JP2005257687A - トンネルコンダクタンスの変化を検出することによってポリマーをシーケンシングするための方法及び装置 - Google Patents

Abstract

【課題】トンネルコンダクタンスの変化を利用してポリマーをシーケンシングする。
【解決手段】例えば核酸のようなポリマーの分子を識別するシステム及び方法が記載されている。該方法は、対象とする分子の任意の２つの内部エネルギーレベル間の任意のエネルギー差のうちの１つに対応するチャンネルによって分離されたナノ電極対の間のバイアス電圧をセンタリングするステップと、前記対象とする分子が前記チャンネル内にある間、変調波形により前記バイアス電圧を変調するステップとを含む。前記対象とする分子の電気信号特性が、前記ナノ電極間のトンネル電流から導出されて、その特徴的な電気信号が、前記対象とする分子を識別するために、化学的に既知の分子に関する信号の既知の値と比較される。複数のナノ電極対を、更に確実に単一の分子か又は複数の分子を識別するために用いることができる。
【選択図】図１

Description

本発明は、一般に、ポリマー鎖内の分子を識別することに関し、特に、トンネル電流測定によってそのような分子をシーケンシングすることに関する。

バイオポリマー（生体高分子）の機能に関する多くの研究が実施されてきた。バイオポリマーの機能は、バイオポリマー内のモノマーの一次シーケンス（又は一次配列）によって決定される。モノマーのシーケンスを識別することは、バイオポリマーの機能を理解するために不可欠である。迅速で、信頼でき、且つ費用のかからないポリマー（特に核酸）の評価が、ますます重要になってきている。典型的な現在の核酸シーケンシング方法は、特定の塩基で切断された複数の長さのＤＮＡフラグメントをもたらす化学反応か、又は特定の塩基で終了する複数の長さのＤＮＡフラグメントをもたらす酵素反応のいずれかに依存する。

ポリマーをシーケンシングするための既知の各方法は、欠点を有する。例えば、ほとんどの方法は、遅く、労力集中型（又は労働集約型）である。ゲルベースのＤＮＡシーケンシング方法は、３００〜８００塩基長のシーケンス（配列）を識別するために約１日〜３日を必要とする。質量分光法（mass spectroscopy）及びＥＬＩＤＡシーケンシングのような方法は、非常に短いポリマーでしか実行することができない。

最近、自然か又は人工のナノ孔の開発により、核酸分子のシーケンス（配列）の迅速な決定が可能となってきた。ナノ孔のシーケンシングにおいて、適切な溶液内で、一本鎖ＤＮＡがナノ孔を通過させられて、個別のヌクレオチド（か又はヌクレオチドの環境内の物理的変化）が物理的に感知される。例えば、ナノ孔を有するメンブレン（又は膜）が、溶液内において２つのチャンバに分離し、その２つのチャンバ間に低電圧が印加される。ナノ孔を介した２つのチャンバ間の溶液内のイオン電流が、ナノ孔の内部のＤＮＡの存在をモニターするために使用される。一本鎖ＤＮＡがナノ孔内にある時には、この一本鎖ＤＮＡがナノ孔を部分的に遮断するので、２つのチャンバ間のイオン電流が減少させられる。ＤＮＡ塩基を識別するために、イオン電流の変化を使用することが提案されている。（例えば非特許文献１、Ｂａｌｄａｒｅｌｌｉ他著の特許文献１、及びＣｈｕｒｃｈ他著の特許文献２を参照のこと。各文献は、参照により本明細書内に組み込まれる。）典型的には、ナノ孔のアスペクト比のために任意の所与の時間においてナノ孔内に約１０のＤＮＡ塩基があるので、個別のＤＮＡ塩基を識別するためにイオン電流の変化を使用することは、非常に困難である。

一方、ナノテクノロジにおける発展によって、ナノ孔を介した分子の通過を制限することが実現可能となっている。例えば、分子がナノ孔を通過する時にポリヌクレオチドを特徴付けるためのメンブレン・チャンネルの使用が、研究されてきている。Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ他（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ他著の非特許文献２を参照のこと。非特許文献２は参照により本明細書内に組み込まれる）は、電界を使用して、一本鎖ＲＮＡ及びＤＮＡ分子を、脂質二重層メンブレン内の２．６ナノメートルの直径のイオンチャンネルを介して押し込むように通過させている。そのチャンネルの直径は、核酸ポリマーの一本鎖だけが、任意の所与の時間においてチャンネルを通過することが可能な直径である。核酸ポリマーがそのチャンネルを通過する時に、そのチャンネルを部分的に遮断したポリマーによって、イオン電流が一過的に減少する結果となる。電流の減少の持続時間は、核酸ポリマーの長さに正比例するので、（上述の）Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ他は、イオン電流における変化を測定することにより核酸の長さを経験的に決定することができた。
米国特許第６，０１５，７１４号 米国特許第５，７９５，７８２号 Ａ．Ｍｅｌｌｅｒ他著、「Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules」、米国科学アカデミー会報、第97巻、1079〜1085頁、2000年 Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ他著、米国科学アカデミー会報、第93巻、13770〜13773頁、1996年11月 Ｂ．Ｓｔｉｐｅ他著、「Single-Molecule Vibrational Spectroscopy and Microscopy」、1998年6月12日、Science、第280巻、1732〜1735頁

