-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein hochspezifisches In-situ-Hybridisierungsverfahren
von markierten Oligonucleotiden mit in einem Zielobjekt nachzuweisenden
Nucleotidsequenzen sowie dabei eingesetzte Hybridisierungspuffer,
Oligonucleotide sowie Verfahren zur Markierung der Oligonucleotide.
-
Sowohl
die molekularbiologische Grundlagenforschung als auch die angewandte
Forschung, insbesondere die molekulare Beschreibung physiologischer
oder krankhafter Vorgänge,
bedient sich in zunehmendem Maße
einer Nucleotidanalyse auf Zell- und Gewebeebene. Zur exakten Lokalisation
und quantitativen Abschätzung
der Expression von zum Beispiel DNA oder RNA in Zellen oder Geweben
wird die molekulare In-situ-Hybridisierung
eingesetzt. Grundlage dieses molekularbiologischen Nucleinsäurenachweises
ist das Prinzip der spezifischen Basenpaarung zweier komplementärer Nucleinsäuremolekülen. Eine
in einem Zielobjekt vorhandene Nucleotidsequenz wird durch Basenpaarung
mit einer markierten komplementären
Nucleotidsequenz, der Sonde, nachgewiesen. Derartige Verfahren sind
aus Wernert und Behrens (mta 13 (1998) 12, 880–886) bekannt.
-
Den
In-situ-Hybridisierungsverfahren ist gemeinsam, dass nach radioaktiver
oder nicht-radioaktiver Markierung der Nucleinsäure-Sonden und gegebenenfalls erfolgender
In-situ-Amplifikation der zu untersuchenden Nucleotidsequenzen eine
Hybridisierung in situ stattfindet. Im Vorfeld der In-situ-Hybridisierung wird üblicherweise
zunächst
das Gewebe fixiert, eingebettet, ein Schnitt hergestellt, die Zielnucleinsäure demaskiert,
gegebenenfalls ein DNAse oder RNAse-Verdau durchgeführt und
gegebenenfalls die Zielnucleinsäure und
die Probe denaturiert. Anschließend
kann dann die eigentliche Hybridisierung mit der markierten Sonde stattfinden.
-
Ein
besonders bedeutsamer Anwendungsbereich der In-situ-Hybridisierung ist die Untersuchung
von mit dem menschlichen oder tierischen Immunsystem zusammenhängenden
Vorgängen.
Für die
Durchführung der
ISH ist die Kenntnis der Sequenz der nachzuweisenden DNA oder RNA
notwendig. Die Nucleotidsequenzen der Ig-λ-leichte Ketten-Gene sind aus
Hieter et al. (Nature 294 (1981), 536–540) und die der κ-leichte
Ketten-Gene aus Hieter et al. (Cell 22 (1980), 197–207) bekannt.
Sowohl diagnostische als auch therapeutische Verfahren, im Rahmen
derer Qualität
und Quantität
einer Ig-basierten Immunantwort analysiert werden müssen, sind
bekannt.
-
So
ist beispielsweise aus Takahashi et al. (J. Oral. Pathol. Med. 1996
(25) 331–335)
bekannt, die Immunglobulin (Ig) λ und κ leichten
Ketten mRNA mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) als Hinweis auf
eine Immunreaktion im Rahmen einer Zahnerkrankung nachzuweisen.
Unter Einsatz Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC)-markierter λ- und κ-leichte
Ketten-Oligonucleotidgemische sowie Anti-FITC- Antikörper, die mit alkalischer Phosphatase
konjugiert worden waren, wurden λ-
und κ-leichte
Ketten-mRNA in verschiedenen
Schnitten nachgewiesen. Auch Pringle et al. (J. of Pathology 162
(1990), 197–207)
beschreibt eine ISH von Ig leichte Ketten mRNA unter Verwendung
von Gemischen von markierten Oligonucleotiden. Die beschriebenen
Verfahren erweisen sich jedoch insofern als nachteilig, als dass
einerseits die Hybridisierungszeit vergleichsweise lang, andererseits
auch die erhaltene Sensitivität
verbesserungsfähig
sind.
-
Aus
der
DE 42 16 949 C2 und
der WO 93/24652 sind Verfahren zur Hybridisierung von spezifischen Proben
in situ bekannt, wobei Hybridisierungspuffer eingesetzt werden,
die keine oder wenig denaturierende Agentien enthalten. Formamid-haltige
Hybridisierungspuffer sind für
den Einsatz in ISH zum Beispiel aus Rüger et al. (Biochemica 3 (1995),
27–29)
bekannt. Diesen Puffern haftet jedoch der Nachteil an, gesundheits- und
umweltgefährdend
zu sein. Überdies
sind sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten aufgebaut
und vergleichsweise teuer. Die vorgenannten Druckschriften betreffen
auch nicht die In-situ-Hybridisierung von Ig-λ- und κ-leichte Ketten-Nucleotidsequenzen.
