CN107980061A - 使用导电聚合物的游离dna捕获平台以及该平台的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了使用导电聚合物检测游离DNA的结构及其应用。具体而言,本发明公开了由用于分离和检测游离DNA的表面修饰的导电聚合物构成的纳米结构。通过使用所述纳米结构,包括循环肿瘤DNA在内的游离DNA可被有效检测和分离。
Description
技术领域
本发明涉及使用导电聚合物检测游离DNA(cell-free DNA)的结构及其应用,更加具体而言,本发明涉及用于分离和检测游离DNA(例如,循环肿瘤DNA)的由表面修饰的导电聚合物构成的纳米结构。
背景技术
循环游离DNA的存在最先于1948年由Mandel和Metais报道。已在多种生理和病理条件(例如,炎性病变,氧化应激和恶性肿瘤)下对循环游离DNA(cfDNA)进行了研究。在健康的受试者体内,cfDNA的血液浓度为0-100ng/ml并且其平均血液浓度为30ng/ml。假设正常细胞中DNA的含量为6.6pg,该值对应于平均每毫升血液中0至15,000基因组等同物并且基因组的平均数目为5000/ml。在此,大多数DNA是双链并且作为核蛋白复合物存在。
虽然与游离DNA释放进入血流有关的准确机理尚不清楚,但是游离DNA释放进入血流似乎受到细胞凋亡,坏死和细胞中的活性释放的组合的影响。
循环游离DNA是一种潜在的有用生物标志物。DNA水平和碎裂模式显示了用于诊断和预后目的的极大的可能性。最近,Bartoov等人介绍了一种基于对受试者的体液样本中的cfDNA进行测量来评估男性受试者的生育能力的方法(WO2008/047364)。他们还说明了一种通过给药DNase治疗生育能力低的男性的方法。进一步而言,游离DNA被认为是用于无创监控恶性和良性增殖和炎性病症(例如,子宫内膜异位症)的生物标志物。
具体而言,在根据检测癌症特异性基因的方法诊断和监控癌症方面,采用循环游离DNA中的循环肿瘤细胞(CTC)或循环肿瘤DNA(ctDNA)(其提取并分离自血液)的无创检测预期会在癌症的诊断领域做出贡献。
使用无创血液样本的癌症诊断方法是一种非常引入关注的方法并且目前已吸引的大量关注。如果可从血液样本中有效分离或捕获CTC和ctDNA,那么它们可形成诊断和治疗策略的基础。此外,因为可定期选择由于对抗癌药物具有耐受性而产生的靶向肿瘤的基因改变的治疗方法,所以传统癌症的治疗可被最大化。
在患有各种不同的恶性实体肿瘤的患者的血液中作为上皮细胞存在的循环肿瘤细胞(CTC)源自原发性肿瘤克隆并且是恶性的(Fehm等人,[Clin.Cancer Res.8:2073-84,2002])。此外,已经报道了CTC可被认为是独立于癌症发展的诊断。
鉴于多种原因,在管理患者方面重要的是检测和计算循环肿瘤细胞。循环肿瘤细胞可在原发性肿瘤形成之前进行检测,由此产生早期诊断。因为循环肿瘤细胞对治疗产生响应并且数量会减少,所以,CTC的计算可监控给定治疗方案的效果。这样的循环肿瘤细胞可用作监控如下患者体内疾病复发的工具,所述患者被给予佐剂并具有不可预期的疾病。
血液中具有非常少的CTC和ctDNA。例如,每108个至109个血液细胞中具有大约1个CTC和ctDNA。因此,已设计了几种CTC分离方法。例如,使用微流体装置的方法,其中,捕获抗体与磁性颗粒结合,所述磁性颗粒上固定有抗EpCAM(上皮细胞粘附分子)抗体,或者所述捕获抗体与具有柱状结构的树脂表面结合,等等,已知的分离方法是通过利用CTC与血液细胞之间的尺寸差异的过滤器等进行分离的方法(Isolation of rare peripherycirculating tumor cells in cancer patients by microchip technology.SunithaNagrath等人,Nature,2007,450:1235-1239)。
为了提取ctDNA,通常使用商售试剂盒。在Qiagen循环核酸试剂盒中,使用带正电荷的二氧化硅膜引入DNA附着,并且所附着的DNA通过改变pH进行分离。然而,使用该试剂盒,采集效率仍然很低。
法国的Laurent研究组介绍了一种使用基于液滴的数字PCR通过识别肾癌患者的血浆中存在的ctDNA而对KRAS肿瘤形成基因进行量化的技术。美国Pennsylvania大学的Diamond研究组研究了使用带正电荷的聚乙烯亚胺纳米颗粒附着带负电荷的DNA。具体而言,该技术通过将光可裂解的配体附着于纳米颗粒表面并随后用光辐照被配体捕获的DNA而进行有效分离。中国德州学院的Wang研究组,使带正电荷的聚合物附着于磁性纳米颗粒并随后通过改变pH实现基因DNA的有效附着和分离。
然而,目前检测DNA的方法还有许多问题。首先,具有诸如较长的检测时间、过程复杂、成本较高并且采集效率低之类的问题。具体而言,因为ctDNA是在晚期癌症患者体内检测到而非早期癌症患者体内,因此,亟需一种超灵敏的检测/分离技术。
由此,本发明的发明人确认了通过使由导电聚合物制备的纳米结构的表面带上正电荷来大大提高ctDNA的纳米结构附着,并且通过电信号使ctDNA从纳米结构中有效释放出来并完成本发明。
发明内容
因此,鉴于上述问题作出了本发明,本发明的主要目的在于提供使用导电聚合物检测和/或分离游离DNA(cfDNA)的结构以及包含该结构的试剂盒。
本发明的另一目的在于提供使用导电聚合物检测和/或分离cfDNA的方法。
本发明的又一目的在于基于cfDNA的检测和分离结果提供用于诊断癌症的发作和预后的信息。
本发明的再一目的在于提供基于cfDNA的检测和分离结果诊断癌症的发作和预后的方法。
根据本发明,上述目的和其他目的可通过提供用于检测和分离游离DNA的结构来完成,所述游离DNA优选为循环肿瘤DNA(ctDNA),所述结构包括表面修饰的导电聚合物。
在本文中,因为游离DNA带有负电荷,所以表面修饰的导电聚合物优选地带有正电荷。
纳米结构可具有纳米芯片形状、纳米点形状、纳米棒形状或纳米线形状,但不限于此。
导电聚合物可选自:聚乙炔、聚苯胺、聚吡咯、聚噻吩和聚硫氮化物。最优选地,所述导电聚合物是聚吡咯。
根据本发明的另一方面,本发明提供用于检测和分离游离DNA的试剂盒,其中,所述试剂盒包括所述结构。
