CN110819705A - Uc患者肠道菌群多样性及差异性的分析方法 - Google Patents

Uc患者肠道菌群多样性及差异性的分析方法 Download PDF

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CN110819705A CN201910761062.7A CN201910761062A CN110819705A CN 110819705 A CN110819705 A CN 110819705A CN 201910761062 A CN201910761062 A CN 201910761062A CN 110819705 A CN110819705 A CN 110819705A
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缪应雷
孙杨
马岚青
张海蓉
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张安兴
牛俊坤
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杨刚
刘晓林
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明提供了一种UC患者肠道菌群多样性及差异性的分析检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)对相同饮食结构及居住环境的UC患者及配偶进行粪便及肠道黏膜标本采集及处理；(2)对处理后的粪便及肠道黏膜标本分别进行DNA提取及纯化；(3)对提取纯化后的DNA进行16s rRNA分析比对。本发明对UC及其健康配偶肠道菌群的多样性及差异性进行了研究，通过LEfSe分析UC患者肠道中显著改变的核心菌群，为挖掘该核心菌群的关键功能，推测出其可能的致病机制奠定基础。

Description

UC患者肠道菌群多样性及差异性的分析方法
技术领域
本发明具体涉及一种UC患者肠道菌群多样性及差异性的分析方法。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种发病机制未明的慢性非特异性肠道粘膜炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)。IBD是北美和欧洲的常见病，Siew Ng等进行了21世纪全球炎症性肠病发病率及患病率的系统性综述，总共纳入1990年至2016年147项研究，Siew等敏锐的捕捉到在高收入国家过去2-3世代，在发展中及新兴工业国家仅1世代的时间，IBD都均持续增加。在香港IBD的发生率从1985年的1/106增加至2014年的30/10。在中国近20年来IBD也以惊人的步伐成为消化系统的常见病。发病率的升高可能与工业化和城市化的推动、卫生条件、营养状况等相关。
IBD中又以UC发病率较高，病变主要限于大肠粘膜与粘膜下层，呈连续性弥漫性炎症，多数在直肠乙状结肠，可蔓延至全结肠。临床表现为腹泻、粘液脓血便、腹痛、里急后重和不同程度的全身症状。本病青壮年居多、诊治困难、终身治疗，现有药物治疗有限、花费巨大、累积并发症发生率高。IBD患者药物依从性的调查结果显示，纳入研究的UC患者中，86.2％的患者治疗依从性差，39％的患者年收入少于1万元，50％的患者治疗费用超过年收入的一半，93.5％的患者觉得治疗费用是巨大的经济负担，经济压力是导致依从性差最主要的原因之一。患者因病致贫、致残、致癌、致死时有发生，降低患者生活质量，造成沉重的经济负担。
目前认为UC是遗传易感个体免疫系统对肠道微生物或组分启动异常反应，造成持久、过激、不可逆的免疫性损伤。全基因组关联分析(Genome-wide association study,GWAS)鉴定出了超过200个与IBD相关的风险基因座，Jostins等在发现的163个与IBD易感性相关的多态性位点中，仅能解释约7％-40％的IBD发病机制，Frank等发现IBD微生物的改变与疾病分型和基因型相关。Balish等将白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)基因敲除小鼠放置于无菌环境中培养，其不会发生UC；将小鼠给予粪肠球菌灌肠后可诱发UC。国内外文献大量报道肠道菌群失调在UC的易感个体中，触发异常免疫反应。动物实验中CX3CR1+骨髓细胞过表达IL23可诱发UC，更换小鼠饲料可引起菌群的快速变化，包括变形菌门丰度改变、拟杆菌门降低、疣微菌门增多，菌群变化作用于CD4+ T细胞，诱导结肠炎发生。Leber等发现肠道上皮细胞缺失具有抗炎活性的NLRX1小鼠，在DSS诱导的肠炎小鼠中敏感性增加，肠道菌群韦荣球菌属、梭菌目丰度增加，代谢组学上皮细胞增殖、氨基酸代谢、紧密连接蛋白表达发生显著变化。上述研究提示我们肠道微生物是IBD发病的关键因素。
