KR100448880B1

KR100448880B1 - 단백질칩 기판 및 플라즈마를 이용한 단백질칩 기판의제조방법

Info

Publication number: KR100448880B1
Application number: KR20010060556A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 정동근; 박헌용; 김진모
Original assignee: 김성훈; 정동근
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2001-09-28
Publication date: 2004-09-18
Also published as: KR20030027379A

Abstract

본 발명은 단백질칩 기판 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 플라즈마를 이용하여 기판상에 활성기를 집적시키는 것을 특징으로 한 단백질칩 기판의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 단백질칩 기판, 그리고 상기 단백질칩 기판을 이용하여 제조된 단백질칩에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질칩 기판의 제조방법은 단백질을 고정화시키는 활성기를 대면적 기판의 표면에 고밀도로 균일하게 집적시킬 수 있고, 활성기 형성 시간이 짧아 대량생산에 유리하다는 장점을 가지고 있다. 또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 단백질칩 기판 및 단백질칩은 단백질 고정화 능력이 우수하다는 장점을 가지고 있어, 소량의 시료만으로도 항원 등 다양한 물질의 정성 분석 또는 정량 분석을 대량으로 빠르게 수행할 수 있으며, 다양한 질환에 대한 진단 및 특정 집단의 질환 프로파일 구축 등에 이용될 수 있다.

Description

단백질칩 기판 및 플라즈마를 이용한 단백질칩 기판의 제조방법{Protein chip plate and manufacturing method of the same plate using plasma}

본 발명은 단백질칩 기판 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 플라즈마를 이용하여 기판상에 활성기를 집적시키는 것을 특징으로 한 단백질칩 기판의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 단백질칩 기판, 그리고 상기 단백질칩 기판을 이용하여 제조된 단백질칩에 관한 것이다.

최근 인간 유전체의 구조가 거의 대부분 밝혀지면서 인체를 구성하는 기능연구에 대한 관심이 급증하고 있다. 이와 같이, 유전자의 기능을 규명하는 총체적인 연구분야를 기능 제노믹스(Functional Genomics)라 정의하며, 이는 유전자를 실험재료로 사용하여 연구하는 제노믹스(genomics), 세포 내의 총체적인 단백질군을 대상으로 연구하여 유전자의 기능을 규명하는 프로테오믹스(proteomics), 그리고 이 두 분야를 공통적으로 원하는 바이오인포매틱스(bioinformatics)로 구분되어 진다. 최근까지만 하더라도 유전자나 세포의 기능연구에 대한 분자생물학적인 접근은 대부분 단일 유전자나 그 유전자가 발현하는 mRNA의 발현 조절을 중심으로 이루어졌으나, 요즘에는 단백질체를 중심으로 바뀌고 있는 추세이다.

상기 단백질체 연구에 필수적으로 이용될 수 있는 핵심기술이 단백질칩(protein chip)이다(Gavin MacBeath and Stuart L. Schreiber,Science, 289:1760~1763, 2000). 단백질칩은 수십 내지 수천 개의 단백질을 작은 기판상에 고정해 동시다발적으로 단백질의 결합을 분석하는 자동화 기기 시스템이다. 이는 수십 내지 수천 개의 유전자를 기판상에 고정화시켜 동시다발적으로 유전자의 변화를 유전자간의 상보적 결합을 통하여 정량분석함으로써 유전자 발현이나 돌연변이를 검색하는 마이크로 어레이 DNA칩(microarray DNA chip)과 비슷하다(Yasuda, H., Lamage, C. E.,J. Appl. Polym. Sci.17: 201, 1973; Muguruma, H., Karube, I.,Trends Anal. Chem.18: 62, 1999; Nalanishi, K., Muguruma, H., Karube, I.,Anal. Chem.68: 1695, 1996; Miyachi, H., Hiratsuka, A., Ikebukuro, K., Yano, K., Muguruma, H., Karube, I.,Biotechnol. Bioengin.69: 323, 2000) . 그러나, 단백질칩은 상기 DNA칩으로는 알아내지 못하는 다음과 같은 부분을 분석할 수 있다.

첫째, 단백질-단백질간의 상호작용에 관한 정보를 얻을 수 있다. 세포 내 신호전달이나 조절은 단백질-단백질간의 상호작용의 형태로 나타나는데, 이를 단백질칩을 통하여서 분석할 수 있다.

둘째, 인간을 포함한 고등생물체로부터 효모에 이르기까지 단백질은 유전자와는 관계없이 번역 후 변형(post-translational modification)이 일어나는데, 인산화(phosphorylation), 산화(oxidation) 등과 같은 이차적인 수식에 관한 정보를 얻을 수 있다.

