KR102472648B1

KR102472648B1 - 염증성 장질환 환자의 미생물 군집 평가 방법

Info

Publication number: KR102472648B1
Application number: KR1020200000258A
Authority: KR
Inventors: 이홍섭
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-02
Filing date: 2020-01-02
Publication date: 2022-12-01
Also published as: KR20210087243A

Abstract

본 발명은 장 용종 절제술에 사용되는 인젝터를 흡인 카테터로 사용하여 대장 내시경 세척액을 흡인함으로써 염증성 장질환 환자의 미생물 군집을 평가하는 방법에 관한 기술로, 본 발명의 방법은 채취, 검사, 분석 등에 단점이 있는 기존 대변 채취 방법을 대체할 수 있고, 특히 대변은 장내 미생물의 최종 산물로 실제 장내에 존재하는 미생물 군집과 차이가 있는 바, 정확한 미생물 군집의 평가 방법을 제공한다는 점에서 이점이 있다.

Description

염증성 장질환 환자의 미생물 군집 평가 방법{Method for assessmenting microbiome from Patients with inflammatory bowel disease}

본 발명은 염증성 장질환 환자의 미생물 군집 평가 방법에 관한 것이다.

염증성 장질환(Inflammatory bowel disease; IBD)은 궤양성 대장염 및 크론병을 포함하는 만성 장질환이다. 궤양성 대장염(Ulcerative colitis; UC) 환자는 장내 미생물 군집에 세균 불균형(dysbiosis)이 있는 것으로 보고된 바 있다. 이 질병의 정확한 기전은 밝혀지지 않았으나 장내 세균 불균형이 주요한 원인 중 하나로 알려져 있다.

장내 미생물 군집의 가장 일반적인 평가 방법은 대변을 수집하고 분석하는 것이다. 대변을 수집하는 방법이 표준적이나 장내 미생물 군집 분석에 따르면, 대변 다루기를 꺼리는 사람들이 많고, 대변 수집은 개인의 부작용 및 오염 가능성 등의 문제가 있어 제한적이라는 단점이 있다. 또한, 내시경 검사를 통한 점막 조직 수집이 가장 이상적인 방법이나 이는 침습적인 방법으로 일반적으로 많은 작업을 필요로 한다. 또한 직장 도말 검사는 결장의 장내 박테리아와 크게 다른 것으로 나타났다. 따라서 장내 미생물 불균형을 쉽게 평가할 수 있는 새로운 방법의 개발이 필요한 실정이다.

최근 대장암 검진을 위한 대장 내시경 검사가 빠르게 증가하고 있어 대장 내시경 검사를 통해 장액을 쉽게 흡인할 수 있다. 일반적으로, 대장 내시경 완하제 사용이 장내 미생물 군집에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 결장 수집을 이용한 소규모 연구에서 대장 내시경 완하제는 장내 세균 수를 크게 감소시켰으나 대부분의 경우 14일 이내에 회복하는 것으로 보고되었다. 또한, 대장 내시경 검사를 통한 장액은 장내 박테리아와 유사하다는 조직학적 분석 결과가 보고된 바 있다. 이에, 본 발명에서는 정상인과 비교하여 염증성 장질환 환자에서 장내 세척액(flushing fluid) 내 미생물 군집의 차이를 확인하고자 한다.

미국 공개특허 제2017-0159108호 (2017.06.08. 공개)

본 발명의 목적은 염증성 장질환 환자의 미생물 군집 평가 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염증성 장질환 환자로부터 분리된 시료에서 미생물 다양성을 예측하는 단계를 포함하는 염증성 장질환 환자의 미생물 군집 평가방법을 제공한다.

