的に向上させることができる。
　本発明は、電極間の距離を所望の距離に設定することができるので、小さな試料は勿論のこと、大きな試料をも精度良く分析することができる。
本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 本発明の分析方法の一実施形態を示す図である。 実施例における、分析装置の作製工程を示す図である。 実施例における、顕微鏡にて撮影したソリッドステートナノポアデバイスの写真である。 実施例における、顕微鏡にて撮影したソリッドステートナノポアデバイスの写真である。 実施例における、顕微鏡にて撮影したソリッドステートナノポアデバイスの写真である。 実施例における、顕微鏡にて撮影したソリッドステートナノポアデバイスの写真である。 実施例における分析装置の構成を示す図である。 実施例における分析装置の構成を示す図である。 実施例における分析装置に設けられた孔の特性を示すグラフである。 実施例における分析装置に設けられた孔の特性を示すグラフである。 実施例における分析装置に設けられた孔の特性を示すグラフである。 実施例における分析装置の構成を示す図である。 第２の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第２の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第２の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第２の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第２の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第２の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 実施例における分析装置の構成を示す図である。 第１の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第１の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第１の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第１の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 第１の電極対に流れる電流の特性を示すグラフである。 実施例における、様々な生物学的な試料を用いた場合の、第１の電極対に流れる電流の変化を示す図である。 実施例における、様々な生物学的な試料を用いた場合の、第１の電極対に流れる電流の変化を示す図である。 実施例における、様々な生物学的な試料を用いた場合の、第１の電極対に流れる電流の変化を示す図である。 実施例における、様々な生物学的な試料を用いた場合の、第１の電極対に流れる電流の変化を示す図である。 実施例における、様々な生物学的な試料を用いた場合の、第１の電極対に流れる電流の変化を示す図である。 実施例における、様々な生物学的な試料を用いた場合の、第１の電極対に流れる電流の変化を示す図である。
　本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　〔１．本実施形態の原理〕
　まず、図１Ａ～図５Ｂを用いて、本実施形態の原理について説明する。
　図１Ａに示すように、本実施形態では、試料１０の移動経路を挟むように形成されている第１の電極対（電極１ａおよび電極１ｂ）の間に、試料１０の移動方向（図１中、矢印にて示す）と交わる方向へ電界を形成するように、電圧を印加する。
　そして、本実施形態では、第１の電極対（電極１ａおよび電極１ｂ）の間に挟まれた移動経路内に、第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子５を含む溶液を配置することによって、酸化還元反応に由来する第１の電流を第１の電極対へ流す。つまり、本実施形態では、試料が存在しない状態における酸化還元反応に由来する第１の電流が、第１の電流のベースラインを形成することになる（図１Ｂ参照）。なお、当該第１の電流の大きさは、電気化学活性分子５の種類、および濃度（換言すれば、電極１ａと電極１ｂとの間に存在する電気化学活性分子５の数）に依存している。
　電気化学活性分子５を用いない形態では、第１の電極対の間にはランダムに電流が流れることになり、図１Ｂに示すような安定的な電流のベースラインを形成することができない。それ故に、電気化学活性分子５を用いない形態では、本実施形態のような正確かつ高感度な分析を行うことはできない。
　本実施形態では、次いで、第１の電極対（電極１ａおよび電極１ｂ）の間に挟まれた移動経路に沿って、試料１０を移動させる。つまり、第１の電極対（電極１ａおよび電極１ｂ）の間へ、試料１０を移動させる。このとき、試料１０の特性に応じて、第１の電極対に流れている第１の電流の大きさが変化することになる。更に、上述したように、本実施形態では人為的に大きな値の第１の電流を流しているので、試料１０によって生じる第１の電流の変化の量も、大きなものになる。その結果、本実施形態では、高感度にて試料１０を分析することができる。この点について、図２Ａ～図５Ｂを用いて、更に詳細に説明する。
　図２Ａおよび図２Ｂには、大きな体積を有する試料１０が移動したときの第１の電流の変化を示し、図３Ａおよび図３Ｂには、小さな体積を有する試料１０が移動したときの第１の電流の変化を示している。
　図２Ａに示すように、大きな体積を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、第１の電極対の間に存在していた電気化学活性分子５のうちの大多数が、第１の電極対の間の空間から排除されることになる。換言すれば、大きな体積を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、第１の電極対の間に存在していた電気化学活性分子５の数が大きく変化し、その結果、酸化還元反応を起す電気化学活性分子５の数が大きく変化することになる。そして、図２Ｂに示すように、第１の電極対に流れている第１の電流の値が大きく変化することになる。
　一方、図３Ａに示すように、小さな体積を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、第１の電極対の間に存在していた電気化学活性分子５のうちの少数が、第１の電極対の間の空間から排除されることになる。換言すれば、小さな体積を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、第１の電極対の間に存在していた電気化学活性分子５の数が小さく変化し、その結果、酸化還元反応を起す電気化学活性分子５の数が小さく変化することになる。そして、図３Ｂに示すように、第１の電極対に流れている第１の電流の値が、小さく変化することになる。なお、このような小さな電流の変化は、予め大きな値の第１の電流を第１の電極対へ流していたからこそ、検出できる。
