CN110023482A - 真核细胞的生长控制 - Google Patents

真核细胞的生长控制 Download PDF

Info

Publication number
CN110023482A
CN110023482A CN201780073779.1A CN201780073779A CN110023482A CN 110023482 A CN110023482 A CN 110023482A CN 201780073779 A CN201780073779 A CN 201780073779A CN 110023482 A CN110023482 A CN 110023482A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell density
tank
cell
time
control logic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201780073779.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110023482B (zh
Inventor
C·哈克迈尔
H·布恩特梅尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN110023482A publication Critical patent/CN110023482A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110023482B publication Critical patent/CN110023482B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q3/00—Condition responsive control processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0006—Controlling or regulating processes
    • B01J19/0013—Controlling the temperature of the process

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)
  • Computer Hardware Design (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于控制真核细胞生长的系统(100)。该系统包括控制逻辑(116)和设置为执行该控制逻辑的处理器(104)。控制逻辑可操作地与培养基(M1)中包含真核细胞的第一罐(130)连接。控制逻辑设置为：‑接收目标细胞密度(114)和目标时间(112)；对于多个时间间隔的每一者：·接收第一罐的培养基中真核细胞的测量的细胞密度(122)；·将目标时间处的预测的细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算；·比较预测的细胞密度和目标细胞密度；·如果预测的细胞密度偏离目标细胞密度，则通过控制逻辑，按如下方式调节第一罐中培养基的温度：如果预测的细胞密度低于目标细胞密度，那么升高温度0.1℃至1℃；或如果预测的细胞密度高于目标细胞密度，那么降低温度0.1℃至1℃。