도 1은 (A, B) 대장 내싱경 세척액 및 (C, D) 생검을 샘플링하는 방법을 나타낸 것이다.
도 2는 대변 시료, 세척액 시료 및 생검 시료의 평균 분류학적 구성을 나타낸 것이다.
도 3은 대변 시료, 세척액 시료 및 생검 시료의 알파 다양성 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 대변 시료, 세척액 시료 및 생검 시료의 베타 다양성 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 대변 시료 및 세척액 시료의 Procrustes 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 대변 시료 및 세척액 시료의 미생물 군집을 나타낸 것이다.
도 7은 대변 시료, 세척액 시료 및 생검 시료(궤양성 대장염 vs 정상 대조군)의 다양성 분석을 나타낸 것이다.
도 8은 질병 예측을 위한 LASSO 분석을 나타낸 것이다.
도 9는 대변 시료 및 세척액 시료(궤양성 대장염 vs 정상 대조군)의 미생물 군집을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 염증성 장질환 환자로부터 분리된 시료에서 미생물 다양성을 예측하는 단계를 포함하는 염증성 장질환 환자의 미생물 군집 평가방법을 제공한다.

상기 시료는 대장 내시경 검사 시, 흡인된 세척액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 세척액은 용종 절제술에 사용되는 인젝터로 흡인할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 미생물 다양성은 장내 미생물 타입 분석, 알파 다양성 분석, 베타 다양성 분석, Procrustes 분석, Mantel 분석, 치환 다변량 분산 분석 및 Lasso 분석으로 이루어진 군에서 선택된 분석을 통해 획득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 미생물 군집 평가방법은 상기 예측되는 염증성 장질환 환자의 장내 미생물 다양성과 정상 대조군의 장내 미생물 다양성의 유사성을 분석하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 염증성 장질환 환자의 장내 미생물은 포도상구균(Staphylococcus) 및 류코노스토카세아에(Leuconostocaceae)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 정상 대조군의 장내 미생물은 프레보텔라(Prevotella), 알리스티페스(Alistipes) 및 디설포비브리오(Desulfovibrio)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

상기 염증성 장질환은 궤양성 대장염, 염증성 대장염, 크론병, 장관형 베체트병, 출혈성 직장 궤양 및 회장낭염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 궤양성 대장염 및 정상인 선별

병원에 내원한 환자들은 유럽 크론과 대장염 학회의 권고사항에 따라 궤양성 대장염(UC)으로 진단되었다. 의료 기록, 혈액 검사, 생검을 통한 대장 내시경 검사 및 방사선 검사를 포함한 임상 데이터를 종합적으로 검토하였으며, 임상 활동은 궤양성 대장염의 Mayo 점수를 사용하여 평가하였다. 또한, (1) 심혈관 질환, 만성 신장 질환 또는 만성 간질환 등; (2) 정신 질환 또는 임신 환자; (3) 최근에 (< 3개월) 위장관 수술을 받은 환자는 배제하였다.

궤양성 대장염 환자와 성별 및 연령이 매칭되는 정상인으로, 위장병 또는 재발성 복부 증상이 없는 대상체를 대조군으로 선별하였다. 재발성 복부 증상과 유기 질병의 존재를 배제하기 위해 증상 설문지, 혈액 검사 및 대장 내시경 검사를 완료하였다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 2018년 9월부터 2019년 1월까지 내원한 궤양성 대장염 환자 16명(남성 9명, 여성 7명, 평균 연령: 52.13 ± 14.09세)과 정상인 15명(남성 8명, 여성 7명, 평균 연령: 50.93 ± 14.11세)이 본 연구에 참여하였다. 연령, 동반 질환, 체질량 지수를 포함한 인구통계학적 특성은 두 그룹에서 비슷하였고, 대조군과 비교하여 환자의 흡연율은 유의하게 낮았다(0 vs. 4; P = 0.043). 경도 내지 중등도 질환 활동을 가지는 4명의 환자를 제외하고, 환자의 대부분은 관해 상태였다.

*: 통계적으로 유의함, BMI: body mass index, E1, E2,E3: disease localization by Montreal Classification

실시예 2: 시료 수집

궤양성 대장염 환자와 정상인을 대상으로 명지병원에서 대장 내시경 검사를 수행하였다. 대장 내시경 검사 3일 전에 대변 시료를 수집하였고, 대장 내시경 검사 중 세척액 시료 및 생검 시료를 수집하였다.

