JP2004233356A - ナノポアを通って移動するバイオポリマーの識別装置及び方法 - Google Patents

Abstract

【課題】移動バイオポリマーを固体システム中で迅速かつ効率的に高度の再現性及び予測可能性でシーケンス解析する改善されたシステム及び方法を提供する。
【解決手段】ナノポア内のバイオポリマーを検知するための装置（１）は、第１の電極（７）と、第１の電極（７）に隣接する第２の電極（９）と、両者に隣接して内側にバイオポリマーが位置することができるよう設けられるナノポア（３）と、第１及び第２の電極（７、９）とを電気的に接続して、第１の電極からバイオポリマーの一部分を通って第２の電極にランプ電位を印加して、バイオポリマーの所定の部分を表す信号を生成するための電位手段（１１）とを備える。
【選択図】図１

Description

本発明は、一般にバイオポリマーの分野に関し、特に、ナノポア構造を用いたバイオポリマーのシーケンス解析及び識別するための装置及び方法に関する。

物質をナノメートルスケールで操作することは、多くの電子工学、化学及び生物学的進歩に重要である（非特許文献１参照）。ヒトゲノムプロジェクトに呼応して、マイクロメートル及びナノメートルスケールで多くの配列技術が提案されてきた。これらの技術は、主に、ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子の表現を特徴付けて理解するのを促進するために開発されてきた。一般的な技術は、ｃＤＮＡのマイクロアレイ及びハイブリダイゼーションを用いて、特定の標的遺伝子の有無を決定する。標的遺伝子及びプローブは、溶液中に暴露され、相対的なハイブリダイゼーション配列が一致すると結合する。ハイブリダイゼーションは、配列または標的遺伝子の存在の指標である。色素は、標的またはプローブと共に使用して、ハイブリダイゼーションの存在及び効率を決定することができる。この技術は、標的ｃＤＮＡにおける単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の存在を決定するように、使用が拡張されてきた。マイクロアレイは、特定の患者の様々な疾患を正確かつ同時に選別できる見込みを提供する。理論的には、患者は、入院して、採血、ＤＮＡの抽出及び遺伝子の配列を受けることができなければならない。この配列法は、個人の遺伝子の青写真を提供する。この方法は、罹病性または遺伝的異常の存在に関する患者に固有の情報を医師に提供する。マイクロアレイ技術のいくつかの主要な欠点は、製造が難しく、プローブと標的との効果的なハイブリダイゼーションに長時間（高度の特異性を維持するには、ほぼ一晩）要することである。さらに、患者の多量のゲノムＤＮＡは、極端な量の時間及び労働を要するだろう。したがって、現在、より迅速にバイオポリマーを配列するために、新しい技術が探求されている。ナノスケール台のシステムは、資源（有限の材料）に効果的であると共に、生体細胞中に既に存在する過程（つまり、転位過程）をより密接に模倣することができる。したがって、ナノポア技術は、分子生物学者及び生化学者にとって、重要な基本的領域になった。

電圧勾配は、単鎖バイオポリマーを膜貫通チャネルまたはナノポアを通過させることができることが分かった（非特許文献２参照）。転位（トランスロケート）過程、即ちポリマーの移動過程では、拡張したバイオポリマー分子が、さもなければ開放しているナノポアチャネルの大部分を閉鎖する。この閉鎖により、バイオポリマーの転位時にナノポアを貫通する緩衝溶液のイオン電流が減少する。単一のバイオポリマーの通過は、転位継続時間及び遮断電流の降伏プロットを予測可能な確率論的な感知パターンで記録することにより監視することができる。均一に制御された移動条件から、個々のバイオポリマーの長さは、移動時間から決定することができる。さらに、バイオポリマー鎖の個々のモノマーの異なる物理的及び化学的特性は、遮断電流の測定可能かつ再現可能な変調を生じ、こうした変調は、移動しているバイオポリマーの特定のモノマー配列を識別することを可能にする。当初提案されたこうしたシステムには、多くの問題がある。たとえば、提案されたシステムによっては、ポアを形成するタンパク質（つまり、α−溶血素）が膜上で自己集合する必要があった。膜及びシステムの再現性は、非常に問題があった。第２に、市販の製品は、測定用イオン電流の変動を要する感知システムにはない堅牢性を必要とする。このため、最近の研究は、より高度の再現能力及び製造の容易さを有する固体ポア技術にさらに集中するようになった。「イオンビーム彫刻」などの技術は、分子スケールの孔及びナノポアを薄い絶縁固体膜内に製造する見込みを示した。また、こうしたポアは、分子スケールの電気接合部及びスイッチを局在化させる上で効果的だった（非特許文献１参照）。

こうした技術は、類似する一貫した結果及び電流遮断を示し、二重鎖ＤＮＡは、単鎖ＤＮＡが、α−溶血素によって脂質二重層中に形成されるチャネルを通って移動する時に観察されるイオン電流遮断を連想させる。こうした遮断の継続時間は、ミリ秒台であり、電流低下は、オープンポア値の８８％だった。これは、断面積が３〜４ｎｍ^２である棒状分子の転位に対応する（非特許文献１参照）。しかし、この方法には、移動しているポリマーの有無に関する生の測定値しか得られないという制約がある。さらに、こうしたシステムは、移動するバイオポリマーの一次配列（モノマーユニットの配列）を実際に決定することはできない。