셋째, mRNA 생성 후 발생하는 문제점을 검출할 수 있다. 많은 질병이 전사(transcription) 후 조절이나 단백질의 생성, 그리고 단백질의 위치(localization)와 같은 문제점으로부터 야기되는데, mRNA를 검출하는 DNA칩으로는 이런 정보를 얻기가 힘들다.

넷째, mRNA가 단백질로 발현시 둘 사이의 정량적인 상관 관계가 그리 높지 않을 수 있기 때문에, 경우에 따라 단백질에 관한 정확한 정보를 제공할 수 없다는 DNA칩의 한계를 단백질칩을 통하여 극복할 수 있다.

다섯째, DNA칩으로 규명되는 유전자의 염기서열의 차이가 직접적인 질병을 의미하거나, 표현형의 차이를 나타내지 않는다. 더욱이 비슷한 특성을 가진 아미노산으로의 돌연변이는 대개 단백질의 고유특성을 유지하기 때문에, 질병이나 표현형의 차이를 유발하지 않는다. 그러나, 단백질칩을 이용하면 직접적인 질병 및 표현형의 차이를 나타내는 단백질을 규명할 수 있다.

단백질칩을 이용하면 단백질-단백질간의 상호관계에 관한 데이터 생성이 가능하며, 신약 개발시 시간 및 비용의 절감효과를 가져올 수 있는데, 한 예로 현재의 유전자를 이용한 치료약 개발보다 걸리는 시간을 비약적으로 단축시킬 수 있다. 또한, 단백질칩은 산업적 수요 뿐 아니라, 질환 진단, 환경 모니터링, 유해성 검진 등 잠재수요도 대단히 크다. 이러한 장점들로 인해 DNA칩보다 더 큰 시장을 형성할 것이라 예상되고 있어 단백질칩에 대한 개발이 절실히 요구되고 있다.

단백질칩의 구성을 살펴보면, 단백질칩은 크게 센서칩(Sensor chip)과 단백질 결합 분석 장치(Detection system)로 구성된다. 이 중 센서칩이 단백질칩의 핵심부분으로, 단백질칩의 발전속도를 결정하고 있는 주요 요인이 되고 있는 부분이다. 상기 센서칩은 수십 내지 수백 개의 단백질이 작은 표면에 일정한 배열로 결합된 것인데, 대부분 슬라이드 크기의 유리나 플라스틱을 이용한다.

상기 센서칩에 있어서, 그 핵심기술은 단백질을 칩의 표면에 결합시키는 단백질 고정화 기술이다. 단백질 고정화 기술은 특성에 따라 다음과 같이 세 가지로 나뉘어 진다. 첫 번째는 카르복시메틸-덱스트란(CM(carboxymethyl)-dextran)을 이용하여 특정 단백질을 센서칩의 표면에 고정하는 방법으로, 가장 널리 이용되고 있는 방법이다. 그 중 아민(amine)결합이 가장 보편적으로 이용되며, 산성을 띠는 단백질이나 DNA 등을 결합시키기 위한 티올(thiol)결합이나,아비딘-바이오틴(avidin-biotin)결합이 이용되기도 한다. 두 번째는 다수의 동일 특성을 띠는 단백질군을 결합할 수 있도록 센서칩의 표면을 처리하는 방법이다. 세 번째는 불특정 다수의 단백질을 결합시키는 방법으로, 폴리라이신(polylysine)이나 calix crown(칼릭스 크라운)을 예로 들 수 있다.

그러나, 상기 센서칩의 핵심기술인 단백질을 기판에 고정화시키는데 있어, 비특정 표면 고정화(nonspecific surface immobilization), 고체 표면에의 고정화에 따른 단백질의 생물학적 활성의 상실, 상대적으로 낮은 활성물질의 표면 농도, 표면이탈에 따른 분석신호의 소멸 등의 기술적 어려움이 있는 바, 그 해결이 시급한 실정이다.

한편, 플라즈마(plasma)란 전기적으로 중성인 기체분자가 전기에너지 또는 열에너지를 흡수하여 이온과 전자로 분리되어 있는 상태를 말한다. 현재 플라즈마를 이용하는 기술에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 반도체 공정에서 플라즈마 식각(plasma etching) 및 화학기상증착(PECVD: plasma enhanced chemical vapor deposition), 금속이나 고분자의 표면처리, 인조 다이아몬드 등의 신물질의 합성, 플라즈마디스플레이(PDP: plasma display panel) 및 환경정화 기술 등 그 응용분야가 점점 더 확대되고 있다.

