JP2022134830A - デバイス、トンネル電流測定装置、核酸配列読取装置、トンネル電流測定方法、および、核酸配列読取方法 - Google Patents

デバイス、トンネル電流測定装置、核酸配列読取装置、トンネル電流測定方法、および、核酸配列読取方法 Download PDF

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Abstract

【課題】測定用電極が配置されるサンプル測定流路にサンプルが入りやすくなるデバイスを提供する。【解決手段】トンネル電流の測定に用いられるデバイスであって、該デバイスは、基材と、基材に形成された流路と、サンプルが通過した時のトンネル電流を測定するための一対の測定用電極と、を含み、流路は、サンプル投入流路と、測定用電極が配置されるサンプル測定流路と、サンプル投入流路とサンプル測定流路との間に配置され、サンプル投入流路からサンプル測定流路に向けて流路幅が狭くなる第１テーパー流路と、サンプル測定流路を通過したサンプルを回収するサンプル回収流路と、を含み、第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅が２０ｎｍ～２００ｎｍである。【選択図】図１Ａ

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 令和２年１０月３１日にウェブサイト ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｃｏｍ／２０７２－６６６Ｘ／１１／１１／９８２に掲載。 また、当該刊行物のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌも上記ウェブサイトで公開。ただし、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｍａｔｅｒｉａｌは動画のみである。したがって、書類の提出は省略する。
本出願における開示は、デバイス、トンネル電流測定装置、核酸配列読取装置、トンネル電流測定方法、および、核酸配列読取方法に関する。
生体高分子であるＤＮＡを用いたメモリは、その記憶密度の大きさや記録保持安定性から注目されている。ＤＮＡメモリの商業化には、ＤＮＡ配列を高速で読み取る技術が必要である。ＤＮＡ配列の読取方法として、ＰＣＲ増幅過程における伸長反応を光プローブによる光検出で行う例が知られている。こうした装置はシーケンサとよばれ、既に商品化されている。しかしながら、この方法の課題はＰＣＲ等の増幅過程を必要とするため、これにともなう伸長時間（１塩基あたりおよそ１秒）をこえた読み取り速度を実現することができないという問題がある。また、ＰＣＲはＤＮＡに対してのみ有効であるため、ＤＮＡ以外の生体分子や人工塩基などへの応用ができないため、４塩基のみの組み合わせで格納できる記憶密度は限られてしまうという問題もある。
ＰＣＲ以外の核酸の読取装置（方法）としては、薄膜にナノポア（微細な貫通孔）を形成し、核酸がナノポアを通過する際のトンネル電流を測定する方法が知られている（特許文献１参照）。
また、核酸を読み取る際には、核酸を伸長することが望ましい。核酸を伸長する技術としては、例えば、基材にナノワイヤを形成した流路を設け、核酸がナノワイヤの間を通過することで伸長する技術も知られている（特許文献２参照）。
特表２０１７－５０９８９９号公報 特開２０１６－１０３９７９号公報
ＤＮＡメモリの読取装置（読取方法）は、核酸の読取スピードの向上および少量のサンプルでも核酸配列の読み取り可能であることが望ましい。特許文献１に記載の読取装置（方法）は、ナノポアが形成された薄膜を境界にしてチャンバーが形成され、チャンバーに投入された核酸がナノポアを通過する時のトンネル電流を測定している。しかしながら、ナノポアの開口部は薄膜に対して略直交となるように形成され、且つ、薄膜に対する開口部の領域は微小である。そのため、核酸を含むサンプル液は薄膜全体に接触することから、サンプル液中の核酸が開口部に入り難いという問題がある。
本出願における開示の目的は、上記問題点を解決するためのデバイス、当該デバイスを用いたトンネル電流測定装置およびトンネル電流測定方法、並びに、核酸配列読取装置および核酸配列読取方法を提供することである。
本出願における開示は、以下に示す、デバイス、トンネル電流測定装置、核酸配列読取装置、トンネル電流測定方法、および、核酸配列読取方法に関する。
（１）トンネル電流の測定に用いられるデバイスであって、該デバイスは、
基材と、
基材に形成された流路と、
サンプルが通過した時のトンネル電流を測定するための一対の測定用電極と、
を含み、
流路は、
サンプル投入流路と、
測定用電極が配置されるサンプル測定流路と、
サンプル投入流路とサンプル測定流路との間に配置され、サンプル投入流路からサンプル測定流路に向けて流路幅が狭くなる第１テーパー流路と、
サンプル測定流路を通過したサンプルを回収するサンプル回収流路と、
を含み、
第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅が２０ｎｍ～２００ｎｍである
デバイス。
（２）第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅をＷ１と規定し、第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の幅をＷ２と規定した時に、Ｗ２／Ｗ１が１０～２０であり、
第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分および第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の長さをＬ１と規定した時に、Ｌ１／Ｗ２が０．５～５である
上記（１）に記載のデバイス。
（３）サンプル測定流路の長さが、２０ｎｍ～１０００ｎｍである
上記（１）または（２）に記載のデバイス。
（４）サンプル測定流路とサンプル回収流路との間に配置され、サンプル測定流路からサンプル回収流路に向けて流路幅が広くなる第２テーパー流路を含む
上記（１）～（３）のいずれか一つに記載のデバイス。
（５）サンプル測定流路と第２テーパー流路の接続部分の幅をＷ１ａと規定し、
第２テーパー流路とサンプル回収流路の接続部分の幅をＷ２ａと規定し、
第２テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分および第２テーパー流路とサンプル回収流路の接続部分の長さをＬ１ａと規定した時に、
Ｗ１＝Ｗ１ａ、Ｗ２＝Ｗ２ａ、および、Ｌ１＝Ｌ１ａの関係を満たす
上記（１）～（４）のいずれか一つに記載のデバイス。
（６）上記（１）～（５）のいずれか一つに記載のデバイスと、電気泳動用電源と、測定部と、を含み、
電気泳動用電源は、電気泳動用電極に１０ｍＶ～５Ｖの電圧を印加する
トンネル電流測定装置。
（７）上記（６）に記載のトンネル電流測定装置と、解析部と、を含み、
サンプルが核酸であり、
解析部は、トンネル電流測定装置で取得したトンネル電流の測定結果から核酸配列を特定する
核酸配列読取装置。
（８）デバイスを用いたトンネル電流測定方法であって、
デバイスは、
基材と、
基材に形成された流路と、
サンプルが通過した時のトンネル電流を測定するための一対の測定用電極と、
を含み、
流路は、
サンプル投入流路と、
測定用電極が配置されるサンプル測定流路と、
サンプル投入流路とサンプル測定流路との間に配置され、サンプル投入流路からサンプル測定流路に向けて流路幅が狭くなる第１テーパー流路と、
サンプル測定流路を通過したサンプルを回収するサンプル回収流路と、
を含み、
第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅が２０ｎｍ～２００ｎｍであり、