これまで識別されていないか又は特徴付けられていない生体分子のようなポリマーの識別のため、及び／又は、シーケンシングのための必要性が当該技術分野において継続的に存在する。

下記は分子を直接的に感知するか又は識別するための改善された方法及び装置についての記載である。

本発明は、ナノ電極対の間に形成されたナノメートルスケールのチャンネルを介してポリマーを通過させることによって、核酸のヌクレオチド塩基のようなポリマー内の連結された分子を連続的に識別することに関する。ナノ電極間に印加されるバイアス電圧の変更及び／又は変調と後の信号処理とによって、対象とする所望の分子に対応する特性信号の既知の値と比較されることができる電気的な固有の特徴か又は信号を導出することができる。この比較によって、ポリマーの分子が順番に識別される結果となる。後述される本発明の説明において、連続しているポリマーが好適には一本鎖か又は二本鎖のＤＮＡ塩基のような核酸である好適実施形態に対して特に参照が行われるが、本発明は、そのようなポリマーに限定されることを意図しない。

一態様において、本発明は、調査中の分子を識別するために、トンネルバイアス電圧に対するトンネル電流の依存性（すなわちトンネルコンダクタンスにおける変化）を利用する装置と方法とを提供する。例えば内部固有状態といった、分子の内部構造が、トンネル電流とトンネルバイアス電圧との間の関係を変更する。この変更によって、トンネル電流とトンネルバイアス電圧との間の関係においていくつかの特有の特徴が生じる。従って、調査中の分子を識別するために、それらの特徴を使用することができる。

ナノテクノロジの発展が、ナノスケール電極対を製造することを実現可能にさせている。これにより、それらの電極は、電極間にナノメートルのオーダのチャンネルを有することができる。ポリマーの連結された分子は、従ってチャンネルを介して連続的に通過させられることができ、電極間のバイアス電圧を変調するか及び／又は変化させる間に、トンネル電流の振幅を基準として使用して、識別されることができる。バイアス電圧は、好適には、既知の分子が最も効果的に識別されるバイアス電圧を識別するために、既知の分子についての固有の特徴の値（複数可）を最初に決定する間に変化させられる。対象とする化学的に既知の分子の、特徴的な電気的特性の識別中に、バイアス電圧は、既知の分子に対応する所定のバイアス電圧付近にセンタリングされ（又は中央に位置決めされ）、次いで対象とする分子（複数可）がナノ電極間のチャンネルを通過させられる間に、変調させられる。チャンネル内の対象とする分子（複数可）を識別するために、トンネル電流とバイアス電圧とは、従って、固有の特徴の既知の値（複数可）との後の比較のため、固有の特徴を導出するために使用される。

例えば、固定された低バイアス電圧（例えば１００ｍＶ）を、ＤＮＡ塩基の識別のために使用することができる。バイアス電圧は、既知の分子の内部エネルギーレベル間の１つか又は複数のエネルギー差に対応する選択される共振電圧付近にセンタリングされる。次いで、変調波形によってバイアス電圧が変調される時に、対象とする未知の分子が、チャンネルを通過するよう連続的に強く促されて、分子が電極間を通過する時の該分子を通るトンネル電流とバイアス電圧とを復調することによって、対象とする分子を示す１つか又は複数の電気信号が導出される。導出された電気信号は、次に、既知の分子に対応する信号の既知の値と比較される。

本発明は、内部エネルギーレベルに対する関係に依存する。何故ならば、チャンネルを通過する時にナノ電極に関して異なる配向を有する２つの似ていないＤＮＡ塩基は、（固定されたバイアス電圧において）類似のトンネル電流を有するように見える可能性があり、識別を複雑にするからである。

分子が、「ファネリングされる（すなわち漏斗を通るように狭い所を通過させられる）」ように、すなわち一度に単一分子がチャンネルを通るよう制限されるように、ナノ孔の近くに電極を作ることが望ましい。例えば、電界の印加か、溶液に加えられる力学的な圧力か、又は光学ピンセットを使用することによるような、当該技術分野において既知の技法によって、分子は、電極チャンネル及び／又はナノ孔を通過するよう強く促される。

本発明の一実施形態において、バイアス電圧を変調する波形は、好適には正弦波の全ての高調波が抑制されている正弦波である。別の実施形態において、変調波形は、矩形波である。変調波形は、導出された電気信号内で検出される高調波を無くすために、合成して生成されることができる。これらの技法及び信号の選択は、対象とする分子に対応する電気信号内に存在する検出可能な高調波を強調することが意図されている。

トンネル電流は、好適には、復調波形によってコヒーレントに復調される。アナログ回路か、デジタル回路か、又は数字的プロセスを使用して実施されることができる復調波形による復調の方法は、当該技術分野において既知であるため、ここでの説明を簡単にするために復調器の実施の詳細は説明されない。復調によって、ある固有の特徴が示される結果となる。例えば、分子内における非弾性電子トンネル効果は、変調する波形の２次高調波を使用することによって復調されるトンネル電流中の共振電圧におけるピークを示すことができる。従って、同じ物理的プロセスについて、変調する波形の３次高調波を使用することによって復調されるトンネル電流は、分散のようなカーブ（曲線）を示すことができる。これらの２つの特性信号のいずれかは、既知の分子の既知のカーブ（曲線）との比較に役立つ。復調波形の周波数は、変調波形の周波数と等しくすることができるか、或いはその高調波か又はサブ高調波とすることができる。代替として、復調波形は、以下の周波数成分のうちの少なくとも１つを含む。すなわち、変調波形と同じ周波数、変調波形の全てのサブ高調波、及び変調波形の全ての高調波である。信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を改善するために、（例えば帯域通過フィルタによって）復調前か、又は（例えば低域通過フィルタによって）復調後に、トンネル電流がオプションとしてフィルタリングされることができる。