-
Das
der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem
bestand also darin, eine In-situ-Hybridisierungstechnik
zu entwickeln, die in automatisierbarer, schneller und hochsensitiver
Weise den Nachweis von Immunglobulin λ- und k-leichte Ketten-Nucleotidsequenzen ermöglicht,
wobei gleichzeitig unter Einsatz preisgünstiger, umwelt- und gesundheitsverträglicher
Mittel eine Reduzierung der Hintergrundaktivität soweit wie möglich erreicht
werden soll.
-
Die
vorliegende Erfindung löst
das ihr zugrunde liegende technische Problem durch die Bereitstellung eines
Verfahrens für
die Durchführung
von In-situ-Hybridisierungen
von mindestens einem markierten Oligonucleotid mit nachzuweisenden
Nucleotidsequenzen in Zielobjekten, wobei das mindestens eine markierte
Oligonucleotid in situ unter Zusatz eines formamidfreien Hybridisierungspuffers
mit den Nucleotidsequenzen in Kontakt gebracht und hybridisierende
Nucleotidsequenzen im Zielobjekt nachgewiesen werden.
-
Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Zielobjekten
jedwede Art von Objekten verstanden, die Nucleotidsequenzen enthalten
oder aus diesen bestehen. Dies sind insbesondere biologische Materialien
wie Zellen, Gewebe, Gewebeschnitte, Zellorganelle, Nucleotidsequenz-haltige
Partikel wie Viren oder Liposomen, menschliche, tierische oder pflanzliche
Chromosomen, menschliche, tierische oder pflanzliche extrachromosomale
Strukturen, ebenso wie chromosomale oder extrachromosomale Strukturen
in Procaryoten oder ähnliches.
Die Zielobjekte können
lebend oder tot, vorbehandelt oder unbehandelt sein. Die in ihnen
enthaltenden nachzuweisenden Nucleotidsequenzen können im
Zielobjekt oder an andere Strukturen gebunden vorliegen. Sie können auch
in amplifizierter Form vorliegen. Überdies können die Nucleotidsequenzen
ein zel- oder doppelsträngig
sowie gegebenenfalls mehrfachsträngig
im Zielobjekt vorliegen.
-
Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter nachzuweisenden
Nucleotidsequenzen pro- oder
eucaryotische Nucleotidsequenzen von einige wenige bis viele hundert
oder tausend Nucleotide enthaltende Nucleotidsequenzen verstanden,
beispielsweise Genabschnitte, Gene, Plasmide, Nucleotidsequenzen
in Chromosomen oder Chromosomenfragmente etc. Die Nucleotidsequenz
kann als RNA- oder DNA-Sequenz vorliegen. Sie kann einzel-, doppel- oder mehrfachsträngig sein.
Erfindungsgemäß ist es
daher nicht zwingend notwendig, doppelsträngig in situ vorhandene nachzuweisende
Nucleotidsequenzen vor der ISH in die einzelsträngige Form zu überführen. Erfindungsgemäß kann vielmehr
die Bildung von Tripel-Formationen, das heißt aus drei Nucleinsäuresträngen gebildete
Formationen vorgesehen sein. Die Erfindung erfasst natürlich auch
die Hybridisierung mit einzelsträngigen
Abschnitten, die in nativer DNA bereichsweise vorliegen kann.
-
Die
Erfindung betrifft auch speziell entwickelte markierte und z.B.
für den
Einsatz im vorgenannten ISH-Verfahren besonders geeignete Oligonucleotide
oder Gemische davon sowohl für
die Hybridisierung mit Immunglobulin-λ als auch mit Immunglobulin-κ-leichte Ketten-Nucleotidsequenzen.
Selbstverständlich
sind diese Oligonucleotide auch für andere Zwecke, z.B. andere
ISH-Verfahren oder In-situ-Amplifikationen
geeignet.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist das Immunglobulin-λ-leichte
Ketten-Oligonucleotid ausgewählt
aus der Gruppe der Sequenzen bestehend aus SEQ ID Nr. 1 bis 6. Die
Erfindung betrifft auch ein Gemisch aus verschiedenen, zum Beispiel
zwei, drei, vier, fünf
oder sechs der genannten Oligonucleotide, und für den Einsatz im vorgenannten
ISH-Verfahren besonders
geeignet, insbesondere ein Gemisch aus SEQ ID Nr. 2, 3 und 6.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
ist die Nucleotidsequenz des κ-leichte
Ketten Oligonucleotids ausgewählt
aus der Gruppe der Sequenzen, bestehend aus SEQ ID Nr. 7 bis 10.
Die Erfindung betrifft auch ein Gemisch aus verschiedenen, zum Beispiel
zwei, drei oder vier der genannten Oligonucleotide, insbesondere
aller vier Oligonucleotide (SEQ ID Nr. 7, 8, 9 und 10).