尽管国内外大量研究都提供了UC患者肠道生态失调的证据，但结果差异大，未能获得一致结论，UC的微生物群落状态至今不明，与肠菌相关的作用过程和致病机理并不明确，探究原因，可能与缺乏标准化流程，混杂因素的干扰导致实验室之间的差异相关。首先，各类研究始终无法排除饮食、生活习惯、居住环境、种族等混杂因素的干扰；其次，缺乏与UC粘膜病变相关的样本研究；最后，测序方式之间的差异导致研究结果的差异。
研究揭示，长期共同的生活，配偶双方的肾脏功能、脂质代谢等生化学指标及握力测试的结果都出现惊人地一致性。进一步研究发现，配偶双方患有相同疾病的可能性很大。Hippisley等研究发现配偶一方患病，另一方的患病率会显著提高。研究显示健康宿主肠道菌种相对稳定，约60％菌种可在肠道内恒定存在数十年，同时IBD无论缓解或活动，亦存在相应的核心菌种，基于核心菌种可很好的区分UC、CD和健康对照。这其中，饮食及环境变化是宿主肠道微生态最重要且可修饰的决定因素，其变化可快速改变肠道菌群结构、核心菌株基因组编码序列及KEGG通路丰度，但其“肠型”在饮食干预中却基本保持一致。
尽管上述研究都没有明确提出UC肠道微生态失调的具体机制，但是目前的线索提出了一个临床研究者应该注意的问题：相同的环境、膳食、种族、相似的生活习惯，促使夫妻间原本有差异的肠道微生态系统逐渐趋同、菌群趋于相似，导致配偶之间在性格、生理越来越相似，有些夫妻甚至出现“夫妻相”，配偶双方患有相同疾病的可能性很大。我们推测:选择UC患者及其健康配偶，能够深入发现之间核心微生物群落的异同点，挖掘致病菌群、探讨作用机制、明确精准靶向生物学诊断指标。
传统研究微生物的分子生物学技术包括：分离培养、生物芯片、温度梯度凝胶电泳(Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE)、变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)、末端限制性片段长度多态性(Terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)、印记杂交、定量PCR、基因芯片等，它们是迄今为止使用最为广泛的微生物鉴别技术。但却面对诸多缺点：耗时长、有偏倚、低精度、只能验证已知，无法探索未知。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，分子大小适中，突变率小，最常用于探索菌群的分类、种系、结构及多样性，在临床微生物群落生态学研究领域广泛应用。
发明内容
本发明针对上述问题，提出了一种针对UC患者肠道菌群多样性及差异性的分析检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)选择数对相同饮食结构及居住环境的UC患者及配偶，对其进行粪便及肠道黏膜标本采集及处理；
(2)对处理后的粪便及肠道黏膜标本标本分别进行DNA提取及纯化；
(3)对提取纯化后的DNA进行16s rRNA分析。
本发明粪便标本采集与处理的方法为：
未行肠道清洁准备前，将粪便排入干净的卫生纸上，使用粪便采样套装，由患者用压舌板挑取1管(1g)粪便至粪便保存管(内含3ml粪便保存剂)，于24小时内放置负80摄氏度的冰箱保存，后期进行DNA的提取，转运可在常温下进行。
本发明肠道粘膜标本采集与处理的方法为：
UC患者及其健康配偶统一行肠镜检查，取直肠粘膜组织，受试者均不限制饮食。用一次性活检钳于直肠病变最重处取粘膜活检组织6块，其中4块分别放入不同冻存管中并用1mlPBS缓冲液反复洗涤3次，再次分别置入新的冻存管中，然后迅速转移至液氮保存备用，后期进行DNA的提取，用于16s rRNA和宏基因组学研究。另外2块放入4％福尔马林液中保存，制作蜡块，用于组织学及免疫组织化学检查。
本发明DNA提取方法为：
(1)向装有粪便的离心管中加入1ml的ddH2O,涡旋仪最大震速混匀一分钟。备溶菌酶,放入冰盒，CTAB放入65℃水浴锅；
(2)离心机10000g离心1min；
(3)倾倒液体，留沉淀(必要时重复1-3步骤)；
(4)加入800ul SM缓冲液；
(5)涡旋仪震荡10min；
(6)2000g离心10min；
(7)过滤：准备新的1.5ml离心管，2.5ml针筒抽取上清，过一个0.22um的滤头，若上清过于浑浊，可先过一个0.45um的滤头，过滤后体积在400ul左右；
(8)加入100mg/ml的溶菌酶(lysozyme),量为过滤后液体体积的1/100，金属浴37℃至少30min；
(9)取出后短暂离心，加入液体总体积1/5的氯仿，摇匀至乳白色，室温静置10min，准备DNase于冰盒中，reaction buffer从4度冰箱中取出置于室温)；
(10)2500g离心5分钟，分层，上层为清亮水层，中间白色蛋白质层，下层为氯仿有机层，取上层水层至新的2ml离心管中；
(11)加入液体总体积的1/10体积的reaction buffer，再加入1ul的DNase；
(12)轻震荡混匀37℃金属浴温育15min(备stop buffer从4度冰箱中取出置于室温)；