別の実施形態において、複数のナノ電極対を配向させることができる。これにより、ポリマーが、連続する電極対の間に形成された各チャンネルを通過することができる。従って、各々の変調されたトンネル電流の類似の信号処理、及び／又は、フィルタリングによって、対象とする複数の分子を同時に識別することができる。

既知の分子の内部エネルギーレベルと固有の電気的特性とは、分光法のような従来の技法によって識別可能であるが、本発明は、代替の方法を提供する。１つか又は複数の既知の同一の分子（複数可）が、分子の内部エネルギーレベルであると疑われるレベルを包含する電圧範囲全体にわたってバイアス電圧を変化させ、且つ、同時にバイアス電圧を変化させる速度よりも高い周波数を有する変調波形によってバイアス電圧を変調させるために十分な時間の間、ナノ電極間に配置されることができる。上述のシーケンシング方法の比較に後に使用されることができる、既知の分子に関連付けられた固有の電気信号（複数可）は、分子が電極間にある時に測定される分子を通るトンネル電流を復調することによって導出される。既知の分子（複数可）をナノ電極間に配置することは、光学ピンセットによってチャンネル内に分子（複数可）を保持することによってか、又はナノチャンネルを介して、チャンネルの同一の分子を含むポリマーを通過させることによって、成し遂げられることができる。これにより、同一の分子が、信号処理中に常に存在することになる。

別の態様において、本発明は、上記の研究成果を実行するための装置を提供する。該装置は、対象とする分子における内部エネルギーレベル間の１つか又は複数のエネルギー差に対応するバイアス電圧を印加させるため及び変調させるため（及びオプションとして変化させるため）に信号発生器に接続されるナノ電極対と、ナノ電極チャンネルを介して通過するようポリマーを強く促すための手段と、トンネル電流信号を取得し、その取得した信号をコヒーレントに復調し、結果として得られる固有の電気信号を既知の分子に関連付けられた信号の既知の値と比較するための信号処理手段とを含む。オプションの実施形態において、チャンネルを介したポリマーの通過を一度に単一分子に制限するために、ナノ孔か又はナノチャンネルは、ナノ電極のすぐ近くに配置することができる。上述のように、ナノ電極チャンネルを介してポリマーを押し込むように通過させるために、光学ピンセットか、電界発生器か、又はポリマーの通過を強く促すための他の手段を使用することができ、取得される信号の信号対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）を改善するために、フィルタを使用することができる。

信号処理装置は、対象とする分子の導出された特徴的な電気信号を収集して記憶するために、且つ、比較の目的のために既知の分子に関連付けられたそのような信号の既知の値を検索するために、更にメモリを含むことができる。本発明は、より高速な速度（すなわちリアルタイム）のシーケンシングと、より長いポリマーをシーケンシングするための能力とを提供する。この能力は、例えば、ヌクレオチドのシーケンシングに関連付けられるような分析コストを低減するために役立つ。

トンネルコンダクタンスの変化を利用してポリマーを連続的にシーケンシングすることができる。

本発明の他の特徴及び利点は、その好適実施形態の後述の説明と、特許請求の範囲とから明らかとなるであろう。

本発明のより良い理解のために、添付図面と詳細な説明とを参照する。

本発明は、ポリマーをシーケンシングするためのシステムと方法とを提供する。図１（一定の縮尺に従って描かれているものではない）を参照すると、本発明の好適実施形態は、溶液内のポリマー２を、一度に単一分子（８）ずつ、一対のナノ電極６の間のチャンネル４を横切るように強く促すステップと、対象とする分子８の内部エネルギーレベルのうちの任意の２つの間のエネルギー差に対応する電極６の間のバイアス電圧Ｖ_Ｂ１２をセンタリングするために、従来の信号発生器１０を使用するステップとを含む。変調波形Ｗ_ＭＯＤ１４が、次にバイアス電圧Ｖ_Ｂ１２に対して印加される。分子８を介してチャンネル４を流れるトンネル電流Ｉ_Ｔ１６は、センサ１８（例えば電流センサ）によって取得され、信号処理装置２０に中継される。該信号処理装置２０は、ロックイン増幅器及び／又は位相検波器を含むことができる。取得されたトンネル電流Ｉ_Ｔ１６は、次に、チャンネル４を通過する分子８が既知の分子と同一であるかどうかを決定するため、従って既知の分子に関連付けられた所定の信号Ｓ_{ＫＮＯＷＮ}２６と比較されることができる特性信号すなわち、