간략하게, 대변은 대변 검체 채취 키트(ChunLab, Inc)를 사용하여 수집하였고, 각 대변에서 총 2개의 펠렛(각각 약 400 mg)을 획득하였다. 임의의 화학적 첨가제 사용 없이, 대변 시료의 각 펠렛을 2개의 멸균 무균 튜브에 넣고 분석에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

더불어, 대장 내시경 검사를 위해, 실험에 참여한 환자 및 정상인에게 동일한 장 세정 제품인 2 L 폴리에틸렌 글리콜(PEG) + 아스코르베이트 용액(Coolprep®; 태준제약)을 제공하였고, 모든 참여자의 검사는 저녁 시간(14:00 이후)에 진행되었다. 대장 내시경 검사 3일 전부터 섬유질, 씨앗, 해조류 및 혼합 곡물의 섭취를 삼가하도록 하였고, 검사 전날에는 가벼운 저녁 식사 후, 물을 제외하고는 금식을 요청하였으며, 검사 당일에는 검사 전 8시간에서 4시간 사이에 장 세정 제품을 섭취하도록 하였다.

연구 프로토콜은 헬싱키 선언(MJH 2018-08-020)의 윤리적 지침에 따라 명지 병원의 기관생명윤리위원회에 의해 승인되었으며, http://cris.nih.go.kr (KCT0003352)에 등록되었다.

모든 내시경 절차는 대장 내시경(CF-H290; 일본 도쿄 올림푸스)을 이용한 백색광 내시경을 사용하여 수행되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 대장 내시경 검사 동안 S 결장에서 세척액 약 3-5 cmm를 Clear-Hemostat 카테터(FM-EH0001,　Finemedix　Co.)로 수집하였고, 동시에 내시경 겸자(FB-24K-1; Olympus, Tokyo, Japan)로 S 결장에서 단일 점막 생검을 수집하였다. 모든 시료는 수집 후 즉시 얼음 위에 보관한 다음 분석을 위해 같은 날 ChunLab, Inc.으로 전달하였다.

실시예 3: 박테리아 군집 분석

3-1. 대변 시료에서 게놈 DNA 추출

대변 시료 400 mg에 DNA 추출 용해 완충액(SDS 4%, Tris-HCL 50 mM, EDTA 50 mM, NaCl 5000 mM) 15 mL를 첨가하고, 1분 동안 격렬하게 볼텍싱(vortexing)하여 균질화시켰다. 균질화된 분변 현탁액 1.4 mL를 2 mL 튜브로 옮긴 후, 50초 동안 비드 비팅(bead beating)을 하고 14,000 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후 상층액 200 μL를 96 웰 플레이트로 옮기고, 상층액 1 μL를 뉴클레아제가 부재한 물 에 29 μL에 용해시켰다. PCR을 수행할 때까지 플레이트를 -25℃로 유지하였다.

추출된 DNA는 박테리아 16s rRNA 유전자의 V3 내지 V4 영역을 표적으로 하는 341F(5'-TCGTCGGCAGCGTC-AGATGTGTATAAGAGACACAG-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'; 밑줄친 서열은 표적 부위 프라이머를 나타냄) 및 805R(5'-GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAG-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') 프라이머를 사용하여 증폭시켰다.

PCR 조건은 다음과 같다 : 95℃에서 3분 동안 초기 변성; 95℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 프라이머 어닐링, 72초에서 30초 동안 연장으로 25 사이클; 72℃에서 5분 동안 최종 신장.

이후, Illumina NexTera 바코드 부착을 위한 2차 증폭을 위해, i5 정방향 프라이머(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-XXXXXXXX-TCGTCGGCAGCGTC-3'; X는 바코드 영역을 나타냄) 및 i7 역방향 프라이머(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXGGGGAGAGTCTGTG-3')를 사용하였다. 2차 증폭의 PCR 조건은 증폭 사이클이 8로 설정된 것을 제외하고는 이전 조건과 동일하다.