(13)取出，短暂离心，加入总体积的1/10体积的stop buffer，65℃，10min；
(14)加入3.8％体积的SDS,(每100ul体积加入3.8ul SDS,如400ul，加入15.2ul的SDS)；
(15)加入蛋白酶K，每100ul体积加入0.5ul proteinase K(如400ul，加入2ul)；
(16)混匀，56℃40min；
(17)加入CTAB，每100ul加入14ul CTAB，吹打至乳白色，65℃，10min；
(18)取出短暂离心，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，8000g离心5min,取上清至新的离心管；
(19)加入等体积PCI，轻轻颠倒混匀，8000g离心5min,取上清至新的离心管。
DNA的纯化方法为
(1)准备好纯化柱加套管，标记号码；
(2)Binding buffer:样品体积＝2:1，加入Binding buffer进离心管中，吹打混匀后加入纯化柱；
(3)10000g离心30s,去滤液；
(4)Wash buffer 200ul加入纯化柱，10000g离心30s,去滤液；
(5)重复第4步，再洗一次，去滤液；
(6)将纯化柱套到新的标记好的离心管中，ddH2O 10ul加到纯化柱膜正中央，10000g离心30s；
(7)离心管中10ul，取1ul进行核算定量，≤30ng/ml合格。
本发明PCR+PCR产物纯化的方法为：
(1)一个PCR管中：Sample buffer 4.5ul+template DNA 1uL，每个样品准备三个PCR管，标记，PCR仪中95℃3min,4℃∞，设置液体体积为10ul体系；
(2)取出置于冰盒上，按照PCR管数，混匀Master Mix＝4.5ul reaction buffer+0.5ul enzyme；
(3)调节PCR仪程序，设置液体体积为10ul体系；
30℃ 3h,
65℃ 10min
4℃ ∞
(4)准备好纯化柱加套管，标记；
(5)扩增完取出置于冰上，将每3个PCR管中的液体汇合成一管，加入5倍体积Binding buffer，混匀，加入纯化柱；
(6)10000g离心30s,去滤液；
(7)Wash buffer 200ul加入纯化柱，10000g离心30s,去滤液，洗2次；
(8)将纯化柱套到新的标记好的离心管中，Elution Buffer 30ul加到纯化柱膜正中央，10000g离心30s；
(9)离心管中30ul，取1ul进行核算定量，2-3ug/ul合格。
本发明中16s rRNA分析包括以下步骤:
a.数据统计与测序
(1)设置30bp窗口长度，截除read末端序列，移除最终read长度低于原始read长度75％的reads；
(2)去除接头污染reads；
(3)去除含N的reads；
(4)去除低复杂度reads(默认reads中某个碱基连续出现的长度≥10，设置10bp),样品通过barcode合并建库，得到Clean Data后，利用barcode序列与测序reads比对。通过Illumina平台(25,000tags，MiSeq平台)进行测序，完成112个人源样品(粪便56个，肠黏膜56个)V3-V4区扩增子信息采集，下机数据经过去除低质量reads。测序策略(PE101/PE150/PE250/PE300)：PE300；
正向引物为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
反向引物为：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
b.序列拼接
使用FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，FLASH)利用重叠关系将双末端测序获得的Paired-reads组装成序列，获得高变区Tags。
(1)最小匹配长度15bp；
(2)重叠区域允许错配率0.1，去除没有overlap关系的reads。
c.OTU及其丰度分析
(1)处理后的Clean Tags进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚类、注释完成物种分类；
(2)利用UPARSE在97％相似度下进行聚类，获得OTU的代表序列；
(3)使用usearch global方法将所有Tags比对回OTU代表序列，获得每个样品在每个OTU的丰度统计；
(4)使用RDP classifer(V 2.2)软件将OTU代表序列与数据库(Greengene)比对进行物种注释；
(5)OTU Venn图：在97％的相似度下，获得每个样品OTU个数，利用Venn图展示多样品共有和各自OTU数目，展示重叠情况，结合OTU所代表的物种，分别找出健康人—UC患者粪便及粘膜的核心微生物组；
(6)OTU PCA分析