　上述したように、第１の電流の変化量は、試料１０の体積と相関関係がある。したがって、第１の電流の変化量を測定することによって、試料１０の体積に関する情報を得ることができる。
　更に、図４Ａおよび図４Ｂには、電気化学活性分子５と試料１０とが同じ種類の電荷（正の電荷、または、負の電荷）を有しているときの第１の電流の変化を示し、図５Ａおよび図５Ｂには、電気化学活性分子５と試料１０とが異なる種類の電荷を有しているときの第１の電流の変化を示している。
　図４Ａに示すように、電気化学活性分子５と同じ種類の電荷を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、第１の電極対の間に存在していた電気化学活性分子５のうちの大多数が、電気的な反発力によって、第１の電極対の間の空間から排除されることになる。換言すれば、電気化学活性分子５と同じ種類の電荷を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、第１の電極対の間に存在していた電気化学活性分子５の数が大きく変化し、その結果、酸化還元反応を起す電気化学活性分子５の数が大きく変化することになる。そして、図４Ｂに示すように、第１の電極対に流れている第１の電流の値が、大きく変化することになる。なお、電気化学活性分子５が有している電荷量が大きくなればなるほど、第１の電流の変化量も大きくなるように変化する傾向を示す。
　一方、図５Ａに示すように、電気化学活性分子５と異なる種類の電荷を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、第１の電極対の間に存在していた電気化学活性分子５のうちの少数が第１の電極対の間の空間から排除されるか、または、電気的な引力によって、電気化学活性分子５が第１の電極対の間の空間内へ集められることになる。換言すれば、電気化学活性分子５と異なる種類の電荷を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、第１の電極対の間に存在していた電気化学活性分子５（換言すれば、酸化還元反応を起し得る電気化学活性分子５）の数が小さく変化するか、または増加することになる。その結果、図５Ｂに示すように、第１の電極対に流れている第１の電流の値が、小さく変化するか、または増加することになる。なお、電気化学活性分子５が有している電荷量が大きくなればなるほど、第１の電流は大きくなるように変化する傾向を示す。
　上述したように、第１の電流の変化量は、試料１０の電荷の種類および電荷量と相関関係がある。したがって、第１の電流の変化量を測定することによって、試料１０の電荷に関する情報を得ることができる。
　更に、図１Ａ～図５Ｂに示すように、本実施形態では、試料１０の移動経路を挟むように形成されている第２の電極対（電極２ａおよび電極２ｂ）の間に、試料１０の移動方向（図１中、矢印にて示す）と略平行な電界を形成するように電圧を印加してもよい。
　この場合、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内を試料１０の移動方向に沿って移動するイオンに由来する第２の電流が、第２の電極対へ流れることになる。そして、当該第２の電流の大きさは、試料１０の体積と相関関係がある。
　例えば、図２Ａに示すように、大きな体積を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、当該試料１０によって、電極２ａから電極２ｂへ向かう（または電極２ｂから電極２ａへ向かう）イオンの移動が大幅に阻害される。その結果、第２の電極対に流れている第２の電流の値が、大きく変化（具体的には、大きく減少）することになる。
　一方、図３Ａに示すように、小さな体積を有する試料１０が第１の電極対の間へ移動すると、当該試料１０によって、電極２ａから電極２ｂへ向かう（または電極２ｂから電極２ａへ向かう）イオンの移動が少し阻害される。その結果、第２の電極対に流れている第２の電流の値が、小さく変化（具体的には、小さく減少）することになる。
　上述したように、第２の電流の変化量は、試料１０の体積と相関関係がある。したがって、第２の電流の変化量を測定することによって、試料１０の体積に関する情報を得ることができる。
　〔２．試料の分析方法〕
　本実施形態の試料の分析方法は、第１工程～第４工程を有している。また、本実施形態の分析方法は、上記第１工程～第４工程に加えて、更に、第５工程～第７工程のうちの少なくとも１つの工程を有していてもよい。以下に、各工程について説明する。
　　〔２－１．第１工程〕
　第１工程は、試料の移動経路を挟むように形成されている第１の電極対の間に、試料の移動方向と交わる方向へ電界を形成するように電圧を印加する工程である。
　つまり、本実施形態では、第１の電極対の陽極と陰極との間の空間内が、試料の移動経路となる。そして、第１の電極対の陽極と陰極との間に形成される電界は、試料の移動方向と交わる方向に形成されている。
　上記電界は、試料の移動方向と交わる方向へ形成されていればよく、交わる角度は特に限定されない。例えば、上記電界と上記試料の移動方向とは、４５度以上９０度以下の角度、６０度以上９０度以下の角度、７０度以上９０度以下の角度、８０度以上９０度以下の角度、または９０度の角度にて交わっていてもよい。勿論、これ以外の角度で交わっていてもよく、特に限定されない。
　上記第１の電極対の具体的な構成としては特に限定されず、適宜、公知の電極を用いることが可能である。例えば、第１の電極対としては、金電極、白金電極、銀電極、銅電極、または有機電導性ポリマー電極（例えば、ポリピロール）を用いることが可能である。
　これらの中では、第１の電極対として金電極または白金電極を用いることが好ましい。当該構成であれば、第１の電極対において、より安定的に電気化学活性分子の酸化還元反応を起すことができる。また、当該構成であれば、第１の電極対において気体が発生することを、より確実に抑制することができる。なお、この点については、後述する〔２－２．第２工程〕にて、より詳細に説明する。
　上記第１の電極対の陽極と陰極との間の距離は特に限定されず、試料の大きさに応じて適宜設定することができる。つまり、上記第１の電極対の陽極と陰極との間の距離は、分析しようとする試料が通過し得る距離であればよい。
　例えば、試料を球形であると仮定し当該球の直径をＹ〔ｎｍ〕とする。この場合、第１の電極対の陽極と陰極との間の距離Ｘは、Ｙ〔ｎｍ〕よりも長ければよい（Ｙ＜Ｘ）。
　本実施形態では、第１の電極対に対して、第１の電極対の表面で生じる電気化学活性分子の酸化還元反応に由来する電流を流す。そして、当該電流の発生は第１の電極対の陽極と陰極との間の距離の影響を受けないので、第１の電極対の陽極と陰極との間の距離には、特に上限はない。