-
Diese
erfindungsgemäßen λ- und κ-Oligonucleotide
sind hochsensitiv, hochspezifisch und entsprechen jeweils der konstanten
Region der menschlichen λ- und κ-Gene. Die
Oligonucleotide können
als einzelne Oligonucleotide zum Beispiel in dem erfindungsgemäßen Verfahren
oder als Gemisch aus zum Beispiel drei, insbesondere SEQ Nr. 2,
3, 6 für
die λ- beziehungsweise
vier, insbesondere SEQ Nr. 7, 8, 9 und 10 für die κ Ig-leichte Ketten-Nucleotidsequenz-Detektion
eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide beziehungsweise
deren Gemische zeichnen sich auch dadurch aus, dass die bei einer
herkömmlichen
ISH auftretende Hintergrundfärbung
weitgehend bis ganz vermieden werden kann. Die erfindungsgemäßen Einzeloligonucleotide weisen
eine über
fünfzig-
bis hundertfach höhere
Sensitivität
auf, als Sonden des Standes der Technik. Die Oligonucleotide können als
Sinn- oder Antisinn-Oligonucleotide ausgeführt sein.
-
Die
Verwendung der vorgenannten, insbesondere als Antisinn-Oligonucleotide
ausgeführten,
Oligonucleotidsonden in Form eines Gemisches führt bei gleicher Endkonzentration
wie für
ein einzelnes Oligonucleotid zu einer zusätzlichen Erhöhung der
Sensitivität
um den Faktor 2 bis 5.
-
Die
Erfindung betrifft auch die vorgenannten Oligonucleotide und deren
Verwendung in dem vorgenannten In-situ-Hybridisierungsverfahren,
wobei die Oligonucleotide markiert sind, beispielsweise mit einer
radioaktiven oder chemilumineszenten Markierung. So kann beispielsweise
vorgesehen sein, die Oligonucleotide mit Isotopen zu markieren,
insbesondere Radioisotopen. Erfindungsgemäß ist jedoch die Markierung
mit Enzymen, Antikörpern,
Fluorochromen, Fluorogenen, Photoaffinitäts- oder Spinlabeln bevorzugt.
Insbesondere werden die Oligonucleotide mit Biotin, FITC oder DIG
(Digoxigenin) markiert. Erfindungsgemäß ist dabei in einer besonders
bevorzugten Ausführungsform
vorgesehen, die Oligonucleotide an ihrem 3'- oder 5'-Ende zu markieren. Bevorzugt wird eine
3'-Endmarkierung,
wobei in einer bevorzugten Ausführungsform
das molare Verhältnis
von markiertem Nucleotid dNTP zu unmarkiertem dNTP 1:1 beträgt.
-
Die
Erfindung betrifft auch einen Hybridisierungspuffer sowie dessen
Verwendung in einem Hybri disierungsverfahren, z.B. dem vorgenannten
In-situ-Hybridisierungsverfahren,
wobei dieser Hybridisierungspuffer aus 10 Gew.-% Dextransulfat,
0,2 Gew.-% Lauroylsarcosin, 0,1 bis 0,8 M NaCl und 0,01 bis 0,8
M Na3-Citrat in Wasser besteht. Der erfindungsgemäße Puffer
weist in Wasser also nur 4 Komponenten auf und enthält keine
denaturierenden Agentien wie Formamid, aber auch keine RNA, DNA
oder sonstige Zusätze.
-
In
besonders bevorzugter Ausführungsform
beträgt
der NaCl-Gehalt 0,3 bis 0,6 M, insbesondere 0,6 M.
-
In
einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der Na3-Citrat-Gehalt 0,03 bis 0,06 M, insbesondere
0,06 M.
-
Der
erfindungsgemäße Hybridisierungspuffer
ist also Formamid-frei und weist keine anderen als die vorgenannten
Komponenten auf. Er ist daher in besonders vorteilhafter Weise einfach
und kostengünstig
herzustellen, da er aus insgesamt lediglich fünf Komponenten aufgebaut ist.
Der Hybridisierungspuffer ist insbesondere auch aufgrund des Fehlens
von Farmamid giftfrei, nicht fruchtschädigend und daher ohne besondere Vorsichtsmaßnahmen
einsetzbar. Der Hybridisierungspuffer ermöglicht in besonders vorteilhafter
Weise eine hochspezifische, Hintergrundfreie Hybridisierung.
