CN114934108A - 聚合物通过纳米孔的确定性步进 - Google Patents

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Abstract

在用于控制靶聚合物分子(14)通过纳米孔(20)的易位的方法中，将夹具(10)沿靶聚合物分子长度可逆地结合到连续的多个聚合物亚基(12)，并且将分子和夹具布置在与纳米孔(20)流体连通的离子溶液(30)中。横跨纳米孔施加恒定的易位力(V驱动)，以诱导靶聚合物分子(14)行进到纳米孔(20)中，直到夹具(10)紧靠纳米孔的孔并停止靶聚合物分子进一步行进到纳米孔中。然后横跨纳米孔施加电压控制脉冲(V脉冲)和/或在纳米孔处施加热控制脉冲(H脉冲)，其脉冲持续时间使在行进到纳米孔(20)中的相反方向上夹具(10)沿靶聚合物分子(14)步进不超过一个聚合物亚基。不向夹具(10)提供燃料。

Description

聚合物通过纳米孔的确定性步进
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2018年6月28日；申请号：2018800565234(PCT/US2018/040152)；发明名称：“聚合物通过纳米孔的确定性步进”。
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年6月29日提交的美国临时专利申请号62/526823的权益，其全部内容通过引用结合到本文中。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在NIH授予的合同号R01HG003703的政府支撑下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
本发明涉及通过使聚合物通过纳米孔的易位来表征聚合物，并且更具体地涉及对聚合物通过纳米孔的步进的控制。
聚合物及其亚基可以通过测量纳米孔的电导率的变化来表征，聚合物通过该纳米孔步进。已使用纳米孔确定的聚合物特性包括浓度(例如样品溶液中的分子数)、聚合物长度、沿聚合物长度的单体单元数以及聚合物及其单体单元的化学和物理性质，包括连续的单体单元的特定序列，如Deamer等，Nat.Biotechnol.，34:518-524，2016；Manrao等，Nat.Biotechnol.，30:349-353，2012；Akeson等，Biophys.J.，77:3227-3233，1999；和Cherf等，Nat.Biotechnol.，30:344-348，2012所描述的，其全部内容均通过引用结合到本文中。在基于纳米孔的表征技术的一个示例中，待研究的聚合物在与纳米孔流体连通的顺式储器中在离子溶液中提供。聚合物通过纳米孔从顺式储器易位到反式储器，在此期间可以检测到纳米孔的横越并可以确定聚合物的特性。尽管通过在顺式储器和反式储器电极之间施加恒定的偏压产生的电场通常用于驱动聚合物通过纳米孔，如例如Kasianowicz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：13770-13773，1996所描述的，其通过引用将其全部内容结合到本文中，但是也可以替代地采用其他力，包括流体静压力、光学力或磁场，并且这些力中的两种或更多种的组合可用于驱动聚合物通过纳米孔，如例如Lu等，Nano Lett.13：3048-3052，2013；以及Keyser等人，Nature Physics，2：473-477，2006所描述的；二者全部内容通过引用结合到本文中。
已经提出将活性酶与聚合物结合，以减慢或延迟聚合物以不期望的快速速率被自由驱动通过纳米孔的想法，例如，如Akeson的美国专利号7625706；Akeson的美国专利号7238485；Akeson的美国专利号7947454；Akeson的美国专利号8673556；Cherf的US20140051068；Moysey的US 20140335512；以及Jayasinghe的US 20150031020所教导的，其全部内容通过引用结合到本文中。这样的活性酶，例如聚合酶或解旋酶，取决于源自化学底物例如三磷酸腺苷(ATP)的能量，以沿聚合物行进并相应地使聚合物通过纳米孔步进。活性酶的ATP依赖性运动使得可能驱动聚合物通过感测纳米孔，其速率取决于酶的周转数，即每单位时间将酶沿其聚合物底物行进的最大步数。但是，与从本体液相酶的研究中得出的其他概念一样，已经确定周转数与单个分子活性的行为没有什么关系，其中单个酶分子的每个活性步伐之间的时间间隔围绕酶的周转数随机变化。
在纳米孔处和通过纳米孔的单个分子的每个连续步伐之间的随机时间间隔(例如，聚合物的相邻单体单元通过纳米孔步进之间的时间)引起重大问题，因为正是在这些间隔期间测量并评价纳米孔的电导率，以表征纳米孔中的聚合物及其聚合物亚基。这些间隔中的许多间隔可能短到引起遗漏的错误，而其他间隔可能长到被误解为连续的相同单体，而实际上不存在这样的连续的相同单体单元。它们也使得不可能将长度为X的均聚物区域(四个相同单体的序列)与长度为X+1、X+2、……或X+n的那些区分。
发明简述
在本文提供的用于控制靶聚合物分子通过纳米孔的易位的方法中，将夹具沿所述靶聚合物分子长度可逆地结合到连续的多个聚合物亚基。所述靶聚合物分子包括沿所述靶聚合物分子长度的连续的多个聚合物亚基。将所述靶聚合物分子和可逆结合的夹具布置在与所述纳米孔流体连通的离子溶液中。所述纳米孔的孔直径小于所述夹具的外径。
横跨所述纳米孔施加恒定的易位力，以诱导所述离子溶液中的所述靶聚合物分子行进到所述纳米孔中，直到所述靶聚合物分子上的夹具紧靠所述纳米孔的孔并停止所述靶聚合物分子进一步行进到所述纳米孔中。随后施加控制脉冲，所述控制脉冲为横跨所述纳米孔的电压控制脉冲和在所述纳米孔处的热控制脉冲中的至少一种。所述控制脉冲的控制脉冲持续时间使得所述夹具在行进到所述纳米孔中的相反方向上沿所述靶聚合物分子步进不超过一个聚合物亚基。不向所述夹具提供燃料。所述夹具的步进引起所述靶聚合物分子进一步步进到所述纳米孔中，但不超过一个聚合物亚基。重复施加所述控制脉冲，以引起所述靶聚合物分子的连续的多个聚合物亚基通过所述纳米孔易位。
该易位控制方法使得表征靶分子的方法成为可能，其中当所述聚合物亚基在所述纳米孔中时，获得聚合物亚基的特征指示。在此，在获得通过所述纳米孔易位的每个聚合物亚基的特征指示的同时，重复施加所述控制脉冲，以引起所述靶聚合物分子的连续的多个聚合物亚基通过所述纳米孔易位。
本文提供的用于表征靶聚合物分子的纳米孔系统包括第一流体储器和第二流体储器，所述第一流体储器和第二流体储器与纳米孔流体连通，所述纳米孔在所述第一流体储器和所述第二流体储器之间形成唯一的流体路径。在所述第一流体储器中提供夹具。所述夹具紧靠所述纳米孔并且可逆地结合到所述第一流体储器中的离子溶液中的所述靶聚合物分子的连续的多个聚合物亚基。所述靶聚合物分子包括沿所述靶聚合物分子长度的连续的多个聚合物亚基。