を導出するために、復調器２２によって復調される。取得されたトンネル電流Ｉ_Ｔ１６が、オプションとして、復調前か又は復調後にそれぞれ、帯域通過フィルタ２８か又は低域通過フィルタ２８かのいずれかに通過させられることができる。線形及び／又は非線形の曲線のあてはめか、及び／又は、変動分析（例えばアラン偏差）などによる従来の技法を、導出された特性信号Ｓ_Ｃ２４と所定の信号Ｓ_{ＫＮＯＷＮ}２６との比較を成し遂げるために用いることができる。

図２を参照すると、ポリマー２は、当該技術分野において既知の任意のタイプのポリマーとすることができるが、好適には、核酸か又はタンパク質を含む。ＤＮＡは、デオキシリボースと、１つか又は複数のリン酸基と、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びシトシン（Ｃ）の誘導体とを含むデオキシリボヌクレオチドのポリマーである。ＤＮＡ鎖３内の４つの異なる塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＴ）をシーケンシングすることによって、ＤＮＡ鎖３の遺伝情報を決定することができる。ＲＮＡもまたシーケンシングされることができ、ＲＮＡ鎖が４つの塩基の中のチミンの代わりにウラシル（Ｕ）分子を含むことが認識されている。ＤＮＡ鎖は、一本鎖か又は二本鎖である可能性があり、最初に二本鎖のサンプルであったものを一本鎖へと減らすために、及び／又は、２次ＤＮＡ構造を除去するために、既知の技法を適用することができる。便宜のため、任意の従来の方法が、対にされた塩基の間の水素結合を、熱によってか或いはイオン化する酸又はアルカリによって分離させることなどにより、二本鎖ＤＮＡを一本鎖へと分離するために用いられることができる。

ポリマー２が分散させられる溶液は、シーケンシングのために、ナノ電極チャンネル４を横切って十分なポリマー移動を可能にする任意の液体とすることができる。このような溶液は、一般に電流を通す媒介としてのイオンを含み、該イオンは、例えば、バリウム、カルシウム、セシウム、塩化物、リン酸塩、カリウム、ナトリウム、又は硫酸塩が好適であるが、必ずしも生体の状態においてシミュレートするための水溶性ベースである必要は無い。ナノ電極６のそれぞれの側においてそれぞれ配置された一対の電極３２の手段によって、ナノ電極６に対して平行ではない電気泳動電界３０を確立し、調整する（零に調整する、及び／又は、その極性を反転する）ことによって、ポリマー２を、チャンネル４内へと強く促すか、又はチャンネル４を通過するよう強く促すことができる（非特許文献２を参照のこと。非特許文献２は参照によって本明細書内に組み込まれる。）。ナノ電極６の片側だけに溶液に対して力学的な圧力をかけることか、又は光学ピンセット（図３に要素７として示される）を使用することによるような、チャンネル４を通過するようにポリマーを強く促すための他の手段を用いることができる。ポリマー２はまた、ポリマー鎖の端に触媒を物理的に連結させて、その触媒を変位させることによってポリマーを引き出すことにより、チャンネルを通過するために誘導されることが可能である。

ナノ電極６は、電流損失を防止するために絶縁されるべきである。ナノ電極６は既存のナノスケールの製造技術を使用して、導電性はあるが溶液に対しては不活性な材料（例えば金）の様々なサイズと形状とに構成されることができる（非特許文献１を参照のこと）。原子の単分子層とサブ単分子層とが、厳密なスペック（仕様）に合わせて正確に蒸着させられるか又は欠乏させられることができる。更には、金属内のナノ孔か又はナノチャンネルを開いて制御するために、且つ、ナノ電極の先端間のチャンネルのサイズを制御するために、電解金属溶解反応を使用することができる。既知のナノリソグラフィ方法は、化学蒸着、電気化学蒸着、化学的析出、電気メッキ、熱拡散及び蒸発、物理気相成長法（ＰＶＤ法）、ゾル−ゲル蒸着、集束電子ビーム、集束イオンビーム、分子線エピタキシ、ディップペン・ナノリソグラフィ、反応性イオンビームエッチング、化学的にアシストされたイオンビームエッチング、マイクロ波によってアシストされたプラズマエッチング、電解酸化、走査プローブ法、化学エッチング、ナノ印刷、及びレーザアブレーションを含むが、これらに限定されるものではない。

チャンネル４を通過する分子８の特性は、ナノ電極６の間のトンネルコンダクタンスの変化の振幅か又は持続時間によって識別されることができる。各タイプの分子は、分子の識別を可能にする固有の特徴を示す。各モノマーにおける容量（ボリューム）、形、又は電荷は、特徴的なやり方でコンダクタンスに影響を与える。更には、コンダクタンスの変化の持続時間を観察することによって、ポリマー２の全体のサイズを決定することができる。バイアス電圧Ｖ_Ｂ１２を変調し、次いで、ナノ電極６から得られるトンネル電流Ｉ_Ｔ１６を復調することによって、トンネルコンダクタンスの変化は、効果的に決定される。ナノ電極のうち１つはアノード電極として、他方はカソード電極として機能する。ナノ電極６間のチャンネル４の幅は、ナノメートルのオーダであり、長さ５は、鎖３における塩基分子間の間隔とほぼ同じ長さか又はこれよりも短い。チャンネル長と厚さとが比較的短い（小さい）場合には、ナノ電極の精密な形状は重要ではない。ナノ電極間のチャンネル４の幅を完全に一様にすることができないことが予想される。しかしながら、測定可能なトンネル電流は幅に対してほぼ指数関数的に上昇するので、分子を横切るトンネル電流に起因すると考えられる信号が、該分子が最も狭い幅の地点を通過する時に、測定を支配する。このことは実際には、対象とする特定の分子と共にチャンネル内に存在する可能性がある追加の望んでいない分子のトンネル電流の効果を制限する有益な効果がある（何故ならば、例えば、ナノ電極間のチャンネルの長さが、望ましくないことに、ナノ電極間に複数の分子が存在することができるからである）。