PCA分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，通过保留低阶主成分，忽略高阶主成分，能够减少数据集的维数、保持数据集中对方差贡献最大的特征。依据每个样品OTU计算相对丰度，进行PCA分析。PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，如果两个样品距离越近，则表示两个样品组成越相似。
d.物种分类和丰度分析
(1)profiling面积图和柱状图：与数据库比对，对OTU进行物种分类并分别在门、纲、目、科、属、种几个分类等级对个样品做物种profiling面积图和柱状图。
(2)系统进化分析：系统进化树是表示物种间发育关系的树状图，枝长长短表示进化距离差异。系统关系越近、进化树种距离越近。我们选取属水平丰度最高的一条作为代表序列，构建物种系统进化树。
e.多样性分析
(1)Alpha多样性(Alpha diversity)，包括observed specices指数、chao指数、ace指数、shannon指数以及simpson指数，前面4个指数越大、最后一个指数越小，说明样品中物种越丰富。
(2)Beta多样性(Beta diversity)分析样品在物种多样性方面存在的差异大小。
(3)PCoA主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCoA)分析样品间差异大小，距离越近，物种组成越相似。
f.物种组成聚类分析
通过QIIME软件进行，聚类方法为UPGMA(Unweighted Pair Group Method withArithmetic mean)。
g.微生物物种显著性差异分析及线性判别分析效应大小(Linear DiscriminateAnalysis Effect Size，LEfSe)分析
LEfSe是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件，强调统计意义和生物相关性，识别不同丰度特征以及相关联的类别，以期发现UC患者高维生物标识和基因组特征，评估预期的生物学行为。
本发明选择相同种族、膳食结构、居住环境、生活方式的UC患者及其健康配偶，将对肠道菌群产生影响的多因素纳入到样本收集的标准中，填补当前研究不足，对粪便及粘膜微生物16S rRNA的V3-V4区进行分析，3062675条Tags用于UC患者肠道菌群结构和组成分析，测序覆盖度97.0％以上，测序质量良好，通过QIIME软件进行物种组成聚类分析，聚类方法为UPGMA，本发明对UC及其健康配偶肠道菌群的多样性及差异性进行了研究，通过LEfSe分析UC患者肠道中显著改变的核心菌群，为挖掘该核心菌群的关键功能，推测出其可能的致病机制奠定基础。
附图说明
图1为样品Phylum分类水平中物种profiling柱状图；
图2为样品Class分类水平中物种profiling柱状图；
图3为样品Order分类水平中物种profiling柱状图；
图4样品Family分类水平中物种profiling柱状图；
图5为样品Genus分类水平中物种profiling柱状图；
图6为UC患者肠道菌群的系统进化树；
图7为OTU维恩图，其中FH，健康对照组粪便样本；FU，溃疡性结肠炎组粪便样本；MH，健康对照组肠粘膜样本；MU，溃疡性结肠炎组肠粘膜样本；
图8为肠道菌群Alpha多样性不同指数的稀释曲线(Shf，健康对照组粪便样本；Spf，溃疡性结肠炎组粪便样本；Shm，健康对照组肠粘膜样本；Spm，溃疡性结肠炎组肠粘膜样本)；
图9为肠道菌群Alpha多样性箱图(FH，健康对照组粪便样本；FU，溃疡性结肠炎组粪便样本；MH，健康对照组肠粘膜样本；MU，溃疡性结肠炎组肠粘膜样本)；
图10为基于Bray-Curtis距离的PCoA分析结果；
图11为基于weighted UniFrac距离的PCoA分析结果；
图12为HC与UC患者肠道菌群LEfSe分析进化分支图(HC，Healthy Control；UC，Ulcerative Colitis)；
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
1.选择24对相同饮食结构及居住环境的UC患者及配偶，对其进行粪便标本采集及处理：未行肠道清洁准备前，将粪便排入干净的卫生纸上，使用粪便采样套装，由患者用压舌板挑取1管(1g)粪便至粪便保存管(内含3ml粪便保存剂)，于24小时内放置负80摄氏度的冰箱保存，后期进行DNA的提取，转运可在常温下进行。
2.粪便标本进行DNA提取及纯化：
(1)向装有粪便的离心管中加入1ml的ddH2O,涡旋仪最大震速混匀一分钟。备溶菌酶,放入冰盒，CTAB放入65℃水浴锅；
(2)离心机10000g离心1min；
(3)倾倒液体，留沉淀(必要时重复1-3步骤)；
(4)加入800ul SM缓冲液；
(5)涡旋仪震荡10min；
(6)2000g离心10min；
(7)过滤：准备新的1.5ml离心管，2.5ml针筒抽取上清，过一个0.22um的滤头，若上清过于浑浊，可先过一个0.45um的滤头，过滤后体积在400ul左右；