トンネル電流測定方法は、
サンプル投入流路およびサンプル回収流路に電圧を印加することで、サンプル投入流路のサンプルをサンプル回収流路に向けて電気泳動するサンプル電気泳動工程と、
サンプル測定流路に配置された一対の測定用電極の隙間をサンプルが通過する時のトンネル電流を測定する測定工程と
を含む、トンネル電流測定方法。
（９）サンプル電気泳動工程において、１０ｍＶ～５Ｖの電圧が印加される
上記（８）に記載のトンネル電流測定方法。
（１０）第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅をＷ１と規定し、第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の幅をＷ２と規定した時に、Ｗ２／Ｗ１が１０～２０であり、
第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分および第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の長さをＬ１と規定した時に、Ｌ１／Ｗ２が０．５～５である
上記（８）または（９）に記載のトンネル電流測定方法。
（１１）サンプルが核酸であり、
上記（８）～（１０）のいずれか一つに記載のトンネル電流測定方法の測定工程により得られたトンネル電流の測定結果から、核酸配列を特定する核酸配列読取工程
を含む、核酸配列読取方法。
本出願で開示するデバイスを用いると、測定用電極が配置されるサンプル測定流路にサンプルが入りやすくなる。
図１Ａはデバイス１の上面図である。 図１Ｂは図１ＡのＸ－Ｘ矢視断面図である。 図１Ｃは図１ＡのＹ－Ｙ矢視断面図である。 図２はデバイス１の作製手順の一例を示す概略図である。 図３はトンネル電流測定装置１００の実施形態の概略を示す概略図である。 図４は核酸配列読取装置１００ａの実施形態の概略を示す概略図である。 図５は、トンネル電流測定方法および核酸配列読取方法のフローチャートである。 図６は図面代用写真で、図６Ａは実施例１で作製したデバイス１の測定用電極４および測定用電極４を配置したサンプル測定流路３２付近のＳＥＭ写真である。図６Ｂは、デバイス１にカバー部材５を接着し電気泳動用電極を挿入した写真である。 図７は実施例４で測定した核酸のトンネル電流の測定結果を表すチャートである。 図８は実施例５および比較例１で測定した核酸のトンネル電流の測定結果を表すチャートである。 図９は実施例６の核酸の移動速度の測定結果を示すグラフである。 図１０は実施例７で測定したサンプルの移動速度の測定結果を示すグラフである。 図１１は、図１０の測定結果を解析したグラフである。
以下に、図面を参照しながら、デバイス、トンネル電流測定装置、核酸配列読取装置、トンネル電流測定方法、および、核酸配列読取方法について詳しく説明する。
本明細書において、同種の機能を有する部材には、同一または類似の符号が付されている。そして、同一または類似の符号の付された部材について、繰り返しとなる説明が省略される場合がある。
本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。数値、数値範囲および定性的な表現（例えば、「同一」、「略」等の表現）については、当該技術分野において一般的に許容される誤差を含む数値、数値範囲および性質を示していると解釈されるものとする。
また、図面において示す各構成の位置、大きさ、範囲などは、理解を容易とするため、実際の位置、大きさ、範囲などを表していない場合がある。このため、本出願における開示は、必ずしも、図面に開示された位置、大きさ、範囲などに限定されない。
（デバイスの第１の実施形態）
図１Ａ～図１Ｃを参照して、第１の実施形態に係るデバイス１について説明する。図１Ａはデバイス１の上面図、図１Ｂは図１ＡのＸ－Ｘ矢視断面図、図１Ｃは図１ＡのＹ－Ｙ矢視断面図である。図２はデバイス１の作製手順の一例を示す概略図である。
デバイス１は、基材２と、基材２に形成された流路３と、サンプルが通過した時のトンネル電流を測定するための一対の測定用電極４ａおよび４ｂ（以下、一対の測定用電極４ａおよび４ｂを「測定用電極４」と記載することがある。）と、を含む。流路３は、サンプル投入流路３１と、測定用電極４が配置されるサンプル測定流路３２と、サンプル投入流路３１とサンプル測定流路３２との間に配置されサンプル投入流路３１からサンプル測定流路３２に向けて流路幅が狭くなる第１テーパー流路３３と、サンプル測定流路３２を通過したサンプルを回収するサンプル回収流路３４と、を含む。第１テーパー流路３３とサンプル測定流路３２の接続部分の幅Ｗ１は２０ｎｍ～２００ｎｍである。
図１Ａに示す例では第２テーパー流路３５が図示されているが、第１の実施形態に係るデバイス１において第２テーパー流路３５は任意付加的な構成である。サンプル測定流路３２から流出したサンプルを回収できれば、サンプル回収流路３４をサンプル測定流路３２に直接連結してもよい。
デバイス１は、例えば、ナノチャネル統合機械的破断接合法（Ｎａｎｏｃｈａｎｎｅｌ－Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ Ｂｒｅａｋ Ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を用いて製造することができる。図２を参照し、デバイス１の製造手順の一例を示す。なお、一対の測定用電極４を作製する機械的破断接合法（ＭＣＢＪ）に関しては、例えば、特表２０１９－５２５７６６号公報、上記特許文献１、Ｍ．Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｋ．，Ｓｈｏｊｉ，Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｋａｗａｉ，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．，３４５（２００８）、および、Ｍ．Ｔｓｕｔｓｕｉ，Ｍ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｋａｗａｉ，Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．９３、１６３１１５（２００８）等に記載されている。
（１）シリコン等の基板２ａ上にポリイミド等の絶縁材料で絶縁層２ｂを形成する。
（２）絶縁層２ｂ上に電子ビームリソグラフィー（ＥＢ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）により測定用電極４を形成するための金属層を堆積する。
（３）化学蒸着によってＳｉＯ2等の堆積層２ｃを形成する。堆積槽２ｃの上に、スピンコーティングにより、レジスト層２ｄを積層する。
（４）電子ビームリソグラフィーにより、測定用電極４を形成するための金属層に重ね合わせるように、サンプル測定流路３２を含む流路３のパターンを形成する。
（５）ドライエッチングにより流路３を形成する。その後、ＭＣＢＪにより、金属層に隙間（ナノギャップＧ）を形成することで測定用電極４を形成する。なお、図２に示す例では、サンプル測定流路３２は測定用電極４の下方までエッチングされているが、測定用電極４の下方部分の流路はなくてもよい。また、図２に示す例では測定用電極４は一つであるが、測定用電極４は２以上形成してもよい。
（６）サンプル液の投入や、電気泳動用電極の挿入等に用いられる孔を必要に応じて形成したカバー部材５を貼り付ける。なお、カバー部材５は、イオン電流測定時に貼り付けられていればよい。
基板２ａは、半導体製造技術の分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無い。基板２ａの材料としては、例えば、Ｓｉ、ＳｉＯｘ、ＳｉＮｘ、Ｇｅ、Ｓｅ、Ｔｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＧａＮ、ＩｎＳｂ、ＩｎＰ等が挙げられる。
絶縁層２ｂも半導体製造技術の分野で一般的に用いられている材料であれば特に制限は無い。絶縁層２ｂの材料としては、例えば、ポリイミド、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリエポキシなどの絶縁性高分子；ＳｉＯ2、酸化アルミニウム等の絶縁性酸化半導体金属物；等が挙げられる。
堆積層２ｃを形成する材料としては、ポリイミド、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリエポキシなどの絶縁性高分子；ＳｉＯ2、酸化アルミニウム等の絶縁性酸化半導体金属物；等が挙げられる。
測定用電極４を形成する材料としては、トンネル電流を測定できれば特に制限はない。例えば、金、白金、銀、パラジウム、タングステン、および前記金属の合金等が挙げられる。
電子ビームリソグラフィーに用いられるフォトレジスト、現像およびエッチング等に用いる試薬は、微細加工技術の分野で一般的に使用されている材料であれば特に制限はない。また、スピンコータおよびエッチング等に用いる装置も、微細加工技術の分野で一般的に使用されている材料であれば特に制限はない。
カバー部材５は、流路３を形成した基材２に貼り付けることができる材料であれば特に制限はない。カバー部材５の材料としては、例えば、ポリメチルジシロキサン（ＰＤＭＳ）等が挙げられる。カバー部材５と基材２とは、例えば、オゾンプラズマ処理等により貼り付ければよい。
なお、本明細書において「基材」とは、流路３を形成するための基礎となる材料部分を意味する。図２に示す例では、基材２には、基板２ａ、絶縁層２ｂ、堆積層２ｃおよびレジスト層２ｄが含まれる。なお、図２は測定用電極４をサンプル測定流路３２に配置したデバイス１の作製手順の一例に過ぎない。デバイス１は、本出願で開示する効果を奏する範囲であれば、他の工程を追加あるいは削除してもよい。例えば、エッチングにより流路３を形成した後に、レジスト層２ｄは除去されてもよい。その場合、基材２にはレジスト層２ｄは含まれない。また、デバイス１は、電子線彫刻法やナノプリンティング等により作製してもよい。
また、理解を容易にするため、図１Ａ～図１Ｃに示す例では、基板２ａ、絶縁層２ｂ、堆積層２ｃおよびレジスト層２ｄの詳細な記載は省略し、基材２と記載してある。
サンプル投入流路３１とサンプル回収流路３４に電圧を印加することでサンプルには電気泳動力が付与され、サンプルの移動速度が増加する。その結果、電気泳動力を付与しない場合と比較して、サンプルの測定速度が向上する。一方、流路３に電圧を印加しサンプルに電気泳動力を付与する場合、流路３の断面積が大きくなるほどより大きな電圧が必要となる。
ところで、トンネル電流による核酸の読取は、測定したピコアンペアレベルの電流値の差異を識別することで行われる。本発明者らは、様々な実験結果から、特許文献２に記載されているμｍオーダーの流路に投入した核酸に電気泳動力を付与できるレベルの電圧を印加した場合、電気泳動用の電圧に起因するノイズを測定用電極４が検出し、核酸の識別ができないことを新たに見出した。本出願における開示は、当該知見に基づいている。
本出願で開示するデバイス１は、低い電圧でサンプルに電気泳動力を付与できることから、電気泳動用の電圧に起因するノイズが少ないトンネル電流の測定ができる。したがって、上記のとおり核酸の識別に好適に用いることができるが、サンプルは核酸に限定されない。表面電荷を有し電気泳動により移動するサンプルであれば、電気泳動用の電圧に起因するノイズが少ないトンネル電流の測定ができる。サンプルとしては、例えば、ペプチド、脂質、糖鎖、合成高分子等が挙げられる。なお、本明細書において「サンプル液」と記載した場合、「サンプル液」は上記サンプルを電気泳動用の溶媒に溶解または分散した液体を意味する。
デバイス１には、サンプル液を投入するため、所定の大きさのサンプル投入流路３１が必要である。そのため、デバイス１は、測定用電極４を配置するサンプル測定流路３２の幅を狭くし（小さくし）、サンプル投入流路３１とサンプル測定流路３２を第１テーパー流路３３で接続する構造を採用している。
上記のとおり、電気泳動用の電圧に起因するノイズを軽減するためには、サンプル測定流路３２の幅は狭い方が好ましい。第１テーパー流路３３とサンプル測定流路３２の接続部分の幅Ｗ１と規定した時に、Ｗ１は、２００ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下とすればよい。一方、Ｗ１の下限は製造可能な範囲であれば特に制限はない。限定されるものではないが、例えば、２０ｎｍ以上、２５ｎｍ以上、３０ｎｍ以上とすればよい。
サンプル測定流路３２の幅は、何れの箇所も同じであってもよいし、測定結果の解析等を行う際に影響が出ない範囲であれば異なっていてもよい。図１Ａに示す例では、サンプル測定流路３２のＷ１とは反対側の端部をＷ１ａと規定した時に、Ｗ１ａはＷ１と同じであってもよいし、Ｗ１より大きくても小さくてもよい。
一対の測定用電極４ａおよび４ｂの隙間（ギャップＧ、図１Ｂ参照）は、サンプルが通過する際のトンネル電流が測定できる範囲内であれば特に制限はない。限定されるものではないが、例えば、０．１ｎｍ以上、０．３ｎｍ以上、０．５ｎｍ以上、０．７ｎｍ以上、０，９ｎｍ以上とすればよい。一方、ギャップＧの上限は、限定されるものではないが、例えば、５０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、８ｎｍ以下、６ｎｍ以下、５ｎｍ以下、４ｎｍ以下、３ｎｍ以下、２ｎｍ以下、１ｎｍ以下とすればよい。
測定用電極４の長さ（図１ＡのＬ２と同じ方向の隙間Ｇの長さ）も、サンプルが通過する際のトンネル電流が測定できる範囲内であれば特に制限はない。限定されるものではないが、例えば、１０００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下とすればよい。
なお、ＭＣＢＪでは切断を容易にするため、測定用電極４の堆積量（測定用電極４の長さ方向に直交する方向、または、図１ＢのＨ方向。以下、「厚み」と記載することがある。）は小さい方が好ましい。測定用電極４の厚みを増やすと切断場所が制御し難くなり、作製したギャップＧの切断面が乱雑となる恐れがある。そのため、測定用電極４の厚みは、限定されるものではないが、例えば、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下とすればよい。測定用電極４の厚みの下限値はトンネル電流が測定できれば特に制限はなく、限定されるものではないが、例えば、２ｎｍ以上、４ｎｍ以上、６ｎｍ以上、８ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、１５ｎｍ以上、２０ｎｍ以上とすればよい。
上記のとおり、測定用電極４の厚さを小さくしてＭＣＢＪによりギャップＧを形成する関係上、測定用電極４の長さは厚さより大きくすることが好ましい。限定されるものではないが、例えば、長さ／厚さの比は１０～１００が挙げられる。
ところで、特許文献１に記載のデバイスも、ＭＣＢＪにより電極が形成されている。そのため、薄膜に堆積する電極の厚さは上記の理由で薄くなっている。そして、特許文献１に記載のデバイスは薄膜にナノポアを形成していることから、サンプルは電極のギャップＧの厚さ方向に移動する。一方、本出願で開示するデバイス１を用いてサンプルのトンネル電流を測定する場合、サンプルは測定用電極４の長さ方向に移動する。つまり、本出願で開示するデバイス１と特許文献１ではギャップＧに対するサンプルの移動方向が異なる。本出願で開示するデバイスの場合は、電界が測定用電極４の長さ方向に係ることから電界の強さが緩やかになりサンプルの移動速度を制御しやすい。一方、特許文献１のデバイスの場合は、電界は電極の厚さ方向（電極の長さ方向より薄い）に係ることから電界が急激になり、サンプルの移動速度の制御が難しい。以上のとおり、本出願で開示するデバイス１は、特許文献１に記載のデバイスと比較して、測定用電極４のギャップＧを通過するサンプルの移動速度を制御しやすいとの効果を奏する。