第２の方法は、Ｓｉ_３Ｎ_４などの固体材料中のナノポアを通って移動するバイオポリマーを検出するために提案された。しかし、トンネル電流は、トンネル過程に対する量子力学的に可能な障壁の高さ及び幅に指数関数的に依存することが十分に周知されている。こうした依存は、ポア中における転位分子の正確な場所に対する極端な感受性を暗示する。立体属性、及びトンネル電極に対する物理的近接性の両方によって、トンネル電流の大きさの変化を生じ、こうした変化は、理想的な条件下において異なる塩基型間に予想される本質的な相違をはるかに超えると思われる。したがって、配列を行うために必要な特異性を有する最も単純なトンネル構成を予想することは難しい。
リー（Ｌｉ）等著、「ナノメートル長のスケールにおけるイオンビーム彫刻」（Ｉｏｎ ｂｅａｍ ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ ａｔ ｎａｎｏｍｅｔｅｒ ｌｅｎｇｔｈ ｓｃａｌｅｓ）、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４１２号、ｐ．１６６〜１６９、２００１年。 カシアノヴィッチ（Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ）等著、「膜チャネルを使用する個々のポリヌクレオチド分子の特徴付け」（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈａｎｎｅｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、１３７７０〜１３７７３ページ、１９９６年。

したがって、転位又は移動バイオポリマーを固体システム中で迅速かつ効率的に、高度の再現性及び予測可能性でシーケンス解析する改善されたシステム及び方法に対する必要性が存在する。先行技術の過程及び構造による上記及びその他の問題は、本発明により未然に防止される。上記及び下記で本願において引用する参考文献は、本明細書に引用することにより本願に援用する。しかし、引用された参考文献または技術は、本願の先行技術であると認めるものではない。

本発明は、バイオポリマーの識別及びシーケンス解析を改善するための方法及び装置を提供する。この装置及び方法は、ナノポアを通って移動するバイオポリマーまたはバイオポリマーの一部を検出するために使用される。この装置は、第１電極と、第２電極と、第１電極及び第２電極を横断してランプバイアス電位を印加するための電位手段とを備える。第２電極は、第１電極から離間配置されて、第１電極と第２電極との間にナノポアを画定する。ランプバイアス電位を印加するための電位手段は、ナノポアを通って移動するバイオポリマーの一部を表す信号を生成する。本発明は、電極の電圧走査時に共鳴トンネル過程を利用し、この過程は、二重障壁トンネル電位を動的に対称化することを可能にする。

本発明は、第１電極と第２電極との間に画定されたナノポア内のバイオポリマーを識別するための方法も提供する。この方法は、第１電極からバイオポリマーの一部分を通って第２電極に電流を印加して、ナノポア内に位置するバイオポリマーの一部分を表す信号を生成することを含む。

以下に、添付図面を参照して、本発明の好適実施形態について詳細に説明する。

本発明を詳細に説明する前に、本発明は、特定の構成、方法のステップ、または機器に限定されないと考えるべきであり、これらは変更することができる。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施態様のみを説明することを目的としており、制限する意図はないと考えるべきである。本明細書に引用する方法は、引用された事象を理論的に可能な何らかの順序、及び事象の引用された順序で行うことができる。さらに、ある範囲の数値が記載されているが、当該範囲の上限と下限との間にある何らかの数値、記載されたその他の何らかの数値、または記載された範囲内にある数値は、何れも本発明の範囲に含まれる。また、説明されている創意に富む変形の任意の特徴は、個々に、または本明細書に記載されている１つ以上の何らかの特徴に関連して記載し、請求する。

以下で特に定義しない限り、本明細書で使用するすべての技術的及び科学的用語は、本発明に関連する当業者が一般に理解している意味と同じ意味を有する。なお、本明細書では、分かりやすくするために特定の要素について定義する。

本明細書及び添付の請求の範囲で使用する場合、不定冠詞及び定冠詞は複数の指示対象を含むが、文脈上、明らかに異なる場合はこの限りではない。したがって、たとえば、「１つのバイオポリマー」と記載した場合、１つ以上のバイオポリマーを含み、「１個の電位手段」は複数の電位手段を含み、他の場合も同様である。本発明について説明して請求するに当たり、以下の用語は、それに合わせて記載する定義に従って使用する。

「バイオポリマー」は、１種類以上の反復単位のポリマーである。バイオポリマーは、一般に生物学的システムに見られ、特に、多糖類（炭水化物など）、ペプチド（この用語は、ポリペプチド及びタンパク質を含むために使用する）、グリカン、プロテオグリカン、脂質、スフィンゴリピド、抗体などの公知の生体物質、及びポリヌクレオチド、並びにポリヌクレオチドアナログ、たとえばアミノ酸アナログもしくは非アミノ酸基、またはヌクレオチドアナログもしくは非ヌクレオチド基からなるか、もしくはこれらを含む化合物などのアナログを含む。これは、従来の主鎖が、非自然的に発生するかまたは合成主鎖に置き換えられたポリヌクレオチド、または１種類以上の従来の塩基が、ワトソン−クリック型、ウォブル型などの水素結合相互作用に関与することができる基（天然もしくは合成）に置き換えられた核酸（または合成もしくは自然発生アナログ）を含む。ポリヌクレオチドは、１種類以上の鎖が、他の鎖と完全に整列しているか、または整列していない単鎖または複鎖構成を含む。「ヌクレオチド」は、核酸のサブユニットのことであり、燐酸基と、５炭素糖及び窒素含有基と、こうしたサブユニットの機能アナログであって（合成か、自然発生かに関わらず）、２種類の自然発生ポリヌクレオチドの場合に類似する配列固有の方法で、自然発生ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能な機能アナログとを有する。バイオポリマーは、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及びＰＮＡ（ペプチド核酸）、並びに米国特許第５，９４８，９０２号及び該特許に引用されている参考文献（引用することにより、その全体を本明細書に援用する）に記載されているその他のポリヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、長さが約１０〜１００個分のヌクレオチドのヌクレオチドマルチマーを指し、「ポリヌクレオチド」は、任意の数のヌクレオチドを有する１個のヌクレオチドマルチマーを含む。「バイオモノマー」は、同じかまたは他のバイオモノマーと結合して、バイオポリマーを形成することが可能な単一ユニットを指す（たとえば、一方または両方が、除去可能な保護基を有する２つの結合基を含む単一アミノ酸またはヌクレオチド）。

