CN1110316A - 好氧微生物培养物的培养方法和装置 - Google Patents

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Abstract

培养好氧微生物的方法，包括用单一检测工具直 接并同时检测发酵罐中的培养液内的微生物细胞浓 度、碳源浓度、铵离子浓度及所需产物浓度，以了解所 说发酵罐中微生物的生长状态，并根据所测得的数值 自动控制温度、碳源浓度和铵离子浓度，从而使微生 物的好氧培养物发酵中微生物的生长一直被控制在 适当状态。

Description

本发明涉及控制好氧微生物培养物中的温度以保持微生物适当生长的方法，自动控制碳源和铵离子浓度以保持适于微生物生长发酵条件的方法，以及适于完成该方法的装置。
下文所述的是生物化学工业中的典型培养步骤。将原料供入种子发酵罐中并煮沸灭菌，然后接种先已在培养瓶中培养的无菌微生物细胞并使之生长。种子培养一经开始即制备主发酵的培养物。使接种的微生物细胞生长一定时间，当根据微生物细胞的数目明确地判定微生物细胞是处在对数生长期时即将其送入主发酵装置。
主发酵期间的发酵过程由两个阶段组成。前阶段主要是增加微生物细胞数目，第二阶段主要是产生所需产物。控制发酵过程的主要方面是调整培养基，再就是调整碳源供给速度、温度、pH、通气量等（Principles of Fermentation Technology：P.F.Stanbury，A.Whitaker;Pergamon Press）。一定时间后，终止发酵并对所需产物进行分离和纯化处理。
作为控制培养液中碳源浓度的方法，根据呼吸活性的改变或氨消耗速度的改变来估计培养液中碳源浓度的控制方法是已知的。
然而，在不能直接检测微生物细胞的浓度和碳源消耗速率的情况下，由于微生物代谢活性的偶然改变而难以将碳源的浓度控制到一定的值。
已知有可能根据培养液的浊度估计微生物细胞的浓度，然后控制培养液的温度以控制微生物细胞的生长。
然而，当基于培养液的浊度估计微生物细胞的浓度时，因有时每批原料不同而且因混合物内存在杂质而不可能正确估计培养液中的微生物浓度。
因此，在整个培养期间很难自动地和最佳地控制发酵液的温度。
控制发酵的现存方法中，必须取样检测发酵罐培养液中微生物细胞的浓度、碳源浓度、铵离子浓度及所需产物的浓度等。
因取样后进行这些分析最多要花费约1小时，所以难于定时和正确地把握发酵罐中微生物细胞的生长状态。
本发明的目的是发展一种利用联机系统检测发酵罐中微生物细胞的浓度、碳源浓度、铵离子浓度和所需产物浓度以正确掌握发酵罐中微生物细胞的生长状态，适当地基于所检测的数值，和在分批通气培养物的整个培养期间自动控制培养液中的碳源浓度和铵离子浓度，以保持微生物细胞生长的方法和装置。
为达到所说的目的，本发明涉及通气培养微生物的方法及其装置，其特征在于用单一检测工具直接和同时检测发酵罐中的发酵液内的微生物细胞浓度、碳源浓度、铵离子浓度及所需产物浓度以了解所说发酵罐中的发酵液内微生物的生长状态，并基于所测得的数值自动控制所说发酵液中的温度、碳源浓度和铵离子浓度。
在完成本发明方法的装置中，通过联机系统上的取样装置将培养液从发酵罐送到近红外光谱仪，并进行分析。有可能用近红外光谱仪自动检测碳源浓度、微生物细胞浓度、所需产物浓度及铵离子浓度。近红外光谱仪与个人电脑相联，并且所测得的每个数值都可输入电脑。
然后，基于单个检测值或多个检测值正确掌握发酵罐中微生物细胞的生长状态。基于微生物的生长状态，改变培养液的温度，并将微生物细胞的生长状态控制在适于增加所需产物之产率的范围内。基于发酵液中碳源的浓度设定向发酵罐内供入原料的给料速度，并基于设定值控制给料速度的控制装置。通过接到个人电脑上的信号转化器，将各设定值送到与发酵罐相接的相应控制装置。
以下描述本发明控制培养条件的方法。
培养微生物的培养方法总述如下：