본 발명자는 단백질칩에 단백질을 효율적으로 고정화시키기 위한 연구를 수행하던 중, 플라즈마를 이용하여 단백질 고정화를 효율적으로 시킬 수 있는 단백질칩 기판을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 단백질 고정화를 효율적으로 시킬 수 있는 단백질칩 기판의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 단백질칩 기판의 제조방법으로 제조된 단백질칩 기판을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 단백질칩 기판을 이용하여 제조된 단백질칩을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 단백질칩 기판을 제조하기 위한 플라즈마 화학기상증착 장치의 모식도를 개략적으로 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명에 따른 플라즈마 화학기상증착 장치에서 플라즈마를 생성하기 위한 외부전극에 가하는 전력(A: 3W, B: 30W, C: 70W), 크로스링커인 EDC의 농도 및 세척용액에 따른 단백질 고정화 능력을 조사한 것으로서, 기판에 고정된 항체의 FITC 형광을 측정한 결과이다.

도 3은 크로스링커인 EDC의 반응시간에 따른 단백질 고정화 능력을 조사한 것으로서, 기판에 고정된 항체의 FITC 형광을 측정한 결과이다.

도 4는 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 고정되는 FITC-결합 항체의 농도(A) 및 반응시간(B)에 따른 단백질 고정화 능력을 조사한 것으로서, 기판에 고정된 항체의 FITC 형광을 측정한 결과이다.

도 5는 본 발명의 PPEDA 박막 유리판(A)과 상업화되어 있는 아민기 노출 박막 유리판(Cel associate 사, USA)(B)의 단백질 고정화 능력을 동일한 조건에서 비교한 결과를 나타내는 것이다.

도 6은 2차 항체로 FITC-결합 항 마우스 항체를 사용하여 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 고정화된 단백질의 결합특이성을 보여주는 결과를 나타내는 것이다.

A: 항 pIkappaB 항체(토끼)

B: 항 JNK 항체(토끼)

C: 항 p18 항체(마우스)

D: 대조구

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1... 플라즈마 반응 챔버 2... 외부전극

3... 기판 4... 내부전극

5... 히터 6... 전력공급장치

7... 진공수단 8... 가스 주입 수단

9... 거품기

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 플라즈마를 이용하여 기판상에 활성기를 집적시키는 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 단백질칩 기판을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 단백질칩 기판을 이용하여 제조된 단백질칩을 제공한다.

본 명세서에 있어서, "활성기"란 단백질칩 기판상에 부착되어 크로스링커(crosslinker)에 의해 단백질을 고정화시키는 화학적 작용기를 의미하는 것으로서, 아민기, 알데하이드기, 카르복실기 및 티올기로 이루어진 그룹에서 선택되어진 것을 의미한다. 또한, "플라즈마-중합 에틸렌디아민(plasma-polymerizedethylenediamine; PPEDA) 박막 유리판"이란 본 발명의 제조방법에 따라 제조된, 플라즈마에 의해 중합된 에틸렌디아민 박막이 유리판에 증착되어 1차 아민기(primary amine)가 고밀도로 집적 및 노출된 단백질칩 기판을 의미한다.

이하 본 발명에 따른 단백질칩 기판의 제조방법을 상세히 설명한다.

종래기술에서 살펴본 바와 같이, 단백질칩 제조에 있어서 가장 중요한 기술은 단백질을 단백질칩에, 보다 구체적으로 단백질칩 기판상에 고정화시키는 기술이다. 일반적으로 기판상의 활성기와 단백질을 연결접합시키는 크로스링커(crosslinker; 또는 '분자링커'라고도 한다)를 이용하여 단백질을 기판상에 고정화시키는 기술이 사용되는데, 그 원리를 살펴보면 다음과 같다. 크로스링커의 한쪽 말단은 단백질칩 기판의 활성기와 특이적으로 결합하고, 다른 쪽 말단은 단백질과 특이적으로 결합하여 단백질을 단백질칩 기판상에 고정화시킨다. 이 때 활성기가 기판상에 잘 부착되어 있지 않거나, 그 양이 적을 경우 단백질의 고정화 능력이 떨어지게 된다. 단백질의 고정화는 기판에 부착된 활성기의 양과 부착력에 의존하므로, 활성기를 기판상에 부착시키는 것이 가장 중요한 관건이다. 따라서, 본 발명은 단백질 고정화를 효율적으로 시킬 수 있는 단백질칩 기판, 보다 구체적으로 플라즈마를 이용하여 기판상에 활성기를 집적시키는 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법을 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에 따른 단백질칩 기판의 제조방법에 있어서, 기판상의 활성기 집적은 플라즈마 화학기상증착(PECVD; plasma enhanced chemical vapor deposition) 방법을 이용하는 것이 보다 바람직하다. 도 1은 본 발명에 따른 단백질칩 기판을 제조하기 위한 플라즈마 화학기상증착 장치의 모식도를 개략적으로 나타낸 것으로서, 그 구성을 살펴보면, 상기 플라즈마 반응 챔버(1)와, 상기 플라즈마 반응 챔버 내부의 압력을 조절하기 위한 진공수단(7)과, 전구체를 기체상태로 상기 플라즈마 반응 챔버내로 주입하기 위한, 거품기(bubbler)(9)를 포함하는 가스 주입 수단(8)과, 상기 플라즈마 반응 챔버(1) 상부에 배치된 외부전극(2)과, 상기 외부전극(2) 및 상기 플라즈마 반응 챔버(1) 내부에 배치된 내부전극(4)에 전압을 인가하기 위한 전력공급장치(6)로 이루어져 있다. 이러한 구성에 더하여 플라즈마 반응 챔버 내부의 온도를 조절하는 냉각장치(미도시)와 챔버 내부의 대류를 용이하게 하는 팬(미도시)이 설치될 수 있다. 상기 플라즈마 반응 챔버(1)는 그 내부에 기판(3)과, 상기 기판(3) 하부에 배치되어 상기 기판(3)을 지지하는 내부전극(4)과, 상기 내부전극(4)의 하부에 배치되는 히터(5)가 순차적으로 장착되어 있다.