根据本发明的又一方面,本发明提供用于检测和分离游离DNA的方法,所述方法包括:
(i)使形成纳米结构的导电聚合物的表面带正电荷;
(ii)用生物物质处理所述导电聚合物以使cfDNA附着至所述导电聚合物;以及
(iii)采用所述导电聚合物检测cfDNA或通过施加电信号使cfDNA从所述导电聚合物中释放出来。
在本文中,所述生物物质可以是血液、骨髓、胸腔积液、腹腔液、脊髓液、尿液或唾液,并且优选地为血液。
在步骤(ii)中,cfDNA优选地通过施加0.8V至1.2V的电信号持续20秒至40秒而被附着。
在步骤(iii)中,cfDNA优选地通过施加-1.3V至-1.0V的电信号持续4分钟至6分钟而被检测或分离。
基于所使用的导电聚合物的类型和待检测的DNA的类型,本领域技术人员可适当地控制电信号的幅值。
根据本发明的再一方面,本发明提供用于提供诊断受治者体内的癌症发作和预后的信息的方法,所述方法包括使用所述结构检测和/或分离样本中的循环肿瘤DNA(ctDNA),以及分析所检测的或所分离的ctDNA。
根据本发明的再一方面,本发明提供诊断受治者体内的癌症的发作和预后的方法,所述方法包括使用用于检测和分离游离DNA的结构检测/分离样品中的循环肿瘤DNA(ctDNA)以及分析所检测或所分离的ctDNA。
在本文中,所述癌症可选自:恶性肿瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病、恶性淋巴瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道癌和头颈癌。优选地,所述癌症是乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌或胰腺癌。
根据本发明的分析可包括分析样本中ctDNA的浓度、拷贝数或序列。在本文中,当ctDNA的数量(浓度)或拷贝数增加时可提供癌症发展或恶化的信息。
如上所述,根据本发明的由表面修饰的导电聚合物构成的纳米结构可用于涉及检测和分离循环游离DNA(cfDNA)的各种不同的应用中。
附图说明
通过下文的详细描述并结合附图可更加清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征以及其他优势,其中:
图1图示性地举例说明了使用本发明的纳米结构Ppy/Au NW检测和分离循环游离DNA(cfDNA)的方法。
图2举例说明了本发明的纳米结构Ppy/Au NW的俯视FE-SEM图像。
图3举例说明了根据导电聚合物聚吡咯的氧化-还原捕获和释放DNA的机制。
图4A至图4F举例说明了通过控制电压和时间,本发明的纳米线结构与cfDNA的附着和分离能力的评估结果,图4G举例说明了使用本发明的导电聚合物聚苯胺(PANI)和聚噻吩(PEDOT)的纳米线结构与cfDNA的附着和分离能力与聚吡咯(Ppy)纳米线结构的附着和分离能力的比较结果。
图5A举例说明了对导电聚合物聚吡咯的平面结构及其纳米结构与cfDNA的附着和分离能力的评估结果。
图5B举例说明了对尺寸为1.0μm的纳米结构与cfDNA的附着和分离能力的基于浓度的评估结果。
图5C和图5D举例说明了在将不同尺寸的DNA分散至正常人的血浆中之后与cfDNA的附着和分离能力的评估结果。
图6A举例说明了在分别采用本发明的纳米线结构和商售Qiagen试剂盒从正常人、乳腺癌患者和肺癌患者的血液中分离cfDNA之后,分离的cfDNA的浓度比较结果。
图6B举例说明了在分别采用本发明的纳米线结构和商售Qiagen试剂盒从乳腺癌患者和肺癌患者的血液中分离cfDNA之后,通过电泳检测是否存在分离的cfDNA的结果。如图所示,观察到采用本发明的纳米线结构分离的cfDNA以小片段的形式存在,该小片段是癌症特异性ctDNA的特征。另一方面,通过商售Qiagen试剂盒的方式分离的cfDNA具有较低的浓度并且因此在所有患者中均未观察到分离的cfDNA。
图7举例说明了使用作为导电聚合物的聚吡咯纳米结构通过电刺激而附着并分离的cfDNA(左图和中间图)的共聚焦显微图像。
图8举例说明了在分别使用Qiagen试剂盒和纳米结构Ppy/Au NW捕获存在于乳腺癌患者和肺癌患者的血液中的cfDNA之后,捕获的cfDNA的PCR扩增比较结果。
图9举例说明显示基于所应用的电压通过不同粗糙度的聚吡咯的平面结构分离(释放)血液中的循环cfDNA的图。
具体实施方式
本发明中使用的术语如下定义。
术语“受治者”或“患者”是指任何需要治疗的单独的受治者,其包括人类、牛科动物、犬科动物、豚鼠、兔子、鸡、昆虫,等等。此外,所述受治者包括任何如下受治者或者用作对照的受治者,所述受治者没有表现出与某些疾病相关的临床特征并且参与临床测试研究或流行病学研究。在本发明的实施方式中,所述受治者是人类。
术语“循环肿瘤细胞(CTC)”是指在受治者的样本中检测到的任何癌细胞。CTC通常是从实体肿瘤剥落的上皮细胞,在晚期癌症患者的循环血液中检测到非常低浓度的循环肿瘤细胞。CTC还可衍生自原发性肿瘤、继发性肿瘤或三级肿瘤。“循环肿瘤细胞(CTC)”包括通常在循环血液中无法检测到的非肿瘤细胞,以及癌细胞,所述非肿瘤细胞例如,循环上皮细胞或内皮细胞。因此,肿瘤细胞和非肿瘤上皮细胞也包括在本发明的CTC的范围内。
术语“癌症”包括本领域已知的各种不同的癌症类型,包括但不限于:发育异常、增生、实体肿瘤和造血系统癌症。已知许多癌症类型转移并扩散循环肿瘤细胞并且是转移的,等等,例如,从转移的原发性癌症衍生而来的继发性癌症。其他癌症的实例可包括但不限于下列器官或系统的癌症:脑、心脏、肺、胃肠道、泌尿生殖道、肝、骨、中枢系统、妇科、血液系统、皮肤、乳腺和肾上腺。其他类型的癌细胞的实例包括但不限于:神经胶质瘤(神经鞘瘤、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤),神经母细胞瘤,嗜铬细胞瘤,副神经节瘤,脑膜瘤,肾上腺皮质瘤,髓母细胞瘤,横纹肌肉瘤(rhabdomyoscarcoma),肾癌,各种不同类型的血管癌,成骨细胞性骨肉瘤(osteoblastic osteocarcinoma),前列腺癌,子宫癌,子宫肌瘤,唾液腺癌,脉络丛肿瘤,乳腺癌,胰腺癌,结肠癌和巨核母细胞白血病;以及皮肤癌,包括恶性黑色素瘤,基底细胞瘤,鳞状细胞癌,卡波济肉瘤,痣(moles,非典型痣(dysplastic nevi),脂肪瘤,血管瘤,皮肤纤维瘤,瘢痕瘤,诸如纤维肉瘤或血管肉瘤之类的肉瘤以及黑色素瘤。
术语“样本”是指适用于根据本发明的方法的任何样本。样本的供给来源包括全血,骨髓,胸腔积液,腹腔液,中枢脊髓液,尿液,唾液和支气管冲洗液。一方面,所述样本是血液样本,包括例如:全血或其任意部分或组分。适用于本发明的血液样本可提取自任何来源,包括血细胞或其组分,例如,静脉血、动脉血、外周血、组织、脐带血,等等。
术语“蛋白质”包括具有与天然蛋白质相同的生物活性或功能的蛋白质片段、类似物和衍生物。
术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式,例如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。该术语仅指分子的初级结构,即,单链或双链DNA或RNA。其还包括已知的修饰类型,例如,本领域已知的标记物,甲基化,“帽子”,用类似物对天然生成的核苷酸中的一个或多个进行取代,核苷酸间修饰(例如,采用不带电荷的连接体(例如,甲基磷酸酯,磷酸三酯,磷酰胺酯(phosphoamidate),氨基甲酸酯,等等)进行修饰和采用带电荷的连接体(例如,硫代磷酸酯,二硫代磷酸酯,等等)进行修饰),含有悬垂部分(例如,蛋白质(例如,核酸酶,毒素,抗体,信号肽,聚-L-赖氨酸,等等))进行修饰,采用嵌入剂(例如,吖啶,补骨脂素,等等)进行修饰,含有螯合剂(例如,金属,放射性金属,硼,氧化金属,等等)进行修饰,含有烷基化剂进行修饰,采用修饰的连接体(例如,α异头物核酸,等等)进行修饰,以及未修饰的多核苷酸形式。
术语“引物”是指与互补性RNA或DNA靶向多核苷酸杂交的并且能够充当通过例如核苷酸转移酶作用(其由于聚合酶链反应而进行)从单核苷酸逐步合成多核苷酸的合成起始点的寡核苷酸序列。
术语“功能等同物”是指通过一个或多个取代、删除或添加而相对于参比序列发生改变的核苷酸序列和氨基酸序列,例如,突变体序列,所述一个或多个取代、删除或添加的净效应不会在参比序列与目标序列之间产生不利的功能不类似性。根据本发明,基本等同物(例如突变体或氨基酸序列)优选地与所列出的氨基酸序列具有至少80%的序列一致性,更优选地具有至少90%的序列一致性。本发明的基本等同的核苷酸序列可具有较低百分比的序列一致性,例如,当考虑到基因编码的冗余或简并时。优选地,核苷酸序列具有至少约65%的一致性,更优选地具有至少约75%的一致性,最优选地具有约95%的一致性。
抗癌药物的“耐受性”是指癌细胞基因响应抗癌药物而发生了改变,并且因此癌细胞避开了抗癌药物的攻击,从而降低了抗癌治疗的疗效。术语“耐受性”可以与术语“耐药性(resistance)”相同的含义使用。
“治疗”是获得有益的或期望的临床结果的方法。疾病、失调或病症的“治疗”或“缓解”是指相对于未对病症、失调或疾病进行治疗的情况而言,病症、失调或疾病的严重程度和/或不期望的临床症状得到减少和/或病症、失调或疾病的进展得到延迟或拖延。例如,在治疗肥胖方面,体重降低,例如,体重减少至少5%是理想的结果。实现本发明的目的的有益的或期望的结果可包括但不限于:减轻或改善一种或多种症状,降低疾病程度,稳定疾病状态(即,不恶化),延迟或减慢疾病进展,改善或缓解疾病状态,以及(部分或全部)缓解,无论疾病是否是可检测到的。“治疗”还可意味着相对于未进行治疗的期望生存期使生存期得到延长。此外,“治疗”并不必须通过给药单一剂量来完成并且通常通过给药连续剂量来完成。因此,可一次或多次给药治疗有效量,足以缓解疾病、失调或病症的量或足以治疗疾病、失调或病症的量。
术语“约”是指相对于参比量、参比水平、参比值、参比数、参比频率、参比百分比、参比维度、参比尺寸、参比量、参比重量或参比长度发生30%、25%、20%、15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%的改变的量、水平、值、数、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量或长度。
在本说明书的全文中,应当理解的是,诸如“包含(comprise和/或comprising)”之类的术语意在表明存在步骤或要素或一组步骤或要素并且无意排除可能存在或添加一个或多个其他步骤或要素或其组的可能性,除非另有说明。
下文将对本发明进行详细描述。
本发明涉及使用导电聚合物检测和分离游离DNA的结构及其应用。
具体而言,本发明涉及由表面修饰的导电聚合物构成的纳米结构及其应用,该纳米结构有效检测和分离包括循环肿瘤DNA在内的游离DNA。
<导电聚合物>
根据本发明的用于检测游离DNA的结构由导电聚合物构成。
因为导电聚合物具有金属或半导体的电性质、磁性质、光学性质并带有聚合物的延展性和易制造性,导电聚合物是广泛用作各个工业领域以及化学和物理领域中的有用材料。具体而言,导电聚合物具有各种不同的优势,例如,易加工性,高导电性,优异的体相容性,环境稳定性和可逆的体积变化,因此,可用于生物传感器,组织工程,神经探针,药物递送,生物操作器。
可在本发明中使用的导电聚合物的实例包括但不限于:聚吡咯、聚乙炔、聚苯胺、聚噻吩、聚硫氮化物及其衍生物。
优选的导电聚合物的实例包括聚吡咯。聚吡咯在体内具有优异的稳定性并且由于氧化而产生重复扩展且由于还原而产生收缩,因此,其可选择作为医疗操作器的材料和用于体内移植的微型泵。具体而言,导电聚合物由于电聚合过程中的阴离子的掺杂/去掺杂机制表现出可逆的体积扩展和收缩现象,因此其作为药物递送材料而吸引了很多关注。此外,根据电聚合,聚吡咯可通过氧化-还原反应涂覆在导电膜上并且用于制造化学传感器、生物传感器、超级电容器等方面的实际目的。
聚吡咯可根据如下方法合成或可使用商售聚合物。
具体而言,当使用聚吡咯时,聚吡咯纳米结构的电荷仅仅通过电刺激而改变,因此,不需要进行根据DNA分离的传统预处理工艺。此外,附着至聚吡咯表面的DNA还可易于通过电刺激进行收集,无需单独的工艺。
在下文中,除非另有说明,化合物包括化合物自身,其药学上可接受的盐,水合物,溶剂化物,异构体和前药。
导电聚合物化合物可根据本领域已知的方法、其改良方法等进行制备,并且还可购买和使用商售化合物。也就是说,可对基于本领域的技术的各种不同的方法进行适当地改良并参考通常已知的方法使用。例如,可成功地进行对于本领域技术人员而言显而易见的改良,例如,对干扰基团进行适当地保护,用本领域通常已知的另一试剂进行取代,或根据通用方式改变反应条件。
<由导电聚合物形成的结构>
一方面,本发明涉及用于cfDNA检测或分离的导电聚合物及其应用,优选地,用于ctDNA检测或分离的结构及其应用。
具体而言,如图3所示,对构成所述结构的导电聚合物进行电化学表面修饰,由此增加循环游离DNA的附着性质和特异性。
电化学表面修饰
将生物材料固定至电沉积的导电聚合物的技术需要识别分析物。
在各种不同的固定技术中,本发明使用电化学活化聚合物表面以将生物材料固定至聚合物的方法。通过该方法,使期望的材料带有正电荷或负电荷,从而选择性地固定至期望的位点。
优选地,导电聚合物的表面通过电刺激进行修饰并且由此带有正电荷以促进带有负电荷的DNA的分离。
可用于改变由导电聚合物构成的纳米结构的表面性质的带有正电荷的物质优选地选自下列物质中的一种或多种:氨基硅烷(包括氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)),尼龙,硝基纤维素,亚精胺和聚赖氨酸。因为纳米结构的带正电荷的表面的性质取决于带正电荷的材料的类型及其处理浓度,所以,DNA的尺寸可根据纳米结构的表面性质来确定,该尺寸受到在纳米结构的表面上进行处理的材料类型或材料的处理浓度的控制。
明显的是,在结构形成之前或之后或者在结构形成之时,由本领域技术人员适当地执行对导电聚合物的表面的修饰。
由表面修饰的导电聚合物构成的用于cfDNA检测或分离的结构可以是平面结构或纳米结构。
在本发明的实施方式中,纳米结构用于将导电聚合物修饰为与体内环境类似。
在非限制性实例中,可使用三维生物模拟结构,例如,纳米多孔结构或纳米线结构。这样的纳米结构与体内的细胞外基质类似,因此,改善了细胞的体内生长和分化并使得与活组织的相互作用最大化。
可根据通常已知的方法制造纳米结构。例如,可使用杂交方法,例如,(i)气相颗粒生长方法,包括在纳米颗粒合成中使用的激光热解或在薄膜沉积中使用的原子层沉积,(ii)液相生长方法,包括用于形成纳米颗粒的胶体方法和单层磁性结合技术,(iii)固相颗粒制备方法,例如,相分离方法,以制备金属纳米颗粒,(iv)气-液-固(VLS)纳米线生长方法,等等。
在本发明中,可使用模具中通过电学方法制造的并在溶液中生长或各向异性生长的纳米棒或纳米线。可由导电聚合物形成的纳米结构的形状不受到特定的限制,但是最优选地,纳米结构被制造为纳米线结构。
纳米线是指直径为纳米级且长度为几百纳米至微米级的结构。
纳米线的尺寸和界面性质以及电学性质可在其合成过程中准确地控制。这样合成的大量纳米线可有利地进行平行组装。
最近,模具聚合广泛用于制造功能纳米材料。聚合得到的纳米结构的长度、直径和密度可由不同的模具类型和沉积条件控制。
优选地,通过阳极处理生成的具有纳米孔的阳极氧化铝(AAO)可用作模板。多孔AAO主要用作用于生成由金属或陶瓷制成的纳米线或纳米管的通用模板。AAO是热稳定的并且在较高密度(109至1011/cm2)条件下具有垂直排布的纳米通道。在本发明的实施方式中,具有纳米孔的Au纳米线使用通过阳极处理生成的AAO生产。
在本发明的无需支撑物的纳米线结构中,对每个纳米线列的表面进行修饰,由此大大提高对ctDNA的附着,并且,此外,由于各种不同的长度和直径产生了较宽的表面积,本发明的纳米线结构具有大大提高的检测作用。
在另一实施方式中,本发明的导电聚合物可以平面结构的形式简单制造,以待使用。
通过本发明的实施例已确定,上述纳米结构可简单地制造成平面结构形式并且可在涂覆聚合物之后通过电化学方法修饰聚吡咯聚合物的表面制造成纳米线,由此,对ctDNA的附着大大提高并且ctDNA的检测效率可通过电压控制而提高。
这样,由本发明的导电聚合物构成的结构仅响应外部电刺激,并且由此仅通过电信号分离附着的ctDNA。因此,可特异性地且有效地检测ctDNA。
<cfDNA>
由本发明的导电聚合物构成的结构用于检测和分离循环游离DNA(cfDNA),尤其用于检测和分离循环肿瘤DNA(ctDNA)。
循环游离DNA是从血液中存在的细胞中释放出来的所有类型的DNA的统称。无论DNA的起源和来源,可根据本发明对所有类型的DNA进行检测或分离。然而,最优选地,循环游离DNA可以是从循环肿瘤细胞(CTC)中释放出来的循环肿瘤DNA(ctDNA)。
来自癌症患者的血液包括肿瘤DNA片段,即,ctDNA,该肿瘤DNA片段由于细胞凋亡和坏死通过癌细胞的死亡被释放进入血液。总体而言,血液中正常细胞中的内含物被巨噬细胞立即处理,但是从被破坏的癌细胞中释放出来的ctDNA的量大于可被吞噬细胞处理的量。已有报道,在癌症患者带有100g肿瘤的情况下,即,3X 1010个癌细胞的情况下,每天有高达3.3%的cfDNA被释放进入血液。平均来说,ctDNA以具有70个至200个碱基对的小片段至具有21千碱基对的大片段存在。然而,大多数癌症衍生的cfDNA以200bp或更少的小片段存在。
总体而言,正常人的血液中的DNA的平均数量小于30ng/ml,而癌症患者血液中的ctDNA的平均数量为180ng/ml。在原发性癌症患者的情况下,在除去肿瘤部分之后,血液中存在的ctDNA的量减少至正常个体血液中存在的ctDNA的量的一半。另一方面,在转移性癌症患者的情况下,仍然显示出较高的ctDNA值。
因此,ctDNA在检测初始癌症和监测治疗进展方面发挥至关重要的作用。也就是说,当检测到血液中存在的ctDNA时,所检测到的ctDNA可成为了解肿瘤状态的重要线索。
具体而言,因为ctDNA的半衰期小于两小时,所以,其可提供与肿瘤有关的最新的非常有用的信息,即,癌症细胞特异性突变和其他基因变化。
传统蛋白质标志物在如下方面是不利的:可能由非癌症进展、正常细胞导致血液中蛋白质浓度的增加,并由此可表现出假阳性检测。此外,由于大多数蛋白质标志物存在于血液中持续数周,因此,它们在给出与肿瘤的当前状态有关的准确信息方面具有一定限制。另一方面,本发明的经历检测或分离的cfDNA(优选ctDNA)可解决这些问题。
同时,用于检测或分离ctDNA的本发明的样本来源的实例包括全血、骨髓、胸腔积液、腹腔液、中枢脊髓液、尿液、唾液和支气管冲洗液。在优选的实施方式中,所述样本是血液样本,包括例如,全血或其任何部分或组分。
适用于本发明的血液样本的实例包括血液细胞或其组分。例如,血液样本可提取自包括静脉血、动脉血、外周血、组织、脐带血等在内的任何来源。例如,所述样本可根据通常已知的通用临床方法(例如,用于收集和处理全血的步骤)获取和处理。一方面,样本可以是例如从患有癌症的受治者体内收集的外周血。
样本的量(体积)可由本领域技术人员适当地选择和确定。样本的通用量为1ml至20ml,优选地为3ml至7ml。
总体而言,可将用作样本的体液(具体而言,血液)进行稀释,例如,用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(根据目的采用0.251mM含有EDTA的PBS)稀释2倍至20倍,随后进行过滤。具体而言,当血液量或血细胞数量很大时,可进行预处理。
<捕获方法>
另一方面,本发明涉及使用纳米结构检测和分离循环游离DNA(cfDNA)的方法。该方法的概念性示意图如图1所示。
在本发明的实施方式中,所述方法可包括下列步骤:
(i)使形成纳米结构的导电聚合物的表面带正电荷的步骤;
(ii)采用生物物质处理所述导电聚合物以使cfDNA附着至所述导电聚合物的步骤;以及
(iii)采用所述导电聚合物检测cfDNA或通过施加电信号使cfDNA从所述导电聚合物中释放出来的步骤。
如上所述,形成平面结构或使用具有各种不同的直径和长度的导电聚合物形成纳米结构,例如,纳米线结构或纳米芯片结构。随后,通过电化学方法修饰导电聚合物的表面。
在本文中,电化学方法可以是任何通常已知的方法。导电聚合物的表面可基于待检测或待分离的DNA的电荷性质进行修饰。在优选的实施方式中,导电聚合物的表面带有正电荷,从而促进带有负电荷的cfDNA的附着和分离。
具体而言,当由具有不同直径和长度的导电聚合物形成纳米结构时,该结构的表面变得粗糙,并且因此,体面积和表面积的比值增大。因此,更多量的cfDNA可附着至该结构的表面(DNA捕获)。此外,这样的结构可提高与cfDNA的相互作用。
接下来,采用这样的结构处理生物物质样本,优选地为血液,从而使游离DNA(cfDNA)附着至导电聚合物。
在本文中,cfDNA与导电聚合物的附着优选地通过施加0.8V至1.2V的电信号持续20秒至40秒来实施。
具体而言,当执行电聚合以增加具有平面结构的Ppy膜的表面粗糙度时,可使用各种不同的电压,即,0.8V至1.8V。在进行电聚合之后表面粗糙度会随着电压的增加而增加,因此,表面积大大增加并且DNA结合位点增加。因此,DNA捕获/释放效率增加。在实际分析中,将1.5V的电压加至0.1M的吡咯和0.01M PSS的混合溶液中持续5分钟,并且在该条件下,具有平面结构的Ppy膜表现出最高的DNA捕获效率。因此,该条件用作用于生产具有平面结构的Ppy膜的基本条件。平面Ppy膜通过在1.5V条件下进行5分钟的电聚合来生产,随后使Ppy表面的正电荷最大化,将+1.8V的电压施加于1M Tris-HCl缓冲液中持续2分钟以诱导Ppy的过氧化作用。在患者的血浆中孵育过氧化的平面Ppy膜,随后通过施加+1.0V的电压持续30秒以尝试进行DNA捕获。因此,可以确认具有平面结构的Ppy膜的DNA捕获效率类似于纳米结构的DNA捕获效率。将1.3V的电压的施加于捕获的DNA持续3分钟,从而有效释放DNA。
接下来,通过施加电信号解离并释放捕获的cfDNA。
在本文中,在纳米结构的情况下,施加约-1.3V至-1.0V的电信号持续4分钟至6分钟以从导电聚合物中释放游离DNA(cfDNA),随后施加1.3V至1.8V的氧化电压,最优选地施加1.3V氧化电压。此外,在平面结构的情况下,施加约-1.3V至-1.0V的电信号持续4分钟至6分钟以释放cfDNA,随后施加1.3V至1.8V氧化电压,最优选地,施加1.5V氧化电压。
此外,可使用标记物等观察释放的cfDNA。
测试中使用的特定标记物或可检测基团可以是由光谱方式、光化学方式、生物化学方式、免疫化学方式、电学方式、光学方式或化学方式检测的任何标记物并且具有可检测的物理或化学性质。因此,所述标记物是可由光谱方式、光化学方式、生物化学方式、免疫化学方式、电学方式、光学方式或化学方式检测的任何组合物。
有用的标记物的实例包括:AlexaFluor,荧光染料(Invitrogen),磁珠(例如,DynabeadsTM),荧光染料(例如,荧光异硫氰酸酯,德克萨斯红,罗丹明,等等),放射性标记物,其他造影剂(例如,微泡(例如,超声波)),酶(例如,辣根过氧化物酶,ELISA中通常使用的碱性磷酸酶,等等),以及色度标记物(例如,胶体金或彩色玻璃),或塑料(例如,聚苯乙烯,聚丙烯,乳胶,等等)珠。
用于检测标记物的方式是本领域技术人员已知的。例如,标记物是荧光标记物,所述荧光标记物可通过采用适当的光波长激发荧光色并检测所产生的荧光来进行检测。荧光可通过相机胶卷,电子检测器(例如,电荷耦合设备(CCD)或光电倍增管)等从视觉上进行检测。
本发明的方法具有下述优势。
(i)cfDNA易于附着和分离:可仅通过将正电压施加于导电聚合物持续一段较短的时间(例如,大约1分钟)而容易地附着cfDNA,优选ctDNA,以处理样本中的DNA并在大约1V条件下进行反应持续约30秒。此外,当施加约-1.3V的电压持续约5分钟以采集附着的DNA时,可采集90%或更多的附着的DNA。因此,在不使用传统的带有正电荷的聚合物或其他分子的条件下,DNA可附着至样本并从其中解离。
(ii)附着速率优异并且解离方法有效:在无需支撑物的纳米线结构的情况下,每个纳米线列的表面可被修饰并且因此可提供较宽的表面积,从而大大增加与ctDNA的附着。此外,因为作为导电结构的纳米线结构仅响应外部电刺激,所以附着的ctDNA可仅通过电信号解离。
(iii)还可分离存在于血液中的DNA以及存在于诸如唾液、尿液和粪便之类的体液中的DNA。
(iv)可检测小DNA片段。
<捕获试剂盒>
另一方面,本发明涉及用于检测或分离循环游离DNA(cfDNA)的试剂盒,其包括所述结构。
在本发明的实施方式中,本文提供DNA检测设备(试剂盒),其包括固体物质,所述固体物质包括表面修饰为带有正电荷的结构,用于将电压施加于所述固体物质中的结构的电极,以及用于测量在含有DNA的样本穿过所述结构时产生的电信号的测量部分。
根据需要,所述DNA检测设备还可包括用于储存样本的腔室,该腔室与固体物质附着并且在该腔室中储存施加于所述结构的样本。
DNA检测设备(试剂盒)包括用于测量生物样本中cfDNA的量的反应试剂。生物样本中的cfDNA的量可采用本领域通常已知的任何方式测量,例如,核酸染料(例如,嵌入剂,等等),但不限于此。
可用于测量cfDNA的量且包括在根据本发明的试剂盒中的DNA嵌入剂的非限定性的实例包括黄连素、溴化乙锭、原黄素、道诺霉素、阿霉素、沙利度胺、Sybr Green、SybrGold以及PicoGreen。
<其他应用>
另一方面,本发明涉及用于提供诊断受治者体内的癌症发作和预后的信号的方法,所述方法包括检测和分离循环肿瘤DNA(ctDNA)并对其进行分析。
此外,本发明涉及诊断受治者体内的癌症发作和预后的方法,所述方法包括检测和分离循环肿瘤DNA(ctDNA)并对其进行分析。
在本发明中,术语“癌症”代表或指代哺乳动物体内由非典型的且不受控的细胞生长表征的生理状态。待诊断的癌症选自:恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺瘤、黑色素瘤、白血病、恶性淋巴瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺瘤、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道癌和头颈癌。优选地,所述癌症是乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌或胰腺癌。
本发明的方法可用于评估癌症患者和具有癌症风险的人。本发明中公开的诊断或预测方法中的任何方法可用于提供一种或多种癌症指示物,例如,用于诊断或预测是否存在癌细胞或其他疾病的指示物。为了完成所述诊断或预测,可分析并表征样本中的ctDNA的量(浓度),拷贝数或序列。
ctDNA的分析和表征可在不同的间隔执行预定的时间以评估受治者体内疾病的发展和状态。例如,为了追踪疾病随时间的发展和状态,所述分析和表征可以定期的间隔(例如,每天、每两天、每周、每两周、每月、每两个月、每三个月、每六个月或每年)进行。
关于ctDNA的量(浓度)或拷贝数随时间的变化,两倍、五倍或十倍或更多倍的任何增加表明患者的预后恶化,并且这是表明需要对患者改变治疗的初步指示。类似地,两倍、五倍或十倍或更多倍的任何增加表明患者应当接受额外的测试、例如,造影,以进一步评估治疗的预后和对治疗的反应。
ctDNA的量和拷贝数随时间的任何减少表明疾病稳定以及患者对治疗的反应性,并且这是表明无需改变治疗的指示。在具有癌症风险的人体内,检测到的ctDNA量(浓度)或拷贝数的快速增加可提供表明患者体内的肿瘤已发展或增殖的早期预警并且可提供早期诊断。
在本发明的方法中,可进行另一分析以提供另一临床评估。例如,不同于影像分析,可使用基因表达分析和PCR技术(例如,用于获取关于从其中衍生得到ctDNA的肿瘤的类型、转移状态和恶性程度的信息的基因芯片分析)以及使用对特定癌症具有特异性的引物的多重PCR。此外,为了获取用于表征患者癌症的额外信息,可进行细胞尺寸分析、DNA或RNA分析、蛋白质组学分析或代谢组分析。在各个不同的方面,分析包括多重PCR,其使用从对下述标志物或引物中的一种或多种具有特异性的引物中衍生得到的抗体:EGFR,HER2,ERCC1,CXCR4,EpCAM,E-钙黏蛋白,粘蛋白-1,细胞角蛋白,PSA,PSMA,RRM1,雄性激素受体,雌性激素受体,黄体酮受体,IGF1,cMET,EML4,或白血球相关受体(LAR)。
此外,本发明可提供足以确定受治者对特定治疗方案的反应或备选药物在癌症治疗中的作用的数据。
例如,当对患者进行药物治疗时,使用本发明的方法测量药物治疗的作用是有可能的。例如,可使用本发明的方法处理在进行药物治疗之前从患者体内收集到的样本和在进行药物治疗开始时或药物治疗之后从患者体内收集到的一种或多种细胞样本。通过比较分开处理的样本的分析结果,可确定药物治疗的作用或患者对药物的反应。通过该方式,可对失效化合物进行早期确认或可对有望的化合物进行检测。
此外,本发明可提供用于确定特定临床测试的候选受治者的方法。例如,为了确定特定治疗方案是否可通过分析所检测到的候选ctDNA而成功地进行,可确定是否存在特定的标志物。
此外,临床测试过程中的ctDNA分析可提供关于患者是否对测试药物产生反应的信息。在本文中,所检测的ctDNA实际上没有发生改变或ctDNA降低说明患者对测试药物产生反应,并且ctDNA的增加表明较差的反应性。所述信息是药物疗效的初始指示物并且可被研究者用作临床测试中的次级终点。
如上所述,本发明包括由表面修饰的导电聚合物构成的三维纳米结构在检测或分离循环游离DNA(cfDNA)方面的所有各种不同的应用。因此,本发明提供关于癌症的发作诊断和预后的有用信息,具体而言,本发明使用循环肿瘤DNA提供关于癌症的发作诊断和预后的有用信息,因此本发明在选择性治疗癌症且单独地治疗癌症方面非常有用。
<实施例>
材料和方法
1.制备Ppy涂覆的Au NW(Ppy/Au NW)
使用传统的热蒸发技术,将大约150nm厚的Au层沉积在AAO模板(Whatman;孔直径100nm)的一个表面上。通过使用镀金溶液(Orotemps24RTU Rack)并以100mV/s的扫描速率在-1.1V至0V的电势范围下实施循环伏安法而使Au纳米线在后背为Au的AAO膜的孔内以电化学方式生长。
所有电化学实验使用3电极单元中的稳压器/恒流器(BioLogic SP-150)进行,其中,Ag/AgCl,铂线和设计的平台分别用作参比电极、对电极和工作电极。在使用导电碳糊状物固定在铟锡氧化物(ITO)表面之后,将所生成的膜溶解于水性NaOH溶液(2M)中持续4小时以除去AAO模板,这最后产生了垂直对齐的不同长度的Au NW阵列。
为了制备涂覆有Ppy的Au NW,通过在0.8V(相对Ag/AgCl)下实施计时安培分析法(CA)持续20秒,在0.1M吡咯和0.01M聚(4-苯乙烯磺酸钠)(PSS)的水性混合物中实施Ppy在无需支撑物的Au NW上的电化学沉积。得到的Ppy/Au NW用水清洗数次并在Tris-HCl(pH7.5)中孵育,以通过施加1.8V(相对Ag/AgCl)的电压持续2分钟进行Ppy薄层的电化学过氧化。