「基質」は、固体または固体ではない表面であって、保持、埋め込み、付着が可能であり、電極の全体または一部を構成する表面を意味する。

「ハイブリダイズ」、「アニーリング」及び「結合」は、ポリヌクレオチドに関する場合、相互に置き換え可能に使用される。「結合効率」は、結合反応の生産性であって、ある条件の集合下で、ある時間量において形成される結合性生物の絶対的または相対的歩留まりとして測定される生産性を意味する。「ハイブリダイゼーション効率」は、結合効率の特定のサブクラスであり、結合成分がポリヌクレオチドである場合、結合効率を意味する。また、本明細書の全体で、「上」、「下」などの語句は、相対的な意味でのみ使用されていると考える。「集合」は、ある種の構成要素、または複数の異なる種類を有する。「流体」は、本明細書では、液体を意味するために使用する。

「共鳴」または「共鳴トンネル現象」は、電極内の電流基質間の相対的エネルギーレベルが、近接するバイオポリマーセグメントのエネルギーレベルに相対的に類似する作用を意味する。これによって伝導性が増す。

「トンネル現象」という用語は、電子が、量子力学的トンネル現象によらずにエネルギー的に排除される領域を通って、空間内の第１の位置から空間内の第２の位置に移動する能力を意味する。

「内」という語は、「範囲内」及び／または外側でもある一部分を意味する。たとえば、ナノポア「内」のバイオポリマーは、全体のバイオポリマーが、ナノポア開口部の範囲内にあるか、またはバイオポリマーの小部分のみがナノポア付近に位置し、大部分がナノポアの外側に突出していることを意味する。

「対称」または「対称化」という用語は、両方の電極に隣接する類似するトンネル障壁を意味する。

「ナノポア」という用語は、少なくとも一対の電極間にある何らかのポアもしくは孔、または固体基質内の孔を意味する。ナノポアのサイズは様々であり、１ｎｍ〜約３００ｎｍの範囲である。最も効果的なナノポアは約２ｎｍだった。

「転位」または「移動する」という用語は、ある側面から別の側面に、画定された方向に移動することを意味する。速度及び／または方向を有するベクトルに沿ってたどるバイオポリマーの動作である。

「部分」または「バイオポリマーの部分」という用語は、一部、サブユニット、モノマーユニット、モノマーユニットの部分、原子、原子の部分、原子のクラスタ、電荷または帯電ユニットを意味する。

「ランプ電位」または「バイアス電位」は、時間の経過につれて様々な異なる電圧を確立する能力を有することを意味する。場合によっては、これは、「電圧勾配の走査」または時間単位あたりの電圧勾配の変化を意味することがある。ランプ電位は、「電位手段」によって生成される。

「電圧勾配」という用語は、任意の２個の電極間に電位を確立する能力を有することを意味する。

「隣接する」という用語は、何かが付近にあるか、隣にあるか、または近接していることを意味する。たとえば、ナノポアは電極の付近にある場合、電極の隣にある場合、電極を通過する場合、または電極に近接する場合がある。これは、直線的、２次元及び３次元の空間に離間配置されている状態を含む。

図１乃至図３を参照すると、本発明は、バイオポリマー５のシーケンス解析或いは識別することが可能なバイオポリマー識別装置１を提供する。バイオポリマー識別装置１は、第１電極７と、第２電極９と、電位手段１１とを備える。一方または両方の電極は、リング状で良い。第１電極７及び第２電極９は、電位手段１１に電気的に接続される。第２電極９は第１電極７に隣接し、第１電極７から離間配置されている。ナノポア３は、第１電極７及び第２電極９を貫通する。しかし、これは、本発明の要件ではない。任意の基質８を使用する場合、ナノポア３は、基質８も貫通する。ナノポア３は、バイオポリマー５を受容するように設計される。バイオポリマー５は、ナノポア３を通って転位しても、転位しなくても良い。任意の基質８を使用する場合、第１電極７及び第２電極９は基質上に配置されるか、または基質８の一部分を含む。本発明のこの実施態様では、ナノポア３は任意の基質８も貫通する。本発明のその他の実施態様も可能であり、第１電極７と第２電極９とは同一平面に配置され（一方の電極が、他方の電極の上または下に配置される場合と対照的に）、任意の基質８はあってもなくても良い。複数の電極及び／または基質を使用することも、本発明の範囲内である。

バイオポリマー５は、様々な形状、サイズ及び材料から構成される。分子の形状またはサイズは重要ではないが、ナノポア３を貫通して移動することができなければならない。たとえば、単鎖及び二重鎖ＲＮＡ及びＤＮＡをバイオポリマー５として使用することができる。さらに、バイオポリマー５は、帯電している基または官能基を含む場合がある。さらに、金属または材料は、正味の双極子、電荷を提供するためにバイオポリマー５内に添加、ドープもしくはインターカレートするか、または生体分子を通る伝導性を可能にする。バイオポリマーの材料は、電極間の電子トンネルを可能にしなければならない。