チャンネル４の寸法は、分子塩基当たり一分子に、ナノ電極間の通過を分子が制限されるように、分子を制約する機能を果たすことができる。しかしながら、代替として、分子の順序を変えるか又は配向を変えるために、固体状態のナノチャンネルか又はナノ孔、或いは（α−溶血素のような）自然のナノ孔３４を介して、まずポリマー２を「ファネリング」をすることが望ましい。ナノ孔は、例えば、同様に溶液に対して不活性な窒化珪素のような非導電材料で形成されるべきであり、上述の技法のうち１つを使用して作られることができる。

図１を再び参照すると、信号発生器１０は、ナノ電極６に供給されるバイアス電圧Ｖ_Ｂ１２と変調波形Ｗ_ＭＯＤ１４とを提供する。センサ１８は、時間依存性のトンネル電流Ｉ_Ｔ１６の変動を測定するため、ナノ電極を調べるために使用される。取得されたトンネル電流Ｉ_Ｔ１６の信号は、後の分析のために、オプションのデータ記憶装置２５に記憶されることができるか、又は高スループットでリアルタイムな方法を用いて直ちに処理されることができる。いずれかのアプローチにおいて、取得されたトンネル電流Ｉ_Ｔ１６の信号は、復調器２２に通過させられ、そこで、復調波形Ｗ_{ＤＥＭＯＤ}２７が印加される。結果として得られる固有の「特徴」か又は信号Ｓ_Ｃ２４は、次いで、対象とする分子８と既知の分子との間の関係（例えば同一性）を決定するために、既知の分子の固有のか、又は既知の分子に関連付けられた、所定の信号（複数可）Ｓ_{ＫＮＯＷＮ}２６と比較されることができる。

量子力学によれば、トンネル電流Ｉ_Ｔ１６は、バイアス電圧Ｖ_Ｂ１２の線形関数であるので、ｄＩ_Ｔ／ｄＶ_Ｂとして定義されるトンネルコンダクタンスは、ナノ電極６に関連する分子８の所与の配向についての定数である。この近似は、低バイアス電圧についてのみ正確である。何故ならばそれは、分子８の内部状態に起因すると考えられる影響を含まないためである。分子の内部状態を考慮すると、トンネル電子のエネルギーが、Δε_ｉｊ≡ε_ｉ−ε_ｊ付近にある時には、トンネルコンダクタンスが変更される。ここで、ε_ｉとε_ｊとはそれぞれ、分子の状態ｉと状態ｊのエネルギーである。対応する「共振電圧」は、トンネルコンダクタンスの変化から決定されることができ、調査中の分子８を識別するために使用されることができる。これらの「共振電圧」の値は、（例えばＤＮＡ塩基の）分子の方向に対してより敏感でないことが予想される。何故なら、それらはその分子８の内部状態によって決定されるためである。異なる量子状態がトンネルコンダクタンスに与える影響の詳細は、関与した物理プロセスに依存する。例えば、いくつかの分子において、非弾性電子トンネル効果は、少なくともトンネル電子エネルギーの小さな範囲内でトンネルコンダクタンスを変更する主要なプロセスである。

分子状態のエネルギーは、その価電子数（又は電子数）、振動量子数（又は振動数）、及び回転量子数によって決定される。分子内における電子の状態、振動の状態、及び回転の状態に関連付けられるエネルギーは、それぞれ、ｅＶ、１００ｍｅＶ、及び１００μｅＶのオーダである。従って、基底電子状態における振動状態が、説明された方法を使用して対象とする分子を識別する目的のために、最も適した状態であろう。

特定の分子に関連付けられた特性信号（複数可）を最初に識別するためには、単一の既知の分子がナノ電極間のチャンネル４内に（例えば光学ピンセットによって）配置されることを必要とするか、又は繰り返し分子を含むポリマー鎖が生成されてチャンネルを通過させられることを必要とするかのいずれかである。２次構造が低減されたか又は除去された状態の繰り返しシーケンス（配列）を有する（好適には一本鎖の）核酸を酵素によって生成するための、当該技術分野で既知の任意の技法を用いることができる。対象とする分子８がナノ電極６間のチャンネル４に入ると、バイアス電圧Ｖ_Ｂ１２を、対象とする範囲、すなわち、分子８の予想される共振電圧（複数可）を包含する電圧範囲全体にわたって（線形的に又は非線形的に）掃引することができる。トンネルバイアス電圧Ｖ_Ｂ１２と、その対応する、センサ１８によって取得されたトンネル電流Ｉ_Ｔ１６とを、これらの「共振電圧」を明らかにするための後の処理のために、データ記憶装置２５内にオプションとして記憶することができる。

非弾性電子トンネル効果に起因すると考えられる特性は、観測することができ、識別情報を導出するのに役立つ。このプロセスにおいて、バイアス電圧に関連するトンネル電流Ｉ_Ｔ１６の２次導関数ｄ^２Ｉ_Ｔ／ｄＶ_Ｂ ^２は、「共振電圧」における検出可能なピークを示す（非特許文献３を参照のこと。非特許文献３は参照によって本明細書内に組み込まれる）。異なる物理プロセスが生じている場合には、「共振電圧」におけるトンネル電流の特性が異なる可能性がある。従って、ｄ^ｎＩ_Ｔ／ｄＶ_Ｂ ^ｎ（ここでｎは異なる値である）は、例えば「共振電圧」におけるピークの、いくつかの固有の特徴を示す。ナノ電極６の間のチャンネル４内の単一分子８の滞在時間中、バイアス電圧Ｖ_Ｂ１２が、対象とする範囲全体にわたって掃引されることになるので、この方法の帯域幅は比較的広い。

代替として、バイアス電圧Ｖ_Ｂ１２を、変調周波数ｆ_ｍにおける変調波形Ｗ_ＭＯＤ１４によって、変調する（ディザリングする）ことができる。信号ｄ^ｎＩ_Ｔ／ｄＶ_Ｂ ^ｎを、変調周波数のｎ次高調波によってトンネル電流Ｉ_Ｔ１６を復調することにより、得ることができる。バイアス電圧Ｖ_Ｂ１２が「共振電圧」にわたって走査すると、得ようとしている固有の特徴が現われるであろう。好適には、特性信号に見出されることが予測される高調波を欠くように変調波形Ｗ_ＭＯＤ１４が生成される。適切な波形は、例えば、正弦波の全ての高調波が抑制されている矩形波又は正弦波を含むことができる。変調波形はまた、合成して生成されることもできる。これにより、その波形は何らかの手法で特性信号内の高調波を強調することができる。取得されるトンネル電流信号は、復調波形Ｗ_{ＤＥＭＯＤ}２７によってコヒーレントに復調され、特性信号（複数可）を導出する。その復調波形は、変調波形Ｗ_ＭＯＤ１４と同じ周波数ｆ_ｍを有することができるか、或いはその高調波又はサブ高調波を有することができる。代替として、復調波形は、以下の周波数成分のうちの少なくとも１つの周波数成分を含むことができる。すなわち、変調波形の基本周波数、変調波形の全てのサブ高調波、及び変調波形の全ての高調波である。ある分子について、非弾性電子トンネル効果は、変調波形の２次高調波を使用することにより復調されたトンネル電流におけるピークを示す。従って、それは、変調波形の３次高調波を使用することによって復調されたトンネル電流において分散のようなカーブを示す。

トンネルコンダクタンスの特性信号Ｓ_{ＫＮＯＷＮ}が特定の分子についてまず最初に決定された後、上述の方法か、又は振動分光法のいずれかによって、それらの特性信号が既知の特性信号（複数可）を示すかどうかを判別するために、対象とする未知の分子を調べることができ、それらによって対象とする分子を識別する。このことは１つの方法において、既知の分子についての固有の「共振電圧」において、（変調を伴った）バイアス電圧をセンタリングすること（中央に位置合わせすること）によって成し遂げられる。既知のタイプの対象とする分子がナノ電極６の間のチャンネル４を通過する時には、復調されたトンネル電流から導出される信号は、時間領域内における固有の特徴を示すであろう。（固定されたバイアス電圧で）時間に対してプロットされた固有の特徴は、走査バイアス電圧に対してプロットされた同じ分子の固有の特徴と比較すると、異なって見える可能性がある。この検出モードにおいて、検出帯域幅は、信号対ノイズ比が大幅に改善されるように、チャンネル内の分子の滞在時間によって決定される。

一実施形態において、既知の特性信号と未知の特性信号との比較機能は、ディスクリートなハードウェア構成要素か又は統合された（又は集積された）ハードウェア構成要素内に直接的に実装される。別の実施形態において、検出されたトンネル電流Ｉ_Ｔは、ポリマーについての構造情報を決定するため、いつでも所望の時に分析するために、データ記憶装置２５内にオプションとして記憶される。本発明において使用するために適したコンピュータ２９は、ユーザとデータ記憶装置とをインタフェースするための出力装置及び入力装置と、データ記憶装置に接続された、分析を行うための実行可能なメモリ空間を有する処理装置とを含む。入力装置と出力装置とはまた、処理装置と記憶システムとに接続される。上述の検出された信号のデータ分析を実行するためのコンピュータプログラムは、容易に利用可能である。

図３を参照すると、本発明の別の実施形態において、複数のナノ電極対６ａ〜６ｄが、それらのそれぞれのチャンネルを通過する分子を、独立して識別する。それらの電極対は、信号処理装置２０を共有することができる。各ナノ電極対６ａ〜６ｄに印加される各バイアス電圧は、特定の既知の分子に関連付けられた共振電圧付近にセンタリングされて、特定の変調周波数で変調させられる。絶縁体か又はシールドを介するようにして、連続するナノ電極対の間のバイアス電圧が、互いに干渉しないことを保証するために注意がなされるべきである。各々の対応するナノ電極対６ａ〜６ｄから収集されるＩ_ＴＡからＩ_ＴＤまでのトンネル電流は、上述のように、特定の変調周波数の各所望の高調波における復調器によって同時に復調される。更に上述のように、信号対ノイズ比を改善するために、復調前及び／又は復調後に、オプションのフィルタリングを使用することができる。所与の分子について、対応する復調された信号は、その分子に合わせて調整された適切な検出器を通過する時に、要求される固有の特徴を示す。この装置と方法とによって、いくつかの異なる分子を識別することができ、非常に迅速な方法でポリマーをシーケンシングすることができる。

連続的なナノ電極対は、図３に描かれているように直線状に並べられる必要はなく、ある角度をなすか又はオフセットされることが許容可能である。更に、各ナノ電極対が、対象とする異なる分子を識別することを必ずしも必要とするわけではない。例えば、各対が、同じ未知の分子の異なる特性信号を調べるために、異なる共振電圧を用いることができる。これは、特定の分子を識別するためにナノ電極の異なる対に用いられる複数の共振電圧が、検出／識別の信頼性を高めるために必要か又は望ましい場合の可能性がある。導出される信号と、それぞれのチャンネルを介して分子が通過するタイミングとを、複数のナノ電極対が用いられる場合に、相互に関連付けることができる。

本発明を用いてシーケンシングされることができるポリマーの長さについて、発明人にとって既知の制限はない。しかしながら、ポリマーがあまりにも不規則な形状を有する場合には、ポリマーを真っ直ぐにする（すなわちファネリングする）オプションのステップにおいて、問題に遭遇する可能性があるため、シーケンシングされているポリマーが、線形なバックボーンか、曲線のバックボーンか、又は一直線のバックボーンを有する時には、本発明は最適な結果を提供する。最適なスループットに対する要求はまた、実際には、どれだけ低速でポリマーがシーケンシングされるかを制限する。より低い速度は、より良い信号対ノイズ比を生じる。しかしながら、最低速の限界においては、ブラウン運動は、曖昧さを生じる。従って、ブラウン運動の影響を排除して、スループットを向上させるために、分子を通過させるように促す方法が選択されるべきである。

本発明は、様々な実施形態に関して説明されてきたが、この発明はまた、本発明の思想の範囲内において、幅広く多様な更なる実施形態及び他の実施形態もまた可能であることが理解されるべきである。

本発明による、ポリマーをシーケンシングするための装置を備える、構成要素の概略図である。 本発明による、ファネリング手段と、電気泳動電界発生器とを有するナノ電極の概略図である。 本発明による、ポリマー内の複数の分子を同時に識別するための装置の一部の概略図である。

符号の説明

２ ポリマー
４ チャンネル
６ ナノ電極対
８ 分子
１０ 信号発生器
１２ バイアス電圧
１４ 変調波形
１６ トンネル電流
２０ 信号処理装置

Claims (10)

1. ポリマーの分子を識別するプロセスであって、
   ナノ電極対の間にあるチャンネルによって分離された該ナノ電極対の、間のバイアス電圧をセンタリングするステップであって、該バイアス電圧は、対象とする分子の任意の２つの内部エネルギーレベル間のエネルギー差に対応することからなる、ステップと、
   前記バイアス電圧を変調波形によって変調するステップと、
   前記対象とする分子のうちの少なくとも１つを含む連結された分子からなるポリマーの前記分子を、前記チャンネルを通過するよう連続的に強く促すステップと、
   例えば、トンネル電流から定まるトンネルコンダクタンスの変化から決定される共振電圧のように、前記ポリマーが前記チャンネルを通過する時に、前記対象とする分子が前記ナノ電極間にある間に測定された前記対象とする分子を通るトンネル電流から、前記対象とする分子を示す電気的な信号を導出するステップと、
   前記導出された電気的な信号を、前記対象とする分子に関する信号の既知の値と比較することによって、前記対象とする分子を識別するステップと、
   信号対ノイズ比を改善するために、好適には、前記トンネル電流をフィルタリングするステップ
   とによって特徴付けられる、プロセス。
2. 前記連続的に強く促すステップは、
   ナノ孔か又はナノチャンネルを介して前記ポリマーを例えば押し込むように通過させることによって、前記チャンネルを介する前記ポリマーの前記通過を一度に単一分子に制限するために、前記ポリマーを前記チャンネル内へとファネリングするステップと、
   電界によって前記ポリマーを駆動するステップと、
   前記ポリマーが懸濁させられている溶液に対して力学的な圧力をかけるステップと、
   １つか又は複数の光学ピンセット対によって、前記ポリマーを直接的に操作するステップ
   とによって更に特徴付けられることからなる、請求項１に記載のプロセス。
3. 前記変調波形は、
   正弦波と、
   正弦波の全ての高調波が抑制されている正弦波と、
   矩形波と、
   前記導出された電気的な信号内において検出される高調波が欠如している、合成して生成される波形と、
   前記対象とする分子に対応する前記導出された電気的な信号内に存在する所望の高調波のうちの少なくとも１つを強調する合成して生成される波形
   とからなるグループから選択される、請求項１に記載のプロセス。
4. 固有の電気的な信号を導出する前記ステップは、前記トンネル電流を復調波形によってコヒーレントに復調するステップによって更に特徴付けられ、
   前記復調波形は、前記変調波形と同じ周波数か、前記変調波形の全てのサブ高調波か、又は前記変調波形の全ての高調波を有する少なくとも１つの周波数成分を含み、
   好適には、前記分子内の非弾性電子トンネル効果は、前記変調波形の２次高調波によって復調される時にはピークを示すか、又は前記変調波形の３次高調波によって復調される時には分散のようなカーブを示すことからなる、請求項１に記載のプロセス。
5. 少なくとも１つの追加チャンネルを、少なくとも１つの追加のナノ電極対の間に形成するために、チャンネルによって分離された該少なくとも１つの追加のナノ電極対の間の少なくとも１つの追加のバイアス電圧を、センタリングするステップであって、該少なくとも１つの追加のバイアス電圧は、前記対象とする分子か又は少なくとも１つの追加した対象とする分子の任意の２つの内部エネルギーレベル間の前記エネルギー差に対応することからなる、ステップと、
   前記少なくとも１つの追加のバイアス電圧を、少なくとも１つの追加の変調波形によって変調するステップと、
   前記少なくとも１つの追加チャンネルを通過するよう前記ポリマーを強く促すステップと、
   前記対象とする分子か、又は前記少なくとも１つの追加した対象とする分子を示す少なくとも１つの追加の電気的な信号を、前記ポリマーの分子部分が各チャンネルを通過する間に測定される各電極対の間のトンネル電流から導出するステップと、
   前記少なくとも１つの追加チャンネルを介して前記ポリマーを１回通過させることにより、それぞれの導出された電気的な信号を、前記対象とする分子か又は前記少なくとも１つの追加した対象とする分子に関する信号の既知の値と比較することによって、前記対象とする分子を更に識別するか、又は前記少なくとも１つの追加した対象とする分子を識別するステップ
   とによって更に特徴付けられることからなる、請求項１に記載のプロセス。
6. 化学的に既知の分子の特徴的な電気信号を識別するプロセスであって、
   チャンネル内の１つか又は複数の既知の分子を、１つか又は複数の光学ピンセット対により保持することによってか、又は前記１つか又は複数の同一の分子からなるポリマーを、前記チャンネルを通過するよう強く促すことによってか、又は前記１つか又は複数の既知の分子が懸濁させられている溶液に対して電気泳動駆動電圧を印加し、及び調整することなどによって、前記チャンネルによって分離されたナノ電極対の間に前記１つか又は複数の化学的に既知の同一の分子を配置するステップと、
   前記分子の内部エネルギーレベルであると疑われるレベルを包含する電圧範囲にわたって前記ナノ電極間のバイアス電圧を変化させるステップと、
   前記バイアス電圧を変調波形によって変調するステップと、
   前記１つか又は複数の既知の同一の分子（複数可）が、前記ナノ電極間の前記チャンネル内に配置されている間に測定された前記１つか又は複数の分子を通るトンネル電流を分析することによって、及び／又は、復調することによって、前記１つか又は複数の既知の分子（複数可）を示す電気信号を導出するステップ
   とによって特徴付けられる、プロセス。
7. ポリマーの分子を識別するためのシステムであって、
   ナノ電極対間に形成されたチャンネル内において、溶液内におけるポリマーの連結された分子を連続的に受け取るように構成される該ナノ電極対と、
   対象とする分子の任意の２つの内部エネルギーレベルの間のエネルギー差に対応する前記ナノ電極間のバイアス電圧をセンタリングするために、且つ、前記バイアス電圧を変調波形によって変調するために、前記ナノ電極に電気的に接続された信号発生器と、
   前記溶液に印加される電界を確立する電極と、前記ナノ電極間の前記チャンネルにわたって圧力勾配を作り出す力学的な手段と、１つか又は複数の光学ピンセット対とからなるグループから選択される、前記チャンネルを通過するよう前記ポリマーを強く促すための手段と、
   前記ポリマーの分子部分が前記チャンネルを通過する間、前記ナノ電極間のトンネル電流を測定するための手段と、
   前記トンネル電流から前記対象とする分子を示す電気信号を導出し、且つ、例えば、前記トンネル電流から定まるトンネルコンダクタンスの変動から決定される共振電圧のように、前記導出された電気信号を化学的に既知の分子に関する電気信号の既知の値と比較することによって前記対象とする分子を識別するための、信号処理装置と、
   好適には、復調の前に信号対ノイズ比を改善するための１つか又は複数のトンネル電流フィルタ
   とによって特徴付けられる、システム。
8. 例えば、ナノ孔か又はナノチャンネルのような、前記チャンネルの間の前記ポリマーの通過を一度に単一分子に制限するための手段によって更に特徴付けられる、請求項７に記載のシステム。
9. 前記変調波形は、前記導出された電気信号内で検出される高調波周波数成分を欠いているか、又は前記対象とする分子に対応する電気信号内に存在する高調波周波数成分のうち少なくとも１つを強調する、請求項７に記載のシステム。
10. 前記信号処理装置は、以下の周波数成分すなわち、前記変調波形と同じ周波数、前記変調波形の全てのサブ高調波、及び前記変調波形の全ての高調波、のうちの少なくとも１つを含むようにして、復調波形によって前記トンネル電流をコヒーレントに復調する、請求項７に記載のシステム。

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