(8)加入100mg/ml的溶菌酶(lysozyme),量为过滤后液体体积的1/100，金属浴37℃至少30min；
(9)取出后短暂离心，加入液体总体积1/5的氯仿，摇匀至乳白色，室温静置10min，准备DNase于冰盒中，reaction buffer从4度冰箱中取出置于室温；
(10)2500g离心5分钟，分层，上层为清亮水层，中间白色蛋白质层，下层为氯仿有机层，取上层水层至新的2ml离心管中；
(11)加入液体总体积的1/10体积的reaction buffer，再加入1ul的DNase；
(12)轻震荡混匀37℃金属浴温育15min(备stop buffer从4度冰箱中取出置于室温)；
(13)取出，短暂离心，加入总体积的1/10体积的stop buffer，65℃，10min；
(14)加入3.8％体积的SDS,(每100ul体积加入3.8ul SDS,如400ul，加入15.2ul的SDS)；
(15)加入蛋白酶K，每100ul体积加入0.5ul proteinase K(如400ul，加入2ul)；
(16)混匀，56℃40min；
(17)加入CTAB，每100ul加入14ul CTAB，吹打至乳白色，65℃，10min；
(18)取出短暂离心，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，8000g离心5min,取上清至新的离心管；
(19)加入等体积PCI，轻轻颠倒混匀，8000g离心5min,取上清至新的离心管。
3.DNA的纯化方法为
(1)准备好纯化柱加套管，标记号码；
(2)Binding buffer:样品体积＝2:1，加入Binding buffer进离心管中，吹打混匀后加入纯化柱；
(3)10000g离心30s,去滤液；
(4)Wash buffer 200ul加入纯化柱，10000g离心30s,去滤液；
(5)重复第4步，再洗一次，去滤液；
(6)将纯化柱套到新的标记好的离心管中，ddH2O 10ul加到纯化柱膜正中央，10000g离心30s；
(7)离心管中10ul，取1ul进行核算定量，≤30ng/ml合格。
4.PCR+PCR产物纯化
(1)一个PCR管中：Sample buffer 4.5ul+template DNA 1uL，每个样品准备三个PCR管，标记，PCR仪中95℃3min,4℃∞，设置液体体积为10ul体系；
(2)取出置于冰盒上，按照PCR管数，混匀Master Mix＝4.5ul reaction buffer+0.5ul enzyme；
(3)调节PCR仪程序，设置液体体积为10ul体系；
30℃ 3h,
65℃ 10min
4℃ ∞
(4)准备好纯化柱加套管，标记；
(5)扩增完取出置于冰上，将每3个PCR管中的液体汇合成一管，加入5倍体积Binding buffer，混匀，加入纯化柱；
(6)10000g离心30s,去滤液；
(7)Wash buffer 200ul加入纯化柱，10000g离心30s,去滤液，洗2次；
(8)将纯化柱套到新的标记好的离心管中，Elution Buffer 30ul加到纯化柱膜正中央，10000g离心30s；
(9)离心管中30ul，取1ul进行核算定量，2-3ug/ul合格。
5. 16s rRNA分析
a.数据统计与测序
(1)设置30bp窗口长度，截除read末端序列，移除最终read长度低于原始read长度75％的reads；
(2)去除接头污染reads；
(3)去除含N的reads
(4)去除低复杂度reads(默认reads中某个碱基连续出现的长度≥10，设置10bp),样品通过barcode合并建库，得到Clean Data后，利用barcode序列与测序reads比对。通过Illumina平台(25,000tags，MiSeq平台)进行测序，完成112个人源样品(粪便56个，肠黏膜56个)V3-V4区扩增子信息采集，下机数据经过去除低质量reads。测序策略(PE101/PE150/PE250/PE300)：PE300；
正向引物为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
反向引物为：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
b.序列拼接
使用FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，FLASH)利用重叠关系将双末端测序获得的Paired-reads组装成序列，获得高变区Tags。
(1)最小匹配长度15bp；
(2)重叠区域允许错配率0.1，去除没有overlap关系的reads。
c.OTU及其丰度分析
(1)处理后的Clean Tags进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚类、注释完成物种分类，如图1-5所示；