본 발명의 단백질칩 기판을 제조하기 위한, 플라즈마 화학기상증착 장치의 보다 구체적인 작용은 다음과 같다. 먼저, 기판(3)을 상기 플라즈마 반응 챔버(1) 내부에 있는 상기 내부전극(4) 위에 설치한다. 이후, 상기 진공수단(7)을 통해 상기 플라즈마 반응 챔버(1) 내부의 압력을 진공상태에 가까운 수 mtorr로 낮춘 상태에서 상기 가스 주입 수단(8)을 통해 활성기를 포함하는 전구체를 운송가스와 함께 상기 플라즈마 반응 챔버(1) 내로 주입하고, 상기 내부전극(4)의 하부에 배치되는 히터(5)를 통해 상기 플라즈마 반응 챔버 내부의 온도를 상승시킨다. 이러한 상태에서 상기 전력공급장치(6)로 상기 외부전극(2) 및 상기 내부전극(4)에 전압을 인가하면, 상기 외부전극(2) 및 상기 내부전극(4)에 의해 생성된 플라즈마들이 상기 기판(3)과 상기 플라즈마 반응 챔버(1) 사이에 형성된다. 이 때, 생성된 상기 플라즈마에 의해 상기 활성기를 포함하는 전구체가 중합되면서 활성기를 포함하는 박막이 기판(3)상에 균일하게 증착된다. 본 발명의 단백질칩 기판 제조방법에 있어서, 상기 외부전극(2) 또는 내부전극(4) 중 하나만을 단독으로 사용할 수도 있으나, 둘 다 사용하는 것이 활성기 부착율에 있어서 보다 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 활성기로는 아민기, 알데하이드기, 카르복실기 또는 티올기를 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 아민기를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아민기는 에틸렌디아민(ethylenediamine), 아세토니트릴(acetonitrile), 알릴아민(allylamine) 또는 프로필아민(propylamine) 전구체로부터 유래되는 것을 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 에틸렌디아민으로부터 유래되는 것이 바람직하다. 상기 외부전극 및 상기 내부전극은 일반적인 플라즈마 화학기상 장치에서 사용되는 전극이면 재질 및 형태에 특별한 제한없이 사용될 수 있으나, 특히 외부전극의 경우 그 형태가 평판원형코일형태인 것이 바람직하고, 내부전극의 경우 그 재질이 화학적 반응이 없고, 오염이 적은 재질을 사용하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 스테인레스 재질로 이루어진 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 기판으로는 유리판, 플라스틱, 금속 및 실리콘으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 이용하는 것이 바람직하나, 보다 바람직하게는 유리판을 사용하는 것이 바람직하다. 나아가, 전구체를 플라즈마 반응 챔버내로 주입하기 전에, 전구체를 증기화(vaporization)하는 것이 바람직하다. 이때, 증기화는 거품기를 이용하여 전구체를 가열함으로써 전구체를 증발시켜 기상화하는 방법을 사용하는 것이 바람직하고, 증기화 온도는 50 내지 116℃인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 단백질칩 기판의 제조 방법에 있어서, 상기 전구체는 운송가스를 이용하여 플라즈마 반응 챔버내로 주입하는 것이 바람직하며, 이 때 이용될 수 있는 운송가스로는 아르곤(Ar), 질소(N₂), 헬륨(He) 및 수소(H₂) 등이 이용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 아르곤(Ar)을 사용하는 것이 바람직하다. 