Description

真核细胞的生长控制
发明领域
本发明涉及生物技术领域，并且更具体地涉及控制细胞生长、尤其真核细胞生长的领域。
背景和相关技术
经常通过培养含有编码目的重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞，生产治疗上或商业上重要的蛋白质。例如，种子培养(seed train)法用来产生足够数目的哺乳动物细胞以接种实际上用来生产并收获目的蛋白的大型生产生物反应器。传统种子培养法始于小的细胞样品，例如，冷冻保存的细胞库小瓶，随后是在逐步较大的培养物容器或罐中的多个细胞培养物扩增步骤。
分批和补料分批生产法包括无生产的生长期，此时细胞物质积累，和更有生产性的稳定期，此时大部分蛋白质或其他生物产物在细胞内部或外部生成。尽管也可以在原核细胞中观察到生长期和稳定期，这两个阶段对真核细胞培养有特殊意义，因为真核细胞产生的生物产物对生产性细胞的代谢状态特别敏感(这可以例如对蛋白质产物的糖基化模式产生影响)。
在细胞培养物中培育细胞是一个对许多不同因素非常敏感的过程：培养基或营养溶液的微小组成差异、用于接种生物反应器的细胞样品的微小细胞密度差异或测量工艺参数如pH、温度、氧或二氧化碳浓度的各种装置的不准确校正，可能导致细胞生长速率、每个细胞产生的蛋白质的量和甚至产物的化学组成或修饰的显著差异。真核细胞产生的蛋白质受到许多不同的生物化学修饰过程如糖基化、磷酸化和其他等影响。工艺参数和生长条件的任何变化可能显著影响细胞代谢且因此还可能影响生成的蛋白质的糖基化模式。例如，Gammell P,Barron N,Kumar N,Clynes M(2007)在“Initial identification of lowtemperature and culture stage induction of miRNA expression in suspensionCHO-K1cells”.J Biotechnol 130:213–218中已经将miR-21(一种生长抑制性miRNA)鉴定为在温度变动至低温或正常分批培养期间所诱导的稳定期生长期间被上调。因此，在正在运行的真核细胞培养计划中改变温度可能影响细胞状态。
US 2009/0104594 A1描述一种生物反应器，其包括与无模式适应性控制器或优化器连接的传感器。该传感器可以实时测量与终产物滴度或其他所需产物质量属性相关的量。此外，描述了一种培养活细胞的方法。该方法包括在容器中温育细胞，测量容器内部的多个条件，用无模式适应性控制器将多个测量值与多个设定值分别比较，并且基于至少一个比较调节容器内部的条件。
在培养真核细胞的情况下，制药公司因此尽力保持工艺参数尽可能恒定，以确保在规定的时间间隔内可重复和安全地产生所需的生物产物。
经常，在针对生长期和针对稳定期的两种不同温度条件下培育真核细胞：一般在37℃执行生长期，而一般通过降低温度至约34℃并且在整个生产过程期间恒定保持该温度在34℃，执行生产期，旨在确保标准化、可重复的生产过程、生产过程结束时标准化的产物浓度和质量。同样，该温度在生长阶段期间保持恒定以确保工艺重现性。
因此，培养真核细胞的现有技术方案基于保持培养参数恒定、尤其保持温度恒定(至少在整个生长期和稳定期期间分别保持恒定)。
但是，由于不能完全避免初始细胞密度、培养基组成和测量装置校正性能的微小变异，细胞培养计划的持续时间及给定时间段后可以收获的生物产物的总量仍存在变异性，这使得生物技术公司和制药公司非常难以规划生产过程。
概述
本发明的目的是提供如独立权利要求中具体说明的控制细胞生长的改进方法和系统。本发明的实施方案在从属权利要求中给出。如果并非互斥，本发明的实施方案可以彼此自由组合。
在一个方面，本发明涉及一种用于控制真核细胞生长的方法。控制逻辑接收目标细胞密度和目标时间。目标细胞密度代表在目标时间处真核细胞的所需细胞密度。目标时间代表未来时间点。真核细胞在第一罐的培养基中培养。该方法包括，对于多个时间间隔的每一者(例如，在每个时间间隔的开始或结束时)：
-测量培养基中真核细胞的细胞密度；
-通过控制逻辑，将目标时间处的预测细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算；
-通过控制逻辑，比较预测的细胞密度和目标细胞密度；
-如果预测的细胞密度偏离目标细胞密度，则通过控制逻辑，调节第一罐中培养基的温度。通过如下方式执行调节：如果预测的细胞密度低于目标细胞密度，升高温度0.1℃至1℃；或如果预测的细胞密度高于目标细胞密度，降低温度0.1℃至1℃。
所述特征可以是有利的，因为它们允许主动控制真核细胞的生长，以在规定的时间点产生规定数目的细胞。已经令人惊奇地观察到，虽然培育细胞培养物的同时，温度未保持恒定，但对于许多不同细胞培养计划，在目标时间达到所需的细胞密度，甚至在起始条件(起始温度、起始细胞浓度)略微不同的情况下也是如此。尽管真核细胞及其代谢对环境温度的变化高度敏感，但已经观察到，生成的生物产物并未与恒定温度条件下生成的生物产物不同，至少只要温度调节不超过每个预测时间间隔1℃温差并且不超过或下降低于生理可耐受温度范围。
另外，已经观察到，细胞耐受上文指定的温度范围内的温度变化并且能够从其中迅速恢复。因此，细胞培养计划的总时间不因上文指定的温度范围内调节培养基的温度而延长。这不同于调节其他生产参数，例如，pH，已经观察到所述调节降低细胞生产的效率，因为已经观察到细胞在可以继续积累细胞物质并产生所需的生物产物之前，需要一些附加时间从pH变化中恢复。
通过反复预测当前培育的细胞培养物何时将可能达到所需细胞密度的时间，将预测的时间与指定的目标时间比较并因此通过适应细胞培养基的温度，本发明的实施方案允许补偿细胞培养起始条件的微小变异并可以允许确保细胞培养物将达到所需细胞密度并将在特定、规定的未来时间(“目标时间”)输送所需量的生物产物。取决于细胞系、培养基、罐内条件和所产生生物产物的类型，从细胞培养物接种开始至细胞培养物已经达到目标细胞密度的时间的细胞培养计划常见持续时间将变动。许多计划具有3至5天范围内的常见持续时间，例如，4.5天。已经观察到本发明的实施方案可以补偿在开始时间一个或多个工艺参数与参考细胞培养计划的“常见”或“参比”工艺参数的高达20％偏差。例如，如果参比计划在37℃恒定温度运行并确切地需要4天(96小时)直至达到所需细胞密度，则使用动态、基于预测的温度适应方案的本发明实施方案可以允许在20％较短的时间间隔，即，在3.2天(77小时)内实现相同的细胞密度。同样，在用于接种生物反应器的细胞量比用于接种参比生物反应器的细胞量低20％的情况下，根据本发明实施方案的动态温度适应可以允许补偿降低数目的起始细胞并且在所需的目标时间提供所需的细胞密度。
同样，已经观察到本发明的实施方案成功地补偿几个误差源(氧或养分供应失效、pH控制系统失效等)，其中基于常规的恒定温度细胞培养技术，所述误差源本该导致产物或细胞密度下降多达20％。
因此，本发明的实施方案可以允许补偿系统失效和相对于参考培养物计划的工艺参数偏差并且因此可以允许对细胞培养计划的更好控制及可预测性。
将目标时间处的预测细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算可以仅基于当前测量的细胞密度进行。优选地，目标时间处的细胞密度作为已经在较早时间隔测量的多个实测细胞密度的函数预测。
根据优选的实施方案，温度调节不降低培养基的温度低于温度32℃并且不增加培养基的温度高于温度38℃。
仅在所述温度范围内进行温度调节可能是有益的，因为已经观察到，在所述范围内部的温度调节可以按受控方式影响生长速率，但是不显著地按其他代谢途径(例如，产生热休克蛋白)的方向变动细胞代谢。已经观察到在所述范围内的温度调节是充分和迅速可逆的，因为细胞不需要额外时间从先前使用的温度恢复。
根据实施方案，贯穿整个生长期或贯穿整个稳定期或贯穿整个生长时间和稳定时间进行控制细胞生长和酌情调节温度的方法。
这可以是有益的，因为用于动态调节细胞培养物温度的时间跨度越长，补偿系统组件失效和次优起始条件的能力越好。
根据实施方案，第一罐包含执行在线测量培养基中细胞密度的计量器。因此，在多个时间间隔的每一者时测量的真核细胞的细胞密度是在线测量值。
例如，测量培养基的介电属性以确定给定体积的培养基中细胞数目的测量装置或光学技术(例如，在线显微镜形式)可以用于自动计数培养基中可以使用的活细胞。
例如，FOGALE Biomass系统可以在不取得样品的情况下，用于确定罐中的细胞密度。使用介电性传感器具有以下优点：不同于光学技术，系统对悬液中的气泡、细胞残片和其他粒子不敏感。通过利用FOGALE生物量传感器或相似的传感器装置，存活生物量浓度(Biovolume)可以作为在线测量值确定，与细胞大小变异无关。
在线细胞密度计的另一个例子是原位显微镜。原位显微镜是在细胞培养计划期间为直接获得生物反应器内部(原位)哺乳动物细胞的图像所开发的系统。它仅需要最小的操作员介入。Joeris K1,Frerichs JG,Konstantinov K,Scheper T:"In-situ microscopy:Online process monitoring of mammalian cell cultures"Cytotechnology.2002Jan；38(1-3):129-34.doi:10.1023/A:1021170502775中描述了原位显微镜及其用途的例子。
在线细胞密度计的又一个例子是Raman光谱仪。Raman光谱仪在生物反应器中测定细胞密度的用途已经例如由Justin Moretto等人在"Process Raman Spectroscopy forIn-Line CHO Cell Culture Monitoring"(2011年4月期，American PharmaceuticalReview-第14卷)描述。
执行在线测量细胞密度可以具有避免离线测量相关问题的优点：离线测量数据往往质量低，原因在于测量时刻和执行相应控制操作时刻之间显著的延迟时间。另外，从样品获得测量值的采样过程可能升高不利微生物感染细胞培养物的风险并且可能因采样影响(例如，温度变化)而降低测量准确度。
在又一有益方面，使用在线细胞密度而非离线密度允许全自动化的细胞培养物生长控制。另外，使用在线细胞密度可以在细胞培养计划期间提供多种细胞密度测量值并且因此可以为目标时间处的预测细胞密度提供更好的数据基础，所述数据基础可以再次增加预测准确度。
根据实施方案，控制逻辑配置成当终止标准满足时，终止至少对温度的调节。终止标准可以例如是确定已经达到目标时间，或实测的细胞密度等于或大于目标细胞密度。
任选地，控制逻辑不仅可以停止调节温度，还可以停止培养细胞培养物。例如，控制逻辑可以向自动化控制单元发送一个或多个控制命令，所述控制命令引起控制单元停止对细胞培养罐中的细胞进料及曝气并且开始自动化细胞收获过程。备选地，控制逻辑向有资质的技术工作人员的一个或多个移动通讯设备发送消息，以告知工作人员必须收获或进一步处理罐中的细胞。此外或备选地，屏幕上显示的消息可操作地与控制逻辑偶联。进一步加工可以包括将细胞或包含细胞的整个培养基从第一罐转移至不同的、优选更大的罐，例如，另一个预生产生物反应器或生产生物反应器。取决于实施方案，可以手工、自动或半自动地进行收获过程和/或转移过程。
优选地，完全自动地反复预测目标时间处的未来细胞密度，与目标时间比较并酌情调节温度。根据优选的实施方案，也完全自动地(即，无任何人类介入)将细胞从一个预生产罐反复转移至另一个预生产罐或转移至生产罐并最终收获细胞或生成生物产物。这可以是有利的，因为可以提供全自动系统和方法，其在无任何人类介入的情况下，对起始条件轻微变异稳健、对细胞培养阶段期间系统组件失效稳健并能够在指定的未来时间可靠递送规定细胞密度和规定产物质量。
根据实施方案，控制逻辑接收细胞浓度偏差阈值以调节温度。仅在预测细胞浓度在目标时间距目标细胞浓度偏离超过所述阈值的情况下，控制逻辑才调节第一罐中培养基的温度。这可以是有益的，因为阈值在控制环中引入某种惰性并且确保仅在预测距目标细胞浓度的偏差达到显著水平的情况下，才调节温度。例如，控制逻辑收到细胞浓度偏差下限阈值，例如，目标细胞密度的95％，并且可以仅在预测细胞浓度低于目标细胞浓度的95％情况下，才升高第一罐中培养基的温度。例如，或者备选地，控制逻辑收到细胞浓度偏差上限阈值，例如，目标细胞密度的105％，并且可以仅在预测细胞浓度高于目标细胞浓度的105％情况下，才降低第一罐中培养基的温度。可以同样地使用其他的下限和上限阈值，例如，99％和101％，或98％和102％，或非对称阈值如细胞密度下限阈值99％和细胞密度上限阈值105％。
根据实施方案，控制逻辑提供图形化用户界面(GUI)。GUI使得用户在控制逻辑开始计算预测的细胞密度之前输入目标时间和目标细胞密度成为可能。GUI使得用户在控制逻辑于多个时间间隔处计算预测的细胞密度处修改目标时间和/或目标细胞密度成为可能。