由此,制备得到作为纳米线的具有不同的长度和直径的导电聚合物聚吡咯(Ppy)。随后,如图1所示,导电纳米线结构通过电学方法进行表面修饰并因此带有正电荷或负电荷,从而促进血液中存在的带有负电荷的cfDNA的附着和分离。
2.样本采集和制备
使用NCC人体试验委员会(NCC Institutional Review Board)批准的操作规程将全血收集在含有抗凝剂EDTA的Vacutainer采血管中。使用冷冻离心(3000x g,10分钟)分离血浆。为了评估我们的Ppy/Au NW平台的捕获和释放效率,使用人工血液样本,该人工血液样本通过将DNA ladder(50ng)体外分散至获自健康供体的200μL血浆来制备。对于临床应用而言,收集来自三个健康志愿者的血液样本和患有乳腺癌和肺癌的17个患者的血液样本。
3.DNA捕获和释放
在评估DNA捕获效率之前,在室温下将过氧化的Ppy/Au NW浸入血液样本中持续30分钟以促进DNA和单个纳米线的相互作用,所述样本是:i)含有在人血浆中分散的DNA分子(250ng/ml)的人工样本,或ii)获自三个健康供体和17个癌症患者的未处理的血浆样本(0.2ml至1ml)。
接下来,通过施加1.0V电压(相对Ag/AgCl)持续30秒实施立即DNA捕获。随后,为了释放所捕获的DNA,在-1.3V(相对Ag/AgCl)条件下实施Ppy/Au NW的电刺激持续5分钟。使用PicoGreen分析对所捕获和释放的DNA进行量化。
在260nm和280nm条件下以分光光度法测量所获得的DNA,并将A260/A280比值用于评估所捕获和所释放的DNA的纯度。Ppy/Au NW和DNA之间的相互作用通过在Zeiss LSM 710共聚焦显微镜下检测PicoGreen荧光而可视化。
4.PCR和凝胶电泳
所使用的所有引物的序列在下表1中予以总结(Macrogen,韩国)。
【表1】
DNA ladder(低:10bp至100bp,中:100bp至2kb,高:3.5kb至21kb)购自Bioneer(韩国)。所有PCR扩增在20μL的最终反应体积的GeneAmp PCR系统9600(Perkin Elmer,Norwalk,CT,USA)中进行,所述最终反应体积含有模板DNA,2个寡核苷酸引物(5pM),各200mM的dNTP,10mM的Tris-HCl(pH7.5),50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.1%(w/v)明胶,和1UTaq DNA聚合酶(Perkin Elmer)。
PCR扩增由变性(94℃,30秒)、退火(64℃,30秒)和延续(72℃,1分钟)的45个循环构成。PCR产物在2%琼脂凝胶上进行电泳处理并用溴化乙锭染色以使所述PCR产物的存在在UV透射仪下可视化。
5.QIAamp循环核酸试剂盒
使用QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)从1ml血浆中提取cfDNA。简言之,使用蛋白酶K和细胞裂解缓冲液裂解血浆样本,随后通过施加真空压力使循环核酸与二氧化硅膜结合。在数次洗涤步骤之后,从所述膜中回收DNA片段。
6.数字PCR
在QX200ddPCR系统(BioRad,Hercules,CA,USA)上,使用PrimePCR ddPCR突变分析试剂盒检测cfDNA中的EGFR L858R和外显子19缺失的EGFR突变(p.E746-A750del)。由PCR混合物产生水-油乳液液滴,该PCR混合物包含8μL cfDNA,10μL ddPCR预混液(supermix),和2μL靶向引物和探针。在产生所述液滴之后,在热循环仪中进行PCR。包含扩增的DNA中的至少一个拷贝的阳性液滴可通过荧光分析用微滴分析仪检测。
7.EGFR基因的突变测试
使用PCR-直接测序法检测原发性肿瘤组织中的EGFR基因状态。使用EGFR基因的外显子19和21的特异性引物提取并扩增基因组DNA。PCR产物使用BigDye terminator循环测序试剂盒进行测序并使用ABI PRISM 3100DNA分析仪(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)进行分析。
实施例1.评估使用纳米线结构对cfDNA的附着/分离能力
使用如下特征,通过将DNA ladder分散至血浆中来检测cfDNA的浓缩和分离,所述特征为通过电刺激有效修饰聚吡咯的表面。此外,可以确认,cfDNA以高得多的量附着于纳米线结构中/从纳米线结构中分离。
具体而言,需要三个步骤来完成DNA的浓缩和分离。第一,通过将高电压施加于纳米线结构而实施过氧化,由此诱导产生带有正电荷的表面。随后,在1.0V条件下进行DNA捕获并随后在洗涤三次之后施加1.3V的电压,从而从纳米线结构的表面释放浓缩的DNA并获取浓缩的DNA。因此,可以确认,DNA捕获效率随着过氧化电压的增加而提高(参见图4A),并且当施加1.8V的电压持续两分钟时,表现出最高的DNA捕获效率(参见图4B)。此外,可以确认,完成有效DNA捕获的最合适的电压和时间分别是1.0V和30秒(参见图4C和图4D)。此外,评估得到从纳米线结构的表面释放捕获的DNA的最有效的电压和时间是1.3V和5分钟(参见图4E和图4F)。
此外,本发明的发明人还确认了,在将各种不同尺寸的DNA ladder分散至血浆中之后,使用western印迹和PICO green检测了对DNA的附着和分离能力。结果如图5A至图5D所示。此外,使用不同分子量和不同浓度DNA测量了对cfDNA的附着/分离能力。
因此,可以确认,本发明的结构能够附着和分离DNA,而不会受到分子量或浓度的显著影响。也就是说,可以确认,本发明的结构提供了对从低分子量、中等分子量和高分子量DNA的所有DNA的优良的附着和分离,并且,当在一定浓度或更高浓度下使用DNA时,不会大大影响对DNA的附着和分离能力。
实施例2.使用纳米线结构评估乳腺癌患者和肺癌患者的血液中的cfDNA
使用来自乳腺癌患者的血液,使用荧光染料、SYBR Green/PICO Green,通过共聚焦显微镜来观察附着至导电纳米结构的表面的cfDNA。
如图7所示,可以确认,当使用长度为1.0μm的纳米线时,cfDNA完全附着至线表面,并且在施加电刺激之后,附着的cfDNA被释放并因此未观察到荧光。
此外,采用来自乳腺癌患者和肺癌患者的血液样本,本发明的发明人比较了由本发明的导电纳米结构分离的cfDNA的浓度和通过Qiagen试剂盒分离的cfDNA的浓度。
结果如图6A和图6B所示,癌症患者的血液样本中的cfDNA的量相对于正常人的血液中的捕获到的cfDNA的量高达十倍或更高。此外,当使用本发明的纳米结构时,与商售Qiagen试剂盒相比,成功分离高得多的量的cfDNA。从这些数据可以确认,本发明的导电纳米线有效捕获小DNA片段。
此外,使用Qiagen试剂盒或纳米结构Ppy/Au NW,从来自乳腺癌患者的血液中捕获cfDNA。随后,使用PCR扩增方法检测患者样本中的EGFR和KRAS突变。结果如图8所示。也就是说,使用本发明的纳米结构可分析EGFR和KRAS突变。
此外,使用Qiagen试剂盒或Ppy/Au NW检测来自肺癌患者的血液中的cfDNA,随后执行数字PCR比较患者样本中EGFR突变的检测频率。结果在下表2中予以总结。
表2
因此,与商售Qiagen试剂盒相比,本发明的导电纳米线表现出大大提高的DNA分离结果。从该结果可以确认,与传统Qiagen试剂盒相比,本发明的导电纳米线在检测cfDNA方面有效得多。
具体而言,采用商售产品(Qiagen试剂盒)无法检测的小片段DNA由本发明的聚吡咯纳米线结构检测,这表明聚吡咯纳米线结构可用作癌症诊断试剂盒。
实施例3.使用具有平面结构的聚吡咯评估cfDNA的附着/分离能力
除了具有纳米线结构的聚吡咯之外,本发明还确认了可从具有平面结构的聚吡咯的表面分离血液中的cfDNA循环。
就这点而言,如图9所示,随着电压的增加,血液中存在的cfDNA的量增加。具体而言,当聚吡咯的表面在1.5V的电压下被氧化时,DNA检测效率增加至94%。
基于这些结果,本发明确认了,随着施加于具有平面结构的聚吡咯的电压的增加,cfDNA的分离效率增加。
此外,当在0.6V至0.8V的电压下制备平面Ppy膜时,平面Ppy膜的表面非常平滑,这不适于DNA的捕获和释放。另一方面,当施加1.5V的高电压使用电聚合制备平面Ppy膜时,平面Ppy膜的表面粗糙度显著增加,这适于回收DNA。从上述结果可以看出,当纳米结构的表面粗糙度增加时,纳米结构的表面和DNA之间的相互作用提高,并且体积和表面的比值增加。因此,可使得大量的DNA附着至表面。
虽然上文详细描述了本发明的内容的某些部分,但是对于本领域技术人员而言显而易见的是,这些具体描述仅仅作为优选的实施方式提供,并且本发明无意被限定于这些实施方式。因此,显而易见的是,本发明的范围不限于所描述的具体实施方式。因此,本发明的实质范围由所附的权利要求及其等同内容界定。
【工业应用】
根据本发明的用于检测和分离游离DNA的结构允许容易的附着和分离游离DNA(包括循环肿瘤DNA(ctDNA))等并且提供了显著提高的检测效率。最后,可以预见到,通过电信号有效检测或分离循环肿瘤DNA在诊断癌症的发作和预测癌症诊断方面非常有用。
Claims (20)
1.用于检测和分离游离DNA的结构,所述结构包含表面修饰的导电聚合物。
2.如权利要求1所述的结构,其中,所述表面修饰的导电聚合物带有正电荷。
3.如权利要求1所述的结构,其中,所述结构是纳米结构。
4.如权利要求3所述的结构,其中,所述纳米结构是纳米芯片,纳米点,纳米棒或纳米线。
5.如权利要求1所述的结构,其中,所述导电聚合物选自:聚吡咯,聚乙炔,聚苯胺,聚噻吩和聚硫氮化物。
6.如权利要求5所述的结构,其中,所述导电聚合物是聚吡咯。
7.如权利要求1所述的结构,其中,所述游离DNA是循环肿瘤DNA(ctDNA)。
8.用于检测和分离游离DNA的试剂盒,其包含权利要求1所述的结构。
9.用于检测和分离游离DNA(cfDNA)的方法,所述方法包括:
使形成纳米结构的导电聚合物的表面带正电荷;
采用生物物质处理所述导电聚合物以使cfDNA附着至所述导电聚合物;以及
采用所述导电聚合物捕获cfDNA或通过施加电信号从所述导电聚合物中释放cfDNA。
10.如权利要求9所述的方法,其中,所述生物物质选自:血液,骨髓,胸腔积液,腹腔液,脊髓液,尿液和唾液。
11.如权利要求10所述的方法,其中,所述生物物质是血液。
12.如权利要求9所述的方法,其中,在处理过程中,通过施加0.8V至1.2V的电信号持续20秒至40秒使cfDNA附着。
13.如权利要求9所述的方法,其中,在捕获过程中,通过施加-1.3V至-1.0V的电信号持续4分钟至6分钟而检测或分离cfDNA。
14.如权利要求9所述的方法,其中,所述游离DNA是循环肿瘤DNA。
15.提供诊断受治者体内的癌症的发作和预后的信息的方法,所述方法包括:使用权利要求1所述的结构检测和分离样本中的循环肿瘤DNA(ctDNA)并分析所检测或分离的ctDNA。
16.如权利要求15所述的方法,其中,所述癌症选自:恶性上皮肿瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺瘤、黑色素瘤、白血病、恶性淋巴瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺瘤、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道癌和头颈癌。
17.如权利要求16所述的方法,其中,所述癌症是乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌或胰腺癌。
18.如权利要求15所述的方法,其中,所述分析包括分析样本中ctDNA的浓度、拷贝数或序列。
19.如权利要求18所述的方法,其中,当ctDNA的浓度或拷贝数增加时,提供癌症发展或恶化的信息。
20.诊断受治者体内的癌症发作和预后的方法,所述方法包括:使用权利要求1所述的结构检测和分离样本中的循环肿瘤DNA(ctDNA)并分析所检测或所分离的ctDNA。
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