　但し、第１の電極対の陽極と陰極との間の空間の体積が試料の体積に近いほど（換言すれば、第１の電極対の陽極と陰極との間の空間における、試料の体積占有率が高いほど）、第１の電極対に流れる第１の電流の変化量が大きくなる傾向を示し、その結果、分析感度が上昇する傾向を示す。それ故に、第１の電極対の陽極と陰極との間の距離Ｘの上限値を、１００Ｙ、５０Ｙ、２０Ｙ、１０Ｙ、８Ｙ、６Ｙ、４Ｙ、２Ｙ、１．５Ｙ、または１．２Ｙに設定してもよい。
　つまり、第１の電極対の陽極と陰極との間の距離Ｘを、Ｙ＜Ｘ＜１００Ｙ、Ｙ＜Ｘ＜５０Ｙ、Ｙ＜Ｘ＜２０Ｙ、Ｙ＜Ｘ＜１０Ｙ、Ｙ＜Ｘ＜８Ｙ、Ｙ＜Ｘ＜６Ｙ、Ｙ＜Ｘ＜４Ｙ、Ｙ＜Ｘ＜２Ｙ、Ｙ＜Ｘ＜１．５Ｙ、または、Ｙ＜Ｘ＜１．２Ｙとすることも可能である。但し、本実施形態は、これらに限定されない。
　更に具体的には、第１の電極対の陽極と陰極との間の距離Ｘは、０．１ｎｍ以上であってもよく、０．５ｎｍ以上であってもよく、１ｎｍ以上であってもよく、２ｎｍ以上であってもよく、１０ｎｍ以上であってもよい。また、上述したように距離Ｘの上限値は特に無いが、例えば、上述した全ての下限に対して、上限を５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、１μｍ以下、５μｍ以下、１０μｍ以下、２０μｍ以下、５０μｍ以下、１００μｍ以下、２００μｍ以下、５００μｍ以下、または、１ｍｍ以下に設定することも可能である。
　トンネル電流に基づく分析では、電極対の陽極と陰極との間の距離が２ｎｍ以上になると、これらの電極間に流れるトンネル電流の値は小さくなり、トンネル電流に基づいた分析は困難になる。一方、本実施形態の分析方法は、トンネル電流に基づく分析とは全く技術思想が異なる分析であるために、たとえ第１の電極対の陽極と陰極との間の距離が２ｎｍ以上になったとしても、感度良く分析を行うことができる。
　別の観点からいえば、第１の電極対の陽極と陰極との間の空間の体積は、第１の電極対の陽極と陰極との間の空間における１個の試料（例えば、１分子の試料）の体積占有率が、１％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上になるように設定され得る。このとき、体積占有率が高ければ高いほど、感度良く分析を行うことができる。
　第１の電極対の間に印加される電圧の値としては特に限定されず、用いる電気化学活性分子の種類に応じて、当該電気化学活性分子が酸化還元反応を生じる程度に適宜設定すればよい。例えば、－１０Ｖ以上＋１０Ｖ以下、－５Ｖ以上＋５Ｖ以下、または、－１Ｖ以上＋１Ｖ以下に設定することが可能であるが、これらに限定されない。
　本実施形態に用いられる試料としては特に限定されない。例えば、試料として核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、アミノ酸、タンパク質、花粉、ウイルス、細胞、有機粒子、または無機粒子を挙げることができるが、これらに限定されない。
　本実施形態では、生理的条件下（例えば、０．１５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ６．０～８．０の水溶液）であっても、高感度に電流を測定することができる。それ故に、各種生体分子（例えば、核酸、アミノ酸、タンパク質、花粉、ウイルス、細胞など）を生理条件下にて、不活性化させることなく分析することができる。
　なお、上記試料は、電荷（例えば、表面電荷）を有するものであってもよい。この場合、電荷を有する電気化学活性分子を用いることによって、試料の電荷の種類、および試料の電荷量に関する情報を得ることができる。
　以上に説明した構成は第１工程の基本的な構成であるが、第１工程は、上述した基本的な構成に加えて、更に、試料の移動経路を挟むように形成されている第２の電極対の間に、試料の移動方向と略平行な電界を形成するように、電圧を印加することを包含していてもよい。つまり、第１工程では、第１の電極対によって形成される電界と交わるように、第２の電極対によって別の電界を形成してもよい。
　第２の電極対の間に形成される電界の方向は、試料の移動方向と略平行であればよいが、厳密に平行である必要はない。例えば、第２の電極対の間に形成される電界の方向と、試料の移動方向とには、０度以上４５度以下のズレがあってもよいし、０度以上３０度以下のズレがあってもよいし、０度以上２０度以下のズレがあってもよいし、０度以上１０度以下のズレがあってもよいし、０度以上５度以下のズレがあってもよいし、０度以上２度以下のズレがあってもよい。また、上述した具体的なズレの値に限定されるものでもない。
　上記第２の電極対の具体的な構成としては特に限定されず、適宜、公知の電極を用いることが可能である。例えば、第２の電極対としては、銀／塩化銀電極、金電極、白金電極、銀電極、銅電極、または有機電導性ポリマー電極（例えば、ポリピロール）を用いることが可能である。
　これらの中では、第１の電極対として銀／塩化銀電極を用いることが好ましい。当該構成であれば、第２の電極対に対して、より安定して、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内を試料の移動方向に沿って移動するイオン（例えば、塩化物イオン）に由来する第２の電流を効率よく流すことができる。なお、この点については、後述する〔２－２．第２工程〕にて、より詳細に説明する。
　上記第２の電極対の陽極と陰極との間の距離は特に限定されず、適宜設定することができる。例えば、上記第２の電極対の陽極と陰極との間の距離は、１００μｍ以下であることが好ましい。その理由は、１００μｍよりも長い場合、溶液中におけるイオンの拡散効果がシグナルの感度（第２の電極対によって検出されるシグナルの感度）に影響を与える可能性があるからである。
　　〔２－２．第２工程〕
　第２工程は、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内に、第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置することによって、酸化還元反応に由来する第１の電流を上記第１の電極対へ流す工程である。つまり、第２の工程は、第１の電極対に流される第１の電流のベースラインを形成する工程である。
　なお、当該第２工程は、上述した第１工程の前に行うことも可能であるし、上述した第１工程と同時に行うことも可能であるし、勿論、上述した第１工程の後で行うことも可能である。
　また、上記溶液は、第１の電極対の間の空間を満たすのみならず、第２の電極対の間の空間を満たすように配置され得る。
　上記溶液には、第１の電極対で起こる酸化還元反応を阻害しない限り、電気化学活性分子以外の成分を含有させることも可能である。
　例えば、上記溶液に各種バッファーを加えて、溶液のｐＨを調節してもよい。上記バッファーの種類としては特に限定されず、例えば、Ｔｒｉｓバッファー、ＭＥＳバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、ＭＯＰＳバッファー、またはＨＥＰＥＳバッファーなどの生体または生体分子に対して毒性が低いものを用いることが好ましい。また、上記溶液のｐＨとしては特に限定されず、例えば、ｐＨ６．０～８．０であってもよい。