根据一些实施方案，该方法还包括在达到目标细胞密度后，将第一罐的培养基和其中所含的真核细胞从第一罐转移至第二罐。第二罐大于第一罐。控制逻辑接收又一目标细胞密度和又一目标时间。又一目标细胞密度代表在又一目标时间处真核细胞的所需细胞密度。由于第二罐中的又一个生长控制过程在第一罐中的细胞达到目标细胞密度后进行，又一目标时间代表比转移细胞至第二罐的时间更晚的时间。
例如，控制逻辑可以借助本地(与控制逻辑相同的机器上)安装的GUI从用户或借助网络从远程安装的GUI直接接收目标细胞密度、又一靶密度、目标时间和/或又一目标时间。备选地，控制逻辑可以从已经在控制逻辑实体化之前由用户创建或修改的配置文件读取所述(又一)目标时间和目标细胞密度。
转移的真核细胞随后在第二罐中培养。对于多个其他时间间隔的每一者(例如，在每个时间间隔开始或结束时)，执行以下子方法：
-测量第二罐的培养基中真核细胞的细胞密度；
-通过控制逻辑，将又一目标时间处的又一预测细胞密度作为至少所述实测细胞密度的函数计算；
-通过控制逻辑，比较又一预测的细胞密度和又一目标细胞密度；
-如果又一预测的细胞密度偏离又一目标细胞密度，则通过控制逻辑，调节第二罐中培养基的温度。通过以下方式执行调节：如果又一预测的细胞密度低于又一目标细胞密度，升高温度0.1℃至1℃。如果又一预测的细胞密度高于又一目标细胞密度，控制逻辑降低温度0.1℃至1℃。
取决于实施方案，第一和第二目标细胞密度可以相同或可以彼此不同。
根据一些实施方案，第一和第二罐分别地是设置为培养细胞培养物作为分批培养物的生物反应器。所述方法在产生确定最小数目的细胞以接种生产生物反应器的种子培养培养法中使用。
这可以是有利的，因为可以将细胞培养物半自动或全自动地在第一目标时间培育至第一目标细胞密度。随后，细胞培养物可以转移至另一个较大的罐，例如，又一预生产生物反应器或容器。随后，在又一第二目标时间培育细胞至第二目标细胞密度。所述步骤可以对三个、四个或甚至更多预生产容器或生物反应器重复，直至获得足够数目的细胞以接种大型生产生物反应器。因此，该方法可以用来按种子培养培养物计划培育细胞培养物。
根据实施方案，第一罐是设置为培育细胞培养物作为预生产分批培养物的生物反应器。第二罐大于第一罐并且是设置为培育细胞培养物作为生产培养物的生物反应器。
生产培养物可以例如是补料分批培养物。在一些实施方案中，生产培养物也可以是分批培养物。
根据实施方案，真核细胞是哺乳动物细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。备选地，真核细胞是幼仓鼠肾(BHK)细胞或人细胞系。人细胞系的例子是Per.C6，一个通过用腺病毒E1基因永生化人胚性视网膜细胞所衍生的细胞系。它们经常用于生产单克隆抗体(MAb)，使用G418作为选择剂。另外，真核细胞可以是NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、K562细胞或HEK细胞。
本文所述的全部实施方案可以同样地用于控制原核细胞、尤其细菌细胞(例如、大肠杆菌(Escherichia coli)细胞)的生长。
根据实施方案，第一罐中的培养基具有500升或更小的体积。
根据实施方案，该方法还包括，对于多个时间间隔的每一者(例如，在每个时间间隔的开始或结束时)：
-为当前时间间隔规定当前观测间隔，当前观测间隔具有预定义的长度并且在当前时间间隔结束时终止；并且接收已经在当前观测间隔期间测量的全部细胞密度。
将预测的细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算。该计算包括外推在当前观测间隔期间测量的细胞密度直至目标时间。
例如，控制逻辑可以通过确定时钟提供的当前时间和通过分析配置文件或用户输入以确定观测间隔的长度，规定当前观测间隔。控制逻辑随后将当前观测时间间隔识别为这样的时间间隔，其在当前时间结束并且在当前时间之前启动确定的长度。图2中描述在不同当前时间确定的观测间隔的例子。
根据实施方案，外推包括对当前观测时间期间测量的细胞密度执行曲线拟合操作或回归分析。
根据实施方案，多个时间间隔的全部时间间隔均长度相等。
根据实施方案，多个时间间隔的全部时间间隔均长度不同。
根据实施方案，该方法包括确定当前时间是否接近于目标时间。例如，控制逻辑可以在以下情况时确定当前时间接近于目标时间：a)自培养基接种以来预定的持续时间已经过去或b)已经执行目标时间处细胞密度的预定次数的预测或c)已经达到预定的目标细胞密度百分数或d)已经达到在目标时间之前的预定时间，例如，在目标时间之前13小时(一般，所述在目标时间之前的预定时间在12小时–14小时的范围内)。存在自动确定当前时间是否接近于目标时间的其他方式。备选地，用户借助GUI能够输入当前时间接近于目标时间的指示。
响应于确定当前时间接近于目标时间，控制逻辑减少多个时间间隔的全部未来者的长度。
因为可以增加细胞密度预测的准确性和生长控制的准确性，这可以是有益的：在培养时间结束时，细胞密度已经高并且微小的预测误差结合各预测之间的长时间间距可能导致在目标时间确切产生所需细胞密度失败。为了增加预测和生长控制的准确度，本发明的实施方案使用培养计划结束时较短的预测时间间隔。例如，可以由如上文所述的控制逻辑完全自动执行或可以由用户手工执行预测时间间隔的缩短。
根据实施方案，多个时间间隔的每一者具有小于30分钟、优选地小于10分钟的持续时间。例如，每个时间间隔具有1分钟至10分钟范围内的持续时间。
根据实施方案，观测间隔的预定义的长度在60分钟至480分钟、尤其80至100分钟的范围内，例如，90分钟。
已经观察到，预测时间间隔和观测间隔的上述持续时间在高预测准确度和资源消耗(获得测量值、作出预测并比较预测的细胞密度可能消耗处理能力和产生网络流量，并且包含显示实测细胞密度和预测细胞密度曲线的屏幕更新可能进一步消耗网络、存储器和CPU容量)之间提供良好折衷。
根据实施方案，第一罐中的培养基(和任选地第二罐和其他罐中的培养基也)是CD-CHO AGT培养基。但是，合适的培养基高度依赖于细胞类型、细胞生长阶段(例如，生长期或稳定期)、待生产的产物的类型、所用容器或生物反应器类型和其他因素。因此，还可以使用其他培养基，例如，DMEM、RPMI、Hams F12和其他。
根据又一个实施方案，温度调节包括升高温度0.1℃至0.5℃、优选地0.1℃至0.2℃，或降低温度0.1℃至0.5℃、优选地0.1℃至0.2℃。
根据实施方案，控制系统的GUI或另一个组件使得用户在正在运行的细胞培养计划之前和/或期间输入附加控制参数成为可能。例如，可以允许用户指定预测时间间隔的长度、观测间隔的长度、调节间隔的长度、认定所预测细胞密度(充分)低于或高于目标细胞密度的上限和/或下限阈值和/或根据调节行动的温度调节量。优选地，允许用户输入正温度调节步骤和负温度调节步骤的不同值。这可以是温度控制对生物反应器加热和冷却特征的更好适应。
在又一个方面，本发明涉及一种按所需细胞密度在规定的未来时间提供真核细胞的方法。该方法包括通过人类用户，借助控制逻辑的界面输入所需的细胞密度和未来时间。所需的细胞密度代表在输入的未来时间处真核细胞的所需细胞密度。控制逻辑用于根据本文所述的任一个实施方案的方法控制真核细胞生长。如此执行生长控制，从而使用输入的所需细胞密度作为目标细胞密度，使用输入的未来时间作为目标时间，并且按目标细胞密度在目标时间提供真核细胞。
在又一个方面，本发明涉及控制真核细胞生长的系统。应如此控制系统，从而它在规定的未来时间产生规定数目细胞。该系统包含控制逻辑和设置为执行该控制逻辑的处理器。控制逻辑可操作地与培养基中包含真核细胞的第一罐连接。控制逻辑设置为接收目标细胞密度和目标时间。例如，目标细胞密度和目标时间可以接收自网络接口，可以读取自控制逻辑的配置文件或可以借助图形化用户界面作为用户输入接收。目标细胞密度代表在目标时间处真核细胞的所需细胞密度。目标时间代表未来时间点。
系统配置成对于多个时间间隔的每一者(例如，在每个时间间隔的开始或结束时)，执行包括如下的子方法：
-接收第一罐的培养基中真核细胞的实测细胞密度；
-将目标时间处的预测细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算；
-比较预测的细胞密度和目标细胞密度；
-如果预测的细胞密度偏离目标细胞密度，则通过控制逻辑调节第一罐中培养基的温度：如果预测的细胞密度低于目标细胞密度，控制逻辑升高温度0.1℃至1℃；如果预测的细胞密度高于目标细胞密度，控制逻辑降低温度0.1℃至1℃。
根据实施方案，该系统还包括第一罐和任选地还包括一个或多个其他罐(一旦先前使用的罐中细胞已经达到所需细胞密度，其他罐可以接收来自第一罐或另一个罐的细胞培养物)。
根据实施方案，第一罐包含执行在线测量培养基中细胞密度的计量器。在多个时间间隔的每一者时测量的真核细胞的细胞密度是在线测量值。
根据实施方案，控制逻辑配置成当终止标准满足时，终止至少对温度的调节。终止标准可以例如是已经达到目标时间或实测的细胞密度等于或大于目标细胞密度。
根据实施方案，系统或其组件之一(例如，控制逻辑)配置成提供图形化用户界面(GUI)。GUI使得用户在控制逻辑开始计算预测的细胞密度之前输入目标时间和目标细胞密度成为可能。GUI还可以使得用户在控制逻辑于多个时间间隔处计算预测的细胞密度时修改目标时间和/或目标细胞密度成为可能。
根据实施方案，该系统包括至少第一罐和第二罐。第一罐适应于使得用户将第一罐中的培养基和其中所含的真核细胞从第一罐转移至第二罐成为可能。例如，第一罐可以包含用于将培养基连同细胞从第一罐手工或自动转移至第二罐的开口或管道。
第二罐大于第一罐并且适应于接收培养基连同细胞和额外的无细胞培养基及培育转移的真核细胞。
控制逻辑配置成接收又一目标细胞密度和又一目标时间，例如，通过从存储介质读取又一目标时间或通过借助GUI或网络接口从用户接收目标时间。又一目标细胞密度代表在又一目标时间处真核细胞的所需细胞密度。又一目标时间代表未来时间点(晚于细胞从第一罐转移至第二罐的时间)。
第二罐的细胞密度计配置成为本文中称作“其他时间间隔”或“其他预测时间间隔”的多个时间间隔的每一者，测量第二罐的培养基中真核细胞的细胞密度。控制逻辑针对其他时间间隔的每一者设置，以便：
-将又一目标时间处的又一预测细胞密度作为至少所述实测细胞密度的函数计算；
-比较又一预测的细胞密度和又一目标细胞密度；
-如果又一预测的细胞密度偏离又一目标细胞密度，则调节第二罐中培养基的温度。调节包括：如果又一预测的细胞密度低于又一目标细胞密度，升高温度0.1℃至1℃；或如果又一预测的细胞密度高于又一目标细胞密度，降低温度0.1℃至1℃。
根据实施方案，第一罐是设置为培育细胞培养物作为分批培养物的生物反应器。第二罐大于第一罐并且是设置为培育细胞培养物作为分批培养物的生物反应器。第一罐和第二罐适应于在产生接种生产生物反应器的确定最小数目细胞的种子培养培养法中使用。
根据实施方案，第二罐包含用于测量第二罐中细胞密度的计量器并且包含用于根据控制逻辑的温度控制命令调节第二罐中培养基的温度的温度控制单元。
根据实施方案，第一罐是设置为培育细胞培养物作为预生产分批培养物的生物反应器。第二罐大于第一罐并且是设置为培育细胞培养物作为生产培养物的生物反应器。
根据实施方案，真核细胞是哺乳动物细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
根据实施方案，第一罐中的培养基具有500L或更小的体积。
根据实施方案，控制逻辑针对多个时间间隔的每一者设置为执行：
-为当前时间间隔规定当前观测间隔，具有预定义的长度的当前观测间隔和在当前时间间隔结束时终止；和
-接收已经在当前观测间隔期间测量的全部细胞密度。
将预测细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算包括外推在当前观测间隔期间测量的细胞密度直至目标时间。
根据实施方案，外推包括对当前观测时间期间测量的细胞密度执行曲线拟合操作或回归分析。
根据实施方案，各时间间隔具有相等长度。
根据实施方案，各时间间隔具有不同长度。特别地，细胞培养计划的后三分之一中的至少一些时间间隔短于细胞培养计划的前三分之一中的时间间隔。
根据一些实施方案，控制逻辑设置为确定当前时间是否接近于目标时间。响应于确定当前时间接近于目标时间，控制逻辑减少多个时间间隔的全部未来者的长度。
根据实施方案，多个时间间隔的每一者具有在小于30分钟，优选地小于10分钟的范围内的持续时间，例如，在1至10分钟范围内的持续时间。
根据实施方案，观测间隔的预定义的长度在60分钟至480分钟的范围内。
根据实施方案，温度调节包括升高温度0.1℃至0.5℃、优选地0.1℃至0.2℃，或降低温度0.1℃至0.5℃、优选地0.1℃至0.2℃。