PCR 생성물은 2% 아가로오즈 겔 전기 영동으로 확인하였고, 증폭된 생성물은 QIAquick PCR purification Kit(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제하였다. 동일한 농도의 정제된 생성물을 함께 모으고 짧은 단편(비표적 생성물)을 Ampure beads Kit(Ampure beads kit) (Agencourt Bioscience, MA, USA)로 제거하였다. 생성물 크기 및 품질은 DNA 7500 칩을 사용하는 Bioanalyzer 2100(Agilent, Palo Alto, CA, USA)으로 평가하였다. 다양한 시료로부터 혼합된 앰플리콘(amplicon)을 모으고 파이로시퀀싱을 수행하였다. 시퀀싱 공정은 제조사의 지시에 따라 Illumina Miseq 시퀀싱 시스템(Illumina, USA)을 사용하여 Chunlab, Inc.에 의해 수행되었다.

3-2. 서열 데이터 분석

다양한 시료로부터 수득된 판독 값을 각각의 PCR 생성물의 고유 바코드로 분류하였다. 이어서, 바코드, 링커 및 프라이머의 서열을 서열의 본래의 판독으로부터 제거하였다. 서열 판독 중, 둘 이상의 모호한 뉴클레오타이드를 포함하는 판독, 낮은 품질 점수를 갖는 판독(평균 < 25) 또는 300 bp 미만의 판독은 모두 폐기하였다. 정방향 하프 및 역방향 하프 서열 사이의 BLASTN 검색 결과를 비교하는 Bellerophone 방법을 사용하여 잠재적인 키메라 서열을 탐지하였다. 키메라 서열을 제거한 후 각 판독 값을 EzTaxon-e 데이터베이스의 분류학적 분류에 할당하였다(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net). 여러 그룹 간의 분류군의 풍도(abundance)를 비교하기 위해 LDA Effect Size(LEfSe; Linear Discriminant Analysis Effect Size) 알고리즘을 oline interface Galaxy (http://huttenhower.sph.harvard.edu/lefse/)와 함께 사용하였다. LEfSe 분석은 알파 값 < 0.5를 가지는 Kruskal-Wallis sum-rank test를 사용하여 수행하였고, 이어서 알파 점수 < 0.05 및 one-aginst-all strategy을 가지는 Wilcoxon-rank serum test를 사용하여 수행하였다. effect size > 2(로그 스케일)일 때, 유효한 것으로 간주하였다.

실험예 1: 샘플링 방법 비교

낮은 판독 횟수(< 10,000 판독)로 인해 총 93개의 시료 중 5개의 생검 시료는 분석에서 제외하고, 대변, 세척액 및 생검의 평균 분류학적 조성물을 분석하였다(도 2). 프로테오박테리아(Proteobacteria) 및 아커만시아(Akkermansia; phylru Verrucomicrobia의 속)를 포함하는 장과 밀접하게 접촉하는 미생물이 세척액 및 생검 시료에서 증가되어 있는 것을 확인하였다.

샘플링 방법에 따른 알파 다양성은 도 3에 나타내었다. 생검 시료에서 OTU의 수는 생검 및 대변 시료보다 상당히 높았다. 반면에 Shannon과 Simpson의 다양성에서 대변 시료는 생검 시료 및 세척액 시료와 상이하였다. 샘플링 방법 간의 베타 다양성은 도 4에 나타내었다. 베타 다양성의 모든 샘플링 방법은 서로 크게 상이하였다. 샘플링 방법에서 치환 다변량 분산 분석(PERMANOVA)은 표 2에 나타내었다. 치환 다변량 분산 분석의 모든 샘플링 방법은 서로 크게 상이하였다.

또 다른 분석으로 Procrustes test(p = 0.001) (도 5)와 Mantel test(p = 0.0001)에서 대변 시료와 세척액 시료 사이의 상관 관계를 의미하는 중요한 연관성을 확인하였다. Procrustes test에서 생검 시료는 대변 시료(p value = 0.625)와 생검 시료(pvalue = 0.1417) 사이에 유의한 상관 관계를 보이지 않았다. 세척액 시료와 대변 시료를 비교하였을 때, 세척액 시료의 미생물 특성은 다음과 같다: 소장[프로테오박테리아(Proteobacteria), 장내세균과(Enterobacteriaceae)], 구강 및 상부 위장관[그라뉼리카텔라(Granulicatella), 렙토트리키아(Leptotrichia), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis), 후소박테리움 뉴클레아툼 그룹(Fusobacterium nucleatum group), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra),…], 호흡기[코리네박테리움 두룸(Corynebacterium durum)] 미생물 군집(도 6).