　本実施形態であれば、溶液のｐＨに依存することなく、第１の電極対に大きな値の第１の電流を流すことができる。つまり、生理的条件下にて、生理的な状態の試料を分析することができる。
　また、上記溶液には、第２の電極対が銀／塩化銀電極である場合に電流を流すために塩化物イオン（例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２など）を含有させてもよい。上記構成によれば、第２の電極対に対して、塩化物イオンの移動に由来する第２の電流を流すことができる。上記塩化物イオンの濃度は特に限定されないが、例えば、０．１ｍＭ～５Ｍの範囲であり得、１ｍＭ～１Ｍであることが更に好ましい。当該濃度は、イオン電流の増幅効果が大きく、かつ試料に影響を与えない程度の濃度であるため、好ましい濃度である。
　上記電気化学活性分子は、第１の電極対にて酸化還元反応を生じ得るものであればよく、その具体的な構成は、特に限定されない。上記電気化学活性分子は、酸化還元反応によって気体を発生させないものであることが好ましい。
　例えば、上記電気化学活性分子は、金属錯体、有機金属錯体、または有機分子であってもよい。
　上記金属錯体としては、例えば、鉄錯体（ヘキサシアノ鉄酸カリウム錯体、フェロセン（例えば、ヒドロキシフェロセン）、ポルフィリン鉄錯体、塩化鉄（ＩＩＩ）／塩化鉄（ＩＩ）、フェナントロリン鉄錯体等）、ルテニウム錯体（塩化ヘキサアミンルテニウム錯体、ルテニウムセン等）、コバルト錯体（コバルトセン、ポルフィリンコバルト錯体等）、およびマンガン・ニッケル・銅錯体を挙げることが可能である。これら金属錯体の中では、ヘキサシアノ鉄酸カリウム錯体が好ましいといえる。その理由は、酸化還元電位が低く生成物および反応物がいずれも水に溶けやすく安定しているからである。
　上記有機分子としては、例えば、ベンゾキノン、ベンゾキノンの誘導体、テトラシアノギノジメタン（ＴＣＮＱ）、テトラメチルフェニレンヂアミン（ＴＭＰＤ）、およびテトラチアフルバレン（ＴＴＦ）を挙げることが可能である。これら有機分子の中では、酸化還元電位が低く水溶性が高い物質がよく、ＴＣＮＱまたはベンゾキノンの誘導体が好ましいといえる。
　また、上記電気化学活性分子は、－１Ｖ～１Ｖの電圧が印加されると酸化還元反応を起すものであることが好ましい。
　本実施形態に用いられる電気化学活性分子は上述したものに限定されず、公知の電気化学活性分子を用いることが可能である。例えば、文献Ｘ（理科年表・化学便覧）や文献Ｙ（A.Bard, Electrochemical Methods Fundamentals and Applications,　Wiley）には、様々な種類の電気化学活性分子が開示されており、これらの電気化学活性分子を本実施形態に用いることが可能である。なお、上記文献ＸおよびＹは、本明細書中に参考として援用される。
　上述したように、本実施形態では、後述する第２の電極対に電流を流すために、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内に配置する溶液中に塩化物イオン（例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２など）を含有させてもよい。この場合、上記溶液中に電気化学活性分子が存在することによって、第１の電極対にて電気化学活性分子の酸化還元反応が起こり、その結果、安定な第１の電流を流すことができる。この点について、以下に説明する。
　溶液中に電気化学活性分子が存在しなければ、第１の電極対の陽極と陰極とでは、以下のような反応が生じ、その結果、気体（酸素、塩素、水素など）が発生する。
・陽極：２Ｃｌ－　→Ｃｌ２　＋　２ｅ－　　　　　　　・・・反応１
・陽極：２Ｈ２Ｏ　→Ｏ２　＋　４Ｈ＋＋　４ｅ－　　　　・・・反応２
・陰極：２Ｈ２Ｏ　＋　２ｅ－　→　Ｈ２　＋２ＯＨ－　・・・反応３
　上記気体は、第１の電極対の表面に付着し、第１の電極対に流れる電流の値を不安定にする。
　一方、溶液中に電気化学活性分子（例えば、ヘキサシアノ鉄酸カリウム錯体）が存在すれば、第１の電極対の陽極と陰極とでは、以下のような反応が生じ、その結果、気体が発生しない。なお、当該電気化学活性分子は単なる一例であって、本実施形態は、これに限定されない。
・陽極：［Ｆｅ（ＣＮ）６］４－　→　［Ｆｅ（ＣＮ）６］３－　＋　ｅ－　・・・反応４
・陰極：［Ｆｅ（ＣＮ）６］３－　＋　ｅ－　→　［Ｆｅ（ＣＮ）６］４－　・・・反応５
　このとき、反応４および反応５によって生じる電子の流れが、第１の電極対に流れる第１の電流を形成することになる。
　なお、ヘキサシアノ鉄酸カリウム錯体などは、負の電荷を有するイオンを形成するので、当該負の電荷に基づいて、試料の電荷の種類および電荷量に関する情報をも得ることができる。
　また、溶液中に電気化学活性分子（例えば、塩化ヘキサアミノルテニウム錯体）が存在すれば、第１の電極対の陽極と陰極とでは、以下のような反応が生じ、その結果、気体が発生しない。なお、当該電気化学活性分子も単なる一例であって、本実施形態は、これに限定されない。
・陽極：［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋　→　［Ｒｕ（ＮＨ３）６］４＋　＋　ｅ－　・・・反応６
・陰極：［Ｒｕ（ＮＨ３）６］４＋　＋　ｅ－　→　［Ｒｕ（ＮＨ３）６］３＋　・・・反応７
　このとき、反応６および反応７によって生じる電子の流れが、第１の電極対に流れる第１の電流を形成することになる。
　なお、塩化ヘキサアミノルテニウム錯体などは、正の電荷を有するイオンを形成するので、当該正の電荷に基づいて、試料の電荷の種類および電荷量に関する情報をも得ることができる。
　以上に説明した構成は第２工程の基本的な構成であるが、第２工程は、上述した基本的な構成に加えて、更に、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内に、第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置することによって、第１の電極対の間に挟まれた移動経路内を試料の移動方向に沿って移動するイオンに由来する第２の電流を上記第２の電極対へ流すことを包含していてもよい。
　上述したように、電気化学活性分子を含む溶液には、第２の電極対に電流を流すために塩化物イオン（例えば、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２など）を含有させてもよい。このとき、例えば、第２の電極対として銀／塩化銀電極を用いると、第２の電極対の陽極と陰極とでは、例えば以下のような反応が生じる。つまり、
・陽極：Ａｇ　＋Ｃｌ－　→ＡｇＣｌ　＋　ｅ－　　・・・反応８
・陰極：ＡｇＣｌ　＋　ｅ－　→　Ａｇ　＋Ｃｌ－　・・・反応９
　このとき、反応８および反応９によって生じるイオン（例えば、塩化物イオン）の流れが、第２の電極対に流れる第２の電流を形成することになる。