第１電極７は、様々な導電性材料を含むことができる。こうした材料としては、導電性の金属、スズ、銅、亜鉛、鉄、マグネシウム、コバルト、ニッケル及びバナジウムの合金が挙げられる。導電性を与える先行技術で公知のその他の材料を使用しても良い。第１電極７は、固体基質８上に配置されるか、または固体基質８の一部を構成する場合、第２電極９に対してどの位置に配置しても良い。第１電極７は、第１電極７と第２電極９との間に電位を確立することができるように配置しなければならない。さらに、バイオポリマー５は、バイオポリマー５の一部を識別または配列できるように、十分に近くに配置しなければならない。つまり、第１電極７、第２電極９、及びナノポア３は、バイオポリマー５を識別または配列できるように、間隔を置いて配置しなければならない。これは、図１に示す実施態様が、いかなる点でも、空間的な向き、本発明の各構成要素の位置を制限しないことを意味すると考えるべきではない。第１電極７は、様々な形状及びサイズで設計することができる。先行技術で十分に公知のその他の電極の形状を使用して良い。さらに、リングまたはその他の形状の部分または曲線部分は、本発明に使用することができる。電極は、変則的な形式で設計するか、または互いに離間配置しても良い。しかし、構造は、第１電極７及びナノポア３を横断して第２電極９に電位を確立することができなければならない。

第２電極９は、第１電極７に関して上記で説明した材料と同じか、または類似する材料から構成することができる。上記のとおり、電極の形状、サイズ及び位置は、第１電極７及びナノポア３と相対的に変更して良い。

任意の基質８は、基質及びナノポアを設計するために先行技術で公知の様々な材料を含むことができる。基質８は、固体材料を含んでも、含まなくても良い。たとえば、基質８は、メッシュ、ワイヤ、またはナノポアを構成できるその他の材料を含むことができる。こうした材料としては、シリコン、シリカ、Ｓｉ_３Ｎ_４などの固体材料、カーボンベースの材料、プラスチック、金属、または半導体もしくは導電性材料をエッチングもしくは製造するために先行技術で公知のその他の材料が挙げられる。固体基質８は、多様な形状及びサイズから構成することができる。しかし、基質８を貫通するナノポア３を形成できるように十分に大きく、十分な幅がなければならない。

ナノポア３は、任意の基質８上または基質８を通るどの場所に配置しても良い。上記のとおり、ナノポア３は、第１電極７と第２電極９との間の間隔（平面または非平面構成の場合）により確立しても良い。基質８を使用する場合、基質８は、第１電極７及び第２電極９に隣接して配置するべきである。ナノポアのサイズは、１ｎｍ〜３００ｎｍの範囲である。殆どの場合、バイオポリマーを識別及び配列するのに効果的なナノポアは、約２〜２０ｎｍの範囲であろう。これらのサイズのナノポアは、バイオポリマーの転位を可能にするのに十分な大きさである。ナノポア３は、先行技術で公知のどの方法を用いて確立しても良い。たとえば、ナノポア３は、アルゴンイオンビームスパッタリング、エッチング、光リソグラフィ、または先行技術で十分に公知のその他の方法及び技法を用いて彫刻することができる。

電位手段１１は、基質８、ナノポア３、第１電極７及び第２電極９に対してどの場所に配置しても良い。電位手段１１は、第１電極７と第２電極９との間に電圧勾配を確立できるようにランプしなければならない。本発明には、様々な電位手段１１を使用することができる。こうした多くの電位手段は、先行技術で公知である。電位手段１１は、第１電極７と第２電極９との間に電圧勾配を確立するようにランプする能力を有する。これは、本発明の重要な態様であり、したがって、以下でさらに詳細に説明する。

信号検知のための任意の手段を使用して、バイオポリマー及び電位手段１１から生成された信号を検知することができる。この信号検知手段は、先行技術で十分に公知で、本発明の１つ以上の構成要素に電気的に接続できるどの構造、構成要素または装置でも良い。

次に、本発明の第２実施態様である図２（ａ）、（ｂ）を参照すると、一連の個々の基質が使用されている。たとえば、第１基質１６及び第２基質１８は、単一基質８の所定の場所に使用される。本発明のこの実施態様では、第１電極７は、第１基質１６またはこの基質の一部分を含む。この電極は、基質上に埋め込まれるか、付着、積層、蒸着、エッチングされるか、または第１基質１６の全部または一部を含む。第２電極９は、第２基質１８またはこの基質の一部分を含む。この電極は、基質上に埋め込まれるか、付着、積層、蒸着、エッチングされ、または第２基質１８の全部または一部を含む。第１基質１６は、第２基質１８に隣接して配置される。この図は、空間的に第２基質１８の上に配置された第１基質１６を示す。第１電極７は第１ナノポア３を含み、第２電極９は第２ナノポア３’を含む。第１電極７の第１ナノポア３及び第２電極９の第２ナノポア３’は、同軸状に整列して、バイオポリマー５が貫通して移動する１個の連続ポアを形成する中心線を有する。ナノポア３及びナノポア３’の中心点が、互いに対して相対的な角度及び距離だけ偏位するか、または離間配置されることは、本発明の範囲内である。

次に、図３（ａ）、（ｂ）を参照すると、本発明の第３実施態様が示されている。この実施態様では、第１電極７及び第２電極９は、同一平面内で離間配置されている。１個以上の任意の基質または電極を使用することができる。任意の基質８を使用しない場合、第１電極７及び第２電極９は、ナノポア３を画定するように隣接して配置する。これらの図は、一対の電極を示すが、本発明は、この構成にのみ限定されると解釈するべきではない。形状またはサイズが異なる様々な電極を使用することができる。さらに、本発明は、様々な方向及び空間（つまり一次元、二次元、三次元空間）内でトンネルすることが可能な類似するかまたは異なる多数の電極を含む。