-
In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Markieren von Oligonucleotiden,
insbesondere an deren 3'-Ende, wobei mindestens
ein zu markierendes Oligo nucleotid in einem Reaktionspuffer und
H2O nach Zugabe eines molaren 1:1-Verhältnisses
von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP mit einer terminalen Transferase
inkubiert wird und eine Anheftung einer endständigen markierten Nucleotidsequenz
erzielt wird. Insbesondere ist dabei vorgesehen, dass das markierte
und unmarkierte dNTP dATP, dCTP, dGTP, dUTP oder dTTP ist.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
wird ein molares 1:1-Verhältnis
von markiertem dUTP zu unmarkiertem dATP eingesetzt. In einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform
wird ein molares 1:1-Verhältnis von
markiertem dATP zu unmarkiertem dATP eingesetzt. Die Markierung
kann, wie vorstehend ausgeführt,
eine üblicherweise
verwendete Markierung sein, insbesondere eine Biotin-, FITC- oder
DIG-Markierung. Das erfindungsgemäß eingesetzte molare Verhältnis von
1:1 bei der terminalen Markierungsreaktion weicht um eine 10er Potenz
von dem üblicherweise
eingesetzten Markierungsverhältnis
ab (üblicherweise
wird ein Verhältnis
1:10 von markiertem zu unmarkiertem dNTP eingesetzt, vgl. z.B. Boehringer
Mannheim Markierungskit; Best.-Nr. 1417231). Das bei der erfindungsgemäßen Markierungsreaktion
vorgesehene molare 1:1-Verhältnis
führt,
insbesondere bei Einsatz des erfindungsgemäßen Hybridisierungspuffers,
insbesondere in dem erfindungsgemäßen In-situ-Hybridisierungsverfahren,
zu einer besonders hohen Sensitivität und niedrigen Hintergrundfärbung beim
Nachweis der zu testenden Nucleotidsequenzen. Erfindungsgemäß konnte eine
drastische Erhöhung
der Sondensensitivität
und eine besonders signifikante Reduzierung der bei üblichen Markierungsreaktionen
auftretenden Hintergrundfärbungen
bewirkt werden.
-
In
einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird das
Verfahren zur 3'-Markierung von
Oligonucleotiden bei einer Temperatur von 30 bis 40°C, insbesondere
37°C, besonders
bevorzugt für
eine Zeitdauer von 10 bis 60 Minuten, insbesondere 30 Minuten, durchgeführt.
-
Gemäß der Erfindung
ist vorgesehen, dem Reaktionspuffer Co2+,
beispielsweise in Form von CoCl2 zuzuführen. In
besonders bevorzugter Ausführungsform
werden dem Reaktionspuffer 0,5 bis 5, insbesondere 1 mM CoCl2 zugesetzt.
-
Die
mittels der vorgenannten Mittel und Verfahrensweisen ermöglichte
erfindungsgemäße In-situ-Hybridisierung zeichnet
sich durch eine besonders rasche Verfahrensdurchführung von
zum Beispiel nur 3,5 Stunden für
den gesamten Prozess, eine besonders schonende Behandlung der Zielobjekte
beziehungsweise nachzuweisenden Nucleotidsequenzen aufgrund des
Fehlens denaturierender chemischer Agenzien, eine aufgrund der Abwesenheit
toxischer Bestandteile gute Handhabbarkeit und vor allen Dingen
extrem hohe Sensitivität
bei geringer oder gar nicht vorhandener Hintergrundfärbung aus.
Die erfindungsgemäße Vorgehensweise
ermöglicht
insbesondere die Detektierung nachzuweisender Nucleinsäuren mittels
automatisierter Systeme sowie auch eine Auswertung mittels automatisierter
Bildanalysesysteme und gewährt
in einfacher, kostengünstiger
und schneller Weise die Analyse auch größerer Mengen an Material. Die
erfindungsgemäße Verfahrensweise
ist daher insbesondere für
High-Throughput-Verfahren geeignet.
-
Die
Erfindung sieht selbstverständlich
auch vor, dass die Zielobjekte vor der Hybridisierung einer Vorbehandlung
unterzogen werden.
-
Eine
derartige Vorbehandlung kann beispielsweise eine Fixierung, Einbettung,
Schnittherstellung, Demaskierung der Zielnucleinsäure, DNAse-Verdau,
RNAse-Verdau und/oder Denaturierung sein.
-
So
kann erfindungsgemäß beispielsweise
eine Aldehydfixierung oder eine Alkohol-Säure-Fixierung vorgesehen sein.
Die Fixierung kann insbesondere in Formalin stattfinden. Erfindungsgemäß kann weiterhin vorgesehen
sein, die fixierten Zielobjekte in zum Beispiel Paraffin einzubetten.
-
Die
gegebenenfalls fixierten und eingebetteten Zielobjekte können dann
auf gegebenenfalls ebenfalls vorbehandelte Objektträger, beispielsweise
erhitzte, gewaschene und getrocknete Objektträger aufgezogen und dann deparaffinisiert
werden. Die Objektträger
können
gegebenenfalls mit zum Beispiel Aminopropyltriethoxisilan-TESPA
vorbehandelt sein.
-
Die
erfindungsgemäß gegebenenfalls
vorgesehene Fixierung kann zu einer Vernetzung zwischen Proteinen
und zwischen Nucleinsäuren
und Proteinen führen.