サンプル測定流路３２の長さＬ２は、サンプルが通過する際のトンネル電流が測定できる範囲内であれば特に制限はない。長すぎるとデバイス１の流路全体が長くなる。一方、短すぎると、サンプルが核酸やペプチド等の細長いサンプル（以下、「細長サンプル」と記載することがある。）の場合、細長サンプルが伸長した状態を維持し難くなる。限定されるものではないが、Ｌ２は、２０ｎｍ以上、２５ｎｍ以上、３０ｎｍ以上、３５ｎｍ以上、４０ｎｍ以上、４５ｎｍ以上、５０ｎｍ以上とすればよい。また、Ｌ２は、２０００ｎｍ以下、１５００ｎｍ以下、１０００ｎｍ以下、８００ｎｍ以下、６００ｎｍ以下、４００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下とすればよい。勿論、Ｌ２の長さは測定用電極４のギャップＧ部分の長さより長くする必要がある。
電気泳動用の電圧に起因するノイズを軽減するためには、流路３の深さＨも小さい方が好ましい。流路３の深さＨは、限定されるものではないが、例えば、２００ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下とすればよい。一方、流路３の深さＨは、例えば、２０ｎｍ以上、２５ｎｍ以上、３０ｎｍ以上とすればよい。
第１の実施形態に係るデバイス１では、第１テーパー流路３３の長さ（図１ＡのＬ１）およびサンプル投入流路３３の幅（第１テーパー流路３３との接続部分、図１ＡのＷ２）に特に制限はないが、流路３の幅は可能な範囲で小さくすることが望ましい。なお、サンプル液を投入するため、サンプル投入流路３１は必要に応じてＷ２より幅が広い幅広部分を有していてもよい。
第１の実施形態に係るデバイス１では、サンプル回収流路３４の幅および任意付加的に設けられる第２テーパー流路３５の長さ（図１ＡのＬ１ａ）に特に制限はないが、流路３の幅は可能な範囲で小さくすることが望ましい。なお、サンプルを回収するため、サンプル回収流路３４は必要に応じてＷ２ａより幅が広い幅広部分を有していてもよい。
特許文献１および２に記載のデバイスと比較して、第１の実施形態に係るデバイス１を用いてトンネル電流を測定することで以下の効果を奏する。
（１）サンプル投入流路３１に投入したサンプル液に含まれるサンプルは、電気泳動により第１テーパー流路３３を介してサンプル測定流路３２に誘導される。したがって、特許文献１に記載のナノポア形式と比較してサンプル液中に含まれる核酸等のサンプルの量が少なくても、より確実に測定用電極４にサンプルを誘導できる。
（２）特許文献１に記載のデバイスのナノポアは、薄膜に形成した３次元の孔である。したがって、ナノポア内で孔のサイズを変えたりすることは非常に困難である。また、特許文献１に記載のデバイスは、薄膜にサンプル液が接触するようにチャンバーが形成されている。したがって、チャンバーとナノポアの開口部を段差無く設計することは非常に困難である。つまり、サンプル液に含まれる核酸等のサンプルが開口部に流れやすくするための流路設計には制限がある。一方、デバイス１は、基材２上に流路３を形成することから、電子ビームリソグラフィーにより所望の形状の流路３を簡単に形成できる。
（３）サンプル測定流路３２の幅の絶対値を非常に小さくすること、および、サンプル投入流路３１からサンプル測定流路３２に向けてテーパーを形成することで、流路３の断面積を特許文献２に記載の実施形態より小さくできる。そのため、サンプルに電気泳動力を付与するための電圧を小さくすることができ、トンネル電流測定時に電気泳動用の電圧に由来するノイズを低減できる。
（デバイス１の任意付加的な変形例）
図１Ａ～図１Ｃを参照して、デバイス１の任意付加的な変形例（限定）について説明する。なお、デバイス１の任意付加的な変形例は、デバイス１の実施形態の各構成をより限定した実施形態である。したがって、デバイス１の任意付加的な変形例では、限定事項のみ説明し、第１の実施形態において説明済みの事項についての繰り返しとなる説明は省略する。
（変形例１）
デバイス１は、第１テーパー流路３３とサンプル測定流路３２の接続部分の幅をＷ１と規定し、第１テーパー流路３３とサンプル投入流路３１の接続部分の幅をＷ２と規定した時に、Ｗ２／Ｗ１の下限を２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上とし、上限を５０以下、４０以下、３０以下、２０以下としてもよい。また、第１テーパー流路３３とサンプル測定流路３２の接続部分Ｗ１および第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の長さをＬ１と規定した時に、Ｌ１／Ｗ２の下限を０．３以上、０．４以上、０．５以上とし、上限を１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下としてもよい。
第１テーパー流路３３の形状を上記の比とした場合、第１の実施形態に係るデバイス１に記載の効果に加え、以下の効果を奏する。
（１）第１テーパー流路３３を上記の比にすることで、サンプル液中の細長サンプルを直線化しやすくできる。
（２）流路に溶媒を充填して電圧を印加した際には流路内には電気浸透流（ＥＯＦ）が発生するが、壁に沿った領域は逆流する。第１テーパー流路３３を変形例１に記載した範囲にすると、ＥＯＦの発生が抑制されやすく、また、第１テーパー流路３３の形状により電界増強による加速効果が得られる。したがって、サンプル液中に含まれる細長サンプルを直線化した上で、サンプル測定流路３２に導入しやすくなる。
（変形例２）
デバイス１は、サンプル測定流路３２とサンプル回収流路３４との間に配置され、サンプル測定流路３２からサンプル回収流路３４に向けて流路幅が広くなる第２テーパー流路３５を含んでもよい。
デバイス１が第２テーパー流路３５を含む場合、第１の実施形態に係るデバイス１および変形例１に記載の効果に加え、サンプル測定流路３２の出口で細長サンプルがスタックすることを防ぎ、細長サンプルの通過を促進するとの効果を奏する。
（変形例３）
デバイス１は、変形例２に加え、サンプル測定流路３２と第２テーパー流路３５の接続部分の幅をＷ１ａと規定し、第２テーパー流路３５とサンプル回収流路３４の接続部分の幅をＷ２ａと規定し、第２テーパー流路３５とサンプル測定流路３２の接続部分および第２テーパー流路３５とサンプル回収流路３２の接続部分の長さをＬ１ａと規定した時に、Ｗ１＝Ｗ１ａ、Ｗ２＝Ｗ２ａ、および、Ｌ１＝Ｌ１ａの関係を満たしてもよい。換言すると、流路３は、サンプル測定流路３２を中心にして左右対称となるように形成してもよい。
デバイス１の流路３を、サンプル測定流路３２を中心にして左右対称となるように形成した場合、第１の実施形態に係るデバイス１、変形例１および変形例２に記載の効果に加え、以下の効果を奏する。
（１）電気泳動用の電極のプラス・マイナスを入れ替えることで、測定用電極４を通過したサンプルを逆方向からも測定ができる。例えば、核酸やペプチド等の配列読取の際に、同じ配列を異なる方向から確認できるので読取精度の向上が期待できる。
（その他の変形例）
本出願で開示するデバイス１は上記実施形態１および変形例１～３に限定されず、本出願で開示する技術思想の範囲内において、適宜変形または変更され得る。また、各実施形態において任意の構成要素を省略することも可能である。