　　〔２－３．第３工程〕
　第３工程は、第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路に沿って、上記試料を移動させる工程である。
　上記工程では、試料の移動に伴って、第１の電極対の間に挟まれた空間内に存在する電気化学活性分子の数が変化する。例えば、試料の特性に応じて、電気化学活性分子の数が大きく減少したり、小さく減少したり、大きく増加したり、小さく増加したりする。そして、当該電気化学活性分子の数の変化によって、第１の電極対および第２の電極対に流れている電流の値が変化することになる。
　上記移動を生じさせる駆動力は特に限定されない。例えば、自由拡散によって試料を移動させることも可能であるし、第２の電極対によって電気的に試料を移動させることも可能である。
　上記試料が、第１の電極対の間に挟まれた移動経路に沿って移動する距離Ｌ（換言すれば、試料の移動方向に沿った第１の電極対（陽極および陰極）の長さ）は特に限定されず、適宜設定することが可能である。
　試料の体積、電荷の種類、および電荷量をより正確に予測するという観点からは、上記距離Ｌは、試料の長手方向への長さよりも長いこと、換言すれば、試料の全体が第１の電極対の間の空間内に完全に収容される長さであることが好ましいといえる。
　例えば、上記距離Ｌは、０．１ｎｍ以上であってもよく、０．５ｎｍ以上であってもよく、１ｎｍ以上であってもよく、２ｎｍ以上であってもよく、１０ｎｍ以上であってもよい。また、距離Ｌの上限値は特に無いが、例えば、上述した全ての下限に対して、上限を５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、５００ｎｍ以下、１μｍ以下、５μｍ以下、１０μｍ以下、２０μｍ以下、５０μｍ以下、１００μｍ以下、２００μｍ以下、５００μｍ以下、または１ｍｍ以下に設定することも可能である。勿論、本実施形態はこれらに限定されない。
　　〔２－４．第４工程〕
　第４工程は、試料の移動によって生じる第１の電流の変化量を測定する工程である。つまり、第４工程は、試料の移動に伴って、第１の電極対の間に挟まれた空間内に存在する電気化学活性分子の数が変化し、これによって生じた第１の電流の変化量を測定する工程である。
　当該工程は、第１の電極対を流れる電流を公知の電流計によって測定することによって実施することができる。
　以上に説明した構成は第４工程の基本的な構成であるが、第４工程は、上述した基本的な構成に加えて、更に、試料の移動によって生じる第２の電流の変化量を測定することを包含していてもよい。
　当該工程は、第２の電極対を流れる電流を公知の電流計によって測定することによって実施することができる。
　　〔２－５．第５工程〕
　本実施形態の試料の分析方法は、上述した第１工程～第４工程に加えて、更に第５工程を有していてもよい。
　上記第５工程とは、標準試料の体積と第１の電流の変化量との相関関係に基づいて、体積が未知である試料における第１の電流の変化量から、当該体積が未知である試料の体積を算出する工程である。
　換言すれば、上記第５工程とは、体積が既知である標準試料を用いて上記第１工程～上記第４工程にしたがって予め求められている、標準試料の体積と第１の電流の変化量との相関関係に基づいて、体積が未知である試料における第１の電流の変化量から、当該体積が未知である試料の体積を算出する工程である。
　標準試料の体積と第１の電流の変化量との相関関係は、体積が既知である様々な標準試料を、上述した第１工程～第４工程にしたがって解析することによって、求めることができる。
　例えば、第１工程～第４工程によって、体積（または、試料の形状を球とみなしたときの直径の長さ）がＶ１である試料１における第１の電流の変化量がＡ１であり、体積がＶ２である試料２における第１の電流の変化量がＡ２であり、体積がＶ３である試料３における第１の電流の変化量がＡ３であり、体積がＶ４である試料４における第１の電流の変化量がＡ４であることが測定されたとする。
　なお、当該例は、４種類の標準試料を用いた場合の例であるが、標準試料の数は、特に限定されない。但し、より精度良く未知の試料の体積を算出するためには、標準試料の数は多いほど好ましいといえる。
　上述したＶ１～Ｖ４とＡ１～Ａ４とから、公知の方法にしたがって、体積Ｖを第１の電流の変化量Ａの関数として表すことができる。なお、当該関数の種類（例えば、１次関数、２次関数など）は、標準試料の実測値に最も近似した関数を選択すればよい。
　それ故に、上記第１工程～第４工程にしたがって、体積が未知である試料における第１の電流の変化量を測定すれば、当該測定値を上記関数へ代入することによって、体積が未知である試料の体積を算出することができる。
　上記標準試料は体積が既知であるものであればよく、具体的な構成は特に限定されない。例えば、当該標準試料としては、ポリスチレンビーズなどを用いることが可能である。
　　〔２－６．第６工程〕
　本実施形態の試料の分析方法は、上述した第１工程～第４工程に加えて、更に第６工程を有していてもよい。
　上記第６工程とは、標準試料の電荷量と第１の電流の変化量との相関関係に基づいて、電荷量が未知である試料における第１の電流の変化量から、当該電荷量が未知である試料の電荷量を算出する工程である。
　換言すれば、上記第６工程とは、電荷量が既知である標準試料を用いて上記第１工程～上記第４工程にしたがって予め求められている、標準試料の電荷量と第１の電流の変化量との相関関係に基づいて、電荷量が未知である試料における第１の電流の変化量から、当該電荷量が未知である試料の電荷量を算出する工程である。
　標準試料の電荷量と第１の電流の変化量との相関関係は、電荷量が既知である様々な標準試料を、上述した第１工程～第４工程にしたがって解析することによって、求めることができる。
　例えば、第１工程～第４工程によって、電荷量がＣ１である試料１における第１の電流の変化量がＡ１であり、電荷量がＣ２である試料２における第１の電流の変化量がＡ２であり、電荷量がＣ３である試料３における第１の電流の変化量がＡ３であり、電荷量がＣ４である試料４における第１の電流の変化量がＡ４であることが測定されたとする。
　なお、当該例は、４種類の標準試料を用いた場合の例であるが、標準試料の数は、特に限定されない。但し、より精度良く未知の試料の電荷量を算出するためには、標準試料の数は多いほど好ましいといえる。
　上述したＣ１～Ｃ４とＡ１～Ａ４とから、公知の方法にしたがって、電荷量Ｃを第１の電流の変化量Ａの関数として表すことができる。なお、当該関数の種類（例えば、１次関数、２次関数など）は、標準試料の実測値に最も近似した関数を選択すればよい。
　それ故に、上記第１工程～第４工程にしたがって、電荷量が未知である試料における第１の電流の変化量を測定すれば、当該測定値を上記関数へ代入することによって、電荷量が未知である試料の電荷量を算出することができるとともに、電荷の種類に関する情報も得ることができる。