提供电路，所述电路包括在所述第一储器中的电极、在所述第二储器中的电极以及电流放大器，所述电流放大器用于在所述第一储器和所述第二储器之间横跨所述纳米孔施加恒定的偏压，以诱导所述靶聚合物分子行进到所述纳米孔中。电压脉冲发生器与所述电路连接，以在所述第一储器和所述第二储器之间横跨所述纳米孔施加电压控制脉冲，以在远离所述纳米孔的方向上使所述夹具沿所述靶聚合物分子的连续的聚合物亚基逐个聚合物亚基步进，并将所述聚合物分子进一步步进到所述纳米孔中。所述系统不包括用于所述夹具的燃料并且不包括用于所述夹具的燃料源。计算机控制器与所述电路连接，以在所述靶聚合物分子的连续的多个聚合物亚基通过所述纳米孔步进的同时，收集通过纳米孔的离子电流的电指示。
本文提供的用于表征靶聚合物分子的另一种纳米孔系统包括第一流体储器和第二流体储器，所述第一流体储器和第二流体储器与纳米孔流体连通，所述纳米孔在所述第一流体储器和所述第二流体储器之间形成唯一的流体路径。在所述第一流体储器中提供夹具。所述夹具紧靠所述纳米孔并且可逆地结合到所述第一流体储器中的离子溶液中的所述靶聚合物分子的连续的多个聚合物亚基。所述靶聚合物分子包括沿所述靶聚合物分子长度的连续的多个聚合物亚基。
提供电路，所述电路包括在所述第一储器中的电极、在所述第二储器中的电极以及电流放大器，所述电流放大器用于在所述第一储器和所述第二储器之间横跨所述纳米孔施加恒定的偏压，以诱导所述靶聚合物分子行进到所述纳米孔中。激光器与所述计算机控制器连接，以产生激光脉冲，并且光学器件与所述激光器相邻布置并定向以将所述激光脉冲引导至所述纳米孔。将吸收来自所述激光脉冲的能量的材料元件在所述纳米孔处布置，以在每个激光脉冲期间加热所述离子溶液，并进而在远离所述纳米孔的方向上使所述夹具沿所述靶聚合物分子的连续的聚合物亚基逐个聚合物亚基步进，并将所述靶聚合物分子进一步步进到所述纳米孔中。所述系统不包括用于所述夹具的燃料并且不包括用于所述夹具的燃料源。计算机控制器与所述电路连接，以在所述靶聚合物分子的连续的多个聚合物亚基通过所述纳米孔步进的同时，收集通过纳米孔的离子电流的电指示。
本文提供的纳米孔系统和方法使得能够确定性控制靶聚合物分子通过纳米孔的易位，和在表征靶聚合物分子时相应的优越的控制程度。在下面以及在附图中和在权利要求中描述本公开的这些和其他方面以及实施方式。
附图说明
图1A、图1B和图1C是夹具-铰接的聚合物分子通过生物膜中的生物纳米孔的确定性步进的三个阶段的示意图；
图1D、图1E和图1F是夹具-铰接的聚合物分子通过固态膜中的纳米孔的确定性步进的三个阶段的示意图；
图2是纳米孔系统的示意图，该系统包括在顺式储器中提供的夹具-铰接的聚合物分子，用于通过纳米孔向反式储器的确定性步进；
图3是用于进行夹具-铰接的聚合物分子通过纳米孔的确定性步进的方法步骤的流程图；
图4A、图4B、图4C和图4D是在进行图3的流程图的方法步骤中，待测量的纳米孔电流或待施加的控制脉冲电压的图；
图5是在夹具-铰接的聚合物通过纳米孔的确定性步进中，用于实施电压控制脉冲施加的纳米孔系统和相关的电子设备的示意图；
图6是包括控制脉冲电压施加电子设备的纳米孔系统的电路模型；
图7是图5的系统的低噪声电压脉冲发生器的示意性框图；
图8是在夹具-铰接的聚合物通过纳米孔的确定性步进中，用于实施热控制脉冲施加的纳米孔系统和相关的元件部分的示意图；
图9A和图9B分别是与夹具连接的和与纳米孔连接的金纳米颗粒(NP)的示意图，用于在图8的纳米孔系统中提供吸收性材料；
图10是聚合酶合成的示意图；
图11是对于ATP驱动的聚合物步进和不具有ATP的偏压驱动的聚合物步进的条件(均具有T4解旋酶聚合物夹具)，测量的纳米孔电流随与感测的单体相邻的约5个核碱基而变化的图，其中图上方显示的DNA序列作为在横轴下面显示的一系列重叠的5聚体读出；
图12是对于2mM的ADPNP以及对于无ATP类似物，使用T4噬菌体解旋酶作为聚合物夹具，横越全长聚合物的中值测量的持续时间的图，其中垂直封端线表示几个相同聚合物完全横穿纳米孔的持续时间范围；
图13是对于四种不同的温度，使用T4噬菌体解旋酶夹具铰接的DNA分子，中值单体步进持续时间随所施加的偏压驱动电压而变化的图；
图14A、图14B和图14C是通过施加的偏压驱动电压来克服聚合物分子在纳米孔中的布朗运动的聚合物分子控制的示意图；以及
图15A和图15B是对于采用160mV偏压驱动电压的实验纳米孔系统，测得的纳米孔电流和施加的电压控制脉冲幅度随时间变化的图。
详细描述
本文提供用于在如图2所示的纳米孔系统中靶聚合物分子通过纳米孔的确定性步进而非随机步进的所有结构、系统和相应的方法。在一种实施方式中，该结构、系统和方法用于驱动靶聚合物分子的线性连接的连续的单体残基通过纳米孔，具有精确的确定性运动，使得相同的单体单元的重复序列横穿纳米孔所花费的时间识别已通过纳米孔易位的相同单体的精确数量。具体地，当每个单体通过纳米孔步进之间的时间间隔是已知常数k时，也就是说，如本文所述，当步进是确定性时，则相同的单体单元的重复序列横穿纳米孔所花费的总时间除以间隔常数k识别已横穿纳米孔的相同单体的精确数量。
如图1A至图1C所示，本文提供确定性推进夹具10的结构，沿靶聚合物分子14(例如DNA链)或沿分子长度具有聚合物亚基的其他合适的聚合物分子，该夹具可逆地夹持在多个单体12(例如，1-20个单体的组)上或可逆地与其结合。夹具10的外径16大于通过纳米孔20延伸的孔或通道的直径18，如图1A至图1C所示。
本文所用的术语“聚合物分子”旨在指生物分子，例如多核苷酸，例如生物聚合物核酸分子脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、合成的核酸例如肽核酸(PNA)以及蛋白质、糖聚合物和其他生物分子。因此，下面的讨论并不旨在局限于特定的实现。在用于聚合物分子表征的一系列实施方式中提供与这些分子例如多核苷酸的实例有关的细节，以说明本文提供的原理。
还参考图2的横截面示意图，该夹具-铰接的分子构型可用于纳米孔系统25中用于表征聚合物分子。纳米孔系统通常包括结构26，例如膜，其中布置有纳米孔20，其在性质上可为生物的或固态的任一种或两种。如果需要，其中布置有纳米孔的膜或其他结构26可在边缘处通过例如支撑结构28支撑。排列结构26和支撑结构28，以将顺式储器30与反式储器32分开，其中纳米孔提供两个储器之间的唯一的流体路径。顺式储器和反式储器包括离子液体溶液，并且顺式储器包括待通过纳米孔20易位至反式储器的靶分子14。待通过纳米孔易位的顺式储器中的靶分子14各自具有可逆的夹具10，该夹具在多个聚合物亚基上沿分子长度的位点布置，形成靶分子-夹具复合物。这种靶分子-夹具复合物的溶液可以采用常规方式来产生，例如Moysey在US 20140335512中描述的，该专利的全部内容通过引用结合到本文中。在顺式储器中提供靶分子-夹具复合物，用于分析通过纳米孔易位的靶分子。