(2)利用UPARSE在97％相似度下进行聚类，获得OTU的代表序列；
(3)使用usearch global方法将所有Tags比对回OTU代表序列，获得每个样品在每个OTU的丰度统计；
(4)使用RDP classifer(V 2.2)软件将OTU代表序列与数据库(Greengene)比对进行物种注释；
(5)OTU Venn图：在97％的相似度下，获得每个样品OTU个数，利用Venn图展示多样品共有和各自OTU数目，展示重叠情况，结合OTU所代表的物种，分别找出健康人—UC患者粪便及粘膜的核心微生物组，如图7所示；
(6)OTU PCA分析
PCA分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，通过保留低阶主成分，忽略高阶主成分，能够减少数据集的维数、保持数据集中对方差贡献最大的特征。依据每个样品OTU计算相对丰度，进行PCA分析。PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，如果两个样品距离越近，则表示两个样品组成越相似。
d.物种分类和丰度分析
(1)profiling面积图和柱状图：与数据库比对，对OTU进行物种分类并分别在门、纲、目、科、属、种几个分类等级对个样品做物种profiling面积图和柱状图，见图1-5。
(2)系统进化分析：系统进化树是表示物种间发育关系的树状图，枝长长短表示进化距离差异。系统关系越近、进化树种距离越近。我们选取属水平丰度最高的一条作为代表序列，构建物种系统进化树，见图6。
e.多样性分析
(1)Alpha多样性(Alpha diversity)，包括observed specices指数、chao指数、ace指数、shannon指数以及simpson指数，前面4个指数越大、最后一个指数越小，说明样品中物种越丰富，如图8-9所示。
(2)Beta多样性(Beta diversity)分析样品在物种多样性方面存在的差异大小。
(3)PCoA主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCoA)分析样品间差异大小，距离越近，物种组成越相似，见图10-11。
f.物种组成聚类分析
通过QIIME软件进行，聚类方法为UPGMA(Unweighted Pair Group Method withArithmetic mean)。
g.微生物物种显著性差异分析及线性判别分析效应大小(Linear DiscriminateAnalysis Effect Size，LEfSe)分析，如图12所示。
LEfSe是一种用于发现高维生物标识和揭示基因组特征的软件，强调统计意义和生物相关性，识别不同丰度特征以及相关联的类别，以期发现UC患者高维生物标识和基因组特征，评估预期的生物学行为。
实施例2
1.选择24对相同饮食结构及居住环境的UC患者及配偶，对其进行肠道黏膜标本采集及处理：UC患者及其健康配偶统一行肠镜检查，取直肠粘膜组织，受试者均不限制饮食。用一次性活检钳于直肠病变最重处取粘膜活检组织6块，其中4块分别放入不同冻存管中并用1mlPBS缓冲液反复洗涤3次，再次分别置入新的冻存管中，然后迅速转移至液氮保存备用，后期进行DNA的提取，用于16s rRNA和宏基因组学研究。另外2块放入4％福尔马林液中保存，制作蜡块，用于组织学及免疫组织化学检查。
2.肠道黏膜标本进行DNA提取及纯化：
(1)向装有直肠黏膜组织的离心管中加入1ml的ddH2O,涡旋仪最大震速混匀一分钟。备溶菌酶,放入冰盒，CTAB放入65℃水浴锅；
(2)离心机10000g离心1min；
(3)倾倒液体，留沉淀(必要时重复1-3步骤)；
(4)加入800ul SM缓冲液；
(5)涡旋仪震荡10min；
(6)2000g离心10min；
(7)过滤：准备新的1.5ml离心管，2.5ml针筒抽取上清，过一个0.22um的滤头，若上清过于浑浊，可先过一个0.45um的滤头，过滤后体积在400ul左右；
(8)加入100mg/ml的溶菌酶(lysozyme),量为过滤后液体体积的1/100，金属浴37℃至少30min；
(9)取出后短暂离心，加入液体总体积1/5的氯仿，摇匀至乳白色，室温静置10min，准备DNase于冰盒中，reaction buffer从4度冰箱中取出置于室温；
(10)2500g离心5分钟，分层，上层为清亮水层，中间白色蛋白质层，下层为氯仿有机层，取上层水层至新的2ml离心管中；
(11)加入液体总体积的1/10体积的reaction buffer，再加入1ul的DNase；
(12)轻震荡混匀37℃金属浴温育15min(备stop buffer从4度冰箱中取出置于室温)；
(13)取出，短暂离心，加入总体积的1/10体积的stop buffer，65℃，10min；
(14)加入3.8％体积的SDS,(每100ul体积加入3.8ul SDS,如400ul，加入15.2ul的SDS)；