本発明の重要な構成要素について説明したので、電圧勾配及び電子エネルギーレベルの走査について順に簡単に説明する。本発明の重要な構成要素は、電位手段１１である。上記のとおり、電位手段１１はランプさせる（即ち、傾斜して作用させる）ことができる。ランプの目的及びどのようにランプするかを次に説明する。

図１乃至図３に示す２個の導電電極間の領域を移動するモノマーのサイズ及び一般的な特性により、トンネル電流のいくつかの相違を想像することは可能だが、各モノマーのトンネル電流は定性的に類似の大きさを有すると単純に予想され、様々なモノマーを識別することは問題になるだろう。これは、特に、バイオポリマーが、ポアを通過する時に、ほぼ側方に移動し、トンネル電流の大きさを著しく変化させると考えられる場合に、特に当てはまることである。その代わりに、モノマーを適切に識別するために、各々のモノマー個々の内部構造を特定する必要があると提案する。これは、各々のモノマーがポアを通って移動する時に、各モノマーの電子エネルギーレベルの構造を「走査」することにより最も容易に行われるだろう。先ず、こうした走査を行うことを可能にする物理的機構について説明し、動的要件を明確にする。次に、こうした要件を満たす構造を実際に実現することを説明する。

実際のシステムの関連する特性を示し、しかも細工しやすい単純なモデルの実際的なシステムを得ることは重要である。図４は、トンネル構成のモデルを示す。これは、実際的なシステムの一次元量子力学的表現であり、電位エネルギーレベルは、図示のとおり、識別された実際の領域を表現するように選択されている。モノマーに対応する障壁及び量子井戸の詳細な形状は重要ではないが、エネルギー障壁により導電電極から分離される明確なエネルギーレベルのスペクトルを有する量子井戸の一般的な特性は重要である。

量子力学的計算から、図４に示す二重障壁電位では、入射エネルギーが、中心量子井戸の結合状態エネルギーのどれかに一致する場合、この構造に入射する粒子が移動する確率は１００％であることは十分に公知である（障壁に関する重要な付加的なある要因も充足されなければならない。この点について、後に詳細に説明する）。この現象は、共鳴トンネル現象と呼ばれ、本発明の主要な特徴である。本発明に用いる一般的な概念は、移動するバイオポリマー５のエネルギースペクトル上で、電極を横断するトンネル電圧をランプさせる（即ち、印加電圧を変化させて走査する）ことである。図５に示すように、特定の電圧では、入射エネルギーは、内部のヌクレオチドエネルギーレベルに順次一致し、トンネル電流の著しい増加を生じる。当然、印加電圧のランプ時間は、ナノポアを通るヌクレオチドの転位に比べて短いことが必要である。現在の実験条件では、モノマーは、約１μ秒でナノポアを通って移動する（非特許文献２；「ホモポリマー、または単一ＲＮＡ分子内のセグメントとしてのポリシチジル酸、ポリアデニル酸及びポリウリジル酸のμ秒スケールの識別」（Ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ ｔｉｍｅ−ｓｃａｌｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌｉｃ ａｃｉｄ，ａｎｄ ｐｏｌｙｕｒｉｄｙｌｉｃ ａｓ ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ｏｒ ａｓ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、生物物理学ジャーナル、７７号３２２７〜３２３３ｐ．（１９９９年）参照）。したがって、印加されるトンネル電圧周波数に与えられる制約は、約１０ＭＨｚ程度を超えるということである。

一次元量子力学的二重障壁の移動を詳細に研究すると、上記の測定に関する重大な問題が明らかになる。後に示す追加説明によれば、移動の問題を厳密に解決し、移動確率は、入射エネルギーが入射エネルギーレベルに一致し、２個の障壁が等しい強度である場合にのみ１００％になることが示されている。「等しい障壁条件」は、文献に記載されているが、共鳴トンネル現象の問題については殆ど触れられていない。この問題を定量的かつ明確にするには、図４に示す二重障壁構造の場合、非共鳴トンネル現象の確率は、以下の形式を取る：

ここで、Ｔ_Ｌ（Ｔ_Ｒ）は、左（右）の障壁を通る量子力学的トンネル現象の確率である。これらのトンネル現象の要因は、以下のとおり、個々の障壁の統合された強度に指数関数的に依存する：

ここで

Ｌは障壁の幅、μは基質の質量、（Ｖ_ｉ−Ｅ）は、障壁上部と入射エネルギーとの間のエネルギー差である（大きさの評価として、現在のナノポア構造の場合、単一障壁の高さは約２．５ｅＶであり、単一障壁の幅は約０．５ｎｍであり、単一障壁トンネル現象の確率はＴ_ｉ〜３Ｘ１０^−４が得られると仮定することができる）。こうした小さいトンネル現象の確率は、トンネル電流の大きさを計算する場合、明らかに制限的な要因である。

二重障壁構造の著しい特性は、入射粒子のエネルギーが中心量子井戸の結合状態のエネルギーに一致する場合、転位確率が非常に高くなり、その結果トンネル電流が非常に増加する可能性があるということである。実際、一定の条件では、転位確率は、井戸を囲む障壁の大きさに関係なく１になる。この現象は、共鳴トンネル現象と呼ばれる。関連説明に示すように、一般的な二重障壁構造の全体的な転位確率は、以下の形式を有する：

