CN101812176A

CN101812176A - 一种具有生物活性的导电聚苯胺及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101812176A
Application number: CN 201010146034
Authority: CN
Inventors: 王巍
Original assignee: WUXI ZHONGMEI YIXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: WUXI ZHONGMEI YIXIN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2010-04-13
Filing date: 2010-04-13
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2030-04-13
Also published as: CN101812176B

Abstract

本发明公开了一种采用原位电化学组合合成方法，使带有生物活性单元的苯胺衍生物单体以活性自由基聚合方式与溶液中的苯胺共聚于电极上，一步直接在电极上原位生成具有生物活性的导电聚苯胺，及采用独立寻址的微电极阵列技术，应用所述的具有生物活性的导电聚苯胺制备功能化微电极阵列的技术。本发明解决了困扰学术界已久的如何将生物活性单元不失活地且永久地结合到金属上、而且还能一步到位地将生物活性分子接入导电聚合物的难题，为无标记的分析方法奠定了基础，可使生物传感器实现向微型化、集成化方向的发展，第一次从可操作层面上提供了自动化生产蛋白质芯片的可能性，可以推动物联网产业链的发展，具有深远的社会意义和广阔的市场价值。

Description

一种具有生物活性的导电聚苯胺及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种具有生物活性的导电聚苯胺及其制备方法和应用，具体说，是涉及一种采用原位电化学组合合成(combinatorial synthesis)方法，使带有生物活性单元的苯胺衍生物单体以活性自由基聚合方式与溶液中的苯胺共聚于电极上，一步直接在电极上原位生成具有生物活性的导电聚苯胺，及采用独立寻址的微电极阵列技术，应用所述的具有生物活性的导电聚苯胺制备功能化微电极阵列。

背景技术

导电聚合物因其特殊的结构和优异的物理化学性能，在光学、电磁学和化学等领域具有广阔的应用前景。近年来，导电聚合物在生物材料领域的应用，取得了一定的研究成果。导电聚合物在生物材料领域中的应用，以作为生物传感器最为多见。通常情况下，将不同的酶、辅酶、抗体、DNA、甚至细胞和组织等生物活性物质固定于导电聚合物中，形成各种新型的生物传感器。这种传感器具有响应性能强，制作过程简单、可控等特点。在构建导电聚合物生物传感器过程中，聚合物的合成通常采用操作简单、易于控制的电化学方法。在聚合过程中，生物活性物质既可与聚合物单体同时聚合到电极表面，也可先与其单体吸附在电极表面，再氧化聚合形成生物识别固态元件。其间，通过有效地控制聚合物电聚合过程，生物活性物质可固定到各种类型的电极或者电极的特定部位，也可将两种或多种酶等生物活性物质同时固定于同一层聚合膜或分别固定于多层聚合膜上。导电聚合物作为分子导线，其三维立体结构可使电子在生物分子(活性中心)与电极表面直接传递，显著提高生物传感器的响应特性。通过控制聚合膜的厚度、生物分子在膜中的空间分布、聚合膜的空隙度等指标可以调整生物传感器的响应特性和选择性。

构建导电聚合物生物传感器的关键是如何将生物活性物质有效地固定在导电聚合膜上，且最大限度地保持其生物活性，形成可长期反复作用的生物识别固态元件。生物活性物质常用的固定方法主要有包埋法、共价法、吸附法和交联法。其中以包埋法最为多见，该法依赖于电化学聚合而实现，即，在电化学聚合的同时，生物活性物质以包埋的形式固定到导电聚合膜中。目前，导电聚合物生物传感器的研究虽然取得了一定的成果，但同时也面临了一些问题。如无常规设备可制造稳定的可重复生产的导电聚合物生物传感器，这在很大程度上限制了此类传感器在分析领域的广泛应用。

在导电聚合物中，聚苯胺因其导电性能优良，环境稳定性好，合成工艺简单，原料成本低廉等优点，被称为是最有可能实际应用的导电聚合物。然而用传统方法合成的聚苯胺由于其分子量小，分子链中存在缺陷而使其导电性能和力学性能大大降低，从而限制了其实际应用。如中国专利CN 1718611，由于其制备工艺的限制，制备的导电聚苯胺脆性较大，韧性较差，并且热稳定性也不佳。又如中国专利CN 1294154，采用乳液聚合的方法，掺杂剂采用十二烷基苯磺酸等，得到一种非常稳定的水相聚苯胺乳液，但是需要用破乳剂对其破乳，使得相应的一系列后续工艺变得复杂，大大增加了聚苯胺的生产成本。

原位聚合法，是指单体吸附在其他基材上，通过引发基体表面上的单体聚合，从而获得聚合物包覆基材表面的功能性复合材料的方法。该方法具有不需要特殊设备、操作简单、膜厚可控等优点，尤其对找不到合适溶剂的导电聚合物具有优势：既改善了聚苯胺的加工性，又易工业化；既赋予了绝缘基质电学和光学性能，还保持了基质的完整结构。

由于存在链转移和链终止反应，传统自由基聚合不能较好地控制分子量及大分子结构。活性自由基聚合具有无终止、无转移、引发速率远远大于链增长速率等特点，它的优点在于可控制聚合物的分子量，分子量分布(相同的链长)窄，可进行端基官能化，形成立体结构如纳米纤维，梳型，星型高分子，嵌段共聚物，接枝共聚物等，是实现分子设计、合成具有特定结构和性能聚合物的重要手段。

发明内容

本发明为了解决困扰学术界已久的如何将生物活性单元不失活地且永久地结合到金属上而且还能一步到位地将生物活性分子接入导电聚合物的难题，提供了一种具有生物活性的导电聚苯胺及其制备方法和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的具体技术方案如下：

本发明的具有生物活性的导电聚苯胺，具有如下通式：

通式中的R1为

其中的n可为1、2或3；X代表生物活性单元，可以是DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞，优选辅酶R-生物素(Biotin)；

通式中的R2可以是氢，也可以是游离于苯胺邻位和间位的饱和或不饱和烃类取代基、芳香族(包括杂环)类取代基、烃类和/或芳香族(包括杂环)醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基。

本发明的具有生物活性的导电聚苯胺的制备方法，包括如下具体步骤：

a)制备带有生物活性单元的苯胺衍生物单体

将带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入苯胺衍生物的无水乙腈溶液，其中：带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺与苯胺衍生物的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂(activator)，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌20～40分钟后，进行减压蒸镏至粉末状；加入过量氧化溶液(oxidation solution)，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌5～15分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入10％氢氧化铵脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用；

b)将步骤a)制备得到的带有生物活性单元的苯胺衍生物单体与其摩尔量的1～10倍的苯胺及适量作为电解质的氯化钾混合，以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在0.5～1.5伏，30秒总时间以原位合成及电化学沉积的方式在电极上进行共聚，即得具有生物活性的导电聚苯胺。

所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指带有DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞单元的甘醇亚磷酰胺，优选生物素甘醇亚磷酰胺。

所述的苯胺衍生物是指通式为：其中的n可为1、2或3；其中的R2可以是氢，也可以是游离于苯胺邻位和间位的饱和或不饱和烃类取代基、芳香族(包括杂环)类取代基、烃类和/或芳香族(包括杂环)醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基。

本发明采用独立寻址的微电极阵列技术，应用所述的具有生物活性的导电聚苯胺制备功能化微电极阵列的方法如下：将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片上，此电路上的每个电极由CMOS(互补金属氧化物半导体)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的SRAM(静态随机存取记忆体)导通该开关；微电极阵列放置在一个专门设计的流体反应器中，反应器中的反应液为步骤a)制备得到的带有生物活性单元的苯胺衍生物单体与其摩尔量的1～10倍的苯胺及适量作为电解质的氯化钾混合而成，计算机以数字方式指示微电极阵列响应数字命令来组装导电聚合物；一旦电极被呼叫到，导电聚合物在该电极下的逻辑电路控制下立即在原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干即得。

所述电极可以是金属、不锈钢、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、网状玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料，优选金属。

所述金属可选自铂、铱、钯、金、银、铜、汞、镍、锌、钛、钨或铝，优选铂。

正因为每个电极都与其下的独立寻址逻辑电路连接，所以都具有智能传感和讯号放大功能，当以一定的脉冲波扫描每个电极时，会产生一个微小的偶极化电子信号，此信号因电极所处的生物环境(有无分子识别反应)的变化而略有差异，因此，CMOS的运用提供了前所未有的可重复性，高度灵活的微米和亚微米范围内合成聚合物微阵列的能力，使生物传感及无标记分析方法得以成为现实。这种方法大大简化了含多种内容的蛋白芯片乃至蛋白质文库的制作，聚苯胺的微观结构不仅可将蛋白质伸展出电极表面，从而有利于其对目标分子的交互作用；而且它的导电性的优点对蛋白质的快速检测和进而测定其对目标分子的交互作用(比方说抗体与抗原的作用)也有着无可比拟的优越性。

本发明人还研究发现：随着反应的进行，导电聚苯胺分子在形成电流通路的同时不断延伸，依次从纳米颗粒到纳米纤维，最后纤维与纤维连接成片状网络结构。通过调控单体浓度、电流密度和反应时间等活性自由基聚合条件，可以控制生长成纳米纤维。因为纳米纤维状的导电聚苯胺具有纳米的三维微观结构，具有独特的化学、物理性质，因此，可大幅提高对生物分子或者细胞的检测灵敏度，大大缩短检测的反应时间，并且可以实现高通量的实时检测分析，使生物传感器实现向微型化、集成化方向的发展。

与现有技术相比，本发明的突破点主要有以下几点：

1、通过先将生物活性单元引入苯胺衍生物单体中，然后采用原位电化学组合合成方法，一步直接在原位形成具有生物活性的导电聚苯胺，解决了困扰学术界已久的如何将生物活性单元不失活地且永久地结合到金属上、而且还能一步到位地将生物活性分子接入导电聚合物的难题。

2、通过调控单体浓度、电流密度和反应时间等活性自由基聚合条件，可以控制导电聚苯胺生长成纳米纤维状，从而大幅提高对生物分子或者细胞的检测灵敏度，大大缩短检测的反应时间，实现高通量的实时检测分析，使生物传感器向集约化、微型化和微功耗方向发展成为可能。

3、为无标记的分析方法奠定了基础，使批量制作蛋白质芯片真正成为可能，第一次从可操作层面上提供了自动化生产蛋白质芯片的可能性并且具有很高的重现性。

附图说明

图1是本发明中的独立寻址逻辑电路芯片的结构示意图；图中：1是指聚合反应驱动电路；2是指通过内部寻址连接导通的电极；3是指通过内部寻址连接的电极但在实验中有意不通电而保持惰性；

图2是独立寻址逻辑电路芯片中的微电极阵列以荧光扫描仪(Axon4200A)扫描得到的照片；

图3是独立寻址逻辑电路芯片中的微电极阵列在室光下的照片(16微米直径的电极经100倍光学放大得到)；

图4是证明电流密度和反应时间与导电聚苯胺的聚合度的关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明；实施例中所用化学试剂均向美国Sigma-Aldrich公司采购，生物素甘醇亚磷酰胺及接有荧光基团Cy5的卵白素以及供DNA合成之用的活化剂(activator)和氧化溶液(oxidationsolution)是从美国Glen Research公司采购。

实施例1：制备带有生物活性单元的苯胺衍生物单体

将生物素甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入苯胺邻甲醇的无水乙腈溶液，其中：生物素甘醇亚磷酰胺与苯胺邻甲醇的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌30分钟后，进行减压蒸镏至粉末状；加入过量氧化溶液，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌10分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入10％氢氧化铵脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用即可，本实施例的化学反应式如下：

类似的合成方法也适用于带有饱和或不饱和烃类取代基、芳香族(包括杂环)类取代基、烃类和/或芳香族(包括杂环)醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基的苯胺邻甲醇、苯胺邻乙醇或苯胺邻丙醇。

实施例2：制备具有生物活性的导电聚苯胺

将制备得到的带有生物素取代基的苯胺单体与其摩尔量的1～10倍的苯胺及适量作为电解质的氯化钾混合，以10毫秒开，10毫秒关的脉冲，在1.0伏，30秒总时间以原位合成及电化学沉积的方式在电极上进行共聚，即得具有生物活性的导电聚苯胺。

实施例中使用的电极为铂金属，可由铱或其他金属(例如：钯、金、银、铜、汞、镍、锌、钛、钨、铝)或不锈钢、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、网状玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料所替代。

实施例3：制备功能化微电极阵列

将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片(见图1所示)上，此电路上的每个电极由CMOS(互补金属氧化物半导体)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的SRAM(静态随机存取记忆体)导通该开关；微电极阵列放置在一个专门设计的流体反应器中，反应器中的反应液为制备得到的带有生物素取代基的苯胺单体与其摩尔量的1～10倍的苯胺及适量作为电解质的氯化钾混合而成，计算机以数字方式指示微电极阵列响应数字命令来组装导电聚合物；一旦电极被呼叫到，导电聚合物在该电极下的逻辑电路控制下立即在原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干，在pH4的缓冲液中对每一电极进行扫描读数(包括空白和对比(control))，以Axon 4200A扫描得到图2照片，室光下电极的照片见图3所示(16微米直径的电极经100倍光学放大得到，其中圆形为电极，电极周围为绝缘体)。

所述电极可以是金属、不锈钢、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、网状玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料，优选金属；所述金属可选自铂、铱、钯、金、银、铜、汞、镍、锌、钛、钨或铝，优选铂。

实施例4：证明电流密度和反应时间与导电聚苯胺的聚合度的关系实验

使正电荷在不同的脉冲间隔时间在电极上通过，总电荷是由脉冲与时间的积分决定。对数字1，脉冲是2毫秒开，10毫秒关；对数字2，脉冲是4毫秒开，10毫秒关；即对每下一个数字，脉冲开启时间增加一倍，总时间不变一律为60秒，电压始终维持在1.0伏，见表1所示。

表1数字与脉冲的对应关系

数字	开/关(微秒)	脉冲数	峰值(mV)
数字	开/关(微秒)	脉冲数	峰值(mV)	1	2---10	5000	23
2	4---10	4285	40	1	2---10	5000	23
2	4---10	4285	40	4	8---10	3333	59
8	16--10	2307	47	4	8---10	3333	59

将电极经去离子水清洗后用氮气吹干，随即进行光学测量。如图4所示，数字1勉强可见，数字2以后逐步清晰，数字8呈蓝色，说明随着电流密度的增大和反应时间的延长，导电聚苯胺的聚合度逐渐增大，聚苯胺的氧化态逐步增高。

Claims

1.一种具有生物活性的导电聚苯胺，其特征在于，具有如下通式：

通式中的R1为

其中的n为1、2或3；X代表生物活性单元；

通式中的R2是氢，或是游离于苯胺邻位或间位的饱和或不饱和烃类取代基、芳香族类取代基、烃类和/或芳香族醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基。

2.根据权利要求1所述的具有生物活性的导电聚苯胺，其特征在于，所述生物活性单元是DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞。

3.根据权利要求2所述的具有生物活性的导电聚苯胺，其特征在于，所述生物活性单元是辅酶R-生物素。

4.一种权利要求1所述的具有生物活性的导电聚苯胺的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

a)制备带有生物活性单元的苯胺衍生物单体

将带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺溶解在无水乙腈中，然后加入苯胺衍生物的无水乙腈溶液，其中：带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺与苯胺衍生物的摩尔比为10∶1～1∶10；加入适量5-乙硫基四氮唑(ETT)活化剂，使形成的活化剂无水乙腈溶液的浓度为0.25mol/L；在室温下搅拌20～40分钟后，进行减压蒸镏至粉末状；加入过量氧化溶液，所述氧化溶液是由单质碘溶于四氢呋喃∶水∶三乙胺＝8∶1∶1的混合溶剂中形成，溶液的质量百分比浓度为4％；室温下搅拌5～15分钟后，以硫代硫酸钠还原至中性，然后减压蒸出四氢呋喃，以氯仿萃取，有机层经无水硫酸钠干燥后，减压蒸干有机溶剂；最后加入10％氢氧化铵脱保护，减压蒸出过量氨气后以0.2M盐酸中和至中性，放入-4℃冰箱备用；

5.根据权利要求4所述的具有生物活性的导电聚苯胺的制备方法，其特征在于，所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指带有DNA、RNA、肽、蛋白质、酶、辅酶、抗体、组织或细胞单元的甘醇亚磷酰胺。

6.根据权利要求5所述的具有生物活性的导电聚苯胺的制备方法，其特征在于，所述的带有生物活性单元的甘醇亚磷酰胺是指生物素甘醇亚磷酰胺。

7.根据权利要求4所述的具有生物活性的导电聚苯胺的制备方法，其特征在于，所述的苯胺衍生物是指通式为：

其中的n为1、2或3；其中的R2是氢，或是游离于苯胺邻位或间位的饱和或不饱和烃类取代基、芳香族类取代基、烃类和/或芳香族醚或硫醚类取代基、卤素类取代基、经硅烷保护的一级或二级醇类取代基、经FMOC或BOC保护的胺类取代基、对称或不对称取代的三级胺、酰胺或磺酰胺类取代基、饱和或不饱和烃取代的羧酸酯类取代基。

8.一种应用权利要求1所述的具有生物活性的导电聚苯胺制备的功能化微电极阵列，其特征在于，制备方法如下：将微电极阵列建立在独立寻址的逻辑电路芯片上，此电路上的每个电极由互补金属氧化物半导体(CMOS)晶体管的开关连接，通过发送电子地址信号到共同结点电路进而到与每个电极相关的静态随机存取记忆体(SRAM)导通该开关；微电极阵列放置在一个专门设计的流体反应器中，反应器中的反应液为制备得到的带有生物活性单元的苯胺衍生物单体与其摩尔量的1～10倍的苯胺及适量作为电解质的氯化钾混合而成，计算机以数字方式指示微电极阵列响应数字命令来组装导电聚合物；一旦电极被呼叫到，导电聚合物在该电极下的逻辑电路控制下立即在原位迅速生成，经去离子水清洗后用氮气吹干即得。

9.根据权利要求8所述的功能化微电极阵列，其特征在于，所述电极是金属、不锈钢、金属合金、碳纳米管、玻璃碳、网状玻璃碳、石墨、掺杂氧化物、铟锡氧化物、氧化硅、砷化镓半导体、金属掺杂聚合物或陶瓷材料。

10.根据权利要求9所述的功能化微电极阵列，其特征在于，所述电极为铂金属。