　上記標準試料は電荷量および電荷の種類が既知であるものであればよく、具体的な構成は特に限定されない。例えば、当該標準試料としては、化学修飾したポリスチレンビーズ、または化学修飾した金粒子などを用いることが可能である。
　　〔２－７．第７工程〕
　本実施形態の試料の分析方法は、上述した第１工程～第４工程に加えて、更に第７工程を有していてもよい。
　上記第７工程とは、標準試料の体積と第２の電流の変化量との相関関係に基づいて、体積が未知である試料における第２の電流の変化量から、当該体積が未知である試料の体積を算出する工程である。
　換言すれば、上記第７工程とは、体積が既知である標準試料を用いて上記第１工程～上記第４工程にしたがって予め求められている、標準試料の体積と第２の電流の変化量との相関関係に基づいて、体積が未知である試料における第２の電流の変化量から、当該体積が未知である試料の体積を算出する工程である。
　標準試料の体積と第２の電流の変化量との相関関係は、体積が既知である様々な標準試料を、上述した第１工程～第４工程にしたがって解析することによって、求めることができる。
　例えば、第１工程～第４工程によって、体積（または、試料の形状を球とみなしたときの直径の長さ）がＶ１である試料１における第２の電流の変化量がＡ１であり、体積がＶ２である試料２における第２の電流の変化量がＡ２であり、体積がＶ３である試料３における第２の電流の変化量がＡ３であり、体積がＶ４である試料４における第２の電流の変化量がＡ４であることが測定されたとする。
　なお、当該例は、４種類の標準試料を用いた場合の例であるが、標準試料の数は、特に限定されない。但し、より精度良く未知の試料の体積を算出するためには、標準試料の数は多いほど好ましいといえる。
　上述したＶ１～Ｖ４とＡ１～Ａ４とから、公知の方法にしたがって、体積Ｖを第２の電流の変化量Ａの関数として表すことができる。なお、当該関数の種類（例えば、１次関数、２次関数など）は、標準試料の実測値に最も近似した関数を選択すればよい。
　それ故に、上記第１工程～第４工程にしたがって、体積が未知である試料における第２の電流の変化量を測定すれば、当該測定値を上記関数へ代入することによって、体積が未知である試料の体積を算出することができる。
　上記標準試料は体積が既知であるものであればよく、具体的な構成は特に限定されない。例えば、当該標準試料としては、ポリスチレンビーズなどを用いることが可能である。
　＜１．各種計測方法の説明＞
　　＜１－１．ＰＣ電気計測＞
　ＬａｂＶＩＥＷプログラム（ＮＩ　Ｐｘｌｅシステム）にしたがって、各種計測および解析を行った。具体的な方法は、当該プログラムに添付のプロトコールにしたがった。
　具体的には、１０ｋＨｚ～１ＭＨｚで、Ｉ－Ｖ計測（電流－電圧計測）およびＩ－ｔ計測（電流－時間計測）を行った。Ｉ－Ｖ計測は、一定時間内で定常電流が安定したレンジに推移したことを確認した後で、行った。
　　＜１－２．第２の電極対による電流の計測＞
　電流の計測には、１ｍＭ～１００ｍＭの緩衝溶液、および１ｍＭ～１００ｍＭの電気化学活性分子を用いた。
　上記緩衝溶液としては、ｐＨ６．５～８．０に調節したリン酸緩衝溶液、０．５×ＴＥ、または０．５×ＴＢＥなどを用いた。当該緩衝溶液は、生理的な条件に近い緩衝溶液であるといえる。
　第２の電極対によるシグナルは、孔（第１の電極対の間の空間）の開口部におけるイオンの電荷輸送を遮断することによって生じるシグナルであるため、電流値が減少するというシグナル（negative signal）になる。
　　＜１－３．第１の電極対による電流の計測＞
　電流の計測には、１ｍＭ～１００ｍＭの緩衝溶液、および１ｍＭ～１００ｍＭの電気化学活性分子を用いた。
　上記緩衝溶液としては、ｐＨ６．５～８．０に調節したリン酸緩衝溶液、０．５×ＴＥ、または０．５×ＴＢＥなどを用いた。当該緩衝溶液は、生理的な条件に近い緩衝溶液であるといえる。
　安定に電流を計測することができるように、低電位（－１Ｖ～１Ｖ）で酸化還元反応を起す電気化学活性分子を用いた。例えば、電気化学活性分子として１０ｍＭのフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウムを用いた場合には、当該電気化学活性分子を用いない場合と比較して、第１の電極対に流れる電流の値を略１０３倍上昇させ、かつ、計測されるシグナルの強度を上昇させた。
　第１の電極対によるシグナルは、例えばフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウム（負電荷を有する電気化学活性分子）を用いて、負に帯電した試料（例えば、粒子）を分析した場合には、電極付近での酸化還元反応を阻害するために、電流値が減少するというシグナル（negative signal）になる。
　一方、例えば塩化ルテニウムヘキサアミン（正電荷を有する電気化学活性分子）を用いて、同じ大きさの負に帯電した試料（例えば、粒子）を分析した場合には、シグナルが大きくなる。このことから、試料の荷電状態を反映したシグナルが得られることがわかる。またバックグランドとなる電流は、電気化学活性分子を加えた場合は安定するが、加えていない場合には不安定になる。
　＜２．分析装置の作製＞
　図１Ａに概略を示す分析装置を作製した。以下に、分析装置の作製方法を説明する。
　　＜２－１．ソリッドステートナノポアデバイスの作製＞
　本実施例では、Ｓｉ基板をベースとした、ＳｉＯ２のメンブレン構造を有するソリッドステートナノポアデバイスを作製し、当該デバイスを分析装置の構成の一部として用いた。
　上記ソリッドステートナノポアデバイスは、主として、電子線描画および深掘ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）、または各種エッチング（例えば、ＫＯＨ溶液を用いたエッチング）によって作製した。
　具体的には、まず、図６の（ａ）～（ｆ）に示すように、Ｓｉ基板上に、内部にＡｕ電極対（第１の電極対に対応）が埋め込まれているＳｉＯ２膜を形成した。つまり、当該工程によって、微小な電極間距離（例えば、ナノメートルサイズ）を有するＡｕ電極対を形成した。
　次いで、図６の（ｇ）～（ｉ）に示すように、Ａｕ電極対の間に存在しているＳｉＯ２膜を除去することによって、Ａｕ電極対の間に孔（Ａｕ電極対の間の空間）を形成した。
　更に、図６の（ｊ）～（ｎ）に示すように、上記孔の下に存在しているＳｉ基板を除去することによって、上記孔を貫通させた。
　次いで、フォトリソグラフィー、およびＡｕスパッタリングによって、上記ソリッドステートナノポアデバイスに含まれるＡｕ電極対からの引き出し線を作製した。なお、当該引き出し線には、電流計または電圧印加装置が接続されることになる。
　以上のようにして、様々な横断面の直径（例えば、０．０５μｍ～２００μｍ）および深さ（例えば、０．０５μｍ～５０μｍ）を有する孔を備えたソリッドステートナノポアデバイスを作製した。
　　＜２－２．マイクロ流路の作製＞
　上記Ａｕ電極対の間に形成された孔へ試料を導入するためのマイクロ流路を作製した。