例えば、サンプル液が流れやすくするように、製造したデバイス１を親水化処理してもよい。親水化処理方法としては、プラズマ処理、界面活性剤処理、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）処理、光触媒処理、ＳｉＯ2膜の被覆等が挙げられる。例えば、デバイス１の流路３が形成されている面を１０～３０秒間プラズマ処理することで、表面に水酸基を導入することができる。また、デバイス１がカバー部材５を備えていてもよい。更に、デバイス１のサンプル投入流路３１およびサンプル回収流路３４に、電気泳動用の電圧を印加するための電極が形成されていてもよい。電気泳動用の電極は後述する。
（トンネル電流測定装置の実施形態）
図３を参照して、トンネル電流測定装置１００の実施形態について説明する。図３はトンネル電流測定装置１００の実施形態の概略を示す概略図である。トンネル電流測定装置１００は、デバイス１に加え、電気泳動用電源（以下、「第１電源」と記載することがある）６と、測定部７と、を含む。測定部７は、トンネル電流検出部（以下、「検出部」と記載することがある。）７ａおよびトンネル電流測定用電源（以下、「第２電源」と記載することがある。）７ｂを含む。
図３に示す例では、サンプル投入流路３１内のサンプル液と接する箇所に電気泳動用第１電極（以下、「第１電極」と記載することがある。）６１が形成され、サンプル回収流路３４内の溶媒と接する箇所に電気泳動用第２電極（以下、「第２電極」と記載することがある。）６２が形成されている。第１電極６１および第２電極６２は、デバイス１の構成であってもよいし、トンネル電流測定装置１００の構成であってもよい。
第１電極６１および第２電極６２は、Ａｇ／ＡｇＣｌ、アルミニウム、銅、白金、金、銀、チタン等の公知の導電性金属で形成することができる。第１電極６１および第２電極６２は、基材２上に形成してもよいし、デバイス１とは別体としカバー部材５の孔を介して挿入してもよい。
図３には、第１電極６１に接続する第１電源６ａおよび第２電極６２に接続する第１電源６ｂの２つの第１電源６を用いて電気泳動用の電圧を印加する例が示されている。図３に示す例では、第１電源６として２つの電源を用いていることから、昇圧、降圧を独立して実施ができる。なお、図３に示す例は単なる例示であって限定されるものではない。後述する電気泳動用の電圧を印加できれば、例えば、第１電源６は一つであってもよい。本出願で開示するトンネル電流測定装置１００は、デバイス１の流路３、特に、サンプル測定流路３２の幅を非常に小さくすることで、サンプルの電気泳動に必要な電圧を小さくできる。そのため、測定部７は、サンプルが測定用電極４の隙間を通過する際のトンネル電流を測定する際に、ノイズ成分が小さなトンネル電流の測定値が得られる。したがって、得られた測定結果は、核酸やペプチド配列の特定、脂質、糖鎖、合成高分子の分析等の用途に好適に用いることができる。
第１電源６が印加する電圧は、小さすぎるとサンプルの移動速度が遅くなり測定に時間を要する。限定されるものではないが、例えば、１０ｍＶ以上、１５ｍＶ以上、２０ｍＶ以上、２５ｍＶ以上、３０ｍＶ以上とすればよい。一方、第１電源６が印加する電圧の上限は、得られた測定結果を解析する際の解析部の精度および流路３の幅等を考慮し適宜設定すればよい。限定されるものではないが、例えば、５Ｖ以下、３Ｖ以下、１Ｖ以下、５００ｍＶ以下、３００ｍＶ以下、１００ｍＶ以下、９０ｍＶ以下、８０ｍＶ以下、７０ｍＶ以下、６０ｍＶ以下、５０ｍＶ以下とすればよい。なお、トンネル電流測定装置１００で得られたトンネル電流の測定結果は、トンネル電流測定装置１００とは別体の解析部により解析をしてもよい。したがって、トンネル電流測定装置１００において解析部は必須の構成ではない。
測定部７の検出部７ａは、トンネル電流測定用電源（以下、「第２電源」と記載することがある。）７ｂにより電圧が印加される一対の測定用電極４ａおよび４ｂの隙間をサンプルが通過するときに発生するトンネル電流の変化を測定できる構成を具備していれば特に制限はない。例えば、発生するトンネル電流の変化はピコアンペアレベルであることから、ピコアンペアレベルの電流を測定できる公知の電流計を使用すればよい。また、電圧計で測定した電圧から電流を計算してもよい。測定部７ａは、任意付加的に、電流増幅アンプ、ノイズ除去装置、Ａ／Ｄコンバーター等を含んでいてもよい。測定部７ａが、電流増幅アンプ、ノイズ除去装置、Ａ／Ｄコンバーター等を含む場合は、測定したトンネル電流値の生データではなく、解析しやすいデータを提供できる。代替的に、測定部７ａはトンネル電流の変化を測定できる構成のみとし、電流増幅アンプ、ノイズ除去装置、Ａ／Ｄコンバーター等は、解析部８の構成としてもよい。
第２電源７ｂは、一対の測定用電極４ａおよび４ｂに電圧を印加する。第２電極７ｂによって印加される電圧は、トンネル電流が測定できれば特に制限はない。限定されるものではないが、例えば、下限を２０ｍＶ以上、５０ｍＶ以上、１００ｍＶ以上とし、上限を７５０ｍＶ以下、５００ｍＶ以下、２５０ｍＶ以下等にすればよい。第２電源７ｂの具体的な構成は特に限定されるものではなく、周知の電源装置を使用すればよい。
本出願で開示するトンネル電流測定装置１００を使用してトンネル電流を測定することで、電気泳動用の電圧に起因するノイズ成分が少ないトンネル電流の測定結果が得られるとの効果を奏する。
（核酸配列読取装置の実施形態）
図４を参照して、核酸配列読取装置１００ａの実施形態について説明する。図４は核酸配列読取装置１００ａの実施形態の概略を示す概略図である。核酸配列読取装置１００ａは、トンネル電流測定装置１００に加え、トンネル電流測定装置１００で取得したトンネル電流の測定結果から核酸配列を特定する解析部８を必須の構成として含む以外は、トンネル電流測定装置１００と同じである。したがって、核酸配列読取装置１００ａの実施形態では解析部８を中心に説明し、トンネル電流測定装置１００の実施形態において説明済みの事項についての繰り返しとなる説明は省略する。よって、核酸配列読取装置１００ａの実施形態において明示的に説明されなかったとしても、トンネル電流測定装置１００の実施形態で説明済みの事項を採用可能であることは言うまでもない。
解析部８は、トンネル電流測定装置１００で取得したトンネル電流の測定結果から核酸配列を特定する。より具体的には、解析部８はトンネル電流の測定値からコンダクタンスを計算する。トンネル電流が測定されるときにコンダクタンスは、トンネル電流の測定値を一対の測定用電極４ａおよび４ｂに印加した電圧で割ることで計算できる。核酸が一対の測定用電極４ａおよび４ｂを通過する際に発生するトンネル電流から計算したコンダクタンスは、核酸の種類によって異なる。したがって、計算したコンダクタンスに基づき核酸の種類を特定できることから、トンネル電流の測定値を時系列に解析することで核酸配列の読取ができる。
なお、解析部８は上記コンダクタンスの解析まで行い、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）等の具体的な核酸名の特定は解析部８と別の装置が行ってもよい。代替的に、解析部８は核酸の種類に応じたコンダクタンスを記憶する記憶部を設け、計算したコンダクタンスと記憶部に記載されたコンダクタンスとを対比することで、解析部８がトンネル電流の測定結果から核酸配列を直接読取ってもよい。本明細書において「核酸配列を特定」とは、核酸の種類を具体的に特定することに加え、核酸の種類を特定できるコンダクタンス情報を提供することも包含する。
なお、本明細書において「核酸」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡを構成する上記核酸に加え、人工核酸を含む。人工核酸の例としては限定されるものではないが、例えば、以下の人工核酸が挙げられる。