(15)加入蛋白酶K，每100ul体积加入0.5ul proteinase K(如400ul，加入2ul)；
(16)混匀，56℃40min；
(17)加入CTAB，每100ul加入14ul CTAB，吹打至乳白色，65℃，10min；
(18)取出短暂离心，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，8000g离心5min,取上清至新的离心管；
(19)加入等体积PCI，轻轻颠倒混匀，8000g离心5min,取上清至新的离心管。
3.DNA的纯化方法为
(1)准备好纯化柱加套管，标记号码；
(2)Binding buffer:样品体积＝2:1，加入Binding buffer进离心管中，吹打混匀后加入纯化柱；
(3)10000g离心30s,去滤液；
(4)Wash buffer 200ul加入纯化柱，10000g离心30s,去滤液；
(5)重复第4步，再洗一次，去滤液；
(6)将纯化柱套到新的标记好的离心管中，ddH2O 10ul加到纯化柱膜正中央，10000g离心30s；
(7)离心管中10ul，取1ul进行核算定量，≤30ng/ml合格。
4.PCR+PCR产物纯化
(1)一个PCR管中：Sample buffer 4.5ul+template DNA 1uL，每个样品准备三个PCR管，标记，PCR仪中95℃3min,4℃∞，设置液体体积为10ul体系；
(2)取出置于冰盒上，按照PCR管数，混匀Master Mix＝4.5ul reaction buffer+0.5ul enzyme；
(3)调节PCR仪程序，设置液体体积为10ul体系；
30℃ 3h,
65℃ 10min
4℃ ∞
(4)准备好纯化柱加套管，标记；
(5)扩增完取出置于冰上，将每3个PCR管中的液体汇合成一管，加入5倍体积Binding buffer，混匀，加入纯化柱；
(6)10000g离心30s,去滤液；
(7)Wash buffer 200ul加入纯化柱，10000g离心30s,去滤液，洗2次；
(8)将纯化柱套到新的标记好的离心管中，Elution Buffer 30ul加到纯化柱膜正中央，10000g离心30s；
(9)离心管中30ul，取1ul进行核算定量，2-3ug/ul合格。
5.16s rRNA分析
a.数据统计与测序
(1)设置30bp窗口长度，截除read末端序列，移除最终read长度低于原始read长度75％的reads；
(2)去除接头污染reads；
(3)去除含N的reads
(4)去除低复杂度reads(默认reads中某个碱基连续出现的长度≥10，设置10bp),样品通过barcode合并建库，得到Clean Data后，利用barcode序列与测序reads比对。通过Illumina平台(25,000tags，MiSeq平台)进行测序，完成112个人源样品(粪便56个，肠黏膜56个)V3-V4区扩增子信息采集，下机数据经过去除低质量reads。测序策略(PE101/PE150/PE250/PE300)：PE300；
正向引物为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
反向引物为：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。
b.序列拼接
使用FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，FLASH)利用重叠关系将双末端测序获得的Paired-reads组装成序列，获得高变区Tags。
(1)最小匹配长度15bp；
(2)重叠区域允许错配率0.1，去除没有overlap关系的reads。
c.OTU及其丰度分析
(1)处理后的Clean Tags进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚类、注释完成物种分类；
(2)利用UPARSE在97％相似度下进行聚类，获得OTU的代表序列；
(3)使用usearch global方法将所有Tags比对回OTU代表序列，获得每个样品在每个OTU的丰度统计；
(4)使用RDP classifer(V 2.2)软件将OTU代表序列与数据库(Greengene)比对进行物种注释；
(5)OTU Venn图：在97％的相似度下，获得每个样品OTU个数，利用Venn图展示多样品共有和各自OTU数目，展示重叠情况，结合OTU所代表的物种，分别找出健康人—UC患者粪便及粘膜的核心微生物组；
(6)OTU PCA分析
PCA分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，通过保留低阶主成分，忽略高阶主成分，能够减少数据集的维数、保持数据集中对方差贡献最大的特征。依据每个样品OTU计算相对丰度，进行PCA分析。PCA运用方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，如果两个样品距离越近，则表示两个样品组成越相似。