　まず、フォトリソグラフィーによって、ＳＵ－８によって形成されたマイクロ流路の型を作製し、当該型をＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）へ転写した。これによって、マイクロ流路が形成されたＰＤＭＳ基板を作製した。
　上記ソリッドステートナノポアデバイスと上記ＰＤＭＳ基板とを、上述した孔とマイクロ流路とが繋がるように、アクリルホルダーを用いて圧着させた。なお、当該アクリルホルダーには、シリンジポンプヘ接続されている孔と、第１の電極対または第２の電極対と電気的な接続を形成するための接続部が形成されている。
　　＜２－３．第２の電極対の作製＞
　Ａｇ／ＡｇＣｌペースト（ＢＡＳ社）を用いて、第２の電極対をＡｇ／ＡｇＣｌ電極として作製した。なお、具体的な作製方法は、公知の方法にしたがった。
　＜３．孔の特性の確認－１＞
　上記＜２．分析装置の作製＞の欄で作製したナノサイズの孔の特性を、顕微鏡によって確認した。
　図７Ａ～図７Ｄに、顕微鏡にて撮影したソリッドステートナノポアデバイスの写真を示す。
　図７Ａは、光学顕微鏡による、ソリッドステートナノポアデバイスの全体を写した写真である。ソリッドステートナノポアデバイスの全体の形状は、略１ｃｍ×１ｃｍの板状の形状であった。そして、当該ソリッドステートナノポアデバイスの中央部近傍に、孔が形成されている。
　図７Ｃおよび図７Ｄは、各々、光学顕微鏡による、孔の暗視野像および明視野像を示している。これらの観察によって、孔が貫通していることを確認した。
　図７Ｂは、更に小さい孔を、走査型顕微鏡で観察した像を示している。更に小さな孔については、当該観察によって、孔が貫通していることを確認した。
　＜４．孔の特性の確認－２＞
　上記＜２．分析装置の作製＞の欄で作製したナノサイズの孔の特性を、電解質溶液（ＫＣｌ溶液）を用いたイオン電流計測によって確認した。
　具体的に、図８Ａは、分析装置の概略を示す図であり、図８Ｂは、分析装置の写真である。そして、図８Ｃ～図８Ｅでは、＜１．各種計測方法の説明＞の欄で説明した方法にしたがって、第２の電極対の間に流れる電流を測定した。
　図８Ｃに、第２の電極対の間に印加する電圧を変化させたときの電流の値を示す。なお、図８Ｃは、６０μｍのサイズの孔に、「１００ｍＭ」、「２００ｍＭ」、「４００ｍＭ」、「６００ｍＭ」、「８００ｍＭ」、および「１Ｍ」の濃度の電解質溶液（ＫＣｌ）を導入して得られた測定結果を示している。図８Ｃから、孔がオーミックな特性を示すことが明らかになった。
　図８Ｄに、孔の横断面の直径とコンダクタンスとの関係を示す。図８Ｄから、コンダクタンスは、孔の横断面の直径に依存することが明らかになった。このとき、膜の厚さ（Ｌ）が孔の厚さ（ｄ）に対して十分に小さいとき（Ｌ<<ｄ）の、孔の厚さとコンダクタンスとの関係を図８Ｅに示す。図８Ｅに示すように、孔の厚さｄが大きい場合には、コンダクタンスは、孔の直径の二乗と比例関係にあり、孔の厚さｄが小さい場合には、コンダクタンスは、孔の直径と比例関係にある。このことから、電気伝導度は、孔の厚さに依存することが明らかになった。
　つまり、図８Ｃ～図８Ｅから、本実施例で作製した分析装置が、分析装置として適切に機能し得るものであることが確認できた。
　＜５．第２の電極対に流れる電流の特性に関する解析－１＞
　上記＜２．分析装置の作製＞の欄で作製したナノサイズの孔（孔の横断面の直径：２００μｍ、孔の深さ：５０μｍ）に様々な大きさの試料（具体的には、直径が２μｍ、４μｍ、６μｍ、１０μｍ、４０μｍ、または８０μｍであるポリスチレンビーズ）を導入したときに生じる、第２の電極対に流れる電流の変化を測定した。なお、当該測定は、電解質溶液（ＫＣｌ溶液）を用いたイオン電流計測によって確認した。
　図９Ａは、分析装置の概略を示す図である。
　図９Ｂは、直径が４０μｍまたは８０μｍであるポリスチレンビーズを用いたときに実際に測定された電流を示しており、図９Ｃは、このときの、ピーク電流の強度とピークの数との関係を示している。
　図９Ｄは、直径が２μｍ、４μｍ、６μｍ、または１０μｍであるポリスチレンビーズを用いたときの、ビーズの直径と電流の強度との関係を示している。
　図９Ｄに示すように、試料の大きさと第２の電極対に流れる電流との間には、相関関係があることが明らかになった。
　このことは、未知の試料を用いて第２の電極対に流れる電流の変化を測定すれば、例えば、図９Ｄに示すグラフから、当該試料を球状のビーズとして考えたときの直径を算出し得ることを示している。そして、直径が算出できれば、試料の体積も算出することができる。
　＜６．第２の電極対に流れる電流の特性に関する解析－２＞
　上記＜２．分析装置の作製＞の欄で作製したナノサイズの孔（孔の横断面の直径：１０μｍ、孔の深さ：１０μｍ）に試料としてポリスチレンビーズを導入したときに生じる、第２の電極対に流れる電流の変化を測定した。なお、当該測定には、１０ｍＭのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ６）］／Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ６）］を含むＰＢＳを用いた。
　図１０Ａは、直径が８μｍであるポリスチレンビーズを試料として用いたときの、電流と時間との関係を示すグラフである。
　図１０Ｂは、直径が６μｍであるポリスチレンビーズを試料として用いたときの、シグナル強度と試料の直径との関係を示すグラフである。
　図１０Ｃは、直径が６μｍであるポリスチレンビーズを試料として用いたときの、電流強度と表面電荷との関係を示すグラフである。
　図１０Ａ～図１０Ｃから、シグナル強度は、試料の直径と相関関係があり、電流強度は、試料の表面電荷と相関関係があることが明らかになった。
　＜７．第１の電極対に流れる電流の特性に関する解析－１＞
　電気化学活性分子（１０ｍＭのフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウム）を用いた場合に第１の電極対に流れる電流（試料を導入しないときに流れるベースの電流）と、電気化学活性分子を用いない場合に第１の電極対に流れる電流とを比較した。
　図１１Ａは、分析装置の概略を示す図である。
　図１１Ｂは、電気化学活性分子を用いない場合の電流－電圧特性を示している。
　図１１Ｃは、電気化学活性分子を用いる場合の電流－電圧特性を示している。なお、図１１Ｃ中、四角で囲った領域に示すデータは、電気化学活性分子を用いない場合の電流－電圧特性を示している。
　安定な電気計測が可能な低電位（－１Ｖ～＋１Ｖ）では、シグナルの感度が上昇した。例えば、電気化学活性分子として１０ｍＭのフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウムを用いると、第１の電極対に流れる電流の値を略１０３倍上昇させ、かつ、計測されるシグナルの強度を上昇させた。
　第１の電極対によるシグナルは、例えばフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウム（負に帯電した電気化学活性分子）を用いて、負に帯電した粒子を分析した場合には、電極付近での酸化還元反応を阻害するために、電流値が減少するというシグナル（negative signal）になる。