ここで、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは１程度であり、エネルギーＥにわずかに依存する。一般的な非共鳴トンネル現象の場合、Ｔ_Ｌ及びＴ_Ｒは１よりはるかに小さく、したがって、全体の転位確率の表現は、方程式（４）の分母の第１項により支配され、前述のとおり、次式が得られる：

共鳴トンネル現象は、エネルギーが中心量子井戸の内部エネルギーレベルに一致する状態に対応する。この場合、関連説明に示すように、係数Ａ（Ｅ）は零になり、方程式（４）で表された全体の転位係数が、非主要項により支配されることを示す。明らかに、Ｔ_Ｌ＝Ｔ_Ｒ、つまり障壁の全体の大きさがほぼ等しい場合、全体の転位確率は１程度である。実際、関連説明の式から、共鳴状態で等しい障壁の場合、次にようになる：

しかし、エネルギーが、内部エネルギーレベルに一致するように選択し、係数Ａ（Ｅ）をゼロにする場合も、障壁が等しい大きさではなければ、転位係数は小さい状態を保つ。分かりやすくするため、Ｔ_Ｌ＜＜Ｔ_Ｒと仮定する。その結果、方程式（４）から、全体の転位は以下により与えられる：

これは、共鳴状態でも、１より非常に小さいことが明らかである。同様に、Ｔ_Ｒ＜＜Ｔ_Ｌの場合、方程式（４）からの主要項は以下の形式を取る：

したがって、トンネル電圧を走査し、順に移動するモノマーのスペクトルに対応する大きい共鳴トンネル電流を測定するための上記の方法は問題である。特に、ナノポアを通って移動するバイオポリマーがナノポア中心位置から離れるか、または立体非対称によって、２個のトンネル障壁が等しくないように方向付けられる場合、２つの成分の構成要素のトンネル確率Ｔ_Ｌ及びＴ_Ｒは、トンネル確率が障壁の大きさに指数関数的に依存するため、大きさが著しく異なる。この条件では、方程式（７）及び（８）から分かるように、転位確率、その結果トンネル電流のゲインは当然小さい。

この問題の解決方法は、図１乃至図３に大まかに示す構造で具体化される。これらの構造は、バイオポリマー５がナノポアを通って移動するという事実を利用する。モノマーは、ナノポアを通って２個のリング状電極間を移動する時、最初の障壁非対称の基点に関係なく（空間的分離または立体非対称）、ナノポアを２個のリング状電極から分離する障壁が等しい点を常に通過する。この点では、トンネル電圧が個々のモノマーの内部エネルギースペクトルを走査する時に、大きい共鳴トンネル電流の増加がある。予想される共鳴トンネル電流の出力スペクトルの代表的なプロットは、時間の関数として、印加されるトンネル電極電圧と共に参考のために図５に示されている。上記のとおり、各タイプのモノマーは、他のモノマータイプと区別することを可能にする特徴的な内部エネルギーレベルを有する。

図１乃至図３に示すリング状電極の実施態様は、単に実例を示すためのものであり、本発明の範囲を制限する意図はない。製造を容易にするため、上面及び下面は、実際には金属化（メタライズ）すると良い。ただし、ナノポアの開口部を囲む全体の領域を金属化する。これで、リソグラフィで画定された金属電極構造を精密に整列及び配置する作業は必要がなくなる。

次に、図６を参照すると、印加電圧及びトンネル電流は、第１電極７または第２電極９に近接するバイオポリマー５の部分を示す画定信号を生成することが分かる。各々のヌクレオチド基またはバイオポリマー５の部分は、様々な電圧が印加されると、時間の経過につれてトンネル電流中に異なる信号を生成するはずである。たとえば、モノマーまたはバイオポリマー５の部分が、障壁が対称になるように配置される場合、トンネル電流から、より大きい全体の信号が見られる。これらの異なる信号は、第１電極７または第２電極９に近接して配置されるバイオポリマー５のスペクトルを提供する。次に、これらのスペクトルは、コンピュータにより、既に記録されているヌクレオチドまたはバイオポリマー５の部分の以前のスペクトルまたは「フィンガープリント」と比較することができる。次に、このデータベースと比較することにより、このヌクレオチドまたはバイオポリマー５の部分を決定することができる。次に、このデータ及び情報が記憶され、最終的な配列の出力データとして供給される。

本発明の装置について詳細に説明したので、次に方法を順に説明する。本発明の方法は、第１電極７と第２電極９との間に画定されたナノポア３内に位置するバイオポリマー５を識別または配列するための手段を提供する。この方法は、第１電極７からバイオポリマー５の一部を通って第２電極９に電流を印加して、ナノポア３内に位置するバイオポリマー５の部分を識別するステップを含む。バイオポリマー５は、印加電極電圧の様々な段階でトンネル電流を変更することにより識別することができる。さらに、本発明の方法は、第１電極７からバイオポリマー５の一部を通って第２電極９に至る電圧または電位をランプさせて、第１電極７、バイオポリマー５及び第２電極９のエネルギーレベルが共鳴するまでのエネルギーレベルを走査するための電位手段１１を提供する。ランプ電位は、ナノポア３内に位置するバイオポリマー５の部分を識別するために印加される。