根据实施方案，控制逻辑配置成仅在至少调节时间间隔已经自控制逻辑先前对所述第一罐执行温度调节以来过去的情况下，才执行第一罐的温度调节。调节时间间隔的持续时间是在60-120分钟的范围内。
根据实施方案，控制逻辑配置成使得在应当达到所述的所需细胞密度时人类用户(例如，通过提供GUI)能够借助控制逻辑的界面输入所需细胞密度和未来时间。所需的细胞密度代表在输入的未来时间处真核细胞的所需细胞密度。控制逻辑进一步设置为根据本文所述的任一个实施方案控制真核细胞生长。如此执行生长控制，从而使用输入的所需细胞密度作为目标细胞密度，使用输入的未来时间作为目标时间，并且从而按目标细胞密度在目标时间提供真核细胞。
如本文所用的“罐”是容纳、运输或储存液体的容器。罐可以例如是生物反应器，尤其预生产或生产生物反应器、小瓶或收获罐或运输罐。例如，罐可以是具有内容积的容器，所述内容积适于在液体培养基中在允许细胞维持或增殖的受控的一组物理条件下培养多个细胞(例如，重组哺乳动物细胞)。罐的非限制性例子是生物反应器(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性生物反应器)。
如本文所用的“生物反应器”是这样的容器，其中实施涉及生物或衍生自这类生物的生物化学活性物质的化学过程。这种过程可以例如是需氧或缺氧的。存在多个在形状(例如，圆筒形或其他形)、大小(例如，毫升、升至立方米)和材料(不锈钢、玻璃、塑料等)方面变动的不同生物反应器类型。根据实施方案，生物反应器适应于在细胞培养下培育细胞或组织。取决于实施方案和/或操作模式，生物反应器可以是分批生物反应器、补料分批生物反应器或连续生物反应器(例如，连续搅拌罐反应器模式)。连续生物反应器的例子是恒化器。
如本文所用的“控制逻辑”是一段程序逻辑，例如，应用程序或模块、计算机芯片或另一段软件、硬件或防火墙或其组合，其设置为接收并处理来自包含细胞培养物的罐的一个或多个测量值，以处理测量值并且发送一个或多个控制命令至与罐可操作连接的罐或硬件模块，以便控制细胞培养物的生长。例如，控制逻辑可以是作为生物反应器监测和控制软件的部分或与生物反应器监测和控制软件交互操作的程序模块。控制逻辑也可以是实验室信息管理系统(LIMS)的部分。
与罐可操作连接的“测量装置”或“计量器”可以例如是永久或暂时位于罐内部或与罐壁连接并配置成测量罐或细胞培养物或其中所含培养基的一个或多个物理参数或化学参数的测量装置。测量可以响应于命令而执行或定期自动执行。
如本文所用的“在线测量”是获得测量值的过程，所述测量值描述罐或细胞培养物或其中所含培养基的状态特征，因而为执行测量所要求的持续时间短于期间所述特征显著变化的时间。显著变化可以是多于预定阈值的变化。例如，多于5％的变化可以视为显著变化。阈值可以对不同特征变动。在线测量值可以允许实时控制生物反应器。特别地，如所用的“在线测量”可以是对罐或细胞培养物或其中所含细胞培养基直接执行的测量，即，不从培养基取得样品并测量样品。
“离线测量”是获得测量值的过程，所述测量值描述罐或细胞培养物或其中所含培养基的状态特征，因而执行测量所要求的持续时间长于期间所述特征可能显著变化的时间。显著变化可以是多于预定阈值的变化。离线测量的常见例子是对培养基自动化、半自动化或手工采样，例如，以测量当前细胞密度。离线测量值基于不连续采样过程。由于自取得样品以来，生物反应器特征可能同时已经改变，故基于离线测量数据控制生物反应器往往质量低，原因在于测量时刻和相应控制操作执行时刻之间显著的延迟时间。取决于相应的状态特征，显著变化可以是多于预定阈值的变化，例如2％或任何其他百分数值。
“增加或降低温度X℃”例如意指相对于测量的当前温度，例如，在执行细胞密度预测的相同时间，增加或降低对象的温度。根据实施方案，罐包含在线温度计。
如本文所用的“曲线拟合”过程是构建曲线或数学函数的过程，所述过程对一系列可能受约束因素影响的数据点(此处：实测细胞密度)具有最佳拟合。曲线拟合可以包括对数据的确切拟合或平滑，其中构建了大致拟合数据的“平滑”函数。
如本文所用的“回归分析”是一种方法，其更多聚焦于统计推断问题，如对带有随机误差的观测数据拟合的曲线中存在多大不确定性。拟合曲线可以任选地显示在GUI上。拟合曲线用来在无数据可用情况下推断函数的值，并用来总结两个或更多个变量之间的关系。
如本文所用的术语“回归分析”指用于估计各变量之间关系并代表函数(例如，线性或非线性曲线函数)中关系的统计方法。最常见地，给定自变量，回归分析估计因变量的条件期望，即，当自变量固定时因变量的平均值。例如，当前实测细胞密度和生长模式，例如，线性或指数生长模式，可以用于估计未来时间和预测细胞密度之间的关系。已经开发用于实施回归分析的许多技术。例如，可以使用线性回归和普通最小二乘回归。与分类(度量回归)中所用的离散响应变量相反，执行回归分析可以包括估计连续响应变量。
如本文所用的术语“外推”指使用观测数据或使用已经从观测数据导出的曲线(例如，通过拟合或否则内插观测数据)计算延伸超出观测数据范围外的预测数据值。例如，外推可以借助过去时间间隔中获得的观测数据值，通过拟合曲线预测未来数据值。曲线可以是线性或非线性曲线。观测数据的范围可以例如是过去的时间间隔，在其期间已经在特定罐中测量细胞密度。所述时间间隔在本文中还称作“观测间隔”。由于对每个预测从头确定观测时间间隔，它也称作“当前观测间隔”。对未来曲线各段的计算受不确定性的程度影响，因为它可以反映用来构建曲线的方法，如同它反映观测数据那样。
真核细胞尤其可以是衍生自任何人类和非人类哺乳动物(例如，人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、奶牛或兔)的细胞。例如，哺乳动物细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是分化的细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是未分化的细胞。本领域已知哺乳动物细胞的额外例子。
如本文所用的术语“种子培养法”是一个多步骤方法，凭借所方法，第一细胞培养物中起始数目的细胞(例如，重组哺乳动物细胞)扩充成N-1细胞培养物，其含有足够数目的细胞以按照大于0.25x106个细胞/mL的初始细胞密度接种常见的生产生物反应器。因此，种子培养罐是适应于种子培养法中使用的容器或生物反应器。种子培养的目的是产生足够数目的细胞以接种生产生物反应器。从用于细胞系维持的解冻体积起，不得不通过使细胞经过许多培养系统来增加细胞数目，所述培养系统随每一次传代变得更大(例如，T型瓶、转瓶或摇瓶、小规模生物反应器系统和随后较大的生物反应器)。可以应用一次性使用系统和按部分装填状态接种并且此后通过添加培养基增加培养物体积的系统。一般，从最大种子培养规模接种生产生物反应器。种子培养为优化提供空间，例如，选择从一种规模至较大规模的细胞传代的最佳时间点。根据一些实施方案，将种子培养法中所用的每个罐中的细胞在规定的时间培育到与生产生物反应器的目标细胞密相同的细胞密度。在种子培养罐和生产罐的每者中，可以基于相同、共有的目标细胞密度(但是一般取决于每个种子培养步骤的方法特殊性，目标时间不同)，应用根据实施方案本文所述的生长控制方法。在其他实施方案中，种子培养法中的不同步骤使用不同的目标细胞密度。
如本文所用的“分批培养物”是在按照分批模式运行的罐中培育的细胞培养物。当罐(例如，生物反应器)按照分批模式运行时，培养基在整个培养时间期间保持相同。因此，既不增补或补充培养基(在补料分批法的情况下)，也不部分地更换它(在恒化生物反应器的情况下)。在分批培养中，细胞生长，定义为分批培养物中细胞数目增加，一般在初始稳定(滞后期)后非常强烈地增加(指数期)，随后逐渐地下降(过渡期/“稳定期”)并且如果需要，变负(衰亡期)。分批培养中生长停滞的原因是培养基的养分耗尽及有毒物质积累。
如本文所用的“补料分批培养物”是在按照补料分批模式运行的罐中培育的细胞培养物。罐尤其可以是在液体培养基中包含多个细胞的生产罐。在补料分批模式下，在培养期间不从罐中大量或显著取出液体培养基的情况下，向罐定期或连续添加新鲜的液体培养基。新鲜的培养基可以与培养开始时罐中存在的培养基相同。在补料分批培养的一些例子中，新鲜的液体培养基是培养开始时罐中存在的液体培养基的浓缩形式。
如本文所用的“图形化用户界面(GUI)”是允许用户通过图形化图标和可视指示物与电子设备(例如，计算机或智能手机)互动的用户界面类型。GUI使得用户，通过直接操作GUI的图形化元素(例如，图标、按钮、条、文本字段等)，控制基于软件和/或硬件的功能(例如，罐的控制逻辑或硬件模块(例如，恒温器))成为可能。
术语“培养”或“细胞培养”意指在一组受控物理条件下维持或增殖哺乳动物细胞(例如，重组哺乳动物细胞)。术语“哺乳动物细胞培养物”或“细胞培养物”意指含有在一组受控物理条件下维持或增殖的多个哺乳动物细胞的液体培养基。
术语“液体培养基”或“培养基”意指含有足够养分以允许细胞(例如，哺乳动物细胞或细菌)在体外生长或增殖的流体。例如，液体培养基可以含有：氨基酸嘌呤、嘧啶、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸苷、氰钴胺、丙酮酸、硫辛酸、镁、葡萄糖、痕量金属或金属盐和缓冲剂。在一些实施方案中，液体培养基可以含有来自哺乳动物的血清。在一些实施方案中，液体培养基可以含有哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。备选地，培养基可以是基本培养基(例如，仅含有无机盐、碳源和水的培养基)。培养基可以包含衍生自哺乳动物的血清。培养基可以是化学成分确定培养基，其中全部化学组分均已知。
根据实施方案，细胞适应于产生重组蛋白或肽(例如，免疫球蛋白)或其他形式的生物产物。术语“重组”或“工程化”意指并非天然地由生物(例如，哺乳动物)内部存在的内源核酸编码的肽或多肽。工程化蛋白质的例子包括在制药业或生物医学研究中使用的酶、融合蛋白、抗体、抗原结合蛋白和其他类型的肽或蛋白质。
根据实施方案，在测量第一罐的培养基中预定的最小细胞密度后，控制逻辑依据比较结果开始调节第一罐的温度。最小细胞密度可以例如是100000个细胞/mL。这可以是有益的，因为相对于高密度值，低细胞密度值的预测准确度较低。另外，尤其在细胞培养计划的起点，温度因此可以保持处于对快速生长速率最佳的温度，并且可以推迟生长速率的“微细调节”至细胞培养计划的稍后阶段，以避免不必要的延迟。
根据一些实施方案，控制逻辑仅在至少调节时间间隔已经自控制逻辑先前对特定罐执行温度调节以来过去的情况下，才执行所述罐的温度调节。
根据一些实施方案，系统使得用户在细胞培养计划启动之前指定调节间隔成为可能并且任选地使得用户在计划运行时间期间动态修改调节间隔成为可能。例如，GUI可以使得用户还指定除目标时间、目标细胞密度和其他任选的控制参数之外的“调节间隔”成为可能。
如本文所用的“调节间隔”是最小时间，所述最小时间必须自先前由控制逻辑实施的温度调节以来已经过去直至启用控制逻辑以再调节同一罐的温度。优选地，调节间隔具有大约60-120分钟范围内的持续时间。
在上述范围内使用调节间隔可能是有益的，因为调节间隔严禁控制逻辑过于频繁地改变温度。这可能对细胞的总生长速率产生不利影响，因为细胞的代谢将不得不非常频繁适应于不同的温度。
如本文所用的术语“生产罐”指大规模罐，尤其适应于培养稳定期细胞的大规模生物反应器。生产罐一般用于生产和任选地收获所需的生物产物，例如，蛋白质或肽。大规模罐例如具有500L、1,000L、5,000L、10,000L、20,000L、50,000L或100,000L的内部容积。例如，生产罐可以是灌流生物反应器。
如本文所用的术语“灌流生物反应器”指生物反应器，其具有用于培养液体培养基中多个细胞(例如，重组哺乳动物细胞)的内容积，并且具有定期或连续取出生物反应器中液体培养基的手段(例如，出口、入口、泵或其他这类装置)及具有向生物反应器添加基本上相同体积的替换液体培养基的手段(例如，出口、入口、泵或其他这类装置)。添加替换液体培养基可以在基本上相同的时间进行或从生物反应器取出液体培养基后不久进行。从自生物反应器取出液体培养基的手段和添加替换液体培养基的手段可以是单一装置或系统。
附图简述
在下文仅以举例方式，参考附图更详细地解释本发明的实施方案，其中：
详述
图1是控制第一罐和第二罐中细胞生长的系统的框图；
图2描述预测时间间隔和几个不同的当前观测间隔；
图3是通过调节温度控制细胞生长的方法的流程图；
图4描述一个包括多个预生产罐和生产罐的系统；
图5显示六个细胞培养计划的细胞密度曲线；
图6更详细显示温度对图5的6个细胞培养计划之一所获得的细胞密度信号的影响；
图7更详细显示温度对图5的6个细胞培养计划之一所获得的细胞密度信号的影响；
图8描述揭示三个细胞培养计划的在线细胞密度和离线细胞密度依赖于温度调节的曲线；
图9描述揭示细胞密度对其他细胞培养计划的温度调节依赖性的又一曲线；
图10描述两条说明控制逻辑补偿供氧失效的能力的曲线；
图11描述两条说明控制逻辑补偿供氧失效的能力的曲线；
图12描述两条说明控制逻辑补偿pH控制失效的能力的曲线；
图13描述两条说明控制逻辑补偿pH控制失效的能力的曲线；
图14描述三条说明控制逻辑补偿供氧和pH控制均失效的能力的曲线；
图15描述两条说明控制逻辑补偿供氧和温度控制均失效的能力的曲线。
图1是控制第一罐130和第二罐132中细胞生长的系统102的框图。可以根据通过图3中的流程图所示的方法对每个罐执行生长控制。因此，将在下文还通过参考图3描述图1的系统。
数据处理系统102包含一个或多个处理器104、主存储器106和时钟108。时钟108设置为以绝对或相对术语确定时间。它用于确定如在例如图2a-图2d中所示的预测时间间隔和观测间隔。此外，系统102包含非易失性存储介质114，后者包含执行控制逻辑116的计算机可读取指令。控制逻辑可以是独立应用程序或用于控制一个或多个生物反应器和/或实验室装置的应用程序或软件构架的子模块或单元。
此外，存储介质114包含执行图形化用户界面GUI 110的计算机可读取指令。GUI使得用户118能够指定并输入目标时间112和目标细胞密度114。任选地，GUI另外使得用户能够指定观测间隔138的持续时间，在所述观测间隔期间测量并外推细胞密度以预测受控细胞培养物达到目标细胞密度114的未来时间。例如，GUI 110可以是HTML接口或基于Java或基于C#的程序逻辑。根据一些实施方案，GUI 110使得用户不仅在启动细胞培养计划之前指定目标细胞密度、目标时间和观测间隔成为可能，还使得用户在细胞培养计划正在进行期间修改已输入和存储的目标细胞密度、目标时间和/或观测间隔成为可能。
系统102还包含从一个或多个罐接收测量数据和/或向一个或多个罐发送控制命令的接口120。该接口转发收到的测量数据至控制逻辑116并转发来自控制逻辑的控制命令至一个或多个罐。
数据处理系统102可以作为标准计算机系统、作为服务器计算机系统或作为远程移动通讯设备(例如，智能手机或平板电脑)执行。
在图1中描述的例子中，系统102可操作地连接于并控制预生产生物反应器130。生物反应器130包含增加或降低培养基温度的单元138。这个单元可以例如是其目标温度受控制逻辑116控制的恒温器。此外，预生产生物反应器130包含在线细胞密度计134，其适应于在不取得任何样品的情况下，测量第一生物反应器130的培养基M1中当前细胞密度。生物反应器130包含培养基M1，当预生产细胞培养计划启动时，培养基M1不含任何细胞。
在开始在预生产生物反应器130中培育细胞之前，用户118实例化GUI 110和计算机系统102并且输入特定细胞类型的目标细胞密度和目标时间，所述目标时间规定生物反应器130中的细胞应当达到目标细胞密度的时间。一般，目标时间处于已知所述特定细胞培养计划进入特定生长阶段(例如，预生产或生产生物反应器的生长阶段结束或生产反应器的稳定期结束)的时间的+/-20％范围内。
例如，用户可以在周一上午10.00点实例化GUI。用户可能想要在上午11.00点通过用解冻的CHO细胞样品接种生物反应器130，在生物反应器130中启动预生产细胞培养过程之前一小时，培育预生产CHO细胞培养物，其中根据文献或先前实验，所述细胞培养物一般需要48小时在37℃的“恒定温度”条件下达到所需细胞密度。在上午10.00点，用户输入目标时间112、目标细胞密度和观测时间间隔。例如，用户可以输入目标细胞密度4百万细胞/ml和“周一，上午11.00点+48小时”作为未来目标时间。此外，用户可以将预测时间间隔设定为例如约1分钟及将观测间隔设定为例如90分钟。用户可以甚至将目标时间设定为“周一，上午11.00点+47小时”，以缩短执行细胞培养过程所需要的时间达一小时。
在上午11.00点，在已经借助GUI 110配置控制逻辑后，用户通过用解冻的CHO细胞样品接种生物反应器130中的无细胞培养基M1，启动预生产细胞培养。罐的起始温度可以是37℃。
在本文所述的控制方法的第一步骤302中，例如，在约周一上午11.00点，控制逻辑从存储介质114读取事先已经由用户118输入的目标细胞密度114、目标时间112和任选地持续时间观测间隔138。读取的目标细胞密度代表在输入的目标时间处真核细胞的所需细胞密度(周一，上午11.00点+48小时)。当然，取决于实施方案，可以按照多种不同样式指定时间，例如，指定为绝对时间或从当前时间开始或从特定未来时间开始的相对时间。
在步骤304中，在第一罐130的培养基M1中培养真核细胞。例如，步骤304可以包括用CHO细胞接种罐130中的培养基M1。根据其他实施方案，还可能步骤304紧邻步骤302之前执行或步骤302、304二者基本并行执行。
控制逻辑随后可以自动地识别预定义的长度(例如，一分钟)的一系列“预测时间间隔”，也称作“时间间隔”I1、…、I4367。第一时间间隔可以例如在接种时间处、紧邻其之前或紧邻其之后开始。
对于多个时间间隔的每一者306(例如，在这些时间间隔的每者开始或结束时)，执行以下子方法：
在步骤308中，在线细胞密度计134测量第一罐130中培养基M1内真核细胞的细胞密度122。测量值122借助控制逻辑116的接口122发送。
响应于收到实测细胞密度值122，控制逻辑在步骤310中将目标时间“周一上午11.00点+48小时”处的预测细胞密度作为至少当前实测细胞密度的函数计算。特别地，可以将目标时间处的细胞密度作为随如图2中所示滑动观测间隔期间已经测量的多个细胞密度的函数预测。
此外，控制逻辑在步骤312中比较预测的细胞密度和目标细胞密度。
在步骤314中，控制逻辑确定预测的细胞密度是否相对于目标细胞密度更大或更小或与之相同。如若控制逻辑确定预测的细胞密度与用户输入的目标细胞密度相同或至少处于目标细胞密度附近的耐受阈值区范围内，则在步骤318中主动或被动维持生物反应器130中当前培养基的温度。如若控制逻辑确定预测的细胞密度低于用户输入的目标细胞密度输入或低于目标细胞密度以下的下限耐受阈值，则控制逻辑向恒温器138发送温度调节控制命令126，所述温度调节控制命令使得恒温器在步骤316增加生物反应器130中当前培养基的温度达例如0.4℃。备选地，如若控制逻辑确定预测的细胞密度高于用户输入的目标细胞密度或高于目标细胞密度以上的上限耐受阈值，则控制逻辑向恒温器138发送温度调节控制命令126，所述温度调节控制命令使得恒温器在步骤316降低生物反应器130中当前培养基的温度达例如0.4℃。根据实施方案，GUI一104，其使得用户118为认定温度调节有必要的每个预测时间间隔指定带给培养基的温度变化量成为可能。
可以对范围比较短(一般一至数分钟)的多个时间间隔的每一者完全自动执行包括上述步骤308-318的子方法。
根据子方法的一些实施方案，例如，步骤314可以包括确定终止标准是否满足的进一步检查。例如，如若预定的预测时间间隔最大数值已经过去、达到目标细胞密度或超过细胞培养计划预定的最大持续时间等，则控制逻辑确定终止标准满足。
包括反复执行的子方法306-318在内的上述方法可以用于预生产细胞培养生物反应器130中培养细胞至适于在第二罐132(例如，生产生物反应器)中启动后继细胞培养计划的所需细胞密度。生产生物反应器还包含由控制逻辑借助相应控制命令128控制的恒温器140和向控制逻辑116提交实测细胞密度值的在线细胞密度计136。实测细胞密度和温度控制命令128借助接口120传达至控制逻辑和自其传达。第二罐中的细胞培养基M1可以具有与第一罐中培养基基本上相同的组成或可以具有不同组成。通过将细胞转移至并且任选地还将目标细胞密度达到后第一罐中所含的培养基转移至第二罐中，启动第二罐中的第二细胞培养计划。另外，添加无细胞培养基至第二罐，这导致在第二罐中稀释转移的细胞。
在第二罐132中培育细胞之前，用户118根据第二罐中生产细胞培养过程的特点，重新配置目标时间112。例如，第一细胞培养计划可能已经在目标时间即周一上午11.00点+48小时”，即，“周三，上午11.00点”确切终止。将细胞从第一罐转移至第二罐、重新配置控制逻辑和补充附加培养基可以需要30分钟。从文献已知，以如第一罐所提供的细胞数目开始的在目标罐中37℃培养细胞的细胞培养计划需要74小时。因此，在周三11.15点，用户可以通过输入新的目标时间“周三11.30点+74小时”或“周六下午1.30点”，重新配置控制逻辑。已经将细胞从第一罐转移至第二罐后，第二细胞培养计划在周三上午11.30点启动，而如上文对第一细胞培养计划所述，通过调节第二罐132中培养基的温度，控制细胞生长。
图2a描述多个“预测时间间隔”I1、…、I4367，也称作“时间间隔”，其在用真核细胞接种细胞培养基时开始。对于每个时间间隔，例如，在每个时间间隔结束时，测量受控生物反应器中培养基内的当前细胞密度。例如，在第一时间间隔I1结束时，测量细胞密度CDM1。在第二罐时间间隔I2结束时，测量细胞密度CDM2。在第三时间间隔I3结束时，测量细胞密度CDM3。如此类推。此外，对于每个时间间隔或至少对于观测间隔过去后启动的时间间隔，通过外推当前观测间隔期间获得的细胞密度测量值，计算预测的细胞密度CDP。
例如，在时间间隔I6结束时，通过外推观测时间间隔期间测量的细胞密度CDM1、CDM2、…、CDM5、CDM6，预测目标时间112处的预测细胞密度CDP6。此外，控制逻辑将预测的细胞密度CDP6与目标细胞密度114比较并且如若预测的细胞密度CDP6与目标细胞密度114显著不同，在时间间隔I6结束时，调节受控生物反应器的温度。
图2b显示时间间隔I7结束时由控制逻辑执行的数据处理步骤。通过外推观测时间间隔期间测量的细胞密度CDM2、CDM3、…、CDM6、CDM7，预测目标时间112处的细胞密度CDP7。此外，控制逻辑将预测的细胞密度CDP7与目标细胞密度114比较并且如若预测的细胞密度CDP7与目标细胞密度114显著不同，在时间间隔I7结束时，调节受控生物反应器的温度。
图2c显示时间间隔I11结束时由控制逻辑执行的数据处理步骤。通过外推观测时间间隔期间测量的细胞密度CDM6、CDM7、…、CDM10、CDM11，预测目标时间112处的细胞密度CDP11。此外，控制逻辑将预测的细胞密度CDP11与目标细胞密度114比较并且如若预测的细胞密度CDP11与目标细胞密度114显著不同，在时间间隔I11结束时，调节受控生物反应器的温度。
图2d显示时间间隔I4365结束时由控制逻辑执行的数据处理步骤。通过外推观测时间间隔期间测量的细胞密度CDM4358、…、CDM4365，预测目标时间112处的细胞密度CDP4365。此外，控制逻辑将预测的细胞密度CDP4365与目标细胞密度114比较并且如若预测的细胞密度CDP4365与目标细胞密度114显著不同，在时间间隔I4365结束时，调节受控生物反应器的温度。与图2a-2c中描述的时间间隔相比，图2d中描述的时间间隔显著地较短。例如，图2a-2c中描述的时间间隔可以具有数分钟(例如，15分钟)的持续时间，并且图2d的右侧部分中描述的时间间隔可以具有一分钟的持续时间。例如，当确定当前时间接近于目标时间，例如，先于目标时间2-3小时时，控制逻辑可以自动使用较短的时间间隔。这可以是有益的，因为细胞密度已经在该计划的这个阶段高并且轻微测量误差可能对预测的目标时间产生明显影响。通过使用较短的时间间隔，可以增加预测次数和预测准确度，因为可以增加方法针对离群测量值的稳健性。
图4描述一个包括多个预生产罐400、412、130和一个生产罐132的系统。在种子培养法中使用预生产罐400、412、130以提供足够数目的细胞，以启动生产生物反应器132中的生产细胞培养计划。将第一预生产生物反应器用解冻的细胞系样品400接种并且第一预生产细胞培养在第一罐410中启动。一旦第一罐中达到第一目标细胞浓度，将第一罐中的培养基和细胞转移至第二预生产罐412并且第二预生产细胞培养在第二罐412中启动。一旦第二罐中达到第二目标细胞浓度，将第二罐中的培养基和细胞转移至第三预生产罐130并且第三预生产细胞培养在第三罐130中启动。一旦第三罐中达到第三目标细胞浓度，将第三罐中的培养基和细胞转移至生产罐132并且生产细胞培养在生产罐132中启动。至少生产生物反应器可以包含气体流入管路或管道。例如，单一气体流入管路或管道可以用于输送来自特定供应商的环境空气或(已经膨胀的)压缩空气至生物反应器中。所述环境空气或压缩空气可以由气体(尤其地球大气常见的N2、O2和CO2)的混合物组成，或具有不同的组成。此外或备选地，单一气体流入管路或管道或任何其他气体流入管路或管道可以用于输送单独气体如N2、O2和CO2至生物反应器。例如，生物反应器可以包含从流入气体生成极精细分散的气泡以改善罐中细胞通气状况的微喷雾器。