Figure 2022134830000002
天然の核酸に加え、異なる種類の人工核酸を加えることで、多ビット化により核酸メモリの高密度化ができる。
核酸配列読取装置１００ａは、任意付加的に、測定したトンネル電流値および／または解析部８が解析した結果を表示するための表示部９、予め解析部８や表示部９を機能させるためのプログラムを格納したプログラムメモリ１０、プログラムメモリ１０に格納されているこのプログラムを読み出し実行するための制御部１１を含んでいてもよい。プログラムは、予めプログラムメモリ１０に記憶しておいても良いし、記録媒体に記録され、インストール手段を用いてプログラムメモリ１０に格納されるようにしてもよい。
表示部９は、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、有機ＥＬディスプレイなど、公知の表示装置を用いればよい。
（トンネル電流測定方法および核酸配列読取方法の実施形態）
次に、図５を参照して、トンネル電流測定装置１００を用いたトンネル電流測定方法、および、核酸配列読取装置１００ａを用いた核酸配列読取方法について説明する。図５は、トンネル電流測定方法および核酸配列読取方法のフローチャートである。トンネル電流測定方法の実施形態は、サンプル電気泳動工程（ＳＴ１）およびトンネル電流測定工程（ＳＴ２）を含む。核酸配列読取方法の実施形態は、サンプル電気泳動工程（ＳＴ１）およびトンネル電流測定工程（ＳＴ２）に加え、核酸配列読取工程（ＳＴ３）を含んでいる。
サンプル電気泳動工程（ＳＴ１）は、サンプル投入流路３１にサンプル液を投入し、サンプル回収流路３４に溶媒を投入し、第１電極６１および第２電極６２に電圧を印加することで実施される。第１テーパー流路３３、サンプル測定流路３２、必要に応じて形成される第２テーパー流路３５には、投入したサンプル液または溶媒が毛管力により浸透することで液絡が取れる。サンプル液を作製するための溶媒は電気が通ればよい。限定されるものではないが、例えば、超純水、緩衝液等が挙げられる。超純水は、例えば、ＥＭＤミリポア社（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）Ｉｎｔｅｇｒａｌ３３／５／１０１５（カタログ番号））によって製造されたＭｉｌｌｉ－Ｑ（登録商標）Ｉｎｔｅｇｒａｌ３（装置名）を用いて製造することができる。緩衝液としては、ＴＥバッファー、ＴＢＥバッファー等の公知の電気泳動用のバッファーが挙げられる。バッファーの濃度は、限定されるものではないが、例えば１μＭ以下等、電気泳動ができる範囲で適宜調整すればよい。また、サンプル液には、電気浸透流（ＥＯＦ）の影響を軽減するため、必要に応じてｐｏｌｙｖｉｎｙｌ－ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ）等の界面活性剤の他、両親媒性の化学物質が挙げられる。
トンネル電流測定工程（ＳＴ２）では、サンプル測定流路３２に配置された一対の測定用電極４ａおよび４ｂの隙間をサンプルが通過する時のトンネル電流を測定する。
核酸配列読取工程（ＳＴ３）は、サンプルが核酸の場合に実施される。核酸配列読取工程（ＳＴ３）では、トンネル電流測定工程（ＳＴ２）で得られたトンネル電流値から、上記（核酸配列読取装置の実施形態）に記載の方法により核酸配列を特定する。なお、必要に応じて、配列が既知の核酸で予め電気泳動工程（ＳＴ１）、トンネル電流測定工程（ＳＴ２）および核酸配列読取工程（ＳＴ３）を実施し、核酸の種類と計算したコンダクタンスを関連付けて記憶部に記憶してもよい。また、サンプルがペプチドの場合は、核酸をアミノ酸と読み替えればよい。
以下に実施例を掲げ、本出願における開示内容を具体的に説明するが、この実施例は具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は、本出願における開示の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
〔デバイス１の作製〕
＜実施例１＞
図２に示す手順にしたがって、デバイスを作製した。具体的手順は以下のとおり。
（１）シリコン基板２ａ上にポリイミドで絶縁層２ｂを形成した。
（２）絶縁層２ｂ上に、電子ビームリソグラフィーおよびリフトオフ技術を用いて、絶縁層２ｂ上に測定用電極４を形成するための金属層を堆積した。レジストにはＺＥＰ５２０Ａを用い、測定用電極４を形成するための金属層の材料は金を用いた。
（３）化学蒸着によってＳｉＯ2の堆積層２ｃを形成した。堆積槽２ｃの上に、スピンコーティングにより、レジスト層２ｄを積層した。レジストは、ＺＥＰ５２０Ａを使用した。
（４）電子ビームリソグラフィーにより、測定用電極４を形成するための金属層に重ね合わせるように、サンプル測定流路３２を含む流路３のパターンを形成した。
（５）ドライエッチングにより流路３を形成した。その後、ＭＣＢＪにより、基板２ａを折り曲げることで金属層に隙間（ナノギャップＧ）を形成することで測定用電極４を形成した。
（６）サンプル液の投入孔および電気泳動用電極の挿入孔を形成したＰＤＭＳ製のカバー部材５を電子ビームリソグラフィーにより作製した。流路３を形成した基材２とカバー部材５をオゾンプラズマで処理し接合した。電気泳動用電極にはＡｇ／ＡｇＣｌを用い、カバー部材５に形成した孔から挿入した。
図６Ａは、実施例１で作製したデバイス１の測定用電極４および測定用電極４を配置したサンプル測定流路３２付近のＳＥＭ写真である。図６Ｂは、デバイス１にカバー部材５を接着し、電気泳動用電極を挿入した写真である。
図６Ａに示すデバイス１の寸法を図１Ａの符号を参照して説明する。第１テーパー流路３３とサンプル測定流路３２の接続部分の幅Ｗ１の長さは２００ｎｍ、サンプル測定流路３２の長さＬ２は８μｍ、第１テーパー流路３３とサンプル投入流路３１の接続部分の幅Ｗ２は２μｍ、第１テーパー流路３３の長さＬ１は５μｍで、Ｗ１＝Ｗ１ａ、Ｗ２＝Ｗ２ａ、Ｌ１＝Ｌ１ａであった。また、一対の測定用電極４ａおよび４ｂの隙間Ｇは０．５５ｎｍ～１．０ｎｍの間となるように調整した。また、流路３の深さは、５０ｎｍであった。
＜実施例２＞
電子ビームリソグラフィー用のマスクを変えることで、実施例１より流路の幅は小さいが比は同じとなるようにデバイスを作製した。実施例２で作製したデバイスのサイズは、Ｗ１＝Ｗ１ａ＝２０ｎｍ、Ｗ２＝Ｗ２ａ＝２００ｎｍ、Ｌ１＝Ｌ１ａ＝５００ｎｍ、Ｌ２＝８００ｎｍであった。また、一対の測定用電極４ａおよび４ｂの隙間Ｇは１ｎｍ、流路３の深さは２０ｎｍであった。
＜実施例３＞
〔核酸配列読取装置（トンネル電流測定装置）の作製〕
電気泳動用電源６として電池を用い、実施例２で作製したデバイスの電気泳動用電極にリードを介して接続した。測定部７のトンネル電流検出部７ａには、電流計として電流／電圧増幅することで微小電流値を電圧として計測し電流値を得る方法を用い、電圧計としてＡ／Ｄコンバーターである Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔのデジタルオシロスコープを用いた。また、電流増幅アンプは市販の電流増幅アンプに帰還抵抗を組み込むことで高精度化した。
［トンネル電流測定方法および核酸配列読取方法］
＜実施例４＞
（１）サンプル液の作製
核酸として配列が既知のλＤＮＡ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた。溶媒には水を用い、核酸を溶媒に溶解することでサンプル液を作製した。核酸の濃度は、１マイクロｍｏｌ／ｌとした。
（２）（トンネル電流の測定（核酸情報の取得）
サンプル投入流路に上記（１）で作製したサンプル液を投入し、サンプル回収流路に溶媒を投入した。電気泳動用電極６１および６２に直流電圧６００ｍＶ，－６００ｍＶをそれぞれ印加した。測定用電極４には、１００ｍＶの直流電圧を加えた。図７に測定結果を示す。