Um die nachzuweisende Nucleinsäure
den Oligonucleotidsonden zugänglich
zu machen, ist es daher vorteilhaft, eine limitierte Proteolyse
zum Beispiel mit Pepsin, Proteinase K oder Pronase durchzuführen.
-
Erfindungsgemäß kann gegebenenfalls
zur Erhöhung
der Spezifität
eines DNA- oder RNA-Nachweises insbesondere in komplexeren Systemen
ein DNAse- oder RNAse-Verdau vorgesehen sein.
-
Obgleich
erfindungsgemäß eine Denaturierung
von nachzuweisenden Nucleotidsequenzen und erfindungsgemäßen, vorzugsweise
einzelsträngig
vorliegenden, Oligonucleotidsonden nicht notwendig ist, kann diese
jedoch gegebenenfalls durchgeführt
werden, wobei die nachzuweisende Nucleotidsequenz und/oder Oligonucleotidsonde,
zum Beispiel durch Erhitzen auf 75°C bis 95°C, denaturiert werden.
-
Erfindungsgemäß kann auch
vorgesehen sein, die nachzuweisenden Nucleotidsequenzen und/oder die
erfindungsgemäßen Oligonucleotide
vor der In-situ-Hybridisierung
zu amplifizieren, zum Beispiel mittels PCR.
-
Die
erfindungsgemäße Hybridisierung
kann über
einen Zeitraum von 0,5 bis 2 Stunden stattfinden. Bevorzugt wird
ein Zeitraum von einer Stunde. Die Hybridisierung findet in einer
bevorzugten Ausführungsform bei
45°C bis
60°C, insbesondere
55°C statt.
Selbstverständlich
ist es möglich,
dass nach der Hybridisierung mindestens ein Waschschritt durchgeführt wird.
In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung wird nach dem gegebenenfalls
erfolgten Waschschritt oder direkt nach der Hybridisierung ein Nachweisschritt
bei 30 bis 37°C durchgeführt.
-
Das
erfindungsgemäße In-situ-Hybridisierungsverfahren
kann beispielsweise bei der Diagnose von Erkrankungen des menschlichen
oder tierischen Körpers
eingesetzt werden, beispielsweise bei allergischen Erkrankungen,
Autoimmunkrankheiten sowie onkogenen Erkrankungen. Selbstverständlich kann
die erfindungsgemäße Verfahrensweise
auch im Rahmen der Grundlagen- oder angewandten Forschung eingesetzt werden.
-
Die
Erfindung betrifft auch einen Testkit zur Durchführung des vorgenannten In-situ-Hybridisierungsverfahren,
umfassend mindestens ein Gefäß, das mindestens
eins der vorgenannten Oligonucleotide ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus SEQ ID Nr. 1 bis 10, vorzugsweise markiert, gegebenenfalls auch
amplifiziert enthält
und/oder mindestens ein Gefäß enthaltend
einen erfindungsgemäßen Hybridisierungspuffer, und/oder
gegebenenfalls mindestens ein Gefäß enthaltend Waschlösungen.
Es kann vorteilhafterweise vorgesehen sein, in dem Kit erfindungsgemäß markierte
Oligonucleotide einzusetzen. Es ist bevorzugt, in dem Kit weitere
Komponenten, z.B. Antikörper
vorzusehen.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung einen Kit zur Markierung von Oligonucleotiden umfassend
mindestens ein Gefäß enthaltend
eine terminale Transferase und/oder ein Gefäß enthaltend einen Reaktionspuffer
und gegebenenfalls CoCl2-Lösung,
gegebenenfalls ein Gefäß enthaltend
Kontrolloligonucleotid (unmarkiert), ein Gefäß enthaltend gegebenenfalls
ein weiteres Kontrolloligonucleodit mit Markierung gegebenenfalls
ein Gefäß enthaltend
eine Kontroll-Nucleotidsequenz sowie entweder getrennt in einzelnen
Gefäßen oder
bereits ge mischt in einem Gefäß ein markiertes
dNTP und ein unmarkiertes dNTP im molaren 1:1 Verhältnis, z.B.
unmarkiertes dATP und markiertes dUTP.
-
Weitere
vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den
Unteransprüchen.
-
Die
Erfindung wird anhand der Beispiele, der dazugehörigen Zeichnungen und Sequenzprotokolle
näher erläutert.
-
Das
Sequenzprotokoll erfasst die in SEQ ID Nr. 1 bis 10 dargestellten
Nucleotidsequenzen, wobei SEQ ID Nr. 1 bis 6 Antisenseoligonucleotide
darstellen, die dem Nachweis der mRNA der Ig-λ-leichten Kette und die SEQ
ID Nr. 7 bis 10 dem Nachweis der mRNA der Ig-κ-leichten Kette dienen.