在一个实施方式中，在顺式储器30和反式储器32中分别包括电极34、36，可在这两个电极之间施加恒定的偏压38。通过在顺式储器电极34和反式储器电极36之间施加这样的偏压产生的电场可用于以常规方式驱动顺式储器中的带电分子通过纳米孔到达反式储器。但是要认识到，可替代地采用其他易位力。因此，尽管本文中的步进控制方法描述将使用术语“偏压”或V驱动，但是应当理解，其他力也可用于驱动聚合物通过纳米孔，包括流体静压力、光场或磁场以及两种或更多种场的组合。以后，当在本文中使用术语“恒定的电压驱动偏压”或V驱动时，应理解这些场中的任一个或多个可被替换。用于电泳驱动通过纳米孔的分子易位的其他细节和实例在2003年9月30日授予Branton等人的“Molecular and AtomicScale Evaluation of Biopolymers”的美国专利号6627067中提供，其全部内容通过引用结合到本文中。
现在参考本文中启用的方法，如图1A所示，在纳米孔20处显示所研究的靶聚合物分子14，其包括可逆结合的夹具10。如图1B所示，在顺式储器和反式储器之间存在施加的偏压V驱动，如图2所示，以提供有利于靶聚合物14行进到纳米孔20中的条件。当靶聚合物14行进到纳米孔中时，如图1B所示，当夹具10紧靠在纳米孔20的区域40上时，易位自动停止，纳米孔20的内径18小于夹具的外径16，如图1A所示。在这种条件下，聚合物14的一个聚合物亚基42(例如一个单体)占据纳米孔内的位点，例如，在一个优选的实施方式中，占据纳米孔20的高度敏感的狭窄区域44的位点。结果是，对于该条件，只要亚基42保留在纳米孔中合适的位点，例如纳米孔的高度敏感的区域，则亚基42的电学和体积性质就主导纳米孔的顺式至反式电导率。因此，感测、检测、测量或以其他方式确定与纳米孔的电导率相关的纳米孔系统的参数提供在此条件下亚基42的特征指示。
在确定亚基42的特性指示之后，然后如图1C所示，除了跨越纳米孔的偏压驱动电压V驱动以外，还提供控制脉冲，例如作为电压控制脉冲V脉冲和/或热控制脉冲H脉冲提供。控制脉冲使夹具10在箭头44指示的方向远离纳米孔20沿聚合物14步进。具体地，可控地驱动夹具10以沿聚合物步进一个聚合物亚基，然后可逆地结合到聚合物亚基的下一个连续的组12。结果是，纳米孔中的亚基42现在移入反式储器中的溶液中，而下一个亚基46现在主导纳米孔的顺式至反式电导率。夹具远离纳米孔沿聚合物的确定性步进的该过程继续使聚合物分子一次一个亚基进入并通过纳米孔步进。不向夹具施加能量来为夹具从一个聚合物亚基到下一个聚合物亚基的步进提供燃料。具体地，不向夹具供应化学燃料，并且不向夹具供应生化燃料。仅控制脉冲施加引起夹具从一个聚合物亚基向下一个聚合物亚基步进。
图1A至图1C显示具有线性亚基序列的靶聚合物分子14，这些亚基在图中以简单的圆圈表示。仅出于解释清楚的目的提供此表示。加载到顺式储器中的靶聚合物分子可为单链的(如ssDNA)，或者可为双链的(如dsDNA)。在任一种情况下，将夹具布置在单链聚合物分子区域上的位点处。因此，双链靶聚合物分子提供有单链区域，可以采用常规方式向该单链区域布置夹具，使得夹具可沿双链靶分子的单链区域在某一点定位。
图1A至图1C的条件针对其中提供纳米孔20作为膜35中的生物纳米孔的实施方式显示，膜35可为生物的或有机的，例如脂质双层、四醚脂质或三嵌段共聚物。例如，纳米孔可作为耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)提供，其为八聚体蛋白通道；可作为细菌孔蛋白CsgG提供，其为九聚体蛋白通道；或者可作为这些和其他通道的突变体提供，例如Moysey在美国专利号9617591中教导的那样，其全部内容通过引用结合到本文中。将所选的生物纳米孔布置在例如二植烷酰基磷脂酰胆碱膜(diPhPC)、四醚脂质、三嵌段共聚物或固态结构(例如组成的固态膜)中。可提供这样的固态膜作为例如一个或多个石墨烯层、SiNx或其他固态支撑物，离子不能横穿该固态膜，但是在该固态膜中可布置任何上述生物纳米孔，其方式为防止离子从顺式流动到反式，除非通过纳米孔自己的通道。
在图1A至图1C所示的在纳米孔处的聚合物捕获和步进的条件也在图1D至图1F中显示，但是对于固态纳米孔系统的实施方式。如在图1D至图1E中所示，在顺式储器和反式储器之间存在施加的恒定的偏压V驱动，如图2所示，以提供有利于在纳米孔20的位点处捕获包括夹具10的靶聚合物14的条件。纳米孔20在这里是在固态膜37中布置的孔、洞、通道或其他开口。该膜可由如上所述的任何合适的固态材料形成，例如石墨烯或其他原子薄材料，或作为微电子材料，例如氮化物、氧化物或材料层的组合。固态膜进而可采用图2的膜26和支撑结构28的方式由诸如微电子基板的支撑结构支撑。应认识到，为清楚起见，图2的系统25显示具有纳米孔20，该纳米孔20为膜26中的孔，但是可采用生物、有机和固态纳米孔和膜的任何合适的组合，并且旨在用于图2的纳米孔系统25。
当靶聚合物14由于恒定的偏压而通过纳米孔易位时，如图1E所示，当夹具10紧靠在纳米孔20上时，易位自动停止。纳米孔直径18小于夹具的外径16，如图1D所示。在这种条件下，靶聚合物14的一个亚基42(例如一个单体)占据纳米孔的最敏感区域。结果是，对于这种条件，只要单体亚基42保留在纳米孔中，则亚基42的电学和体积性质就主导纳米孔的顺式至反式电导率。结果是，感测、检测、测量或以其他方式确定与纳米孔的电导率有关的纳米孔系统的参数提供在该条件下与亚基42有关的特性指示。
在确定亚基42的特性指示之后，然后如图1F所示，与偏压驱动电压V驱动组合提供控制脉冲，例如电压控制脉冲V脉冲和/或热控制脉冲H脉冲，以在箭头44指示的方向，远离纳米孔20，使夹具10沿靶聚合物14步进。具体地，驱动夹具10沿聚合物步进一个单体亚基，然后结合到下一组聚合物亚基。结果是，纳米孔中的亚基42移入反式储器中，而下一个亚基46现在主导纳米孔的顺式至反式电导率。夹具沿靶聚合物的确定性步进的该过程继续使聚合物分子一次一个亚基进入并通过纳米孔步进。
图3是用于实现图1A-C和图1D-F所示条件的方法步骤的流程图，而图4A-4D是指示每个方法步骤的条件的测量的电信号的图。在方法50中，在组装纳米孔系统以开始52该方法之后(其中靶聚合物分子与在顺式储器中布置的夹具铰接在一起)，然后在第一步54中，在顺式储器和反式储器之间施加恒定的偏压驱动电压V驱动。在下一步56中，确定56靶聚合物是否已经在纳米孔处被捕获。图4A是针对纳米孔测得的电流随时间变化的图，显示当在纳米孔处捕获靶聚合物时，通过纳米孔测得的电流从开孔电流水平急剧下降至指示聚合物分子在纳米孔中的捕获的较低水平。如果确定聚合物尚未在纳米孔处被捕获，则维持恒定的偏压并继续测定，直到确认聚合物已经在纳米孔处被捕获为止。
在下一步58中，在顺式储器和反式储器之间除了偏压以外，还施加控制脉冲，例如电压控制脉冲和/或热控制脉冲。在一个实施方式中，在这里对于电压控制脉冲，如图4B的图所示，横跨纳米孔施加电压脉冲。然后，如图4C的图所示，横跨纳米孔的总电压包括加入恒定的偏压和脉冲电压。可手动或通过自动化系统控制每个脉冲的时序和持续时间，所述自动化系统可提供连续重复的脉冲。偏压和脉冲电压的极性相对于纳米孔是相同的，因此对于给定的聚合物电荷，偏压和电压脉冲的总和是累加的，并且在驱动聚合物通过纳米孔的方向定向。