将用作种子的微生物细胞加到起始培养基中。然后微生物细胞的生长速度逐渐增加并达到最大速度（对数生长期）。生长停止并保持在所谓静止状态（静止期）。进而，达到一个活微生物细胞数目降低的阶段（死亡期）。当消耗了一定量的碳源时，即连续或间断地供入培养基（进料培养期）。
此时，工艺控制的必要方面是调整培养基以及调整温度、加入碳源的速度、pH及通气流量等（Biseibutsu Kogaku no Oyo：Shichiji Saburo;Kyoritsu Shuppan Kabushiki Kaisha）。
现有培养装置中，如图4所示的各控制装置均基于各个测知的数值分别工作。
在用于本发明的培养装置中，则使用连有如图1所示的联机取样装置的近红外光谱仪，通过联机系统分析发酵液。该培养装置配有碳源进料速度控制装置、供氧通气流速控制装置、压力控制装置、带有检测发酵液的pH电极的pH控制装置和带有检测发酵液温度的温度计的温度控制装置。各控制装置均接受个人电脑的指令。各控制装置的作用是基于近红外光谱仪的分析数值由个人电脑决定的。
在图1所示装置中开始培养。按照先已输入个人电脑的程序经过一定时间后，定时从培养罐中取样，并用近红外光谱仪进行成份分析，其中设定取样周期的时间间隔时没有考虑微生物细胞的代谢状态或生长状态。
在进料之前，当了解到主发酵罐的培养物溶液中碳源浓度降低到预先根据近红外光谱仪分析结果而设定的控制性靶值时，开始流加培养期的第一次进料。
此时的进料设定值是基于微生物细胞消耗碳源的速度和进料开始时发酵液中的碳源浓度，由个电脑自动计算的。
进料设定值的计算法如下所述。
根据在前次取样和本次取样时对碳源浓度所作分析的结果，以及前次取样后所加供料溶液中碳源的量，计算出发酵液中碳源的消耗速率。另外，根据残留糖浓度的实际值和设定值（其在SV下引入）间的量差关系计算出供料溶液的进料速率。
控制方法的实例如下所述。
1）在（分析结果）＞（SV）+0.2（g/dl）的情况下，进料速率＝0.8×（发酵液中碳源的消耗速率）
2）在（SV）+0.2（g/dl）≥（分析结果）＞（SV）+0.1（g/dl）的情况下，（加入速率）＝0.9×（发酵液中碳源消耗的速率）
3）在（分析结果）＝（SV）的情况下，（进料速率）＝（发酵液中碳源的消耗速率）
4）在（SV）-0.1（g/dl）＞（分析结果）≥（SV）-0.2（g/dl）的情况下，（进料速率）＝1.1×（发酵液中碳源的消耗速率）
5）在（SV）-0.2（g/dl）＞（分析结果）的情况下，（进料速率）＝1.2×（发酵液中碳源的消耗速率）
然而，当所需产物产生的速率高并且微生物细胞的生长是在常规范围内时（即微生物细胞的代谢活性高时），则在高浓度碳源时进行培养以加速碳源的消耗速率，从而缩短培养周期并增加产率。
根据对微生物细胞生长状态的估计确定培养物溶液的温度。而微生物细胞的生长速率则是将对微生物细胞浓度的分析结果，与先前基于达到高产率时发酵过程中细胞的最佳浓度所确定的细胞浓度范围相比较而估测的。
当微生物细胞生长并且微生物细胞的浓度达到一定水平时，第一次自动改变温度。温度改变的范围是根据对微生物生长速度的估计而确定的。
另外，当微生物细胞的浓度达到预先定好的水平时进行第二次改变。此温度改变的范围同第一次改变一样也是根据对微生物生长速度的估计而确定的。
在整个发酵期间，有可能通过重复上述操作，并预先确定控制与微生物细胞浓度范围相应的最适温度的设定值，来自动控制发酵温度。
在需要氮源作为原料的培养物中，有可能按照本发明用近红外光谱仪直接检测铵离子浓度，自动计算出控制原料进料速率的靶值。
通常使控制发酵液中pH、发酵罐中通气流速和压力的靶值保持一定水平。
根据本发明的方法和装置，可直接检测培养液中碳源的浓度，并设定控制给料速率的靶值。因此，既使在培养期间微生物细胞的代谢活性有大的变化，也可不间断地自动控制培养液中的碳源浓度。
因为可以直接检测培养液中微生物细胞的浓度和所需产物的生长速率，所以尽管原料批量间有所不同或混有杂质，仍有可能直接了解到培养液中微生物细胞的生长状态。另外，通过自动改变培养液的温度，有可能在整个培养期间适当地维持微生物细胞的生长状态。再者，由于可直接了解培养液中微生物细胞的生长状态，故可适当地维持培养条件。这些都是与生产能力的增加相联系的。因为有可能直接检测铵离子浓度，所以也可以自动计算出控制原料给料速率的靶值。
下面借助实施例进一步举例描述本发明。
所使用的近红外光谱仪是由BRAN+LUBBE公司生产的INFRA ANALYZER 600。碳源、谷氨酸、微生物细胞和铵离子浓度的校正曲线如下所述。较正曲线上所示的符号F[nnnn]是指在波长nnnn（nm）处的吸光率。
（碳源浓度）＝32.36+0.900×（295.2×F（2270）-1019.0×F[2180]-163.7×F[1982]+848.3×F[2100]）
（谷氨酸的浓度）＝-4.064+1.079×（-383.2×F[2190]+1233.0×F[2139]+122.9×F[1982]-998.5×F[2100]）
（微生物细胞浓度）＝-1.570+0.321×（-100.1×F[2348]+71.18×F[2208]+53.83×F[1445]）
（铵离子的浓度）＝-2.817+0.856×（-846.5×F[1818]+878.6×F[1778]-15.8×F[2100]）
实施例1
（发酵生产谷氨酸）
用表1所示的培养基接种乳酸发酵短杆菌（brevibacteriumlactofermentum）ATCC 13969，并于31.5℃预培养17小时。
表1
培养基的成分
成份  浓度
葡萄糖  3.0g/dl
KH2PO40.1g/dl
MgSO4·7H2O 0.04g/dl
FeSO4·4H2O 0.001g/dl
肉汁  1.0g/dl
尿素  1.4g/dl
MnSO4·7H2O 0.001mg/dl
大豆蛋白水解液(T-N.4g/dl)  0.098mg/dl
维生素Bl-HCl  200γ/e
生物素  300γ/e
Af(AZ-20R)  0.0005mg/dl
按上述方法预培养后，在5Kl容量的主发酵罐中连续制得培养物。
培养基如表2所述。其他培养条件列于表3中。
表2
培养基的成分
成分  浓度
碳源(转化成蔗糖)  8.0g/dl
KH2PO40.2g/dl
MgSO4·7H2O 0.1g/dl
FeSO4·4H2O 2.0g/dl
盐酸硫胺素  200μg/e
大豆蛋白水解液(T-N.4g/dl)  2.5ml
注：使用甘蔗废糖蜜和淀粉糖化溶液（1：1）作为碳源。
表3
培养条件
配料溶液的量  1.5ke
培养温度  31.5℃
搅拌转数  145rpm
pH  7.8
培养时间  37hours
在主培养开始的同时，通过联机取样装置将培养液从发酵罐送到近红外光谱仪并进行分析。
每隔10分钟取样。
由个人电脑掌握微生物细胞的生长状态和碳源的浓度，计算出向发酵罐内给进原料的速度和发酵温度的各设定值。通过个人电脑的信号转化器将各计算的设定值送到各相应的控制装置。
控制碳源浓度的方法如下所述。
在起始培养基中所含碳源的浓度降到2g/dl以下之后，供入作为碳源的供养溶液。预先在个人电脑中准备好设计程序，通过控制进料速率按该程序将残糖浓度维持在一定水平。
发酵启动后，碳源的浓度即开始降低。约10小时后，根据用近红外光谱仪分析的结果，残糖浓度降至2g/dl以下。用个人电脑计算出进料速率。
计算方法如下文所述。
基于前次取样和本次取样时对碳源浓度所作分析的结果，以及前次取样后加入的供料溶液中碳源的量，计算出发酵液中碳源的消耗速率。另外，根据残糖浓度的实际值与设定值（该值在SV下引入）之间的大小关系计算出供料溶液的进料速率。
控制方法如下所述。
1）在（分析结果）＞（SV）+0.1（g/dl）的情况下，（进料速率）＝0.8×（发酵罐中碳源的消耗速率）
2）在（SV）+0.1（g/dl）≥（分析结果）＞（SV）+0.05（g/dl）的情况下，（进料速率）＝0.9×（发酵罐中碳源的消耗速率）
3）在（SV）+0.05（g/dl）≥（分析结果）＞（SV）的情况下，（进料速率）＝0.95×（发酵罐中碳源的消耗速率）
4）在（分析结果）＝（SV）的情况下，（进料速率）＝（发酵罐中碳源的消耗速率）
5）在（SV）＞（分析结果）≥（SV）-0.05（g/dl）的情况下，（进料速率）＝1.05×（发酵罐中碳源的消耗速率）
6）在（SV）-0.05（g/dl）＞（分析结果）≥（SV）-0.1（g/dl）的情况下，（进料速率）＝1.1×（发酵罐中碳源的消耗速率）
7）在（SV）-0.1（g/dl）＞（分析结果）的情况下，（进料速率）＝1.2×（发酵罐中碳源的消耗速率）
计算的具体实例如下所述。
在本次SV＝2（g/dl），分析结果＝1.92（g/dl）的情况下，碳源的消耗速率＝20（Kg/小时），该实例相当于上面（6）中所述条件，且进料速率变为22（Kg/小时）。
此后，每次取样期间重复计算进料速率的设定值。作为在上述条件下控制残糖浓度的结果，可使残糖浓度稳定地保持在2±0.2g/dl。
按下述方法确定控制培养液温度的设定值。在培养开始时即将温度恒定地保持在31.5℃。
当微生物细胞进行生长并且微生物细胞浓度达到5.6g/l时，第一次自动改变温度。当微生物的生长在普通范围时，将温度改变为35.0℃。另外，当微生物细胞浓度达到8.0g/l时，第二次自动改变温度。当微生物的生长处在普通范围内，将温度改变为39.0℃。
培养启动后，自动加入聚乙烯山梨糖醇酐-棕榈酸酯（0.18g/dl）以阻止微生物生长，并在微生物细胞浓度达到5.6g/dl时产生谷氨酸。
在整个培养期间，有可能通过按上述方法控制残糖及温度来自动控制培养条件。所积聚的谷氨酸的浓度为2.5g/dl，且产率为56.5%。
实施例2
（发酵生产谷氨酸）
用表1中所示的培养基接种乳酸发酵短杆菌ATCC  13969，并于31.5℃预培养17小时。按上述方法预培养后，在容量为5Kl主发酵罐中连续制得培养物。该培养基如表2中所示，并且是与实施例1中所述者相同的。所使用的其他培养条件如表3所示，并且是与实施例1中所述者相同的。就所用装置和取样周期而言，在如实施例1中所述的同样条件下进行培养。
在控制碳源浓度的方法中，当起始培养基中所含碳源的浓度降低到2g/dl以下时，加入作为碳源的供料溶液。使用预先在个人电脑上设定的程序，通过控制进料速度使残糖浓度保持在一定的水平。培养启动后，碳源的浓度开始下降。约8小时10分钟后，根据由近红外光谱仪提供的分析结果，残糖浓度降至2g/dl以下。由个人电脑计算出进料速度。
计算方法如下。
基于前次取样和本次取样时碳源浓度的分析结果，以及在前次取样后所加入供料溶液中碳源的量，计算发酵液中碳源的消耗速率。另外，根据残糖浓度的实际值和设定值（其在SV下引入）之间的大小关系计算供料溶液的进料速率。
计算方法同实施例1中所述。
然而，鉴于谷氨酸的生产速率比普通发酵快（即在培养开始后的13小时之间之内），故可理解到微生物的代谢活性高，而在依次发酵中微生物的生长则处于普通范围内。
然后将该碳源的浓度设定在较高水平，即从2g/dl到3g/dl，以加速碳源的消耗并开始培养以缩短培养周期和增加生产能力。由于在上述条件下控制残糖的浓度的结果，故可使残糖的浓度保持在设定值±0.2g/dl水平。
按下述方法确定控制培养液温度的设定值。当开始培养时，将温度恒定在31.5℃。当微生物生长并且在开始培养后的8小时内微生物细胞的浓度达到5.6g/l时，第一次自动改变温度。如微生物的生长稍快于原来的生长速度，则将温度改变为36℃以限制微生物的生长。另外，当微生物细胞的浓度达到8.0g/l时，第二次自动改变温度。如微生物的生长速率处在原来范围内，则将温度改变为39.0℃。
培养开始后，微生物细胞的浓度达到5.6g/dl时自动加入聚乙烯山梨糖醇酐-棕榈酸酯（0.18g/dl），以限制微生物的生长并产生谷氨酸。
在整个培养期间，有可能按上述方法控制残糖浓度及温度，以自动控制培养条件。培养30小时后，所积聚的谷氨酸浓度为12.3g/dl，且产率为55.5%。
比较实施例
（发酵生产谷氨酸）
在如前述实施例中所涉及的培养基和菌株的同样条件下进行比较实验。
确定与控制培养条件相关的控制给料速率、pH和温度的设定值，并在对样品进行手工分析后进行设定和人为决定。将取样和分析周期定为1小时。
基于样品的分析结果并用Lehmann-Shuer氏分析仪确定残糖的浓度。在控制残糖的浓度的方法中，在当起始培养基中所含有的碳源浓度降低到2g/dl以下之后加入作为碳源的供料溶液。由人来确定进料速率。由于控制的结果，在进行控制后残余糖的浓度基本上被控制在2±1.0g/dl范围内。
在开始培养后，培养过程中的pH被不变地控制在7.8。
按下述方法确定控制培养液温度的设定值。当培养开始时温度保持在31.5℃。取样时测定26倍稀释的溶液的浊度。当浊度的改变达到0.45时，将第一次温度改变定在35℃。2小时后，第二次改变温度并定为39℃。
开始培养后，当26倍稀释的溶液的浊度变为0.45时，加入聚乙烯山梨糖醇酐-棕榈酸酯（0.18g/dl），以阻止该微生物的生长并产生谷氨酸。结果，所说培养物中积聚的谷氨酸的浓度为11.4g/dl，且产率为51.5%。按照所说实施例下的产率降低了5%。
另外，在发酵生产L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-谷氨酸等氨基酸，以及发酵生产次黄苷、肌苷酸、鸟苷、鸟苷酸等核酸过程中，可见到相似的产率增加效果。
根据本发明，有可能正确把握发酵罐中微生物的生长状态。并且有可能自动控制残糖的浓度和温度，而与以前方法相比产率增加约5%。
图1表示用于实施例1和2的装置。
图2表示实施例1所述发酵罐中各种状态的分析结果。
图3表示实施例2所述发酵罐中各状态的分析结果。
图4代表用于比较实施例的装置。
图5代表比较实施例所述发酵罐中各状态的分析结果。
图1
①压力设定值
②给料流量设定值
③给料流量控制装置
④供料溶液
⑤通气流量设定值
⑥通气控制装置
⑦压力控制装置
⑧排气
⑨流量计
⑩空气
（11）pH设定值
（12）pH控制装置
（13）pH传感器
（14）温度传感器
（15）温度控制装置
（16）温度设定值
（17）个人电脑
（18）冷却水
（19）NIR光谱仪
（20）联机取样装置
图2
①培养时间（hour）
②[o]微生物细胞的浓度（g/l）
③[△]碳源的浓度（g/dl）
④[□]谷氨酸的浓度（g/dl）
图3
①培养时间（hour）
②[o]微生物细胞的浓度（g/l）
③[△]碳源的浓度（g/dl）
④[□]谷氨酸的浓度（g/dl）
图4
①给料流量控制装置
②给料溶液
③通气控制装置
④压力控制装置
⑤排气
⑥流量计
⑦空气
⑧pH控制装置
⑨pH传感器
⑩温度传感器
（11）温度控制装置
（12）冷却水
图5
①培养时间（hour）
②[△]碳源浓度（g/dl）
③[□]谷氨酸的浓度（g/dl）

Claims (5)

1、培养好氧微生物的方法，该方法包括用单一检测工具直接和同时检测发酵罐中的发酵液内微生物细胞的浓度、碳源浓度、铵离子浓度和所需产物浓度，以掌握所说发酵罐中的发酵液内微生物的生长状态，并基于所测得的数值自动控制所说发酵液中的温度、碳源浓度和铵离子浓度。
2、根据权利要求1的培养好氧微生物的方法，其中单一检测工具是近红外光谱仪。
3、根据权利要求1或2的培养好氧微生物的方法，其中发酵液是氨基酸的发酵液。
4、根据要求1或2的培养好氧微生物的方法，其中发酵液是核酸的发酵液。
5、培养好氧微生物的装置，其包括发酵罐、与之相联的原料供料速率控制装置、温度控制装置和取样装置，还有与取样装置相联的近红外光谱仪、以及与近红外光谱仪相联，并指令各控制装置以保持发酵过程一直适合于微生物生长的个人电脑。
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