-
Die
Figuren zeigen in photografischer (1 bis 7)
und grafischer (8 und 9) Darstellung:
-
1 eine
ISH (In-situ-Hybridisierung) eines Gemisches erfindungsgemäßer sechs
verschiedener Oligonucleotide mit SEQ ID Nr. 1 bis 6 in erfindungsgemäßem Hybridisierungspuffer
auf humaner Tonsille, wobei die Oligonucleotide mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens
markiert (Biotin-markiert)
wurden,
-
2 die
Darstellung einer ISH mit den Oligonucleotiden und dem Hybridisierungspuffer
gemäß 1 auf
humaner Tonsille, wobei zur Markierung der Oligonucleotide eine übliche Markierungsreaktion
(FITC-markiert)
eingesetzt wurde,
-
3 eine
ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines Gemisches von sechs
erfindungsgemäßen Oligonucleotiden
mit den SEQ ID Nr. 1 bis 6 in erfindungsgemäßem Hybridisierungspuffer und
unter Verwendung der erfindungsgemäßen Markierungsreaktion FITC-markiert
(vergleiche 1),
-
4 eine
ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines λ-Oligonucleotid-Gemisches (FITC-markiert)
des Standes der Technik,
-
5 eine
ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines λ-Oligonucleotid-Gemisches (DIG-markiert)
gemäß eines
anderen Standes der Technik,
-
6 eine
ISH auf humaner Tonsille unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Gemisches
von sechs Oligonucleotiden mit den Sequenzen gemäß SEQ ID Nr. 1 bis 6, wobei
die Oligonucleotide erfindungsgemäß markiert (Biotip-markiert)
und ein Hybridisierungspuffer gemäß des Standes der Technik (50
% Formamid enthaltend) eingesetzt wurde,
-
7 eine
ISH gemäß den Bedingungen
der 6 (Biotin-markiert), wobei jedoch anstelle des
Hybridisierungspuffers des Standes der Technik ein erfindungsgemäßer Hybridisierungspuffer
verwendet wurde,
-
8 eine
grafische Darstellung der Hybridisierungssignalintensität und der
im Gewebe auftretenden Hintergrundfärbung einer im Verhältnis 1:10
markierten κ9-Sonde
(SEQ ID Nr. 10) gemäß des Standes
der Technik und
-
9 eine
grafische Darstellung der Hybridisierungssignalintensität und der
im Gewebe auftretenden Hintergrundfärbung einer erfindungsgemäß markierten κ9-Sonde (SEQ
ID Nr. 10).
-
Beispiel
-
Nachweis
der mRNA der λ-leichten-Kette
in humanen Tonsillen-Gewebe mittels ISH
-
I. Markierung der Oligonucleotide
-
Materialien
-
5-facher
Reaktionspuffer für
die terminale Desoxynucleotidyltransferase (MBI Fermentas): 1M Cacody-lat, pH 7,2, 0,5
mM DTT, 0,05 % Triton-X-100 Terminale Transferase (MBI Fermentas):
25 U/μl
20
mM CoCl2 | MBI
Fermentas |
4M
LiCl | FLUKA |
Glycogen
(20μg/μl) | ROCHE |
EDTA
(0,2M, pH 8,0) | SIGMA |
-
Verfahren:
-
A) Markierung
-
Es
wird ein 20μl
Reaktionsgemisch hergestellt aus:
4 μl Reaktionspuffer (5x)
1 μl Oligonucleotid
(Antisinn) (1μg/μl) (beziehungsweise
Gemisch der Oligonucleotide)
1 μl dATP (1mM)
1 μl dUTP (FITC/BIOTIN/DIGOXIGENIN)
(1mM)
1 μl
Terminale Transferase (25 U/μl)
1 μl CoCl2 (20mM)
11 μl aqua dest.
-
Die
Komponenten werden gemischt und bei 37°C (Wasserbad) für 30 Minuten
inkubiert.
-
B) Präzipitation
-
Dem
Reaktionsgemisch wird in Eppendorf-Röhrchen auf Eis 2 μl Glycogen/EDTA
(200 μl
EDTA 0,2 M, pH 8 + 1 μl
Glycogen 20μg/μl) zugegeben,
2,5 μl LiCl
(4M) und 75 μl
Ethanol (100 %, auf Eis) hinzugegeben und gemischt sowie anschließend über Nacht
bei –20°C ausgefällt.
-
C) Rekonstitution
-
Es
wird bei 13000 rpm für
30 Minuten zentrifugiert, der Überstand
abgenommen, das Pellet 1 x mit Ethanol (70 %, 4°C) gewaschen, 30 bis 45 Minuten
bei Raumtemperatur (RT) luftgetrocknet und in 20 μl aqua dest.
aufgenommen. Die markierten Oligonucleotide werden bei –20°C gelagert.
-
II. Herstellung des Hybridisierungspuffers
-
Der
erfindungsgemäße Hybridisierungspuffer
besteht aus:
4X SSC (0,6 M Natriumclorid und 0,06 M Trinatrium-Citrat), 10 Gew.-%
Dextransulfat und 0,2 Gew.-% Lauroylsarkosin in aqua dest. Der Puffer
enthält
keine weiteren Komponenten und ist daher Formamidfrei.
-
Als
Vergleichspuffer wurde ein Standardhybridisierungspuffer hergestellt,
der wie folgt zusammengesetzt war:
45 Gew.-% Formamid, 3,6X
SSC, 7,5 Gew.-% Dextransulfat, 4, 5X Denhardt's Lösung,
1,8 Gew.-% SDS und 0,4 mg/ml Hefe-t-RNA
(20x SSC: 3 M NaCl,
0,3 M Trinatriumcitrat) (50x Denhardt's Lösung:
1 Gew.-% Rinderserumalbumin, 1 Gew.-% Polyvinyl-Pyrrolidon, 1 Gew.-%
Ficoll-400)
-
Weitere
nicht unmittelbar bei der Hybridisierung aber im Rahmen des vorliegenden
Beispiels verwendete Puffer wiesen folgende Zusammensetzung auf:
TBST:
0,1 M Tris/HCl, 0,1 M NaCL, 0,05 % Tween-20, pH 7,5
Blockierungs-Puffer:
1 % Blockierungsreagenz (Roche) in 0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH 7,5 AP-Puffer: 0,1
M NaCl, 0,1 M Tris/HCl, pH 9,5 NBT (Roche): 100 mg/ml in 70 % Dimethylformamid
BCIP (Roche): 50 mg/ml in Dimethylformamid
-
III. Fixierung, Einbettung
und Schnittherstellung
-
Menschliches
Tonsillen-Gewebe wurde in NBF (neutralem gepufferten Formalin) fixiert
und in Paraffin eingebettet. Nach der Paraffineinbettung wurden
2 μm dicke
Gewebe-Schnitte zur Gewährleistung
besserer Haftung auf TESPA- (Aminopropyltriethoxisilan-TESPA) beschichtete
Objektträger
aufgezogen. Zur Entparaffinierung wurden die mit dem Gewebe versehenen
Objektträger
auf 70°C
für 15
Minuten erwärmt
und zweimal jeweils 10 Minuten in Xylol und anschließend einmal
für 5 Minuten
in Ethanol gewaschen sowie anschließend luftgetrocknet.
-
IV. Demaskierung der Ziel-Nucleinsäure
-
Um
die nachzuweisende Nucleinsäure
den Oligonucleotiden zugänglich
zu machen, wurde anschließend
eine limitierte Proteolyse durchgeführt, indem die Objektträger in 0,1
%igem Pepsin in 0,1 M HCl bei 37°C für 2 bis
20 Minuten inkubiert wurden. Anschließend wurden die Objektträger zehn
Sekunden in Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Es wurde weder
ein DNAse- oder RNAse-Verdau noch eine Denaturierung von Zielnucleinsäuren und/oder
Proben durchgeführt.
-
V. Hybridisierung
-
Ein
gemäß I. hergestelltes
Sondengemisch aus Biotin-markierten λ-leichte Ketten-Oligonucleotiden der
Sequenzen gemäß SEQ ID
Nr. 1 bis 6, das heißt
ein sechs verschiedene Oligonucleotide enthaltendes Oligonucleotidgemisch,
wurde in einer Menge von 15 μl
pro Sektion (0,1 ng/μl
Gesamtsondenkonzentration) in Standardhybridisierungspuffer (vergleiche 6)
oder erfindungsgemäßem Hybridisierungspuffer
(auch als LSD-Puffer bezeichnet) (vergleiche 1, 3 und 7)
und auf die Gewebebeschnitte aufgebracht. Anschließend wurde
ein Deckgläschen
aufgelegt und mit Klebematerial abgedichtet. Die Hybridisierung
wurde anschließend
eine Stunde bei 37°C
(Standardhybridisierungspuffer) oder 55°C (erfindungsgemäßer LSD-Puffer)
durchgeführt.
Anschließend
wurde mit TBST zweimal jeweils fünf
Minuten bei Raumtemperatur (bei Standardhybridisierungspuffer) oder
einmal fünf
Minuten bei 55°C
und zweimal jeweils fünf
Minuten bei Raumtemperatur (bei erfindungsgemäßem LSD-Puffer) gewaschen.
-
VI. Nachweis
-
Auf
jeden Gewebeschnitt wurden 200 μl
Anti-Bio(Biotin)-AP
(alkalische Phosphatase konjugiert zu einem Anti-Biotin-Antikörper, DAKO)
aufgebracht (verdünnt
in 1:30 Blockierungspuffer). Anschließend wurde bei 34°C 30 Minuten
inkubiert.
-
Im
Anschluss an die Inkubation wurde zweimal jeweils zwei Minuten mit
TBST und einmal zwei Minuten mit aqua dest. gewaschen.
-
Anschließend wurde
auf jeden Gewebeschnitt 200 μl
AP-Puffer gegeben, der NBT-BCIP-Farbsubstrate (2μl NBT + 10 μl BCIP in 1000 μl AP-Puffer)
enthielt. Anschließend
wurde bei 34°C
30 Minuten inkubiert und sodann dreimal für jeweils zwei Minuten mit
aqua dest. gewaschen. Die so gefärbten
Schnitte wurden in Glycerol eingebettet, mit einem Deckgläschen versehen
und mit Nagellack versiegelt.
-
VII. Ergebnisse
-
Die 1, 3 und 7 zeigen
gemäß des vorbeschriebenen
Verfahrens durchgeführte
ISHs, wobei ein erfindungsgemäßes Oligonucleotidgemisch
der Sequenzen SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5 und 6, jeweils in äquimolaren
Verhältnissen
zueinander, in erfindungsgemäßem LSD-Hybridisierungspuffer
eingesetzt wurde, wobei die eingesetzten Oligonucleotide 3'-endmarkiert gemäß der vorliegenden Erfindung
waren. Es ist erkennbar, dass vorteilhafterweise keine Hintergrundfärbung und
eine sehr hohe Signalstärke
erreicht wird.
-
Im
Vergleich dazu wurde wie vorstehend beschrieben vorgegangen, wobei
anstelle des erfindungsgemäßen LSD-Hybridisierungspuffer
ein Standard-Hybridisierungspuffer mit ca. 50 % Formamid eingesetzt
wurde. Die dazugehörige 6 zeigt
eine vergleichsweise schwache Signalstärke.
-
Ebenfalls
im direkten Vergleich zu den in den 1, 3 und 7 dokumentierten
Ergebnissen ist das in 2 dokumentierte Ergebnis zu
sehen. Gemäß der Verfahrensweise,
die zum Ergebnis nach 2 führte, wurde wie im Vorstehenden
beschrieben vorgegangen, wobei jedoch anstelle der erfindungsgemäßen Markierung
im 1:1 molaren Verhältnis
von markiertem dNTP zu unmarkiertem dNTP eine Standardmarkierung durchgeführt wurde.
Diese wurde wie im Stand der Technik beschrieben (DIG Oligonucleotide-Tailing Kit, Bestell-Nr.
1417231, Boehringer Mannheim, durchgeführt), wobei ein 1:10 molares
Verhältnis
von markiertem dUTP zu unmarkiertem dATP eingesetzt wurde. Es zeigt
sich eine vergleichsweise starke Hintergrundfärbung und überdies, dass die Signalstärke nicht
so stark ist wie bei der Verwendung einer erfindungsgemäßen Markierungsreaktion
(vergleiche zum Beispiel 3).
-
Gemäß der in
den 4 und 5 dokumentierten Ergebnisse
wurde mittels bekannter λ-leichte
Ketten-Oligonucleotid-Gemische
(4: Firma Biogenex, USA, San Ramon, Kat.-Nr. HK856-2K, 5:
Firma Kreatech, NL, Amsterdam, Kat.-Nr. PLD 182) jeweils eine ISH
durchgeführt.
Gemäß der Resultate
von 4 wurde eine FITC-markierte Sonde und gemäß der Experimente
der 5 eine DIG-markierte Sonde eingesetzt. 4 zeigt
eine deutlich stärkere
Hintergrundfärbung
und verringerte Signalstärke
als bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise
(vergleiche zum Beispiel 3). 5 zeigt
eine sehr schwache Signalstärke
im Vergleich zu erfindungsgemäßen Vorgehensweise
(vergleiche zum Beispiel 3). Die eingesetzten Oligonucleotide
sind gemäß Herstellerangaben
markiert gewesen. Die eingesetzten Hybridisierungspuffer sind üblicherweise
eingesetzte Hybridisierungspuffer.
-
Die 8 und 9 stellen
die Intensität
des Hybridisierungssignals sowie der im Gewebe auftretenden Hintergrundfärbung in
Abhängigkeit
von der Verdünnung
einer κ9-Sonde
(SEQ ID Nr. 10) dar.
-
Die 8 zeigt,
dass mittels einer Standardmarkierung unter Verwendung eines 1:10
molaren Verhältnisses
von Bio-, DIG- oder FITC-markiertem dNTP (hier: dATP beziehungsweise
dUTP) zu dATP eine geringere Sensitivität, das heißt Signalstärke, und eine stärkere Hintergrundfärbung erhalten
wird. Dies steht im Gegensatz zu der erfindungsgemäßen Verfahrensweise,
die gemäß der in 9 dargestellten
Grafik bei Verwendung eines 1:1 molaren Verhältnisses von Bio-, DIG- oder
FITC-markierten dNTP (hier: dATP beziehungsweise dUTP) zu dATP eine
gesteigerte Sensitivität,
das heißt
stärkere
Hybridisierungssignalintensität,
und eine geringere beziehungsweise gar keine Hintergrundfärbung mit
sich bringt.
-
-