在下一步60中，确定靶聚合物是否响应所施加的控制脉冲而通过纳米孔步进。图4D的图提供一个示例，该示例显示通过电流测量可确定靶聚合物响应单个电压脉冲而采取一个聚合物亚基的单个步进。如果确定响应于单个电压脉冲或响应于单个热脉冲，聚合物没有采取单个步进，则增加脉冲的幅度和/或持续时间。当指示聚合物响应一个施加的脉冲通过纳米孔正步进一个聚合物亚基时，则在下一步中获得反映该纳米孔感测位点处的聚合物亚基特性的一些代表性指示。例如，如图3所示，在该步骤62中，可获得并记录(如果需要的话)通过纳米孔的测量的电流，以反映当聚合物响应于控制脉冲通过纳米孔步进时聚合物亚基的特性。
在最后的步骤64中，确定纳米孔是否已经打开，例如，通过确定纳米孔电流是否已经返回到开孔电流。如果不是，则继续记录聚合物序列的步骤62。如果确定纳米孔是打开的，则再次进行步骤54，仅横跨纳米孔施加恒定的偏压，同时等待在纳米孔处靶聚合物分子的捕获。
在方法50中，可进行测量纳米孔电流的步骤，以获得纳米孔中聚合物亚基的一系列不同的特征指示。通常，可如下获得聚合物亚基的特征指示，例如检测纳米孔中聚合物亚基的存在；在连续的多个亚基中计数聚合物亚基；在连续的多个亚基中识别相同亚基的数量；识别聚合物亚基；确定亚基的化学方面或亚基的其他特征指示。亚基沿整个聚合物分子的连续序列可采用这种方式表征，提供对于整个聚合物分子序列的数量和身份信息。
该受控步进方法可使用任何合适的电子控制系统来实现。图5为一个实施方式的示意图，其中排列系统75用于利用控制脉冲来实现图3的方法，该控制脉冲为电压控制脉冲。在系统75中，在顺式储器和反式储器中提供电极34、36，并与低噪声电压脉冲发生器70和电流放大器72连接。控制电流放大器72以在顺式储器和反式储器之间施加恒定的偏压V驱动。当通过来自控制计算机74的控制信号触发时，脉冲发生器70产生电压控制脉冲V脉冲，该电压控制脉冲V脉冲被加到在电极34、36之间施加的偏压V驱动上。电流放大器72提供纳米孔电流的模拟输出测量值，其由数字转换器模拟76数字化并提供给计算机74用于记录。由顺式储器和反式储器、纳米孔、电流放大器、A/D转换器、脉冲发生器和计算机形成的电路能够测量电路中的电流，该电流指示通过纳米孔的离子电流。
可根据需要并且以任何合适的方式，例如利用热电加热器/冷却器，使系统为温度受控的。系统的任何元件均不向夹具提供能量以向夹具沿聚合物分子的步进提供燃料，并且系统中不包括能源。如上所述，仅电压控制脉冲引起夹具沿聚合物分子步进。
该系统75可用如图6所示的电路模型80进行电模型化。膜中的纳米孔引起孔隙阻力和膜电容。图7是图5的低噪声电压脉冲发生器70的一个实施方式的示意图。低噪声脉冲发生器包括控制元件，该控制元件确定控制脉冲之间的持续时间以及电压控制脉冲的持续时间和幅度。可特别优选该实施方式，以能够精确地产生电压控制脉冲。具体而言，在优选的实施方式中，如图7所示，存在由电压跟随器-逆变器提供的产生的电容补偿+V脉冲和-V脉冲，以减少电容引起的“过冲”，当将电压脉冲之间的时间间隔设定为最小间隔时(例如，用于使纳米孔数据输出最大化)，该“过冲”的持续时间可使得不能测量通过纳米孔的实际电流。
图8为一个实施方式的示意图，其中排列纳米孔系统85用于使用控制脉冲来实现图3的方法，该控制脉冲为热控制脉冲。在系统85中，在顺式储器和反式储器中提供电极34、36，并与电流放大器72连接。电流放大器72在顺式储器和反式储器之间提供恒定的偏压V驱动。通过来自计算机74的控制产生热控制脉冲，将触发脉冲控制信号提供给激光器82和光学器件84，排列所述激光器82和光学器件84用于将激光能量86的脉冲引导至膜中纳米孔的位点，在该处布置吸收激光能量86的材料。通过吸收性材料吸收激光能量引起在纳米孔附近温度升高的脉冲，如以下所解释的。电流放大器72提供纳米孔电流的模拟输出测量值，其由数字转换器模拟76数字化并提供给计算机74，用于采用图5的电压脉冲控制系统的方式记录。与该系统一样，可根据需要并且以任何合适的方式，例如利用热电加热器/冷却器，此处系统85可为温度受控的。
图9A至图9B说明用于在图8的系统85中的纳米孔的位点处提供吸收性材料的实施方式。在图9A所示的第一实施方式中，提供吸收剂颗粒90，例如金、银或其他合适的纳米颗粒(NP)，其通过分子接头92与夹具10附着。在图9B所示的另一实施方式中，吸收剂颗粒90(例如金NP)借助分子接头92与纳米孔20附着。
在这两个实施方式的任一个中，用激光照射颗粒，优选金NP，在纳米孔附近的溶液的快速局部加热方面特别有效，所述激光的波长利用对金颗粒的等离子体共振效应。由于金纳米颗粒中高度受限的表面等离子体共振效应增强颗粒对光的吸收，因此入射在纳米颗粒上的可见激光引起颗粒温度和相邻的溶液温度快速且大幅增加。可由纳米孔的离子电导率的变化来估计该温度升高。例如，以300mW的束能量运行的532nm波长的激光可容易地将金纳米级直径颗粒和紧紧在NP周围区域的温度在仅纳秒内从室温升高约20℃至约50℃。因为被加热的体积可能小到几幺升，该小的体积可迅速返回到周围溶液体积的温度，因为它的热能迅速消散到周围溶液中，周围溶液的体积通常大至少16个量级。
在另一实施方式中，将图5的控制系统75与图8的控制系统85组合，以能够使电压控制脉冲与热控制脉冲组合。在纳米孔处适当的位置使用吸收剂，例如金NP，采用电压脉冲和热脉冲二者用于以上述方式的确定性单体运动。可手动或通过自动化系统单独控制每个电压脉冲和热脉冲的时序和持续时间，协调热脉冲控制和电压脉冲控制。
现在转向与纳米孔系统一起使用的夹具10的细节，图1A至图1C所示的夹具可采用任何合适的构造和排列，使得夹具通常能够可逆地夹持或可逆地结合到待通过纳米孔易位的靶聚合物的多个聚合物亚基或分子的其他亚基。尽管夹具可为在其他系统中用作依赖酶或生化燃料的发动机的分子，但是本文中的术语“夹具”是指任何生物分子或非生物组件，即固态组件，其可逆地结合到聚合物，并且可通过施加电压控制脉冲V脉冲和/或热控制脉冲H脉冲而不使用生化燃料依赖动作来确定性驱动，以通过聚合物的长度在单个连续的单体步长中步进或移动。不向夹具提供化学或其他燃料，以沿靶聚合物分子的聚合物亚基的序列进行步进。
在一个实施方式中，夹具为解旋酶，例如T4噬菌体解旋酶。在其他实施方式中，也可采用其他酶作为夹具，包括T4噬菌体解旋酶的突变体，以及与核酸聚合物结合的其他蛋白质和生化或无机化学复合物。
使用上述的这种夹具和控制系统，通过使用夹具，本文提供的聚合物步进方法避免酶活性分子的随机运动，所述夹具的运动不需要ATP或化学或生化燃料的输入，取而代之由在恒定的偏压V驱动上叠加的电压控制脉冲V脉冲和/或热控制脉冲H脉冲确定性驱动。结果是，本文提供一种方法，其中靶聚合物单体的线性序列以精确时序的步进运动通过纳米孔易位。两个特征特别使该方法成为可能。
首先，与已用于控制聚合物通过纳米孔的随机运动的用于酶(例如解旋酶和聚合酶)的生化燃料排列不同，本文的方法要求确定性驱动的夹具不使用化学能源以引起夹具沿靶聚合物的单体亚基移动。取而代之的是，这里以恒定的驱动偏压V驱动可控地施加电压控制脉冲V脉冲和/或热控制脉冲H脉冲，当聚合物被驱动通过纳米孔步进一个单体时，如图1C所示，以非常短暂地释放或松开与聚合物结合的夹具，使得夹具沿聚合物滑动一个且仅一个单体步进。因此，除如图1C所示，当夹具相对于靶聚合物移动时，结合的夹具防止或停止靶聚合物被驱动力驱动通过纳米孔，该驱动力在不存在夹具下快速驱动聚合物的全长通过纳米孔。实际上，夹具起到在时钟棘轮上的棘爪的作用，而偏压V驱动用作推动棘轮的弹簧或电动机。
其次，优选持续时间为纳秒至微秒(例如，一毫秒或更短)的电压控制脉冲和/或热控制脉冲通过引起夹持部件沿聚合物每个脉冲滑动一个单体单元，使靶聚合物链通过纳米孔步进。由于恒定的偏压V驱动连续地作用以使聚合物电泳或驱动聚合物通过纳米孔，结合的夹具考虑到其较大的直径而不能移动通过该纳米孔，当夹持部件可逆地但确定地滑动，然后在另一个多个单体单元处可逆地重新夹持聚合物时，聚合物通过纳米孔一次一个单体单元确定性步进。
在优选的实施方式中，将单个电压控制脉冲V脉冲和/或热控制脉冲H脉冲的持续时间调整为不大于从聚合物瞬时释放夹具所需的持续时间，因此在图1C中的向上指向箭头所示的方向，当夹具沿聚合物滑动一个单体步进时，恒定的偏压V驱动驱动聚合物通过纳米孔，以与下一个连续的单体单元或单体单元的组结合。这使聚合物的下一个连续的单体单元占据纳米孔，并优选占据最敏感的纳米孔的最窄区域，使得纳米孔的电导率现在由该下一个连续的单体或单体的组的电性质和/或体积性质主导。因此，一系列这些电压控制脉冲和/或热控制脉冲以时钟系统的棘爪释放机构的方式起作用。连续的电压控制脉冲和/或热控制脉冲从而使待驱动通过纳米孔的靶聚合物的全长步进。
注意到，即使将夹具作为分子夹具酶实施，该分子夹具酶可潜在地利用ATP或另一种生化燃料进行周转并沿聚合物步进，在本文的方法中不提供ATP或化学能源，并且仅通过电压控制脉冲和热控制脉冲(V脉冲和/或H脉冲)使夹具沿其聚合物底物滑动。由于夹具由精确时序的电压控制脉冲V脉冲和/或热控制脉冲H脉冲沿聚合物驱动，因此聚合物通过纳米孔的步进运动是确定的。
脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)驱动的聚合酶和ATP依赖性解旋酶均已用于通过纳米孔随机地步进DNA用于测序。已知这些和其他化学驱动的酶的步进速率可通过机械力来加速、减速或甚至停止。还已知在ATP或dNTP的存在下，即使当机械加速或减速时，核酸步进酶(如解旋酶和聚合酶)沿聚合物底物逐个单体步进，而不跳跃或跳过几个单体。例如，如果如图1A-C所示的夹具10是解旋酶，其在ATP存在下，在图1C中向上箭头所示的方向，通常沿聚合物底物步进，这种步进变得更快，但因为驱动聚合物通过纳米孔从顺式储器到反式储器的偏压增加，仍逐个单体步进，而不会跳跃，如Moysey在美国专利号9617591中所教导的，其全部内容通过引用结合到本文中。
相反地，参考图10，如果夹具是一种进行性聚合酶85，则在dNTP存在下，在箭头86的方向，聚合酶沿聚合物的步进倾向于使聚合物更缓慢地从纳米孔步进出来，但是由于驱动聚合物从顺式到反式的偏压的电泳力变得更大，聚合物仍逐个单体步进，而不跳跃，如Lieberman等人，J.Am.Chem.Soc.，132：17961-17972，2010所描述的，其全部内容通过引用结合到本文中。最后，当通过纯机械力顺时针驱动时，通常消耗ATP以逆时针步进的F1-ATP酶合成ATP的事实清楚地证明，在蛋白质机器上在某一特定点起作用的机械力可在催化位点驱动化学反应。这些示例显示，适当施加的机械力不破裂或破坏酶的正常构象变化。此外，这些示例提供明确的证据，纯机械力可延迟、促进或甚至驱动通常化学能驱动的构象变化。
在ATP存在下，机械力可促进、延迟或替代酶(引起步进)的构象修饰的事实引起通过本文提供的结构解决的以下问题。在不存在任何ATP下，即不存在任何燃料，仅纯机械力可引起聚合物步进酶经历构象修饰，这以表征ATP依赖性步进的相同逐个单体精度，引起其沿聚合物滑动。当使用源自ATP水解的化学能时，酶(诸如解旋酶)经历构象变化，该构象变化使解旋酶沿聚合物的每一个步进精确推进一个且仅一个核碱基。如果单独作用的机械力只是在每个步进中简单地推动酶夹具以随机地在不确定数量的核碱基上滑动，则纳米孔感测到的核碱基序列将不能报告聚合物中核碱基的实际序列，因为通过纳米孔的每个连续的核碱基的识别发生在每个连续步进之间的时间间隔中。
现在参考图11的图，发明人在本文中发现，施加的力可推动酶夹具，以通过ATP实现的方式，但是完全在不存在ATP下，即不向夹具提供任何燃料，每个步进精确地推进一个且仅一个核碱基。图11的图显示由于约5个与在DNA链的每个步进中占据纳米孔最窄区域的单体直接相邻的核碱基的纳米孔电流堵塞。DNA的序列被读作一系列重叠的5聚体，如横轴所示。
如图11的图所示，对于施加的偏压V驱动＝160mV，在偏压驱动的DNA链(圆圈)的每个步进处通过纳米孔的电流与在ATP驱动的链(正方形)的每个步进处的电流读数相同(在此类电流读数的误差限度内)。这显示，机械迫使的运动可使聚合物(例如DNA链)通过纳米孔向前前进一个核苷酸，就像ATP-燃料力一样，并且不使用ATP也可以这么做。因此，电压迫使的运动可忠实地使靶聚合物分子通过纳米孔移动，并因此当聚合物通过纳米孔的运动通过例如ATP-燃料的解旋酶控制时，使得电流水平序列相同。这清楚地显示，足够幅度的纯机械力引起通常为ATP依赖性酶用作夹具，在不存在ATP下，该酶可通过电压控制和/或热控制来驱动，以沿DNA链的长度移动与ATP依赖性DNA电动机酶相同的逐个单体步进精度。
虽然图11的图说明ATP驱动的T4解旋酶的正常5'到3'步进以及在不存在ATP下用作夹具的机械驱动的5'到3'T4-解旋酶，但是T4-解旋酶也可沿DNA链反向(即，从3'到5')被机械驱动。实际上，考虑到Mulkidjanian等人，Nat.Rev.Microbiol.，5：892-899，2007所观察到的情况，其通过引用全文并入本文，当通过机械力反向驱动时，使用F1-ATP酶可合成ATP，而不是水解ATP，如Ito等人，Nature，427：465-468所描述的，其通过引用全文并入本文，应理解的是，沿DNA，在其正常的5'至3'或3'至5'移动方向的反向，通过驱动ATP依赖性核酸步进电动机酶，可产生ATP而不是消耗ATP。结果是，在本文提供的另一实施方式中，可采用偏压驱动电压和电压控制脉冲和/或热控制脉冲来沿聚合物分子长度在两个可能的方向中的任一个上移动夹具。
因为在本文提供的用于控制脉冲的方法中，包括偏压驱动电压V驱动加上附加电压控制脉冲V脉冲的非常短暂的间隔和/或在热控制脉冲H脉冲中在较高温度下的短暂间隔的组合，这里提供对更高偏压和更高温度如何影响步进率的理解。再次使用T4-解旋酶作为DNA链上夹具的实例，对于无脉冲的条件，对于电压和温度参数，产生针对这些条件的实验结果。参照图12的图，在不存在ATP下，当具有结合的夹具的DNA聚合物被恒定的顺式到反式偏压通过纳米孔驱动时，随着横过纳米孔的偏压V驱动的增加，缩短聚合物的全长通过纳米孔步进所花费的中值持续时间。还参见图13，结果是，对于代表图12的图中数据的条件，使用T4解旋酶夹具，随着偏压V驱动的增加，每个单体步进之间的时间间隔的中值持续时间(此处称为中值步进持续时间)缩短。通过将图12中所示的完整分子易位的测量的持续时间除以已知构成易位的分子全长的单体数量，对于图12的数据，确定图13的图中的中值步进持续时间数据。
其他几个因素可影响中值步进持续时间或每个步进之间的时间间隔。例如，加入低浓度的ATP的不可水解的类似物5'-(β,γ-亚氨基)三磷酸(ADPNP)显著减少当如在图11的图所示的条件下，许多相同的聚合物通过纳米孔步进时完全横穿纳米孔的持续时间的范围。可影响中值步进持续时间的其他因素包括聚合物通过夹具的移动方向，例如3'至5'方向或5'至3'方向，以及夹具的氨基酸组成的变化，或夹具组件或其他结构之间形成二硫键。
再次参考图13，发现夹具的温度及其最接近的环境对中值步进持续时间有特别显著的影响，如图13的绘制数据所示。例如，使用T4噬菌体解旋酶作为夹具，虽然观察到将温度降低到室温以下可显著延长中值步进持续时间，但将温度从25℃升高到37℃将中值步进持续时间缩短三倍以上。发现增加的电压和增加的温度都不改变夹具沿观察的DNA聚合物的长度逐个单体步进的精度。
转向电压控制脉冲和热控制脉冲的实施方式，认识到纳米孔系统的特征、夹持部件以及该方法的电压脉冲和/或热脉冲的持续时间和幅度，应彼此以及与熟悉纳米孔感测和纳米孔测序方法的人员所知的其他纳米孔感测的常用特征协调进行选择。在一个实施方式中，用于实现产生确定性步进的控制脉冲的策略如下：
1)第一步，设定恒定的偏压驱动电压V驱动和纳米孔系统的所有其他条件，使得中值步进持续时间尽可能长，并且使得短持续时间步进的频率尽可能低。例如，通过将偏压驱动电压V驱动设定为约20mV至约140mV的电压，并将储器的溶液介质保持在约10℃至约15℃的温度，可实现这一点。认识到，尽管在偏压驱动电压V驱动等于或低于约120mV下可实现更长的中值步进持续时间，但是小于约120mV的偏压可能不能最佳地阻止持续时间的通过，在此期间连续的单体单元可能扩散到纳米孔的感测孔区域之外，如Lu等人，Biophys.J.，109：1439-1445，2015中所解释的，其通过引用整体并入本文。如以下所解释的，这种情况将减少纳米孔在聚合物的不同亚基之间区分的能力。结果是，在优选的实施方式中，偏压驱动电压V驱动为至少约120mV，并且在优选的实施方式中，偏压驱动电压V驱动为约120mV至约140mV。
2)在下一步中，设定电压控制脉冲V脉冲或热控制脉冲H脉冲或V脉冲和H脉冲的同时控制脉冲的频率，使得脉冲之间的持续时间显著小于仅施加偏压驱动电压V驱动在不存在脉冲下测得的最短持续时间步进的持续时间。认识到，尽管脉冲之间的持续时间优选显著小于在不存在脉冲下观察到的最短持续时间步进的持续时间，但是脉冲之间的持续时间优选足够长，使得纳米孔系统电子器件能够准确评价在每个脉冲之间流过纳米孔的离子电流。如果脉冲之间的持续时间比在不存在脉冲下观察到的最短持续时间步进的持续时间足够短，则将保证仅通过偏压就将驱动夹具随机步进的可能性将变得难以察觉地小。那么，因此，基本上每个夹具步进都是由于有意施加电压控制脉冲V脉冲和/或热控制脉冲H脉冲，并且保证聚合物通过纳米孔的步进运动是确定性的、受控的和可重复的。
换言之，为了确保靶聚合物以确定性步进状运动前进通过纳米孔，选择每个电压控制脉冲和/或热控制脉冲的持续时间以克服将夹具结合到聚合物的单体单元的法向力，达小于偏压驱动电压V驱动驱动聚合物通过纳米孔向前一个单体单元所花费的时间长度。
取决于待用纳米孔系统进行的所选的研究，取决于待研究的靶聚合物的细节，并且取决于夹持部件和合适的纳米孔的可用性，本文提供几个优选的实施方式。以下是两个实施方式，其说明纳米孔感测和纳米孔测序领域的技术人员如何能够选择本文提供的系统的合适特征，以及如何设定它们的参数以及纳米孔感测的其他常用特征的参数，使得它们相互协调工作。DNA将用于实施方式，但是可用可逆地结合到聚合物的合适的夹持部件类似地探测线性连接的(即连续的)单体残基的其他带电聚合物，例如RNA、蛋白质和上述分子。
在本文提供的各种实施方式中，单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)为靶聚合物分子。在任一个实施方式中，纳米孔配置有限制孔，靶聚合物的仅一条链将通过该孔，但是具有结合的夹持部件的该一条链不能通过。在容易获得的纳米孔中，对于许多实施方式，优选有机纳米孔(例如蛋白质)或无机固态纳米孔(例如膜中的孔)，在任何一种情况下，其通道孔直径均小于夹具的直径，但大于约1nm。
纳米孔系统的纳米孔、膜和支撑结构的生产、排列和配置可以采用任何合适的方式来实现，例如，如Moysey的美国专利号9617591中所描述的；如Golovchenko的美国专利号7468271中所描述的；如Lieber的美国专利号8698481中所描述的；如Garaj的US20120234679中所描述的；如Lieber的美国专利号9702849中所描述的；如Russo的US9611140中所描述的；如Golovchenko的美国专利号9815082中所描述的；并且如Xie的US20160231307中所描述的；通过引用将其全部内容结合到本文中。
具有用于沿靶聚合物长度计数单体的示例参数的实施方式
在该示例性实施方式中，指定由脂质双层形成的纳米孔膜。例如，可采用横跨支撑结构中的孔延伸的diPhPC脂质双层，其中支撑结构孔的直径为约10微米至约20微米。在此可使用合适的纳米孔，例如CsgG纳米孔。因为已知diPhPC脂质双层膜可在大于约300mV的恒定的或长持续时间偏压下破裂，所以此处相对低的偏压驱动电压(例如V驱动＝120mV)就足够作为恒定的偏压，以在电压控制脉冲期间和电压控制脉冲之间保持，即使该相对低的偏压不能最佳地减少每个连续单体单元在纳米孔最敏感的感测孔之外度过的时间长度，如上所解释的。
在所选的该驱动电压下，然后为确保靶聚合物以确定的步进状运动前进通过diPhPC中的CsgG纳米孔，选择每个电压控制脉冲和/或热控制脉冲的幅度和持续时间以克服将夹具与靶聚合物的单体单元结合的法向力达小于120mV的偏压驱动电压V驱动将聚合物通过纳米孔向前驱动一个单体单元所花费的时间长度。还选择每个电压控制脉冲和/或热控制脉冲的幅度和持续时间，以不破裂或以其他方式损坏膜。通常，对于大多数实施方式，因为电压控制脉冲不是恒定的，所以电压控制脉冲的幅度大于恒定的驱动电压的幅度。
相对脆的diPhPC膜可被大于约180mV的恒定的偏压破坏，但可忍受施加电压幅度高达约500mV的约1微秒的短持续时间脉冲。因此，在该实例中，指定在不存在ATP下，用于短暂克服将夹持部件结合到聚合物的单体单元的力的电压控制脉冲和/或热控制脉冲的持续时间小于约1微秒并且电压小于约500mV。
对于该实施方式，夹具可作为与DNA的单链结合的多种高度进行性DNA酶中的任一种实现。例如，易位酶(例如解旋酶或聚合酶)可用作夹持部件。在解旋酶中，与另外的dsDNA的未配对单链区结合的许多解旋酶是可用的，如von Hippel等人，Cell，104：177-190，2001所解释的那样，在此全文引入作为参考。
在本文的该实施方式和各种实施方式中，可优选仅采用一个夹具而不是几个夹具与DNA聚合物附着。结果是，与未配对的单链DNA区域结合的解旋酶是非常合适的夹具，因为分子生物学领域的技术人员理解如何通过例如暂时性地将大部分ssDNA转化为dsDNA来防止多种解旋酶与ssDNA样品结合。
SF1家族解旋酶，例如T4 Dda解旋酶，可为该实施方式和许多实施方式的优选的夹具选择，因为已经在高分辨率下研究了T4 Dda解旋酶沿ssDNA 5'至3'的易位模式，并且很明显，这些解旋酶与结合的DNA的约12-14个氨基酸接触的大多数是与DNA的糖-磷酸骨架接触，如Saikrishnan等人，Cell，137：849-859，2009中所解释的，其通过引用整体并入本文。因此，在本文中应理解，SF1家族解旋酶与其结合的DNA链中遇到的所有核碱基序列同样结合良好。
此外，在许多生物中发现该易位酶家族的成员，并且在不存在ATP下使结合的解旋酶沿DNA滑动所需的力可能显著变化，取决于从中纯化SF1家族解旋酶的生物。例如，与DNA的结合不能通过小于约180mV的恒定偏压克服，但与DNA链的结合可以通过大于约200mV的电压脉冲(任选与热脉冲协调，二者持续小于约500μs的持续时间)克服的夹具可能是优选的。
为了共同或代替电压控制脉冲而施加热控制脉冲，在许多实施方式中可使用以至少约300mW的束能量操作的532nm波长的激光器。如以上所解释的，该激光器使直接围绕夹具的小于约10幺升体积的离子溶液的温度升高，该夹具已结合一种或多种金、银或其他光吸收纳米颗粒。在该实施方式中，介质的恒定背景温度优选保持在约15℃的偏差温度，然后通过经发射以与电压控制脉冲时间一致的激光升高到约50℃。
电压控制脉冲和/或热控制脉冲之间的持续时间大于在期望的精度水平下单体识别所需的最短时间，但小于为在偏压V驱动条件下夹具滑动一个单体单元的特征的最短时间。滑动的该最短测量的时间随选择的特定解旋酶而变。例如，在不存在ATP下，并且使用优选的T4 Dda解旋酶作为夹具，发现当V驱动＝120mV时，步进之间小于1秒的持续时间非常罕见。因此，电压控制脉冲之间的间隔可设定为等于或小于100毫秒，该条件可容易地实现。这样避免了由于驱动电压而导致的未检测到的滑动，从而确保为了驱动靶DNA聚合物的全长通过纳米孔而施加的脉冲计数将等于聚合物长度中的单体亚基(即核碱基)的数量。
具有用于沿靶聚合物长度确定化学和单体序列的示例参数的实施方式在另一实施方式中，选择纳米孔系统、夹具和控制脉冲，以能够确定靶聚合物的化学性质以及单体亚基沿靶聚合物的序列。如上所述，该实施方式考虑其核碱基是聚合物的单体亚基的靶聚合物分子DNA。因为这里要求有关单体亚基的更详细的信息，所以需要比现有实施方式更大的偏压来驱动聚合物通过纳米孔，使布朗运动的影响最小化，布朗运动否则将劣化详细信息。结果是，作为该实施方式的主题的某些参数和纳米孔感测的其他常用特征的那些参数与先前实施方式中的不同。
由于该实施方式需要大于先前实施方式的偏压驱动电压V驱动，并且因此由于V驱动+V脉冲的组合电压的幅度相应地大于先前实施方式的幅度，因此这里优选比先前实施方式中使用的较不易碎、更坚固的膜。合适的膜包括固态膜，例如石墨烯膜、氮化硅膜或其他合适的固态膜，或两亲三嵌段共聚物膜，如Zhao等人，Science，279：548-552，1998所描述的，其通过引用整体并入本文，例如聚(二甲基硅氧烷)-嵌段-聚(2-甲基噁唑啉)-聚(二甲基硅氧烷)或霉菌酸膜，如Langford等人，J.Lipid Res.，52：272-277，2011所描述的，其通过引用整体并入本文，与diPhPC脂质双层相比，所有这些都可形成更坚固的离子不可渗透的膜。
横过支撑结构中的相对小的孔(例如，小于20微米直径的支撑结构孔)延伸的膜也是优选的，因为它比横过更传统的10微米直径至50微米直径的支撑结构孔形成的膜更坚固。所选直径(例如大于1nm直径，或不超过约2nm直径)的纳米孔可直接刺穿膜，例如石墨烯膜，或者生物纳米孔，例如CsgG孔蛋白的突变体可为在膜中提供的优选的蛋白质纳米孔。与α-溶血素相比，这些中的任一个可更容易地在DNA核碱基之间区分，如Howorka在US20180148481中所描述的，在此以其全文引为参考。
这里可优选约140mV至约250mV的偏压驱动电压V驱动，以通过使布朗运动最小化并且通过使每个连续单体单元在纳米孔的最敏感、狭窄的孔、高电阻区域之外花费的时间长度最小化，来使有助于每个离子电流测量的单体的数量最小化。对于约120mV的示例性驱动电压，参考图14A至图14C可理解该条件。通过横过纳米孔20施加的120mV驱动电压38，使得一个单体单元42在纳米孔的高度敏感的位点44处布置，布朗运动可将单体单元飞快地驱离高度敏感的位点，如图14B所示。通过施加例如大于125mV的较大的偏压驱动电压，如图14C所示，亚基42更快速地返回到高度敏感的位点，从而改善单体识别。因此，可优选采用大于约120mV的相对高的偏压驱动电压，或者采用抵消布朗运动的可变电压。
在该实施方式中，为了施加热脉冲，例如，可采用以至少约300mW的束能量操作的532nm波长的激光器，以升高直接围绕夹具的小于约10幺升体积的离子溶液的温度，其中金纳米颗粒以上述方式与夹具或纳米孔结合。通过激光将优选保持在约10℃的溶液的恒定背景温度升高到约50℃，并采用上述方式控制与电压控制脉冲一致。
在这里横过小于约10微米的支撑结构孔直径选择相对坚固的膜时，大于约500mV的恒定的偏压能够使膜破裂，但是可以耐受脉冲持续时间最多为约1微秒至约3微秒并且幅度小于约900mV的电压控制脉冲。因此，在不存在ATP下，用于短暂克服将夹持部件结合到聚合物单体单元的力的电压控制脉冲在此优选持续时间短于约3微秒，并且电压幅度小于约900mV。
在本文的实施方式中可优选SF1家族解旋酶，因为在许多生物中发现该易位酶家族的成员，并且在不存在ATP下沿DNA滑动结合的解旋酶所需的力将显著变化，这取决于从中纯化SF1家族解旋酶的生物。对于该实例，与DNA链的结合可通过小于约500ns的控制脉冲持续时间和小于约900mV的幅度克服，但是与DNA的结合不能通过小于约500mV的偏压驱动电压克服的夹具可能是优选的。
如在先前的实施方式中一样，在此选择控制脉冲之间的持续时间大于在期望的精度水平上单体识别所需的最短时间，但小于已知为仅在偏压驱动电压的条件下滑动夹具的特征的最短时间。滑动的该最短测量的时间将根据所选择的特定解旋酶而变化。在不存在ATP下并使用优选的SF1家族解旋酶作为夹具，滑动之间的平均持续时间大于约100ms，并且呈指数下降，使得在仅V驱动＝300mV的偏压驱动电压的条件下从一个核碱基滑动到下一个核碱基以约15ms的跨度非常罕见地发生。因此，将电压控制脉冲之间的间隔设定为在例如约5毫秒至约10毫秒的易于实施的持续时间内发生，使随机滑动最小化并提供确定性步进，以确保检测到DNA序列中的每个连续核碱基并通过其在纳米孔处的电流信号而识别。
实验实施例
如图2所示，在二植烷酰基磷脂酰胆碱膜中提供MspA纳米孔，并在纳米孔系统中排列。将具有Dda解旋酶夹具的DNA装入系统的顺式储器中的1M KCl、25mM磷酸盐缓冲液、2mMADPNP、2mM MgCl2、pH 8.0的离子溶液中。将溶液保持在37℃。横过纳米孔的偏压驱动电压为160mV。使用图5的电压脉冲控制系统和图3的控制方法施加电压控制脉冲。在第一个实验中，电压控制脉冲的持续时间为500微秒，在第二个实验中，电压控制脉冲的持续时间为1毫秒。在两个实验中，电压控制脉冲的幅度为300mV。测量纳米孔电流并在2kHz下过滤。
图15A和图15B是在施加电压控制脉冲时随时间变化测量的纳米孔电流的图，并且分别显示对于500微秒持续时间的电压控制脉冲和1毫秒电压控制脉冲，横过纳米孔施加的电压随时间的变化。测得的纳米孔离子电流显示为上线，轴在图的左侧，而施加的电压脉冲显示为下线，其轴标记在图的右侧。如两个数据图所示，通过纳米孔的离子电流的测量的变化与施加的电压控制脉冲V脉冲在时间上一致。这指示响应一个单施加的电压控制脉冲V脉冲，解旋酶夹具沿DNA链长度步进一个单体。图15B中的图的施加的脉冲中显示的电容性电流尖峰过冲是在1毫秒的相对长持续时间的电压控制脉冲期间电子设备补偿不足的结果。
通过该描述、本文提供的实施方式和实验实施例证明，使用本文所提供的纳米孔系统、夹具控制和方法，实现靶聚合物分子通过纳米孔易位的确定性步进而不是随机步进，并能够用纳米孔表征靶聚合物的线性连接的、连续的聚合物亚基。从而使得迄今为止难以进行的精确靶聚合物评价成为可能。
应当理解，尽管在此已经详细描述了优选的实施方式，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神的情况下，可进行各种修改、增加、替换等，并且因此这些被认为在所附权利要求书所限定的本发明的范围内。

Claims (20)

1.一种用于表征靶聚合物分子的纳米孔系统，所述靶聚合物分子选自核酸聚合物分子和蛋白质聚合物分子，且包括沿靶聚合物分子长度的连续的多个聚合物亚基，所述系统包含：
第一流体储器和第二流体储器，所述第一流体储器和第二流体储器各自与纳米孔流体连通，所述纳米孔在所述第一流体储器和所述第二流体储器之间形成流体路径；
酶夹具，所述夹具在所述第一流体储器中提供，所述夹具紧靠所述纳米孔并且可逆地结合到所述第一流体储器中的离子溶液中的靶聚合物分子的连续的多个聚合物亚基，所述夹具具有大于所述纳米孔的直径的夹具外径；
电路，所述电路包含在所述第一流体储器中的电极、在所述第二流体储器中的电极以及电流放大器，所述电流放大器用于在所述第一流体储器和所述第二流体储器之间横跨所述纳米孔施加偏压，以诱导所述靶聚合物分子行进到所述纳米孔中；
脉冲发生器，所述脉冲发生器与所述电路连接，以在所述第一流体储器和所述第二流体储器之间横跨所述纳米孔施加控制脉冲，以在远离所述纳米孔的方向上使所述夹具沿所述靶聚合物分子的连续的聚合物亚基逐个聚合物亚基步进，并将所述聚合物分子进一步步进到所述纳米孔中，所述系统不包括用于所述夹具的燃料并且不包括用于所述夹具的燃料源；以及
计算机控制器，所述计算机控制器与所述电路连接，以在所述靶聚合物分子的连续的多个聚合物亚基通过所述纳米孔步进的同时，收集通过纳米孔的离子电流的电指示。
2.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述酶夹具包含解旋酶。
3.根据权利要求2所述的纳米孔系统，其中所述酶夹具包含SF1家族解旋酶。
4.根据权利要求3所述的纳米孔系统，其中所述酶夹具包含T4 Dda解旋酶。
5.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述酶夹具包含聚合酶。
6.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述纳米孔包含布置在膜中的生物纳米孔，所述膜选自三嵌段共聚物膜、霉菌酸膜、脂质双层膜和四醚脂质膜。
7.根据权利要求6所述的纳米孔系统，其中所述膜包含二植烷酰基磷脂酰胆碱(diPhPC)膜。
8.根据权利要求6所述的纳米孔系统，其中所述纳米孔包含生物纳米孔，所述生物纳米孔选自CsgG细菌孔蛋白纳米孔和耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)孔蛋白A(MspA)纳米孔。
9.根据权利要求6所述的纳米孔系统，其中所述生物纳米孔为蛋白通道。
10.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述纳米孔的直径为约1nm至约2nm。
11.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述电流放大器与所述电路连接，以在所述靶聚合物分子的聚合物亚基通过所述纳米孔步进的同时，产生所述靶聚合物分子的聚合物亚基的模拟电指示。
12.根据权利要求11所述的纳米孔系统，所述系统进一步包括在所述电路中与所述电流放大器连接的模数转换器，以将所述靶聚合物分子的聚合物亚基的模拟电指示数字化。
13.根据权利要求12所述的纳米孔系统，其中所述计算机控制器在电路中与所述模数转换器连接，以控制所述靶聚合物分子的聚合物亚基的数字指示的记录。
14.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述靶聚合物分子为双链核酸聚合物分子，所述双链核酸聚合物分子具有沿着所述核酸聚合物分子长度的单链区域，并且其中所述酶夹具可逆地结合到沿着所述核酸聚合物分子长度的单链区域的位点上的连续的多个聚合物亚基上。
15.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述靶聚合物分子为单链核酸聚合物分子。
16.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述靶聚合物分子为选自DNA、RNA和PNA的聚合物分子。
17.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述纳米孔包括在原子薄固态材料中的通道。
18.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述酶夹具可逆地结合的连续的多个聚合物亚基包括1至20个聚合物亚基。
19.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述离子溶液包括ADPNP。
20.根据权利要求1所述的纳米孔系统，其中所述离子溶液包括缓冲液。
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