　一方、例えば塩化ルテニウムヘキサアミン（正電荷を有する電気化学活性分子）を用いて、同じ大きさの負に帯電した粒子を分析した場合には、シグナルが大きくなる。このことから、粒子の荷電状態を反映したシグナルが得られることがわかる。
　またバックグランドとなる電流は、電気化学活性分子を加えた場合は安定したが（図１１Ｄ参照）、加えていない場合には不安定になるか、または、検出されなかった（図１１Ｅおよび図１１Ｆ参照）。
　具体的に、図１１Ｄは、上記＜２．分析装置の作製＞の欄で作製したナノサイズの孔（孔の横断面の直径：１０μｍ、孔の深さ：１０μｍ）に試料としてポリスチレンビーズ（直径６μｍ）を導入したときに生じる、第１の電極対に流れる電流の変化を示している。なお、当該測定には、１０ｍＭのＫ４［Ｆｅ（ＣＮ６）］／Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ６）］を含むＰＢＳを用いた。
　一方、図１１Ｅおよび図１１Ｆは、上記＜２．分析装置の作製＞の欄で作製したナノサイズの孔（孔の横断面の直径：１０μｍ、孔の深さ：１０μｍ）に試料を導入していないときに生じる、第１の電極対に流れる電流の変化を示している。なお、当該測定にはＰＢＳを用いた。
　＜８．第１の電極対に流れる電流の特性に関する解析－２＞
　様々な生物学的な試料（例えば、花粉（スギまたはヒノキの花粉）、血球（赤血球または白血球）、及びウイルス（アデノウイルス））を用いた場合の、第１の電極対に流れる電流の変化を測定した。
　具体的には、電気化学活性分子としては１０ｍＭのフェリシアン化カリウム／フェロシアン化カリウムを用いた。また、試料を分散させるための溶液としては１×ＰＢＳを用いた。また、孔の横断面の直径（換言すれば、第１の電極対の電極間距離）は、試料の大きさに応じた長さに設定した。具体的には、試料として花粉を用いる場合には、孔の横断面の直径を２００μｍとし、試料として血球を用いる場合には、孔の横断面の直径を５０μｍとし、試料としてウイルスを用いる場合には、孔の横断面の直径を２００ｎｍとした。　　　
　図１２Ａ～図１２Ｃおよび図１３Ａ～図１３Ｃに示すように、第１の電極対に流れる電流の値は、試料の大きさに応じて変化した。
　例えば、２００ｎｍの孔を有するデバイスを用いると、ヒノキの花粉の場合には２．３μＡ（電流の値は、０．３２％減少）においてピークの数が最も多く、スギの花粉の場合には２．６μＡ（電流の値は、０．３６％減少）においてピークの数が最も多かった。
　例えば、５０μｍの孔を有するデバイスを用いると、赤血球の場合には０．１５ｎＡ（電流の値は、０．１５％減少）においてピークの数が最も多く、白血球の場合には２．６ｎＡ（電流の値は、０．７％減少）においてピークの数が最も多かった。
　例えば、２００ｎｍの孔を有するデバイスを用いると、アデノウイルスの場合には８ｎＡ（電流の値は、０．８％減少）においてピークの数が最も多かった。
　本発明は、様々な試料を分析するための各種装置に利用することができる。例えば、高速、高感度および低コストにて、ウイルス検査またはアレルゲン検査を実施する分析装置に利用することができる。

Claims (10)

  1. 　試料の移動経路を挟むように形成されている第１の電極対の間に、上記試料の移動方向と交わる方向へ電界を形成するように、電圧を印加する第１工程と、
    　上記第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路内に、上記第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置することによって、上記酸化還元反応に由来する第１の電流を上記第１の電極対へ流す第２工程と、
    　上記第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路に沿って、上記試料を移動させる第３工程と、
    　上記試料の移動によって生じる上記第１の電流の変化量を測定する第４工程と、を有することを特徴とする試料の分析方法。
  2. 　標準試料の体積と第１の電流の変化量または第１の電流に応じた物理量の変化量との相関関係に基づいて、測定された上記第１の電流の変化量から、上記試料の体積を算出する第５工程を有することを特徴とする請求項１に記載の試料の分析方法。
  3. 　標準試料の電荷量と第１の電流の変化量または第１の電流に応じた物理量の変化量との相関関係に基づいて、測定された上記第１の電流の変化量から、上記試料の電荷量を算出する第６工程を有することを特徴とする請求項１また２に記載の試料の分析方法。
  4. 　上記第１工程は、更に、上記試料の移動経路を挟むように形成されている第２の電極対の間に、上記試料の移動方向と略平行な電界を形成するように、電圧を印加することを包含し、
    　上記第２工程は、更に、上記第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路内に、上記第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液を配置することによって、上記第１の電極対の間に挟まれた上記移動経路内を上記移動方向に沿って移動するイオンに由来する第２の電流を上記第２の電極対へ流すことを包含し、
    　上記第４工程は、更に、上記試料の移動によって生じる上記第２の電流の変化量を測定することを包含する、ことを特徴とする請求項１～３の何れか１項に記載の試料の分析方法。
  5. 　標準試料の体積と第２の電流の変化量または第２の電流に応じた物理量の変化量との相関関係に基づいて、測定された上記第２の電流の変化量から、上記試料の体積を算出する第７工程を有することを特徴とする請求項４に記載の試料の分析方法。
  6. 　上記電気化学活性分子は、金属錯体、有機金属錯体、または、有機分子であることを特徴とする請求項１～５の何れか１項に記載の試料の分析方法。
  7. 　上記電気化学活性分子は、ヘキサシアノ鉄酸カリウム錯体、塩化ヘキサアミンルテニウム錯体、または、ヒドロキシフェロセンであることを特徴とする請求項６に記載の試料の分析方法。
  8. 　上記電気化学活性分子は、－１Ｖ～１Ｖの電圧が印加されると酸化還元反応を起すものであることを特徴とする請求項６に記載の試料の分析方法。
  9. 　上記第１の電極対の陽極と陰極との間の距離は、２ｎｍ以上であることを特徴とする請求項１～８の何れか１項に記載の試料の分析方法。
  10. 　上記第１の電極対は、金電極または白金電極であり、
    　上記第２の電極対は、銀／塩化銀電極であり、
    　上記第１の電極対にて酸化還元反応を生じる電気化学活性分子を含む溶液には、塩化物イオンが含まれていることを特徴とする請求項１～９の何れか１項に記載の試料の分析方法。
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