（３）核酸配列の読取
上記（２）に記載のトンネル電流の波形からコンダクタンスを計算した。時間軸と計算したコンダクタンスから核酸配列を決定したところ、サンプルとして用いたλＤＮＡの配列と同一であることを確認した。
＜実施例５、比較例１＞
電気泳動用電極６１および６２に印加する直流電圧を、０．１Ｖ（実施例５）および１０００Ｖ（比較例１）に変更した以外は、実施例４と同様の手順でトンネル電流の測定を行った。図８に測定結果を示す。図８Ａに示すように、１０００Ｖの電気泳動用電圧を印加した際には、核酸が測定用電極４の隙間Ｇを通過する際に発生するピコアンペアレベルのトンネル電流の差異はノイズのため全く識別できなかった。図８Ｂは、図８Ａのトンネル電流値の測定結果のピコアンペアレベル付近を拡大したグラフである。図８Ｂに示すように、０．１Ｖの場合には、核酸が測定用電極４の隙間Ｇを通過した際に発生するピコアンペアレベルのトンネル電流の差異を識別できた。
以上の結果より、電気泳動用の電圧を高くすると、核酸が測定用電極４の隙間Ｇを通過する際に発生するピコアンペアレベルのトンネル電流の差異はノイズのため識別できないことを確認した。特許文献２に記載のように、基板に形成した流路を核酸の伸長に用いる場合は、流路の幅や印加する電圧は核酸が伸長できる値とすればよい。しかしながら、一般的に流路の幅が大きくなるほど、核酸が流路内を電気泳動により移動するための電圧値が大きくなる。微細加工分野において、基板に微細な流路を形成することは知られている。しかしながら、本出願で開示するデバイスは、流路のサイズおよび配置を工夫することで、基材に形成した流路を用いてトンネル電流により核酸配列を読取れるという顕著な効果を奏する。
［サンプル液の調整による核酸の移動速度について］
＜実施例６＞
次に第１テーパー流路３３を形成した際に、電気泳動による核酸の流れを確認する実験を行った。
（１）デバイスの作製
染色した核酸を光学顕微鏡で観察する関係上、実施例２で作製したデバイスより流路が大きなデバイスを作製した。なお、実施例６では核酸配列を読取る実験ではないことから、測定用電極４を形成しなかった。測定用電極４を形成しなかった以外は、実施例１の手順にしたがってデバイスを作製した。実施例６で作製したデバイスのサイズは、Ｗ１＝Ｗ１ａ＝１μｍ、Ｗ２＝Ｗ２ａ＝１０μｍ、Ｌ１＝Ｌ１ａ＝２０μｍ、Ｌ２＝２０μｍであった。流路３の深さは２０ｎｍであった。
（２）サンプル液の調整
核酸にはλＤＮＡ（ＮＩＰＰＯＮ ＧＥＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた。購入したλＤＮＡは精製することなくそのまま用いた。ＹＯＹＯ－１（登録商標） Ｉｏｄｉｄｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）でλＤＮＡを染色した。
（サンプルａ：ｗｉｔｈｏｕｔ ＰＶＰ）染色したλＤＮＡを、０．１×Ｔｒｉｓ－Ｂｏｒａｔｅｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ＴＢＥ）バッファーに溶解した。
（サンプルｂ：ｗｉｔｈ ＰＶＰ）染色したλＤＮＡを、０．１ｗ／ｖ％ ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ－ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（ＰＶＰ）を含む０．０５×ＴＢＥバッファーに溶解した。
何れのサンプルも、ＴＢＥバッファーのｐＨは７．８で、λＤＮＡの濃度は０．１μｇ／ｍＬであった。
（３）核酸電気泳動
作製したデバイスに直流５Ｖの電圧を印加した。核酸の移動は光学顕微鏡により観察した。図９に測定結果を示す。なお、図９の縦軸のｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｘ）は、サンプル測定流路３２に相当する最も幅が狭い流路の中間位置である。ＰＶＰを含むサンプルｂに含まれるλＤＮＡの移動速度は、ＰＶＰを含まないサンプルａに含まれるλＤＮＡより速かった。これは、ＰＶＰがデバイス１の第１テーパー流路３３で発生する電気浸透流（ＥＯＦ）を抑制したためと考えられる。本出願で開示するデバイス１をトンネル電流測定方法または核酸配列読取方法に用いる場合、核酸の読取速度を向上するためには、ＰＶＰ等の界面活性剤を添加することが好ましいことが明らかとなった。
［第１テーパー流路３３の形状について］
＜実施例７＞
次に第１テーパー流路３３の形状がサンプルの移動速度に与える影響について確認する実験を行った。
（１）デバイスの作製
実施例６に記載のサイズのデバイス（以下、「Ｄｅｖｉｃｅ ｂ」と記載する。）のＷ１およびＷ１ａを以下のとおり変更したデバイスを作製した。Ｗ１およびＷ１ａ以外のサイズはＤｅｖｉｃｅ ｂと同様である。
Ｄｅｖｉｃｅ ａ：Ｗ１＝Ｗ１ａ＝５μｍ
Ｄｅｖｉｃｅ ｃ：Ｗ１＝Ｗ１ａ＝０．５μｍ
（２）サンプル液の調整
サンプル（ビーズ）には、４０ｎｍ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ（登録商標） Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ－Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｙｅｌｌｏｗ－ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｃｏ． Ｌｔｄ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いた。ビーズを、０．１ｗ／ｖ％ ＰＶＰを含む０．１×ＴＢＥバッファーに２×１０12個／ｍLとなるように懸濁した。
（３）電気泳動
作製したデバイスに直流５Ｖの電圧を印加した。
測定結果を図１０に示す。図１０中のＸはサンプル測定流路３２に相当する部分（図１ＡのＬ２）を表し、Ｙは第１テーパー流路３３の入口から第２テーパー流路３５の出口（図１ＡのＬ１＋Ｌ２＋Ｌ１ａ）に相当する部分を表す（以下、Ｙに相当する部分を「微細流路部分」と記載することがある。）。図１０の測定結果から、図１１に示す解析を行った。図１１（ｂ）は、Ｄｅｖｉｃｅ ａ～ｃを個々のビーズが通過する時の位置と移動速度とをプロットしたグラフである。図１１（ｃ）は、Ｄｅｖｉｃｅ ａ～ｃを個々のビーズが通過する時の位置と加速度をプロットしたグラフである。図１１（ｄ）は図１１（ｂ）の拡大図、図１１（ｅ）は図１１（ｃ）の拡大図である。なお、図１１（ｂ）～（ｅ）は概略を示す図であることから、プロットのシンボルは全て●で表されている。
図１１の解析結果および明らかとなった点は以下のとおりである。
（１）第１テーパー流路３３の形状により、ビーズの移動速度および加速度が異なった。
（２）図１１（ｂ）および（ｄ）に示すように、Ｄｅｖｉｃｅ ａ～ｃの何れのデバイスにおいても、微細流路部分に入る前後のビーズの移動速度は安定していたが、微細流路部分に入った後は移動速度が速くなった。そして、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ０をピークに、微細流路部分の出口に向かって、速度が遅くなった。１０個のビーズのトレースデータから計算した速度（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ（ｘ）での速度）は以下のとおり。
Ｄｅｖｉｃｅ ａ：２２５±６３μｍ／ｓ
Ｄｅｖｉｃｅ ｂ：１４５±２３μｍ／ｓ
Ｄｅｖｉｃｅ ｃ：４５±２７μｍ／ｓ
一般に、サンプル粒子の速度ｖは、電気泳動速度ｖｅｐと流路からの電気浸透流の速度ｖｅｏの合計によって決定される。それぞれの速度、すなわちｖｅｐとｖｅｏは、ＤＣ電界Ｅとｖの間の比例関係であるため、次の式で与えられる。