罐410、412、130、132各自包含恒温器138、406、408、140和在线细胞密度计134、402、404、136并且可操作地与控制逻辑116连接并且受其控温。GUI 110使得用户118能够逐一为四个细胞培养计划的每者指定目标时间和目标细胞密度。例如，GUI可以包含第一窗口W410，其为第一罐410设定目标时间和目标细胞密度和任选的其他工艺参数如间隔长度、观测间隔长度、每个时间间隔等温度调节量。GUI可以包含为第二罐412设定上述参数值的第二窗口W412、为第三罐130设定上述参数值的第三窗口W414和为生产罐132设定上述参数值的第四窗口W132。
图5描述六个不同批次细胞培养计划，其为检验温度调节对真核细胞生长速率影响而执行。在对图5ff描述的每个细胞培养计划中，将CHO细胞系在2升生物反应器B-DCU(Sartorius)中培育。EVO200系统(Fogale，现为Hamilton)用于执行在线细胞密度测量。全部批次细胞的培养均根据参考细胞培养方案在摇瓶中实施。用于每个计划的生物反应器配备pO2电极(Clark型)和pH凝胶电极。工作容积总是1.3升并且将生物反应器曝气(顶空通气和曝气环)。穿过顶空，将二氧化碳富集的氮气恒定地以50cc输送至生物反应器。根据pO2调节器，经曝气环引入纯氧。借助质量流量控制器(MFC)调节气流量。借助MFCS记录全部在线测量值。Fogale EVO200系统用于在线细胞数目确定。确定培养物的电容率(电介质电导率)并借助常数因子转化成细胞密度值。这些值称作“在线”细胞密度。借助专门编程的软件读出EVO200系统的测量值并输入为调节生物反应器的温度所设置的控制逻辑。
为了核查基于电容率的细胞密度是否正确地反映真实细胞密度，将它们偶尔与已经通过分析生物反应器的培养基样品确定的离线细胞浓度比较。对于离线控制培养物，首先至少一日一次取得样品并用Cedex细胞分析仪确定细胞密度。在该计划的稍后过程中，部分省略每日离线细胞密度确定。尽管电容率并不在整个发酵过程期间恒定并且依赖于数个参数，仍有可能采用在相关细胞浓度范围内的仅一个转换值工作。
六批次中两者是整个细胞培养计划期间在恒定温度培育的参比批次。在剩余的四个批次中，根据不同方案，通过降低日间隔期间的温度，研究温度对细胞生长的影响。两个参比批次培养物和四个试验批次培养物的每一者总是在标准温度36.5℃开始，持续一天，以调节细胞至高生长速率。此后，如图中所示在四个试验批次3-6中实施温度变化：将批次3在36.5℃培育9.3天和此后在35℃培育；将批次4在36.5℃培育12天，随后在34.5℃培育一天和次日和全部天均在33℃培育；将批次5在36.5℃培育15天并且随后在33℃培育；将批次6在36.5℃培育18天，随后在35℃培育一天，随后在34℃培育一天并且和次日和全部天均在32℃培育。
对于每个批次，连续、平滑线500表示通过将电容率测量值依据单一、经验确定的修正系数转化成“实测细胞密度”所测量的细胞密度。阶梯曲线502表示偶尔进行的离线测量以确保电容率正确反映整个受测温度范围内的真实细胞密度。为了执行细胞密度的离线控制测量，取得样品并使用Cedex细胞分析仪确定细胞密度。
图5显示，可以通过在现有生物反应器系统中调节温度，控制细胞生长速率，并且电容率测量准确地反映相关温度范围内的细胞密度。尽管细胞培养过程期间修改了细胞培养基的温度，但迄今检查的所生成蛋白质和肽未显示偏离于参考细胞培养的生物产物。
图6和图7更详细显示温度对6个细胞培养计划中两者所获得的细胞密度信号的影响。在两个图中，温度504逐步降低导致生长速率下降，因而乘以单一恒定转换因子的实测电容率是细胞密度502(即，给定培养基体积中的细胞数目)的可靠度量，如通过基于样品的偶尔离线细胞密度测量值500确认。
为了评价pH变化对生长速率的影响，执行附加的细胞培养计划(“批次”)(未显示)。附加批次揭示不能在pH 6.75至pH 7.1的宽pH范围内观察到修改的pH的短期影响。尽管如此，pH变化的影响仅随长的延迟时间出现。始于pH 6.75并变动成pH 6.8，约1.5天后观察到影响，在pH 6.7，大约一天后观察到影响，并且在pH 6.6，半天后观察到影响(参见批次4)。如果降低pH低于6.75，在更新的pH增加到标准值(6.9-7.1)相当的时间后，培养物需要再生。因此，观察到，与基于温度的生长控制相反，基于pH的生长控制将面临这样的问题：在生理pH范围内，pH变化似乎对细胞生长没有显著和即刻的影响，并且如果使用生理范围外的pH，则细胞需要额外时间从极端pH值恢复，因而减慢细胞培养计划并降低其灵活性。观察到相比约6.8-7.2的生理pH-范围内的pH变化，细胞培养物生长速率更强烈地依赖于约32-38℃的生理学温度范围内的温度变化。另外，细胞从非生理pH值的恢复显著地劣于从异常低温的恢复。因此，观察到pH调节不适合灵活控制细胞培养物生长速率。
因此，根据实施方案，使用温度提供对细胞培养计划的自动化控制，因为甚至微小的温度变化就对生长行为具有明显的、即刻可逆的影响。
根据实施方案，控制逻辑配置成从借助在线(基于电介质电导率的)测量装置(例如，EVO200)确定的电容率值计算当前生长速率或经由通过电容率系数乘以转换系数而计算的生物测量值(细胞密度值)计算当前生长速率。
通过执行与电容率测量平行的某些离线细胞密度测量并且确定转换系数，确定一个或多个参考细胞培养计划中的转换系数，所述转换系数若乘以电容率值则返回离线细胞密度。
根据实施方案，用于执行电容率离线测量和用于预测目标时间处细胞密度的时间间隔是60秒。对间隔获得的电容率值由控制逻辑(底数e)对数化并且临时或永久存储在存储介质中。任选地，不时测量离线细胞密度并结合相应的在线细胞密度存储。对数化的细胞密度值在预定观测间隔范围内(例如，90分钟)经历线性回归。在每个新电容率(并且因此，在线细胞密度)测量值(例如在每60秒后)后实施新的计算。回归线的斜率随后用来确定当前观测间隔内细胞的生长速率μ。这个值μ天然地对一些实测值波动，但是在指定的观测间隔内部巩固。观测间隔越长，计算的生长速率越稳定，并且目标时间处的预测细胞密度越准确。
使用计算的生长速率，计算目标时间处前瞻性细胞密度的预测值并且预测的细胞密度由用户与目标细胞密度集合比较。在分批法的起点规定目标时间和目标细胞密度，所述起点也可以是启动控制逻辑的时间。如果预后产生高于目标细胞密度的细胞密度，按小值(例如，0.4°)降低温度；如果预测的细胞密度低于目标细胞密度，略微地升高温度(例如，0.2°)。在温度变化后，新的观测间隔自动地启动并且循环再次开始。这个过程持续直至目标时间达到或另一个终止标准满足。
例如，外部可控的水浴槽(连同逆流冷却)可以用于调节生物反应器的温度。但是，可以使用任何控制系统，所述控制系统允许将外部值(设定值、控制参数)转移至能够增加和降低罐中培养基温度的元件。
图8显示如对图5、图6和图7中描述的试验批次所述那样进行的其他试验培养计划(批次6、7和8)的在线(例如，基于电容率的或基于在线显微镜的)细胞密度802、812、822、偶尔测量的离线细胞密度值(符号)800、810、820，和温度信号(短划线)804、814、824。在线和离线细胞密度值按对数标度作图，温度按线性标度作图。垂直箭头表示应当达到目标细胞密度例如4,000,000个细胞/ml(水平线)的目标时间。图8显示，以良好准确度在所需的目标时间达到相应的目标细胞密度。
批次6、7和8基本上具有相同的起始条件、相同的目标细胞密度，但是不同的目标时间。几乎确切地达到相应的目标。各批次的温度曲线、尤其批次8的温度曲线显示，控制逻辑能够考虑细胞的当前生长速率并且因此，若适宜，还考虑不同的生长阶段(接种后的生长期、稳定期或过渡期)。
图9显示如对图5、图6和图7中描述的试验批次所述那样进行的其他试验培养计划(批次9和10)的在线细胞密度902、912、922、偶尔测量的离线细胞密度值(符号)900、910、920，和温度信号(短划线)904、914、924。曲线如对图8所述那样生成并且作为参考，还包含批次8的值(具有与820、822和824不同的参考号900、902和904)。批次9是旨在复现批次8的目标时间和目标细胞密度的细胞培养计划(3天时长)，不过曲线的温度揭示在接种时，批次8和批次9的培养基具有不同温度。然而，程序逻辑能够为批次8和批次9高度准确地提供目标时间处的目标细胞密度。
批次10用与批次9相同的目标细胞密度和起始温度启动，但是目标时间不同(4天)。采用来自批次10的结果，可以显示，可以在完整偏差一天的情况下，用与批次9中相同的细胞密度实现相同的目标细胞密度。因此，本发明的实施方案允许在至少一天的窗口中明确规定发酵终点，例如，旨在适宜的时间执行后续发酵器的接种和旨在规划全部制备过程。
用细胞系T074OPT B048WCB进行上述试验。基于CHO-细胞系T072的细胞培养物，进行其他试验。在其他试验细胞培养计划中，调节间隔的持续时间(60-120min)、起始细胞密度、目标时间(约3-4天，或67-95小时)和温度变化幅度(0.2-0.5℃)略微变动。在全部细胞系中，可以在目标时间达到目标细胞密度。观察到全部温度曲线彼此不同。因此，生长控制系统分别和成功地控制每个细胞培养物。在重大(例如，0.5-1.0℃)温度调节的情况下，增加调节间隔的时间长度(优选地至少90分钟)，从而细胞具有更多时间适应于新温度。
图10-图15显示，通过根据本发明实施方案进行的温度调节控制生长，允许在目标时间提供所需细胞密度，尽管细胞培养计划可能在计划期间面临一个或多个技术性问题和失效时。
技术扰乱可能严重危及细胞培养计划的成功。一般，尽快手工执行纠正措施。一般，可以在4小时内解决操作故障。但是，技术性失效引起的细胞生长延迟经常导致整个细胞培养计划的持续时间延长。
在一组试验中，通过模拟生物反应器的一个或多个种调节性控制措施的失效，评价控制逻辑补偿常见技术性失效所致细胞生长延迟的能力。测试的失效场景包括供氧失效、氧电极失效、温度控制失效、pH控制(CO2供应)失效和其他。在每个测试中，将一个或多个控制功能(例如，O2分压调节作用、CO2分压调节作用等)停止4小时或运行参数(例如，pH)设定为不利值持续大约4小时。随后再启动控制功能或运行参数重新设定成有利值或常见值。所述试验期间不改变控制逻辑的设定，尤其目标时间和目标细胞密度。
在图10-15中以曲线形式展示一些试验的结果。如对图5的附图描述中提到的细胞培养物所述那样，培养用于图10-15中描述的所述试验的细胞培养物。用于所述测试的细胞培养物(“批次”)的编号在此从起点开始。从而，图10-图15中的细胞培养物4-9与细胞培养物不相同，后者细胞培养物的数据形成图5-图9之基础。
图10和图11分别描述两条说明控制逻辑补偿供氧失效的能力的曲线。通过在时间间隔48小时-52小时期间(图10)或在时间间隔55小时-59小时期间(图11)关闭氧调节器，测试控制逻辑补偿供氧失效的能力。图10和图11明确地显示，无氧情况下(氧信号)(上部曲线，细胞密度曲线的斜率降低)，细胞不再生长。控制逻辑确定生长速率降低，预测到鉴于低生长速率，目标时间处的细胞密度将会低于目标细胞密度，并且升高温度，同时延迟1-2小时(图10和图11中的下部曲线)。尽管供氧短暂失效，但可能在设定的目标时间实现所需的细胞密度。
图12和图13分别描述两条说明控制逻辑补偿pH控制失效和所得不利pH值的能力的曲线。通过在时间间隔48小时-52小时期间(图12)或在时间间隔72小时-76小时期间(图13)改变pH控制的设定值至不利值，测试控制逻辑补偿pH控制失效的能力。图12和13显示pH变化对细胞生长没有产生大的影响，并且结果，控制逻辑毫无问题地补偿pH诱导的生长影响并在目标时间提供目标细胞密度。
图14描述三条说明控制逻辑补偿供氧和pH控制均失效的能力的曲线。再次，控制逻辑能够提供目标时间处的目标细胞密度。
图15描述两条说明控制逻辑补偿供氧和温度控制均失效的能力的曲线。接种后26小时，模拟供氧失效约4小时。如预期那样，系统非常强烈地反应以补偿降低的细胞生长。控制逻辑通过增加失效时间期间的温度，对供氧减少做出反应。大约12小时后，通过关闭温度调节器模拟温度控制失效。在约4小时的时间内，反应器温度降低到30℃和31℃之间的值。在这个时间期间，控制逻辑继续预测未来细胞密度并将计算的密度与目标细胞密度比较，但是不能成功地通过并执行各自的新温度设定值。在温度控制器再次开启后，温度控制器从控制逻辑接收新的温度设定值。这导致实际温度轻微超值，这随后得到迅速补偿。在剩余的批次运行时间期间，细胞培养物以受控方式培育。再次，控制逻辑能够提供目标时间处的目标细胞密度。
因此，成功展示了根据本发明实施方案的基于温度的生长调节对多种技术问题和失效是稳健的并且可以补偿之。在无问题情况下耐受断续的氧或pH控制失效并补偿其对生长的影响。甚至仍可以吸收温度控制的失效。