플라즈마 반응 챔버 내부로의 반응가스의 유량(mass flow rate)은 10 내지 50sccm이 바람직하나, 보다 바람직하게는 30sccm이 바람직하다. 또한, 플라즈마 반응 챔버의 전력공급장치의 전력으로서 외부전극에 가하는 전력은 3W, 30W 또는 70W가 바람직하나, 보다 바람직하게는 3W가 바람직하고, 내부전극에 가하는 전력은 3W 내지 20W가 바람직하나, 보다 바람직하게는 3W가 바람직하다. 상기 플라즈마 반응 챔버의 기판의 온도는 20 내지 30℃가 바람직하나 보다 바람직하게는 27℃가 바람직하다. 나아가, 상기 플라즈마 반응 챔버 내부의 압력은 10 내지 300mtorr가 바람직하나, 보다 바람직하게는 30mtorr가 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에서는 에틸렌디아민을 증기화하여 플라즈마 화학기상증착 장치의 플라즈마 반응 챔버에 이동시킨 후 플라즈마 반응 챔버에서 만들어진 플라즈마에 의해 중합된 에틸렌디아민 박막을 유리판 위에 증착시켜 1차 아민기가 고밀도로 노출된 단백질칩 기판을 제조하였으며, 상기 제조된 단백질칩 기판을 플라즈마-중합 에틸렌디아민 박막 유리판(이하 'PPEDA 박막 유리판'이라 한다)이라 명명하였다. 이후, 본 발명에 따른 PPEDA 박막 유리판을 이용한 단백질 고정화의 최적조건을 살펴본 결과, 단백질 고정화의 최적 조건은 크로스링커인 EDC 1㎎/㎖를 5분간 PPEDA 박막 유리판에 반응시킨 다음, 인산염 완충용액(PBS buffer)으로 3회 세척 후, 0.1㎎/㎖의 항체를 10분간 반응시킨 후 상기 인산염 완충용액으로 3회 세척하는 것임을 확인하였다(도 2 내지 도 4 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따라 제조된 PPEDA 박막 유리판에 노출된 1차 아민기 및 고정화시킬 단백질의 카르복실기(carboxyl group)와 결합할 수 있는 크로스링커를 이용하여 상기 1차 아민기가 노출된 PPEDA 박막 유리판에 단백질을 특이적으로 고정화시켰다. 이후, 본 발명의 PPEDA 박막 유리판과 상업화되어 있는 아민기 노출 유리판(Cel associate 사, USA)의 단백질 고정화 능력을 비교한 결과, 본 발명에 따른 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력이 우수함을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 고정화되어 있는 단백질이 그 활성(결합특이성)을 유지하는지 조사한 결과, 특이적 결합력을 잃지 않고 그 활성을 유지하고 있음을 확인하였다(도 6 참조). 이는 단백질칩 제조시 칩에 고정화된 단백질의 활성유지가 핵심인 점을 고려할 때에, 본 발명의 방법으로 제조된 단백질칩 기판이 단백질칩으로서 유용성이 있음을 나타내는 결과이다. 또한, 본 발명의 제조방법에 따른 단백질칩 기판은 플라즈마를 이용하여 대면적 기판에 짧은 시간에 균일한 활성기의 집적이 가능하므로 대량생산의 이점이 있어서 상업화가 가능하다.