この装置は、様々な技術及び材料を使用して製造することができる。ナノポアは、薄い（５００ｎＭ）シリコンフレーム上に支持された自立窒化ケイ素（ＳｉＮ３）膜内に形成することができる。集束イオンビーム（ＦＩＢ）を使用すると、直径約５００ｎＭの最初の単一ポアを膜内に形成することができる。次に、３ＫｅＶのアルゴンイオンによるポア領域の照射が材料をスパッターして、直径約２ｎＭの所望の寸法まで徐々に孔を閉塞させる（非特許文献１参照）。金属電極は、ＳｉＮ３膜の対向表面上に対する蒸着またはその他の付着手段により形成される。金属電極に対するワイヤボンディングにより、トンネル電流バイアス及び検知システムに接続することができる。バイアスは、約３〜５Ｖ、３０〜５０ＭＨｚの適度な要件でＡＣ電源を使用して印加される。トンネル電流は、ナノアンプ範囲内であると予想され、市販のパッチクランプ増幅器及びヘッドステージ（例えば、米国カリフォルニア州、フォスターシティのＡｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社より提供される、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂ及びＣＶ２０３ＢＵ）を使用して測定することができる。

[関連説明]
分析されるこのモデルの実際のシステムは、図４に示す一次元量子力学的二重障壁構造である。この構造は、一定のエネルギー入射粒子のための時間依存シュレディンガー方程式を解いて、転位確率を計算することにより分析される。計算に使用するパラメーターは、図７で定義する。

Ａ１．二重障壁の解について
粒子全体のエネルギーは、障壁以外のすべての領域で電位エネルギーより大きいと仮定する。この条件では、図７に定義する５つの領域の各々におけるシュレディンガー方程式の解は、直接以下のように書くことができる：

ここで

解は、すべての均質な領域の界面においてΨとｄΨ／ｄхとを一致させることにより決定する。この手順は、一対の下位問題として行うことができる。障壁全体の境界条件を一致させることにより、領域１における波動関数の係数は、領域３における係数で書くことができる：

ここで

同様に、第２障壁全体の境界条件を一致させることにより、領域３における波動関数の係数は、領域５の係数で書くことができる：

ここで

領域１の波動関数の係数と領域５の波動関数の係数とを関連付ける完全な式は、方程式（Ａ８）と（Ａ１５）のマトリクスを連結することにより決定される：

全体の転位係数は、以下の境界条件を適用することにより決定される：

これは、左からの単位振幅の入射波（Ａ_１＝１）、右からの入射波（Ｂ_５＝０）は存在しない状態に対応する。したがって、計算された確率の流速伝播は、以下により与えられる：

所定の代数を行って方程式（Ａ２４）を明確に評価し、降羃で大きい「障壁抑止要因」を列挙する項を収集してまとめると、以下になる：

ここで

そして、表記を単純にするために以下の定義を使用した：

Ａ２．共鳴条件について
障壁が、粒子の伝播を強度に妨げる、つまり一般的な「非共鳴」条件でｅ^２γ２，ｅ^２γ４＞＞１であると仮定すると、全体の伝播は、方程式（Ａ２６）の第１項により支配され、以下になる：

この場合、全体の伝播は、２つの障壁の伝播の積に個々に比例する。しかし、以下の特定の状況では：

方程式（Ａ２６）の最初の３項の係数はゼロになる。２つの障壁の全体の大きさが等しい、つまりγ_２＝γ_４である場合、方程式（Ａ２６）の主要項はｅ^０〜１台であり、合計伝播係数は１に近づくことが分かる。これは、共鳴トンネル現象と呼ばれる状態であり、個々の障壁の強度に関係なく、二重障壁構造を通る全体の伝播の著しい特性を示す（障壁が等しい限り）。

方程式（Ａ３１）のいわゆる共鳴状態の実際的な意義を理解することは重要である。この状態の分析を容易にするため、以下の完全に対称な場合にのみ注目する：

その結果、以下のようになる：

単純な三角関数の恒等式を適用して、Φ１及びΦ３を挿入すると、方程式（Ａ３３）を以下のように書き直すことができる：

任意の基準電位エネルギーレベルをＶ_３≡０として選択し、Ｖ_２をＶ_０に変更すると、方程式（Ａ３４）は以下の形式を取る：

この状態は、厳密に、上記のパラメーターを含む井戸型ポテンシャルのエネルギーレベルに関する特性方程式である（ランドウ（Ｌａｎｄａｕ）及びリフシッツ（Ｌｉｆｓｈｉｔｚ）著、「量子力学」（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）、オックスフォード、ペルガモン（１９８９年）参照）。これは、二重井戸構造を通る全体の伝播のこうした現象が、なぜ共鳴トンネル現象と呼ばれるかを示す。入射エネルギーが共鳴エネルギーのどれかに一致する場合は常に、全体の粒子伝播は、二重障壁が対称である限り、著しく増加する。

Ａ３．共鳴時のトンネル電流について
上記のとおり、対称ポテンシャル構造では、伝播確率は、入射粒子エネルギーが中心井戸の共鳴を通過する時に１になる。しかし、非対称障壁を有する二重障壁構造では、状況は著しく異なる。共鳴時の一般的な非対称構造の場合、方程式（Ａ２６）から、主な挙動は以下の形式を取ることが分かる：

これは、左の障壁が比較的大きい場合（γ_２＞＞γ_４）、以下であり：

右の障壁が比較的大きい場合（γ_２＜＜γ_４）、以下であることを暗示する：

これは、非対称二重障壁構造の場合、共鳴トンネル現象の挙動が著しく異なることを示す。障壁がきわめて非対称である場合、共鳴状態に近づくと、トンネル確率は非常に小さくなる。障壁透過性の共鳴トンネル現象が有効であるのは、二重障壁が対称という条件下のみである。

本発明の第１の好適実施形態を説明する図であり、（ａ）は、電極の電圧走査時に、共鳴トンネル現象により個々のモノマーを検出することを可能にする二重リング状電極構造及び測定システムの概略図であり、（ｂ）はそれらの断面図である。 本発明の第２の好適実施形態を示す図で、（ａ）は概略図であり、（ｂ）は断面図である。 本発明の第３の好適実施形態を示す図で、（ａ）は概略図であり、（ｂ）は断面図である。 実際的な電極ナノポアシステムの単純な一次元量子力学的ポテンシャルモデルを示す。 一次元二重障壁量子力学的モデルの共鳴トンネル条件の略図を示す。 予想される共鳴トンネル電流スペクトルを時間の関数として表す代表的なプロットを示す（参考として、印加されるトンネル電極電圧を共に示す）。 分析される一次元量子力学的二重障壁構造のモデル、及び画定された関連パラメーターを示す。

符号の説明

１ バイオポリマー識別装置
３ ナノポア
５ バイオポリマー
７ 第１電極
８ 基質
９ 第２電極
１１ 電位手段

Claims (21)

1. ナノポア内のバイオポリマーを検知するための装置であって：
   第１リング状電極と；
   該第１リング状電極に隣接する第２リング状電極と；
   前記第１リング状電極と前記第２リング状電極に隣接して、前記第１リング状電極と前記第２リング状電極内に前記バイオポリマーが位置することができるよう設けられるナノポアと；
   前記第１リング状電極と前記第２リング状電極とを電気的に接続して、前記第１リング状電極から前記ナノポア内の前記バイオポリマーの一部分を通って前記第２リング状電極にランプ電位を印加して、前記バイオポリマーの所定の部分を表す信号を生成するための電位手段とを備えることを特徴とする装置。
2. 前記第１電極と前記第２電極とを配置するための基質をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
3. 前記第１電極を配置するための少なくとも１個の第１基質をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
4. 前記第２電極を配置するための少なくとも１個の第２基質をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
5. 前記ナノポアを設けるための少なくとも１個の基質をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
6. 前記バイオポリマーの前記部分から生成される前記信号を検知するための信号検知手段をさらに備えることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
7. 前記バイオポリマーが帯電ポリマーであることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
8. 前記バイオポリマーが、炭水化物、タンパク質、核酸、脂質、多糖類、ポリヌクレオチド、プロテオグリカン及びポリペプチドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の装置。
9. ナノポアを通って移動するバイオポリマーを識別するための方法であって、
   ランプ電流は、第１リング状電極から前記バイオポリマーの一部分を通って第２リング状電極へと提供され、これにより、前記ナノポア内に配置された前記バイオポリマーの前記部分を識別する工程を含むことを特徴とする方法。
10. 前記ランプ電流が、前記バイオポリマーの一部分の少なくとも１つの伝導帯エネルギーに一致するエネルギーレベルを有するトンネル電流を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 前記トンネル電流が、共鳴時に、前記バイオポリマーの一部分の前記伝導帯エネルギーを有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ナノポアを通して前記バイオポリマーを移動させて、移動する前記バイオポリマーの前記部分の各々を識別する工程をさらに有することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
13. ナノポアを通って移動するバイオポリマーを検知するための装置であって：
    第１ナノポアを有する第１電極と；
    第２ナノポアを有する前記第１電極に隣接する第２電極であって、前記第１電極の前記第１ナノポアが、前記第２電極の前記第２ナノポアと共に、前記バイオポリマーが前記第１ナノポア及び前記第２ナノポアを通って移動することができるように配置される第２電極と；
    前記第１電極と前記第２電極とを電気的に接続して、前記第１電極から前記バイオポリマーの一部分を通って前記第２電極にランプ電位を提供し、前記第１ナノポア及び前記第２ナノポアを通って移動する前記バイオポリマーの一部分を表す検知可能な信号を生成する電位手段とを備えることを特徴とする装置。
14. 前記第１電極の前記ナノポアの中心点が、前記第２電極の前記ナノポアの中心点と同軸状に配置されることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
15. 前記第１電極が前記第２電極上に配置されることを特徴とする、請求項１４に記載の装置。
16. 前記第１電極及び前記第２電極を配置する基質をさらに備えることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
17. 前記第１電極を配置するための少なくとも１個の第１基質をさらに備えることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
18. 前記第２電極を配置するための少なくとも１個の第２基質をさらに備えることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
19. ナノポアを通って移動するバイオポリマーの一部分を検知するための装置であって：
    第１電極と；
    前記第１電極から離間配置されて、前記第１電極と前記第２電極との間にナノポアを画定する第２電極であって、前記ナノポアが、移動するバイオポリマーを受容するように設計され、前記第１電極が、前記第２電極と電気的に接続される第２電極と；
    前記第１電極と前記第２電極とを電気的に接続して、前記第１電極から前記バイオポリマーを横断して前記第２電極にランプバイアス電位を印加し、前記ナノポアを通って移動する前記バイオポリマーの一部分を表す信号を生成するための電位手段とを備えることを特徴とする装置。
20. 前記バイオポリマーが、前記第１電極と前記第２電極との間に画定された前記ナノポアを通って段階的に移動することを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
21. 第１電極と第２電極との間に画定されたナノポア内のバイオポリマーを識別するための方法であって：
    第１電極からバイオポリマーの一部分を通って第２電極にランプ電位を印加してエネルギーレベルを前記第１電極のエネルギーレベルまで走査し、前記バイオポリマー及び前記第２電極のエネルギーレベルを共鳴させ、前記ランプ電位が、前記ナノポア内に配置された前記バイオポリマーの前記部分を識別するための検知可能な信号を生成する工程を有することを特徴とする方法。
    
    

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