Claims (16)

1.一种用于控制真核细胞生长的方法，所述方法包括：
-通过控制逻辑(116)接收目标细胞密度(114)和目标时间(112)，目标细胞密度代表目标时间处真核细胞的所需细胞密度，目标时间代表未来时间点；
-在第一罐(130)的培养基(M1)中培养真核细胞；
对于多个时间间隔的每一者：
·测量培养基中真核细胞的细胞密度(122)；
·通过控制逻辑，将目标时间处的预测细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算；
·通过控制逻辑，比较预测的细胞密度和目标细胞密度；
·如果预测的细胞密度偏离目标细胞密度，则通过控制逻辑，按如下方式调节第一罐中培养基的温度
-如果预测的细胞密度低于目标细胞密度，升高温度0.1℃至1℃；或
-如果预测的细胞密度高于目标细胞密度，降低温度0.1℃至1℃。
2.根据权利要求1所述的方法，第一罐包含用于执行在线测量培养基中细胞密度的计量器(134)，在多个时间间隔的每一者时测量的真核细胞的细胞密度是在线测量值。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：
-当终止标准满足时，通过控制逻辑，自动终止至少对温度的调节，终止标准是以下之一：
·已经达到目标时间；
·实测细胞密度等于或大于目标细胞密度。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：
-通过控制逻辑，提供图形化用户界面–GUI(110)，GUI使得用户(118)能够在控制逻辑开始计算预测的细胞密度之前输入目标时间和目标细胞密度，GUI使得用户能够在控制逻辑于多个时间间隔处计算预测的细胞密度时修改目标时间和/或目标细胞密度。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括：
-在达到目标细胞密度后，将第一罐的培养基和其中所含的真核细胞从第一罐转移至第二罐(132)，第二罐大于第一罐；
-通过控制逻辑，接收又一目标细胞密度和又一目标时间，又一目标细胞密度代表所述又一目标时间处真核细胞的所需细胞密度，所述又一目标时间代表未来时间点；
-在第二罐中培养转移的真核细胞；
对于多个其他时间间隔的每一者：
·测量第二罐的培养基中真核细胞的细胞密度(124)；
·通过控制逻辑，将又一目标时间处的又一预测细胞密度作为至少所述实测细胞密度的函数计算；
·通过控制逻辑，比较所述又一预测的细胞密度和又一目标细胞密度；
·如果所述又一预测的细胞密度偏离又一目标细胞密度，则通过控制逻辑，通过如下方式调节第二罐中培养基的温度
-如果所述又一预测的细胞密度低于又一目标细胞密度，那么升高温度0.1℃至1℃；或
-如果所述又一预测的细胞密度高于又一目标细胞密度，那么降低温度0.1℃至1℃。
6.根据权利要求5所述的方法，生物反应器的第一罐设置为培养细胞培养物作为分批培养物，第二罐大于第一罐并且是设置为培养细胞培养物作为分批培养物的生物反应器，所述方法在种子培养培养法中使用用于产生确定最小数目的细胞以接种生产生物反应器。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，真核细胞是哺乳动物细胞，尤其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：
对于多个时间间隔的每一者：
-为当前时间间隔规定当前观测间隔(138)，当前观测间隔具有预定义的长度并且在当前时间间隔结束时终止；
-接收已经在当前观测间隔期间测量的全部细胞密度；
将预测细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算，包括外推在当前观测间隔期间测量的细胞密度直至目标时间。
9.根据权利要求8所述的方法，所述外推包括对当前观测时间期间测量的细胞密度执行曲线拟合操作或回归分析。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，多个时间间隔是长度相等的。
11.根据前述权利要求1-9中任一项所述的方法，方法还包括：
-确定当前时间是否接近于目标时间；
-响应于确定当前时间接近于目标时间，减少多个时间间隔的全部未来者的长度。
12.根据前述权利要求8-12中任一项所述的方法，观测间隔的预定义的长度在60分钟至480分钟范围内。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，温度的调节包括升高温度0.1℃至0.5℃，优选地0.1℃至0.2℃，或降低温度0.1℃至0.5℃，优选地0.1℃至0.2℃。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，仅在至少调节时间间隔已经自控制逻辑先前对所述第一罐执行温度调节以来过去的情况下，控制逻辑才执行第一罐的温度调节，调节时间间隔的持续时间在60-120分钟的范围内。
15.以所需细胞密度在规定的未来时间提供真核细胞的方法，所述方法包括：
-通过人类用户(118)，借助控制逻辑(116)的界面(110)输入所需的细胞密度(114)和未来时间(112)，所需细胞密度代表在输入的未来时间处真核细胞的所需细胞密度；
-执行根据前述权利要求1-14中任一项所述的控制真核细胞生长的方法，如此执行生长控制，使得输入的所需细胞密度用作目标细胞密度，输入的未来时间用作目标时间，并且以目标细胞密度在目标时间提供真核细胞。
16.控制真核细胞生长的系统(100)，所述系统包括控制逻辑(116)和设置为执行所述控制逻辑的处理器(104)，所述控制逻辑可操作地与培养基(M1)中包含真核细胞的第一罐(130)连接，控制逻辑设置为：
-接收目标细胞密度(114)和目标时间(112)，目标细胞密度代表目标时间处真核细胞的所需细胞密度，目标时间代表未来时间点；
对于多个时间间隔的每一者：
·接收第一罐的培养基中真核细胞的所测量的细胞密度(122)；
·将目标时间处的预测细胞密度作为至少实测细胞密度的函数计算；
·比较预测的细胞密度和目标细胞密度；
·如果预测的细胞密度偏离目标细胞密度，则通过控制逻辑，按如下方式调节第一罐中培养基的温度
-如果预测的细胞密度低于目标细胞密度，那么升高温度0.1℃至1℃；或
-如果预测的细胞密度高于目标细胞密度，那么降低温度0.1℃至1℃。
CN201780073779.1A 2016-12-21 2017-12-20 真核细胞的生长控制 Active CN110023482B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16205982 2016-12-21
EP16205982.8 2016-12-21
PCT/EP2017/083886 WO2018115161A1 (en) 2016-12-21 2017-12-20 Growth control of eukaryotic cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110023482A true CN110023482A (zh) 2019-07-16
CN110023482B CN110023482B (zh) 2023-05-02