한편, 본 발명에서 사용될 수 있는 크로스링커로는 단백질칩 기판에 부착된 활성기 및 기판에 고정화시키고자 하는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 작용기를 갖고 있는 크로스링커라면 제한없이 이용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochlrode(EDC) 또는 1,4-phenylene diisothiocyanate(PDC)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 단백질칩 기판에 고정화될 수 있는 단백질로는 바이러스, 세균, 진균을 포함하는 단세포, 동물 및 식물로부터 유래하는 항원 단백질을 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

단백질칩 기판의 제조

활성기를 가진 전구체로서 에틸렌디아민(Sigma-Aldrich, USA)을 이용하여 도 1에 도시된 바와 같은 구조의 플라즈마 화학기상증착 장치(Korea Vacuum Tech (주))에서 1차 아민기가 고밀도로 노출된 단백질칩 기판을 제조하였으며, 이를 플라즈마-중합 에틸렌디아민박막 유리판(이하, "PPEDA 박막 유리판"이라 한다)이라 명명하였다. 이 때, 기판으로는 크기 75mm ×25mm의 유리판(Corning, USA)을 사용하였다. 먼저, 플라즈마 반응 챔버에 상기 유리판을 설치하였다. 250㎖의 에틸렌디아민은 거품기(Korea Vacuum Tech (주))를 이용하여 50℃에서 증기화시켰다. 이후, 진공수단을 이용하여 상기 플라즈마 반응 챔버 내부의 압력을 30mtorr로 낮춘 상태에서, 상기 증기화된 에틸렌디아민을 아르곤 가스를 이용하여 가스 주입 수단을 통해 상기 플라즈마 반응 챔버내로 주입하였다. 그리고 나서, 히터를 이용하여 플라즈마 반응 챔버 내부 유리판의 온도를 27℃로 하였다. 이러한 상태에서 플라즈마 반응 챔버 내부의 외부전극과 내부전극에 전압을 인가하여 플라즈마-중합 에틸렌디아민이 부착된 단백질칩 기판, 즉 PPEDA 박막 유리판을 제조하였다. 이 때, 전력에 따른 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력을 알아보기 위해, 상기에서 내부전극에 가하는 전력은 3W로 고정시키고 외부전극에 가하는 전력을 3W, 30W 및 70W로 다르게 하여 PPEDA 박막 유리판을 각각 제조하였다.

<실시예 2>

PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력 확인

2-1) 플라즈마 반응 챔버의 전력, 크로스링커인 EDC의 농도 및 세척용액에 따른 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력 확인

상기 실시예 1에서 전력을 달리하여 제조된 각 PPEDA 박막 유리판 위에 고무로 만들어진 자체 제작한 7 ×3 원형 격자를 올려놓고 밀착시켰다. 그리고 나서, 상기 각 PPEDA 박막 유리판에 노출된 아민기와 결합할 수 있는 크로스링커인 EDC의 농도에 따른 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력을 알아보기 위해, 격자의 원형구멍에 각각 0. 0.1, 0.2, 0.5 및 1㎎/㎖ EDC(Pierce Co., USA) 용액 10㎕를 첨가하여 5분 동안 실온에서 반응시켰다. 이후, 세척용액으로 각각 5분간 3회 세척하였다. 이 때, 세척용액에 따른 단백질 고정화 능력을 알아보기 위해, 세척용액을 인산염 완충용액(PBS buffer) 및 메탄올(MeOH)로 다르게하여 세척하였다. 그리고 나서, 상기 PPEDA 박막 유리판 위에 0.1㎎/㎖ FITC-결합 항 마우스 항체(Pierce Co., USA) 10㎕를 처리하여 한 시간 실온에서 반응시킨 후, 상기 인산염 완충용액 또는 메탄올(MeOH) 20㎖로 각각 5분간 3회 세척한 다음 실온에서 건조하였다. 이후, 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 고정화된 항체의 FITC 형광을 분석하기 위해, BAS 이미지 분석기(Bio-Imaging Analyser System, Fuji Photo Film Co., Japan)를 이용하여 여기(excitation) 파장은 490nm에서, 그리고 방출(emission) 파장은 670nm에서 측정하여 분석하였다.

그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, 외부전극에 가하는 전력을 3W로 하고, EDC를 1㎎/㎖로 사용했을 때 단백질의 고정화 능력이 가장 우수하였음을 확인할 수 있었다. 또한, 세척용액의 경우, 인산염 완충용액 뿐 아니라 유기용매인 메탄올을 이용하여 세척할 때에도 단백질 고정화 능력이 우수함을 확인할 수 있었다.

2-2) EDC의 반응시간에 따른 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력 확인

크로스링커인 EDC의 최적 반응시간을 알아보기 위해, EDC 반응 시간에 따른 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력을 조사하였다. 플라즈마를 발생시키는 외부전극에 가하는 전력을 3W로 하여 상기 실시예 1과 동일한 방법에 따라 PPEDA 박막 유리판을 제조한 후, 크로스링커로는 1㎎/㎖ EDC 10㎕를, 세척용액으로는 인산염 완충용액을, 그리고 기판에 고정화되는 단백질로는 0.1㎎/㎖ FITC-결합 항 마우스 항체(Pierce Co, USA) 10㎕를 이용하여 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법에 따라 FITC-결합 항 마우스 항체가 고정화된 단백질칩을 제조하였다. 이 때, EDC의 반응시간을 0, 5, 10, 20, 30 및 60분으로 다르게 하였다. 이후, 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법으로 BAS 이미지 분석기(Bio-Imaging Analyser System, Fuji Photo Film Co., Japan)를 이용하여 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 고정화된 항체의 FITC의 형광을 분석하였다. 그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 5분부터 FITC 형광이 강하게 나타남을 확인할 수 있었다. 이는 크로스링커인 EDC의 반응시간이 5분 이하라도 충분하다는 것을 보여주는 것이다.