d.物种分类和丰度分析
(1)profiling面积图和柱状图：与数据库比对，对OTU进行物种分类并分别在门、纲、目、科、属、种几个分类等级对个样品做物种profiling面积图和柱状图。
(2)系统进化分析：系统进化树是表示物种间发育关系的树状图，枝长长短表示进化距离差异。系统关系越近、进化树种距离越近。我们选取属水平丰度最高的一条作为代表序列，构建物种系统进化树。
e.多样性分析
(1)Alpha多样性(Alpha diversity)，包括observed specices指数、chao指数、ace指数、shannon指数以及simpson指数，前面4个指数越大、最后一个指数越小，说明样品中物种越丰富。
(2)Beta多样性(Beta diversity)分析样品在物种多样性方面存在的差异大小。
(3)PCoA主坐标分析(Principal coordinates analysis,PCoA)分析样品间差异大小，距离越近，物种组成越相似。
f.物种组成聚类分析
通过QIIME软件进行，聚类方法为UPGMA(Unweighted Pair Group Method withArithmetic mean)。
g.微生物物种显著性差异分析及线性判别分析效应大小(Linear DiscriminateAnalysis Effect Size，LEfSe)分析，如图12所示。
实施例1和实施例2在不同的生物分类层面，通过统计学的方法检验粪便及肠道黏膜间微生物群落相对丰度(Related Abundance)的差异，并使用FDR(false discoveryrate)评估差异的显著性，为挖掘该核心菌群的关键功能，推测出其可能的致病机制奠定基础。

Claims (3)

1.UC患者肠道菌群多样性及差异性的分析检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对相同饮食结构及居住环境的UC患者及配偶进行粪便及肠道黏膜标本采集及处理；
(2)对处理后的粪便及肠道黏膜标本分别进行DNA提取及纯化；
(3)对提取纯化后的DNA进行16s rRNA分析比对，具体包括以下步骤：
a.数据统计与测序,样品通过barcode合并建库，得到Clean Data后，利用barcode序列与测序reads比对。通过Illumina平台(25,000tags，MiSeq平台)进行测序，完成112个人源样品(粪便56个，肠黏膜56个)V3-V4区扩增子信息采集，下机数据经过去除低质量reads。测序策略(PE101/PE150/PE250/PE300)：PE300；
正向引物为：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；
反向引物为：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’；
b.使用FLASH(Fast Length Adjustment of Short reads，FLASH)利用重叠关系将双末端测序获得的Paired-reads组装成序列，获得高变区Tags；
c.OTU及其丰度分析，包括以下步骤：
(1)处理后的Clean Tags进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚类、注释完成物种分类；
(2)利用UPARSE在97％相似度下进行聚类，获得OTU的代表序列；
(3)使用usearch global方法将所有Tags比对回OTU代表序列，获得每个样品在每个OTU的丰度统计；
(4)使用RDP classifer(V2.2)软件将OTU代表序列与数据库(Greengene)比对进行物种注释；
(5)OTU Venn图：在97％的相似度下，获得每个样品OTU个数，利用Venn图展示多样品共有和各自OTU数目，展示重叠情况，结合OTU所代表的物种，分别找出健康人—UC患者粪便及粘膜的核心微生物组；
(6)OTU PCA分析；
d.物种分类和丰度分析、多样性分析、物种组成聚类分析及微生物物种显著性差异分析及线性判别分析效应大小。
2.根据权利要求1所述的UC患者肠道菌群多样性及差异性的分析检测方法，其特征在于，所述多样性分析包括Alpha多样性及Beta多样性，采用Bray-Curtis计算Beta值，并进行PCoA分析，为了保证可靠性，使用weighted UniFrac计算Beta值后再次进行PCoA分析。
3.根据权利要求1所述的UC患者肠道菌群多样性及差异性的分析检测方法，其特征在于，本方法应用Taylor幂法则(Taylor′s power law)和中性理论(neutral theory)对样本微生物群落进行分析。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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