Family

ID=57758446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780073779.1A Active CN110023482B (zh) 2016-12-21 2017-12-20 真核细胞的生长控制

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20200063086A1 (zh)
EP (1) EP3559203B1 (zh)
JP (2) JP7408389B2 (zh)
CN (1) CN110023482B (zh)
ES (1) ES2848701T3 (zh)
HR (1) HRP20210163T1 (zh)
PL (1) PL3559203T3 (zh)
SI (1) SI3559203T1 (zh)
WO (1) WO2018115161A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11568955B2 (en) 2018-08-21 2023-01-31 Lonza Ltd Process for creating reference data for predicting concentrations of quality attributes
US10775395B2 (en) * 2018-10-18 2020-09-15 Arctoris Limited System and method of performing a biological experiment with adaptive cybernetic control of procedural conditions
EP3699261A1 (en) * 2019-02-20 2020-08-26 Sartorius Stedim Biotech GmbH Bioprocess device assembly and inoculation method
JP7210355B2 (ja) * 2019-03-27 2023-01-23 株式会社エビデント 細胞観察システム、コロニー生成位置推定方法、推論モデル生成方法、およびプログラム
JP2020162549A (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 味の素株式会社 制御装置、制御方法およびプログラムならびに有機化合物の製造方法
EP4048772A1 (en) * 2019-10-25 2022-08-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Systems and methods for auto-inoculation in seed train and production processes

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1110316A (zh) * 1993-12-28 1995-10-18 味之素株式会社 好氧微生物培养物的培养方法和装置
JPH0975077A (ja) * 1995-09-19 1997-03-25 Suntory Ltd 動物細胞の新規培養方法
CN101443444A (zh) * 2004-12-29 2009-05-27 比奥根艾迪克Ma公司 生物反应器过程控制系统及方法
CN102482633A (zh) * 2009-07-06 2012-05-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 真核细胞的培养方法
CN102549142A (zh) * 2009-07-31 2012-07-04 巴克斯特保健股份有限公司 在连续细胞培养中产生所关心多肽或病毒的方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0644863B2 (ja) * 1987-01-29 1994-06-15 理化学研究所 細胞の高密度連続培養の立ち上げ方法
US8026096B1 (en) * 1998-10-08 2011-09-27 Protein Sciences Corporation In vivo active erythropoietin produced in insect cells
JP4378909B2 (ja) 2002-02-20 2009-12-09 株式会社日立プラントテクノロジー 生体細胞の培養制御方法及び培養装置の制御装置並びに培養装置
WO2008118500A1 (en) * 2007-03-27 2008-10-02 Wafergen, Inc. Nutrient perfusion plate with heater & gas exchange for high content screening
US9540701B2 (en) * 2014-02-28 2017-01-10 Asl Analytical, Inc. Apparatus and method for automated process monitoring and control with near infrared spectroscopy
WO2015165583A1 (en) * 2014-04-28 2015-11-05 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Fermentation systems

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1110316A (zh) * 1993-12-28 1995-10-18 味之素株式会社 好氧微生物培养物的培养方法和装置
JPH0975077A (ja) * 1995-09-19 1997-03-25 Suntory Ltd 動物細胞の新規培養方法
CN101443444A (zh) * 2004-12-29 2009-05-27 比奥根艾迪克Ma公司 生物反应器过程控制系统及方法
CN102482633A (zh) * 2009-07-06 2012-05-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 真核细胞的培养方法
CN102549142A (zh) * 2009-07-31 2012-07-04 巴克斯特保健股份有限公司 在连续细胞培养中产生所关心多肽或病毒的方法

Also Published As

Publication number Publication date
ES2848701T3 (es) 2021-08-11
JP7408389B2 (ja) 2024-01-05
HRP20210163T1 (hr) 2021-03-19
SI3559203T1 (sl) 2021-03-31
EP3559203B1 (en) 2020-12-02
PL3559203T3 (pl) 2021-05-31
WO2018115161A1 (en) 2018-06-28
JP2022177117A (ja) 2022-11-30
US20200063086A1 (en) 2020-02-27
EP3559203A1 (en) 2019-10-30
CN110023482B (zh) 2023-05-02
JP2020504601A (ja) 2020-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110023482A (zh) 真核细胞的生长控制
US20090117647A1 (en) Method for on-line optimization of a fed-batch fermentation unit to maximize the product yield
US20090048816A1 (en) Method for on-line prediction of future performance of a fermentation unit
US20210379552A1 (en) Systems methods and computational devices for automated control of industrial production processes
Dhir et al. Dynamic optimization of hybridoma growth in a fed‐batch bioreactor
Gnoth et al. Control of cultivation processes for recombinant protein production: a review
Dewasme et al. Experimental validation of an Extended Kalman Filter estimating acetate concentration in E. coli cultures
Gomes et al. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development
CN115427898A (zh) 生物过程的监测、模拟、以及控制
CN111615674B (zh) 缩放工具
US11603517B2 (en) Method for monitoring a biotechnological process
CN117940552A (zh) 生物过程的监测、模拟、以及控制
Abadli et al. An experimental assessment of robust control and estimation of acetate concentration in escherichia coli BL21 (DE3) fed-batch cultures
Dowd et al. Predictive modeling and loose-loop control for perfusion bioreactors
EP4289927A1 (en) Control of perfusion flow bioprocesses
Jenzsch et al. Optimization and control of industrial microbial cultivation processes
Georgieva et al. Mathematical modelling and variable structure control systems for fed-batch fermentation of Escherichia coli
Lane et al. Selection of Microbial Mutants Tolerant To Extreme Environmental Stress Using Continuous Culture− Control Design
US20240067918A1 (en) Apparatus for determining cell culturing condition using artificial intelligence and operation method thereof
Butkus et al. Investigation of Gain Scheduling Algorithm for Controller Adaptation in Microbial Cultivation Process Control Systems
Yu et al. Soft Sensing of Intracellular States in Bioprocessing with Ensemble Kalman Filters
Lyubenova et al. A comparison of three approaches for control of fed-batch process for antibiotic production by Streptomyces strains
Kowshika et al. Neural Network Based Estimation and Modelling of a Fusion Bioreactor
Rashid et al. Advanced manufacturing of biopharmaceuticals
Fu et al. Methods and strategies available for the process control and optimization of monoclonal antibody production

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40010519

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant