CN114517231A - 埃格特氏菌(Eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒 - Google Patents
埃格特氏菌(Eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114517231A CN114517231A CN202210209528.4A CN202210209528A CN114517231A CN 114517231 A CN114517231 A CN 114517231A CN 202210209528 A CN202210209528 A CN 202210209528A CN 114517231 A CN114517231 A CN 114517231A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- eggerthella
- primer
- lenta
- specific primer
- rheumatoid arthritis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学领域,具体而言,涉及一种埃格特氏菌(Eggerthellalenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒。本发明利用埃格特氏菌的特异性引物对埃格特氏菌进行检测,实现了对疑似类风湿关节炎患者进行粪便样本检测。特异性好,本发明根据16S RNA基因序列设计引物,高特异性与目的基因结合。本发明对于埃格特氏菌高表达的RA诊断与临床治疗具有较高的参考价值,适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体而言,涉及一种埃格特氏菌(Eggerthellalenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒。
背景技术
迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)是一种专性厌氧革兰阳性杆菌,生长缓慢,5d内可形成肉眼可见菌落,1935年科学家埃格特首次从人类粪便中分离出该菌,最初归类在厌氧杆菌属中,1999年完成测序后细分为埃格特菌属。
类风湿关节炎又称类风湿(Rheumatoid arthritis,RA),是发病机制还没有完全明确的一种慢性的、对称性的、全身性的、炎症性的自身免疫性疾病,目前RA已成为危害人类健康的重要疾病之一,RA病因复杂、变化多样,现研究证明RA被认为与细菌感染密切相关,前期研究证明RA患者的肠道菌群失衡,并发现埃格特氏菌、牙龈卟啉单胞菌、拟杆菌等显著表达失衡。RA与骨关节炎(osteoarthritis,OA)、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、反应性关节炎等疾病症状有相似性,因此建立一种更加快速鉴别诊断RA的方法,对临床上确诊及治疗有积极指导意义。
RA自身抗体的检查是目前主要诊断检查方法一般包括:患者关节液培养、关节滑膜活检、类风湿因子检测、抗CCP抗体检测、抗核抗体,这些方法虽有利于RA的诊断和治疗,但检查操作繁琐、判断指标复杂,而利用埃格特氏菌在RA患者肠道的富集开发的埃格特氏菌检测试剂盒,便成为了一种快速有效的诊断方法。
前期本研究通过三代宏基因组学检测类风湿关节炎患者(未给药半年以上,且为初次诊断为类风湿关节炎患者的粪便样本)6例,用二代宏基因组学检测类风湿关节炎患者(未给药半年以上,且为初次诊断为类风湿关节炎患者的粪便样本)76例均检测出埃格特氏菌全长DNA序列,而在健康人的粪便中是没有的。同时本研究在类风湿关节炎患者的关节腔的滑膜液中用16SrDNA测序方法也检测到Eggerthella lenta DNA片段,申请人认为Eggerthella lenta同时存在肠道和关节滑膜液中这正是类风湿关节炎“菌-肠-关节轴”致病新机制的发现所在,突破肠壁屏障,进入血液的通路,游离到关节从而加速关节病变的发生。我们预测可以针对Eggerthella lenta的特异性,采用菌群移植,口服益生菌等手段,实现对类风湿关节炎的早期治疗和预防。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种埃格特氏菌的特异性引物;
本发明的再一目的是提供一种埃格特氏菌的特异性检测方法;
本发明的再一目的是提供用于诊断RA的检测试剂盒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
本发明根据埃格特氏菌的线粒体DNA序列,设计一对特异性引物,该引物只对埃格特氏菌具有扩增能力,该引物的核苷酸序列如下所示:
正向引物:Elen-F:(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′);
反向引物:Elen-R:(5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′)。
根据本发明的特异性引物进行埃格特氏菌的检测方法包括如下步骤:
(1)目的DNA的提取:从粪便或滑膜液样本中提取肠道微生物DNA;
(2)利用所述的特异性引物对所述目标DNA进行扩增,得到扩增产物;
(3)对所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
根据本发明的特异性引物,设计一种埃格特氏菌检测试剂盒,所述试剂盒包括核苷酸序列为:正向引物:Elen-F:(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′);反向引物:Elen-R:(5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′)的一对特异性引物。利用所述特异性引物进行检测埃格特氏菌从而诊断患者是否具有类风湿关节炎。
本发明的有益效果是:类风湿关节炎的常规检测均是采集血液样本进行检测,存在一定的局限性。本发明的创新之处是利用埃格特氏菌的检测,对疑似类风湿关节炎患者进行粪便样本的检测。前期我们对156例粪便样本进行宏基因组测序发现,埃格特氏菌在类风湿关节炎患者粪便中高表达,并且在其终端关节腔的滑膜液中也通过16S测序发现埃格特氏菌的DNA片段,我们推测埃格特氏菌因为肠道微环境的失衡导致异常增加,在类风湿关节炎从临床前阶段向临床阶段的转变中发挥着重要作用。本发明的检测方法方便快捷,能在较短的时间内鉴定埃格特氏菌(Eggerthella lenta),且不需要昂贵的仪器设备;特异性好,本发明根据16S RNA基因序列设计引物,高特异性与目的基因结合。本发明对于埃格特氏菌高表达的RA诊断与临床治疗具有较高的参考价值,适于推广应用。
为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,作详细说明如下。
附图说明
图1为验证引物对埃格特氏菌的扩增效果实验中PCR产物的电泳图;
图2为通过宏基因组二代测序技术(metagenomics next-generationsequencing,mNGS)用Illumina(Solexa测序技术)测序平台进行验证迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)与类风湿(RA)的相关性实验中粪便样本中含有E.lenta DNA片段的样本数;
图3为通过宏基因组二代测序技术(metagenomics next-generationsequencing,mNGS)用Illumina(Solexa测序技术)测序平台对16S rDNA基因测序方法进行验证迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)与类风湿(RA)的相关性实验中关节囊滑液样本中含有E.lenta DNA片段的样本数;
图4为通过三代实时单分子测序PacBio SMRT技术进行宏基因组测序方法进行验证迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)与类风湿(RA)的相关性实验中粪便样本中含有E.lenta DNA片段的样本数。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明的具体实施方式公开了根据埃格特氏菌的线粒体DNA序列设计的一对特异性引物、利用所述特异性引物对埃格特氏菌进行检测的方法、以及利用所述特异性引物能够诊断类风湿关节炎的检测试剂盒。
实施例1:本发明实施例的特异性引物对埃格特氏菌的扩增效果
1)模板DNA提取:
随机选择并采集14名RA患者的粪便为样品以及一名健康人的粪便作为对照组,具体步骤如下:
(1)取约200mg粪便样品温度调节为室温;
(2)加入550ul65℃预热的2×CTAB,95℃金属浴5min;
(3)振荡器中混匀1min,使沉淀物溶解;
(4)向振荡器内加入550ul的酚仿,振荡器混匀1min,12500rpm离心10min;
(5)取上清300ul,加入900ul溶液PC,振荡器混匀30s;
(6)取600ul混合液于离心柱中,12500rpm离心1min;
(7)弃废液,重复取混合液离心,直到离心管内液体全部滤过离心柱;
(8)加入450ul溶液PW,12500rpm离心1min,弃废液,重复离心两次;
(9)12500rpm空管离心2min,并静置离心柱2min充分挥发乙醇;
(10)向离心柱内加入30ul已65℃预热EB;
(11)室温孵育5min,12500rpm离心1min即为模板DNA。
2)埃格特氏菌特异性引物的合成:
正向引物:Elen-F:(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′);
反向引物:Elen-R:(5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′)。
3)PCR扩增反应
PCR体系包括如下组分:
试剂 | 体积(μL) |
ddH2O | 7.5 |
Elen-F | 1 |
Elen-R | 1 |
DMSO | 2 |
2×Fast Taq | 12.5 |
模板DNA | 1 |
4)反应程序为:
96℃预变性5min;35个循环:96℃20sec、58℃20sec、72℃60sec;最后72℃延伸10min。
5)PCR产物的鉴定:
首先制备0.8%琼脂糖凝胶,然后加样后电泳35min,最后通过紫外成像仪观察照相并根据扩增产物的大小判定结果。如图1所示,图中M:Marker,即样本你,其中M1-M14来自于不同类风湿关节炎粪便样本提取DNA后检测,M15是健康人粪便DNA作为阴性对照,图中可以看出PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果中有大小约1400bp的明亮条带,此条带大小与迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)相符。
实施例2:通过宏基因组测序技术平台进行验证迟缓埃格特菌(Eggerthellalenta)与类风湿(RA)的相关性实验中粪便样本和滑膜液样本中含有E.lenta DNA片段的样本数。