2-3) 단백질의 농도 및 반응 시간에 따른 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력 확인

본 발명에 따른 PPEDA 박막 유리판에 고정화되는 단백질의 최적 농도 및 시간을 결정하기 위하여, FITC-결합 항 마우스 항체(Pierce Co., USA)의 농도를 0, 0.01, 0.1 및 1㎎/㎖로 다르게 하고, 반응 시간을 0, 10, 30 및 60분으로 하여 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법에 따라 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 고정화시켰다. 이 때, 상기 실시예 2-1) 및 2-2)에서 본 발명의 단백질칩 기판의 제조에 가장 적합하다고 판정된 외부전극에 가하는 전력(3W), 크로스링커(EDC)의 농도(1㎎/㎖) 및 반응시간(5분)에 따라 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법으로 본 실험을 실시하였다. 또한, 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법에 따라 상기 PPEDA 박막 유리판에 고정화된 항체의 FITC 형광을 분석하였다.

그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 항체 농도에 따른 FITC 형광은 0.1㎎/㎖에서부터 검출이 되어 1㎎/㎖에서는 더 강하게 검출됨을 볼 수 있었고, 항체의 반응시간에 따른 FITC 형광은 10분에서부터 검출이 되어 1시간까지 그 검출이 동일한 정도로 지속됨을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 단백질칩 기판을 이용하여 단백질을 고정화시킬 때 단백질 고정화에 소요되는 시간이 종래의 단백질칩 기판(대한민국 공개특허공보 제71894호; Gavin NacBeath and Stuart L. Schreiber,Science, 289, 1760~1763, 2000)에 비해 단축된다는 것을 보여주는 것으로, 본 발명의 단백질칩 기판의 우수성(단백질 고정화 시간 절감)을 나타내는 것이다.

<실시예 3>

PPEDA 박막 유리판과 상업화되어 있는 아민기 노출 유리판의 단백질 고정화 능력 비교

상기 실시예 2에서 단백질 고정화에 가장 적합하다고 판정된 크로스링커 및 단백질의 농도 및 반응시간에 따라 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 FITC-결합 항 마우스 항체를 고정화시켰을 때와 상기 고정화 조건 하에서 이미 상업화되어 있는 아민기 노출 유리판에 상기 FITC-결합 항 마우스 항체를 고정화시켰을 때의 단백질 고정화 능력을 비교하였다.

아민기 노출 유리판(Cel associate 사, USA)에 5분간 다양한 농도(0. 0.1, 0.2, 0.5 및 1㎎/㎖)의 EDC를 상기 실시예 1과 동일한 방법에 따라 부착시켜 세척한 후, 0.1㎎/㎖ FITC-결합 항 마우스 항체를 10분 동안 반응시켰다. 이후, 상기실시예 2-1)과 동일한 방법에 따라 고정화된 항체의 FITC 형광을 검출하였다. 그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 PPEDA 박막 유리판의 경우에는 0.5㎎/㎖에서부터 검출이 되어 1㎎/㎖에서는 더욱 강하게 검출됨을 확인할 수 있었다. 이로부터 EDC의 농도가 증가할수록 본 발명의 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력이 증가함을 확인할 수 있었다. 그러나, 상업화되어 있는 아민기 노출 박막유리판의 경우 1㎎/㎖에서도 검출이 되지 않음을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 제조방법에 따라 플라즈마를 이용하여 제조된 PPEDA 박막 유리판의 단백질 고정화 능력이 기존 아민기 노출 유리판에 비해 우수하다는 것을 보여주는 것이다.

<실시예 4>

PPEDA 박막 유리판에 고정된 단백질의 활성 유지 확인

본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 고정화된 단백질이 그 활성을 유지하고 있는지를 조사하기 위해, 두 종류의 토끼 항체인 항 pIkappaB 항체(BD Pharmingen, USA)와 항 JNK 항체(BD Pharmingen, USA), 그리고 고 등의 방법(Ko YGet al.,J. Biol. Chem.276:23028-33, 2001)에 따라 제작한 항 p18 마우스 항체를 각각 10㎕씩 사용하여 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법으로 고정화시켰다. 이후, 그 위에 2차 항체로 0.1㎎/㎖ FITC-결합 항 마우스 항체(Pierce Co., USA) 10㎕를 반응시킨 후, 기판상에 고정화된 항체의 2차 항체와의 결합능력을 BAS 이미지 분석기(Bio-Imaging Analyser System, Fuji Photo Film Co., Japan)를 이용하여 상기 실시예 2-1)과 동일한 방법으로 분석하였다. 이 때,대조구로 기판상에 고정화된 항 p18 항체에 크로스링커(EDC)를 반응시키지 않고 바로 0.1㎎/㎖ FITC-결합 항 마우스 항체를 반응시켰다. 그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 마우스 항체인 항 p18 항체만이 특이적으로 2차 항체인 FITC-결합 항 마우스 항체와 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 본 발명의 PPEDA 박막 유리판에 고정화된 단백질이 다른 단백질과의 특이적 결합력을 잃지 않고 그 활성을 유지하고 있음을 보여주는 것이다.

본 발명에 따른 단백질칩 기판의 제조방법은 플라즈마를 이용하여 단백질을 기판의 표면에 고밀도로 균일하게 집적시킬 수 있고, 대량생산이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 또한, 본 발명의 제조방법으로 제조된 단백질칩 기판 및 단백질칩은 단백질 고정화 능력이 우수하다는 장점을 가지고 있어, 소량의 시료만으로도 항원 등 다양한 물질의 정성 분석 또는 정량 분석을 대량으로 빠르게 수행할 수 있으며, 다양한 질환에 대한 진단 및 특정 집단의 질환 프로파일 구축 등에 이용될 수 있다.

Claims

단백질칩 기판의 제조 방법에 있어서, 플라즈마 화학기상증착법으로 활성기를 기판상에 집적시키는 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 플라스틱, 금속 및 실리콘으로 이루어진 그룹에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 활성기는 아민기, 알데하이드기, 카르복실기 또는 티올기인 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법.
제 3항에 있어서, 상기 아민기는 에틸렌디아민(ethylenediamine), 아세토니트릴(acetonitrile), 알릴아민(allylamine) 또는 프로필아민(propylamine) 전구체로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법.
제 1항에 있어서, 플라즈마 반응 챔버와, 상기 플라즈마 반응 챔버 내부의압력을 조절하기 위한 진공수단과, 상기 플라즈마 반응 챔버내로 활성기를 포함하는 전구체를 주입하기 위한 가스 주입 수단과, 상기 플라즈마 반응 챔버 내부 또는 외부에 배치되는 하나 이상의 전극과, 상기 전극에 전압을 인가하기 위한 전력공급장치를 포함하는 플라즈마 화학기상증착 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 플라즈마 반응 챔버는 상기 플라즈마 반응 챔버 내부에 배치되는 기판과, 상기 기판 하부에 배치되는 내부전극과, 상기 내부전극의 하부에 배치되는 히터가 순차적으로 장착된 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 기판을 상기 내부전극 위에 장착하고, 상기 진공수단을 통해 상기 플라즈마 반응 챔버 내부를 진공화시킨 상태에서, 상기 가스 주입 수단을 통해 상기 전구체를 운송가스와 함께 상기 플라즈마 반응 챔버내로 주입하고, 상기 내부전극의 하부에 배치되는 히터를 통해 상기 플라즈마 반응 챔버 내부의 온도를 상승시킨 후, 상기 전력공급장치로 상기 플라즈마 반응 챔버 외부에 배치된 외부전극 및 상기 내부전극에 전압을 인가하여 플라즈마를 형성시켜, 상기 플라즈마에 의해 중합된, 활성기를 포함하는 박막을 상기 기판의 표면에 집적시키는 것을특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법.
제 7항에 있어서, 상기 전구체를 증기화(vaporization)한 후에 상기 플라즈마 반응 챔버내로 주입하는 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법.
제 8항에 있어서, 상기 증기화는 거품기를 이용하여 행해지는 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판의 제조방법.
제 1항의 방법으로 제조되고, 플라즈마에 의해 중합된, 에틸렌디아민 박막, 아세토니트릴 박막, 아릴아민 박막 및 프로필아민 박막으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나가 기판 상에 증착되어 아민기가 집적된 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판.
제 10항에 있어서, 상기 박막이 플라즈마에 의해 중합된 에틸렌디아민 박막이고, 상기 기판이 유리판인 것을 특징으로 하는 단백질칩 기판.
제 10항의 단백질칩 기판 위에 단백질을 고정시킨 단백질칩.
제 12항에 있어서, 제 11항의 단백질칩 기판 위에 단백질을 고정시킨 단백질칩.
제 12항에 있어서, 상기 단백질칩 기판 위에 크로스링커(crosslinker)를 결합시킨 후, 그 위에 단백질을 고정화시켜 제조되어지는 것을 특징으로 하는 단백질칩.
제 14항에 있어서, 상기 크로스링커를 격자를 이용하여 상기 단백질칩 기판 위에 결합시키는 것을 특징으로 하는 단백질칩.
제 14항에 있어서, 상기 크로스링커는 1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochlrode(EDC) 및 1,4-phenylene diisothiocyanate(PDC)인 것을 특징으로 하는 단백질칩.
제 14항에 있어서, 상기 단백질은 바이러스, 세균, 진균을 포함하는 단세포,동물 및 식물로부터 유래하는 항원 단백질인 것을 특징으로 하는 단백질칩.