ｖ＝ｖｅｐ＋ｖｅｏ＝（μｅｐ＋μｅｏ）Ｅ（１）
Ｄｅｖｉｃｅ ａ～ｃの全てのデバイスの微細流路部分に安定した電界が形成されていることが示唆され、安定したフロー制御が可能であることがわかった。
（３）図１１（ｃ）および（ｅ）に示すデータから、微細流路部分の加速領域（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ０より左側）の最大加速度は以下のとおり。
Ｄｅｖｉｃｅ ａ：５２μｍ／ｓ2
Ｄｅｖｉｃｅ ｂ：４８６μｍ／ｓ2
Ｄｅｖｉｃｅ ｃ：１２６４μｍ／ｓ2
以上の計算結果から明らかなように、Ｗ２／Ｗ１の値を大きくするほど（第１テーパー流路３３のテーパーの角度を大きくするほど）、加速度が大きくなった。加速度が大きくなると微細流路部分が受ける力も大きくなり、核酸等の細長サンプルのエントロピー解離エネルギーに寄与し、細長サンプルを伸長できる。また、加速度が大きくなると測定用電極の隙間Ｇを通過する単位時間当たりのサンプル数（核酸数）を多くできる。また、単位時間当たりに測定用電極を通過するサンプル数（核酸数）を同じとした場合、Ｗ２／Ｗ１を小さくするほど電気泳動用電圧の値を小さくできるので、電気泳動用電圧に由来する測定ノイズを更に低減できる。
（４）以上のとおり、サンプル投入流路３１からサンプル測定流路３２に向けて第１テーパー流路３３の幅を狭くする割合を調整することで、サンプルの読取速度の向上および／または電気泳動用電圧に由来する測定ノイズの低減、核酸等の細長サンプルの伸長等の効果を相乗的に奏することを確認した。
本出願で開示するデバイスを用いると、サンプルが測定用電極４を通過する際に発生するトンネル電流を測定する際に、電気泳動用電圧に由来するノイズを低減できる。したがって、分析機器産業における分析装置の開発に有用である。
１…デバイス、２…基材、２ａ…基板、２ｂ…絶縁層、２ｃ…堆積層、２ｄ…レジスト層、３…流路、３１…サンプル投入流路、３２…サンプル測定流路、３３…第１テーパー流路、３４…サンプル回収流路、３５…第２テーパー流路、４、４ａ、４ｂ…測定用電極、
５…カバー部材、６、６ａ、６ｂ…電気泳動用電源、６１…電気泳動用第１電極、６２…電気泳動用第２電極、７…測定部、７ａ…トンネル電流検出部、７ｂ…トンネル電流測定用電源、８…解析部、９…表示部、１０…プログラムメモリ、１１…制御部、１００…トンネル電流測定装置、１００ａ…核酸配列読取装置

Claims (11)

  1. トンネル電流の測定に用いられるデバイスであって、該デバイスは、
    基材と、
    基材に形成された流路と、
    サンプルが通過した時のトンネル電流を測定するための一対の測定用電極と、
    を含み、
    流路は、
    サンプル投入流路と、
    測定用電極が配置されるサンプル測定流路と、
    サンプル投入流路とサンプル測定流路との間に配置され、サンプル投入流路からサンプル測定流路に向けて流路幅が狭くなる第１テーパー流路と、
    サンプル測定流路を通過したサンプルを回収するサンプル回収流路と、
    を含み、
    第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅が２０ｎｍ～２００ｎｍである
    デバイス。
  2. 第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅をＷ１と規定し、第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の幅をＷ２と規定した時に、Ｗ２／Ｗ１が１０～２０であり、
    第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分および第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の長さをＬ１と規定した時に、Ｌ１／Ｗ２が０．５～５である
    請求項１に記載のデバイス。
  3. サンプル測定流路の長さが、２０ｎｍ～１０００ｎｍである
    請求項１または２に記載のデバイス。
  4. サンプル測定流路とサンプル回収流路との間に配置され、サンプル測定流路からサンプル回収流路に向けて流路幅が広くなる第２テーパー流路を含む
    請求項１～３のいずれか一項に記載のデバイス。
  5. サンプル測定流路と第２テーパー流路の接続部分の幅をＷ１ａと規定し、
    第２テーパー流路とサンプル回収流路の接続部分の幅をＷ２ａと規定し、
    第２テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分および第２テーパー流路とサンプル回収流路の接続部分の長さをＬ１ａと規定した時に、
    Ｗ１＝Ｗ１ａ、Ｗ２＝Ｗ２ａ、および、Ｌ１＝Ｌ１ａの関係を満たす
    請求項１～４のいずれか一項に記載のデバイス。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のデバイスと、電気泳動用電源と、測定部と、を含み、
    電気泳動用電源は、電気泳動用電極に１０ｍＶ～５Ｖの電圧を印加する
    トンネル電流測定装置。
  7. 請求項６に記載のトンネル電流測定装置と、解析部と、を含み、
    サンプルが核酸であり、
    解析部は、トンネル電流測定装置で取得したトンネル電流の測定結果から核酸配列を特定する
    核酸配列読取装置。
  8. デバイスを用いたトンネル電流測定方法であって、
    デバイスは、
    基材と、
    基材に形成された流路と、
    サンプルが通過した時のトンネル電流を測定するための一対の測定用電極と、
    を含み、
    流路は、
    サンプル投入流路と、
    測定用電極が配置されるサンプル測定流路と、
    サンプル投入流路とサンプル測定流路との間に配置され、サンプル投入流路からサンプル測定流路に向けて流路幅が狭くなる第１テーパー流路と、
    サンプル測定流路を通過したサンプルを回収するサンプル回収流路と、
    を含み、
    第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅が２０ｎｍ～２００ｎｍであり、
    トンネル電流測定方法は、
    サンプル投入流路およびサンプル回収流路に電圧を印加することで、サンプル投入流路のサンプルをサンプル回収流路に向けて電気泳動するサンプル電気泳動工程と、
    サンプル測定流路に配置された一対の測定用電極の隙間をサンプルが通過する時のトンネル電流を測定する測定工程と
    を含む、トンネル電流測定方法。
  9. サンプル電気泳動工程において、１０ｍＶ～５Ｖの電圧が印加される
    請求項８に記載のトンネル電流測定方法。
  10. 第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分の幅をＷ１と規定し、第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の幅をＷ２と規定した時に、Ｗ２／Ｗ１が１０～２０であり、
    第１テーパー流路とサンプル測定流路の接続部分および第１テーパー流路とサンプル投入流路の接続部分の長さをＬ１と規定した時に、Ｌ１／Ｗ２が０．５～５である
    請求項８または９に記載のトンネル電流測定方法。
  11. サンプルが核酸であり、
    請求項８～１０のいずれか一項に記載のトンネル電流測定方法の測定工程により得られたトンネル電流の測定結果から、核酸配列を特定する核酸配列読取工程
    を含む、核酸配列読取方法。
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