如图2所示,本发明实施例选取156例粪便样本:健康人粪便样本(HF):35例(n=35),类风湿关节炎粪便样本(RAF):76例(n=76),骨关节炎粪便样本(OAF):45例(n=45)并进行宏基因组二代测序,结果数据统计为RAF为76例,阳性率为100%,验证RA患者粪便中含有E.lenta DNA片段。(以骨关节炎和健康人为对照组)
如图3所示,本发明实施例通过对210例关节囊滑液样本:骨关节炎滑膜液样本(OASF):112例(n=112),类风湿关节炎滑膜液样本(RASF):98例(n=98)进行16SrDNA V1-V2区二代测序,数据统计结果为RASF:98例,可验证RA患者滑液含有E.lenta DNA片段,阳性率为100%。(以骨关节炎为对照组)
如图4所示,本发明实施例通过对6例RA粪便样本通过三代实时单分子测序PacBioSMRT技术进行宏基因组测序方法进行验证迟缓埃格特菌(Eggerthella lenta)在RA粪便样本中含有E.lenta菌,阳性率为100%。(以健康人为对照组)
以上对本发明的较佳实施例进行了具体说明,当然,本发明还可以采用与上述实施方式不同的形式,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下所作的等同的变换或相应的改动,都应属于本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.埃格特氏菌的特异性引物,其特征在于,包括如下引物对:
正向引物:Elen-F:(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′);
反向引物:Elen-R:(5′-TACGGCTACCTTGTACGACTT-3′)。
2.一种埃格特氏菌的检测方法,其特征在于,所述方法包括使用权利要求1所述的特异性引物进行PCR扩增的步骤。
3.一种埃格特氏菌检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的特异性引物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210209528.4A CN114517231A (zh) | 2022-03-03 | 2022-03-03 | 埃格特氏菌(Eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210209528.4A CN114517231A (zh) | 2022-03-03 | 2022-03-03 | 埃格特氏菌(Eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114517231A true CN114517231A (zh) | 2022-05-20 |
Family
ID=81598645
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210209528.4A Pending CN114517231A (zh) | 2022-03-03 | 2022-03-03 | 埃格特氏菌(Eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN114517231A (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102634596A (zh) * | 2012-05-07 | 2012-08-15 | 镇江和创生物科技有限公司 | 百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的特异性检测用引物探针组合和试剂盒 |
CN103865823A (zh) * | 2012-12-11 | 2014-06-18 | 北京大学 | 一株迟缓埃格特菌及其应用 |
CN109136396A (zh) * | 2018-09-19 | 2019-01-04 | 华南农业大学 | 一种魏氏梭菌病的特异性检测引物和检测试剂盒 |
CN112399850A (zh) * | 2018-07-20 | 2021-02-23 | 玛阿特制药公司 | 用于在减少由治疗诱导的炎症中使用的粪便微生物群组合物 |
CN113564076A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-10-29 | 江苏省农业科学院 | 一种指示菌株及利用噬菌体预测水稻细菌性条斑病发生期的方法 |
CN113564081A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-10-29 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌scs-3及其应用 |
-
2022
- 2022-03-03 CN CN202210209528.4A patent/CN114517231A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102634596A (zh) * | 2012-05-07 | 2012-08-15 | 镇江和创生物科技有限公司 | 百日咳博德特氏菌和副百日咳博德特氏菌的特异性检测用引物探针组合和试剂盒 |
CN103865823A (zh) * | 2012-12-11 | 2014-06-18 | 北京大学 | 一株迟缓埃格特菌及其应用 |
CN112399850A (zh) * | 2018-07-20 | 2021-02-23 | 玛阿特制药公司 | 用于在减少由治疗诱导的炎症中使用的粪便微生物群组合物 |
CN109136396A (zh) * | 2018-09-19 | 2019-01-04 | 华南农业大学 | 一种魏氏梭菌病的特异性检测引物和检测试剂盒 |