실험예 2: 궤양성 대장염 환자와 대조군 비교

대변 시료에서 궤양성 대장염 환자와 정상인 대조군 사이의 다양성(계통형의 수)의 상당한 차이가 발견되었다. 세척액 시료와 생검 시료에서 미생물 다양성을 분석한 결과, 궤양성 대장염 환자와 정상인 대조군 사이에는 큰 차이가 관찰되지 않았다(도 7). 그러나 세척액 시료의 분류학적 분포로부터 시료의 수가 증가함에 따라 다양성의 차이가 보일 수 있다고 제안하였다. PERMANOVA 분석을 통해 특정 인자와 전체 미생물 군집 변이 간의 연관성을 확인하였다. 대변 시료의 경우 궤양성 대장염의 존재와 더 높은 질병 활동을 나타내었고, 세척액 시료의 경우 현재 흡연자, 장 수술 및 장 증상과 관련성을 나타내었다. 결장 조직은 BMI, 수술, order_number 및 sampling_date(표 3)와 유의한 관련성을 나타내었다.

모델링은 각 미생물 군집의 미생물이 질병을 구별하는 능력을 가지고 있음을 확인하였다. 결과적으로, 대변 시료 및 세척액 시료는 각각 AUC 0.85 및 0.81의 정확도를 예측하였다(도 8). 대변 시료 및 세척액 시료의 데이터를 사용할 때 AUC 0.88로 정확도가 증가하였다.

대변 시료의 경우, 장내구균(Enterococcus) 및 젖산간균(Lactobacillus)과 같은 기능성 혐기성 물질이 궤양성 대장염 관련 마커로 발견되었고, 여러 종의 의간균류[Bacteroidetes; 프레보텔라(Prevotella), 박테로이데스(Bacteroides) 등]와 클로스트리디움목(Clostridiales)이 정상 대조군 마커로 발견되었다(도 9).

세척액 시료의 경우, 포도상구균(Staphylococcus), 류코노스토카세아에(Leuconostocaceae)가 궤양성 대장염 관련 마커로 발견되었고, 프레보텔라(Prevotella), 알리스티페스(Alistipes), 디설포비브리오(Desulfovibrio)가 정상 대조군 마커로 발견되었으며, 세척액 시료는 대변 시료보다 마커 수가 적으며 대변 시료와 다른 미생물이 질병 및 정상 대조군 마커로 발견되는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

궤양성 대장염 환자로부터 분리된 대장 내시경 검사 시, 흡인된 세척액에서 미생물 다양성을 예측하는 단계를 포함하는 궤양성 대장염 환자의 미생물 군집 평가방법으로서,
상기 궤양성 대장염 환자의 장내 미생물은 포도상구균(Staphylococcus) 및 류코노스토카세아에(Leuconostocaceae)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 궤양성 대장염 환자의 미생물 군집 평가방법.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 미생물 다양성은 장내 미생물 타입 분석, 알파 다양성 분석, 베타 다양성 분석, Procrustes 분석, Mantel 분석, 치환 다변량 분산 분석 및 Lasso 분석으로 이루어진 군에서 선택된 분석방법으로 분석되는 것을 특징으로 하는 궤양성 대장염 환자의 미생물 군집 평가방법.
청구항 1에 있어서, 상기 미생물 군집 평가방법은 예측되는 궤양성 대장염 환자의 장내 미생물 다양성과 정상 대조군의 장내 미생물 다양성의 유사성을 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 궤양성 대장염 환자의 미생물 군집 평가방법.
삭제
청구항 4에 있어서, 정상 대조군의 장내 미생물은 프레보텔라(Prevotella), 알리스티페스(Alistipes) 및 디설포비브리오(Desulfovibrio)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 궤양성 대장염 환자의 미생물 군집 평가방법.
삭제