CN113564076A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-10-29 | 江苏省农业科学院 | 一种指示菌株及利用噬菌体预测水稻细菌性条斑病发生期的方法 |
CN113564081A (zh) * | 2021-07-30 | 2021-10-29 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种产呕吐毒素降解酶的德沃斯氏菌scs-3及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
UENO TOMOHIRO ET AL: "Eukaryote-made thermostable DNA polymerase enables rapid PCR-based detection of mycoplasma, ureaplasma and other bacteria in the amniotic fluid of preterm labor cases", 《PLOS ONE》, vol. 10, no. 6, pages 0129032 * |
李祥云等: "迟缓埃格特菌的MALDI-TOF MS 和16S rRNA 鉴定及生物学特征研究", 《安徽医科大学学报》, vol. 56, no. 2, pages 191 - 194 * |
芦银香等: "弗氏柠檬酸杆菌的筛选、鉴定及对分散蓝 2BLN 脱色性能", 《天津城建大学学报》, vol. 25, no. 4, pages 290 - 294 * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Man et al. | Campylobacter concisus and other Campylobacter species in children with newly diagnosed Crohn's disease | |
Sepehri et al. | Microbial diversity of inflamed and noninflamed gut biopsy tissues in inflammatory bowel disease | |
Prindiville et al. | Ribosomal DNA sequence analysis of mucosa-associated bacteria in Crohn’s disease | |
CN112609015A (zh) | 一种预测结直肠癌风险的微生物标志物及其应用 | |
CN110819705A (zh) | Uc患者肠道菌群多样性及差异性的分析方法 | |
Varoni et al. | World Workshop on Oral Medicine VII: Targeting the microbiome for oral medicine specialists—Part 1. A methodological guide | |
CN113724862A (zh) | 一种结直肠癌生物标志物及其筛选方法和应用 | |
CN113403409A (zh) | 基于细菌16S rRNA基因序列的细菌“种”水平检测和分析方法 | |
CN109749960B (zh) | 基于多种肠道细菌含量评估便秘风险及便秘程度的方法及装置 | |
CN114517231A (zh) | 埃格特氏菌(Eggerthella lenta)的特异性引物、检测方法及试剂盒 | |
CN115786556A (zh) | Megasphaera micronuciformis肠道菌株的应用 | |
EP4291683A1 (en) | Metagenomic next-generation sequencing of microbial cell-free nucleic acids in subjects with lyme disease | |
WO2021039777A1 (ja) | 関節リウマチを検査する方法 | |
CN111630189B (zh) | 通过细菌性宏基因组分析来诊断胆管癌的方法 | |
US11898210B2 (en) | Tools for assessing FimH blockers therapeutic efficiency | |
CN109913524B (zh) | 普雷沃菌属在鉴别和/或区分不同民族个体中的应用 | |
CN108064273A (zh) | 结直肠癌相关疾病的生物标志物 | |
KR102472648B1 (ko) | 염증성 장질환 환자의 미생물 군집 평가 방법 | |
CN106701915A (zh) | 一种细菌性阴道病的lh‑pcr细菌基因指纹图谱的制备方法及应用 | |
CN116891899B (zh) | 一种基因标志物组合、试剂盒及检测方法 | |
CN113151512B (zh) | 利用肠道细菌检测早期肺癌 | |
CN114606317B (zh) | 一种预测胃癌淋巴结转移的菌群标志物及其应用 | |
CN115992220B (zh) | 一种类风湿关节炎的分子标记及应用 | |
Ibrahim et al. | Methods for microbiota analysis: Sample collection and laboratory methods | |
JP2023020631A (ja) | 全身性エリテマトーデスを検査する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |