CN100342021C - 发酵工艺的最优化 - Google Patents

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Abstract

一种对涉及复合营养素混合物的生物工艺的性能进行最优化的方法，其中周期地、交替地停止每种营养素的供应直到微生物的代谢活动减少一个预定的百分数，随后借助于一个最优化程序计算和调节复合营养素的新的进料浓度。

Description

发酵工艺的最优化
本发明涉及一种对涉及复合营养素混合物的生物工艺进行最优化的方法。
在发酵工艺中，即，在利用微生物将物质转化的工艺(在下文中简称为“生物工艺”)中，经常把复合营养素用作微生物的附加营养源。复合营养素是含有微生物生长所必需的或促进微生物生长的两种或两种以上物质的原料。实例特别是天然原料，例如玉米浸渍液粉或玉米浆(一种从玉米中提取淀粉过程中的废物)或酵母提取物，以及各种物质的合成混合物。这些复合营养素的一个特殊的优点是宽泛的各种物质，例如氨基酸、蛋白质、维生素、无机盐或微量元素，它们是微生物可以利用的。对于获得与使用基本化学确定成分培养基相比而言高的生长速率来说，这是一个优点。
然而在生物工艺中使用复合天然营养素也有各种问题。由于这些物质通常是天然的，因生产商和批号的不同，复合营养素的质量变化很大。同样，对于微生物的实际需要而言，复合营养素的天然组成未必是最佳的。一些成分以太小的量存在，因而具有限制效应，而其他成分过量存在而且或者被浪费或者是抑制性的。此外，复合营养素中的许多不同成分的总体代谢非常复杂而且是部分未知的。各种重叠的调节工艺可能引起工艺的剧烈波动，导致生物工艺的不规则的生产能力和产率。特别是在多步生产工艺中，这可能是一个严重问题，因为后续工艺步骤可能受到影响。此外，非最佳的操作条件增加了成本。关于几种关键物质的培养基的只此一次的最优化不能视为是充分的，因为复合营养素的性质是可变的而且系统本身也是可变的，这由代谢微生物表现出来。
一种已知的最优化手段涉及例如完全因子实验设计，其中在一种统计方法中，在合适的条件下研究了独立变量的所有可能组合。因此需要一个系统模型。尽管在研究中的许多物质和浓度的情形中快速达到了最优化，但是当变量和条件的数量更大时，这些方法是行不通的，因为需要极大数量的实验。一种更有效的最优化策略是通过“反应表面”方法设计试验供其中的一些因素使用，例如，Plackett-Burmann方法(Greasham和Inamine，见：Demain和Solomon(编辑)，Manual forindustrial microbiology and biotechnology，Washington：ASM1986，41-48页)或Box-Behnken方法(Greasham和Herber见：Rhodes和Stanbury(编辑)，Applied microbial physiology-apractical approach.Oxford：Oxford University Press 1997，53-74页)。在这些方法中，变量的数量被减少到例如对生长或产物形成有显著影响的那些因素。
与统计方法不同，遗传算法(genetic algorithms)是不基于模型的最优化方法。就其应用而言，这意味着它们通常不需基于关于微生物代谢的理论探讨。这些方法可按收敛的方式优化大量的培养基组分。从一些平行摇瓶实验中选出最佳的，从它们得到的培养基成为下一批实验的起点。重复该程序，直到达到收敛。在第一批中，培养基随机变化[Weuster-Botz等，Biotechnol.Prog.13：387-393(1997)]。Weuster-Botz等，Appl.Microbiol.Biotechnol.46：209-219(1996)通过使用遗传算法在180个摇瓶实验中优化了八种微量元素，由此，与标准培养基相比，L-异亮氨酸浓度提高了50％。Weuster-Botz等(1996)在L-赖氨酸工艺中使用相同的方法以在472个标准化摇瓶实验中优化13种培养基组分。结果，L-赖氨酸浓度提高了20％以上。与统计公式(包括具有常规完全二阶多项式模型的“反应表面”方法)相比，实验数量明显减少-472个，而不是213＝8192个；这些参数的所有可能组合原本应该包括10113个实验。然而，在借助于间歇式摇瓶实验的培养基最优化方法中存在严重缺陷。经常不能保持pH恒定。由于表面气体进入情况，氧进料很差；而且，因为起子培养物的变化，重复性未必总是可能的。
恒化培养中的脉冲方法[Kuhn等，Eur.J.Appl.Microbiol.6：341-349(1979)；Goldberg和Er-el，Proc.Biochem.16：2-81(1981)；Fiechter，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.30：7-60(1984)；Reiling等，J.Biotechnol.2：191-206(1985)]采用脉冲注射技术获得营养素上的生长反应。这是一种鉴定必须营养素的手段，必须营养素的得率常数随后可在一些恒化实验中测定，在所述那些实验中的每一个实验中有一种必须营养素是限制因素。然后，可利用所述得率常数获得最优化的平衡培养基。然而，由于必须首先鉴定必须营养素，所以实验工作量很大。
已知的最优化方法不令人满意。因此，本发明的目的是提供一种用于使用复合营养素的生物工艺的最优化性能的方法，其中使该工艺过程中培养基中复合营养素的比例恒定地再适应微生物的实际需要和原料的实际质量。
按照本发明发现了，如果周期地、交替地停止每种营养素的供应直到微生物的代谢活动减少一个预定的百分数，就可以最优化使用复合营养素的生物工艺。每一情况下花费的时间被用作一个响应信号，由此借助于一个最优化程序计算和调节复合营养素的新的进料浓度。这些负脉冲之间的等待时间应该在1/4个和1个流体停留时间之间，这取决于过程的动力学。然而，在某些情况下，等候时间可以为零或者甚至长于5个流体停留时间。所述流体停留时间是流速(升/小时)与反应体积(升)的比率。
在理想混合搅拌釜(例如所用的生物反应器)的连续操作中，从理论上讲，反应器中的完全体积交换是永远达不到的。然而，作为化学反应工艺中的一种近似，连续搅拌釜反应器在3个流体停留时间后被视为准稳态的，因为那时计算出已有95％的体积被交换。然而，在生物生产工艺中，该时间至少是5个流体停留时间，因为体积交换过程中微生物对变化了的环境作出反应，从而延迟了准稳态的达到。在本发明的最优化程序中，不需在每个负脉冲之后等待一个准稳态，所以，这是一个相对于常规脉冲—响应方法的优点。
与基于正脉冲响应的方法(其中，微生物的生长速率因营养素脉冲而暂时提高)相比，本发明的方法还有一个优点，即，测定的响应时间不被微生物的滞后期畸变。滞后期是微生物适应变化了的环境条件而花费的时间。它的特征在于，微生物的生长在初始时几乎保持不变。在正的营养素脉冲中，对脉冲营养素的可测的反应被以通常不可重复的方式延迟了，于是使响应时间畸变。
代谢活动可借助于可探测到的工艺参数(例如氧传递速率或二氧化碳传递速率)进行测定。此处的“二氧化碳传递速率”表示每单位时间从液相(发酵液)转移到气相(废气)的二氧化碳的量。它可直接通过废气分析来测定。既然没有被废气分析检测到的和以溶解的形式离开反应器的二氧化碳的量通常是可忽略的，就可将二氧化碳形成速率与出于本发明目的而测定的二氧化碳传递速率等同起来。为进行工艺控制而使用的其它参数例如是pH、溶解氧浓度和温度。借助于所述工艺参数的变化而测定的代谢活动的降低百分数应选定在一个较小的值(例如1-5％)，从而不会使该工艺趋向于主要基质(例如实施例中的山梨糖醇)不能被完全转化的条件。
在本发明最优化方法的工业实施中，优选的是，复合营养素的进料浓度的比率和复合营养素的总量被视为分离的控制变量，但被同时调节。
根据本发明，所述比例和总量可通过优选以多元控制器(multi-component controller)为中心的一个最优化程序来同时调节。该多元控制器可以例如基于模糊逻辑[compare Zadeh，Inf.Control 8：338-353(1965)]。所述最优化程序优选包括下列三个级别：
1.用于产生控制变量的协调控制器；
2.多元控制器(例如模糊逻辑控制器)；和
3.复合营养素的进料浓度的控制。
“最优化程序”表示一些元件的排布，它们可协同地按希望的方式用于控制该工艺。本发明的最优化程序可以例如涉及一个协调控制器，所述协调控制器采用负脉冲响应技术，产生响应时间并利用它们形成输入变量Qsens。在所有情况下，对一种营养素测定脉冲响应时间，而其它的则停止。将倒数Q’sens用作被停止的营养素的输入变量。协调控制器还计算相对于设定值的输入变量，用于调节总量ΨGM。多元控制器为两种营养素中的每一种运行一次(CN1，F，I和CN2，F，I＝复合营养素的进料浓度；该表达方式中，下标N1和N2代表各种复合营养素，F代表进料浓度，I是最优化程序中的顺序下标。)然后，通过控制器输出重新计算复合营养素各自的进料浓度。
用于优化各定量比例的控制变量：
对每种复合营养素完成负脉冲，而其它则被停止。在该情形中，控制变量是CO2形成速率(作为传递速率测定)。
例如，在一种复合营养素的供应已经停止之后，在二氧化碳形成速率降低3％之前测定该时间。然后，最优化算法计算两种复合营养素的新的进料浓度。在一固定的等待时间(该实施例中，5h相当于停留时间的一半)之后，对其它复合营养素完成负脉冲。既然该方法是一种收敛方法，就不必在每个负脉冲之后达到稳态。
因此，用于最优化各定量比例的相关控制变量：
Q sens = Δt i Δ t i - 1 - - - ( 1 )
是这样获得的：用实际脉冲响应时间Δti除以前一循环中的脉冲响应时间Δti-1(用各自其它复合营养素测定的)。在被停止的营养素的情形中，使用Qsens的倒数
Q , sens = Δ t i - 1 Δ t i - - - ( 2 )
因而可应用相同的模糊逻辑控制器，从而明显地减少调谐该控制器的工作量。由于搅拌釜反应器的流体特性，响应时间、因而(1)和(2)中的分母不能变为零。
用于总量的控制变量
用于总量的控制变量是参数xGM的值，该参数是工艺过程中可探测到的并且例如与生物量或与产物的收率(例如氧消耗速率或二氧化碳的有效(virtual)浓度)相关。为输入模糊逻辑控制器，将控制变量在设定点标准化，得到如下的通用输入变量：
Figure C0113777800083
延伸到两种以上的复合营养素：
当有两种复合营养素要最优化时，结果是分为两个不同步骤的循环。然而，原则上该循环可延伸到任何数量的步骤，即，复合营养素。在n种复合营养素的广义情形中，我们可以写出：
Q sens , i = ( n - 1 ) Δ t i Σ q = i - n i - 1 Δ t q - - - ( 4 ) .
这不改变用于控制总量的参数ΨGM。由于该长时间常数，优化三或四种以上的营养素不是一个切实可行的提议。
控制进料浓度：
与多元控制器的输出xa相对应，复合营养素的进料浓度按如下进行控制：
         ck，F，i+1＝xd·ck，F，i，k＝N1，N2        (5)
                                                        。
对涉及复合营养素的所有发酵工艺(例如利用微生物将D-山梨糖醇转化成L-山梨糖)，本发明的方法都是适用的。所述微生物可以是适用于各自的转化的任何微生物，例如，一种弱氧化葡糖杆菌(Gluconobacter suboxydans)菌株可用于将D-山梨糖醇转化成L-山梨糖，例如弱氧化葡糖杆菌IFO 3291，它于1954年4月5日保藏在日本大阪发酵所，或者它于1992年3月30日，按照布达佩斯条约与弱氧化葡糖杆菌DSM 4025一起作为混合培养物保藏在日本发酵研究所，作为FERM BP-3813。
对于微生物(例如弱氧化葡糖杆菌)的连续培养来说，为了实施所需的最优化方法，所述发酵系统包括：
1.一个为连续操作而装备的生物反应器；
2.一个用于将培养基进料分成各个组份的若干物流的装置，以便工艺过程中可以改变培养基的组成；
3.一个用于测定和控制pH、pO2和温度的装置；
4.一个用于测定和控制生物反应器的填充水平(fillinglevel)而确保有效而连续的操作的装置；
5.一个用于控制进料物流和测定废气组成的装置，以便相应的气体传递速率可以作为测定信号获得；和
6.一个用于控制该生物工艺设置的自动化系统。
所述生物反应器可以例如是标准的，例如实验室生物反应器，带有适宜的附加设备和一个自动化系统，例如在一个自动的，例如实验室系统贮藏瓶和用于苛性苏打溶液的瓶中，生物反应器的控制单元，生物反应器自身以及测量探头和产物容器，用于气体进入的管线以及质量流量控制器和灭菌过滤器和用于废气的CO2和O2分析，过程控制计算机和串行接口，用于数据传输的电线，传输的相应形式是例如RS-232，RS-422或Mettler Local-CAN。
现参照例举性的利用弱氧化葡糖杆菌将D-山梨糖醇转化成L-山梨糖，进一步解释本发明。
实施例：弱氧化葡糖杆菌的连续培养，其中将D-山梨糖醇转化成L-山梨糖。
为进行发酵，采用一种标准实验室生物反应器，它带有图1所示的附加设备和自动化系统部件。
图1：自动化实验室系统；下排显示四个储藏瓶(左侧)和用于苛性苏打溶液的瓶。右面是生物反应器的控制单元，生物反应器自身以及测量探头和产物容器。用于气体进入的管线以及质量流量控制器和灭菌过滤器和用于废气的CO2和O2分析显示在过程控制计算机和串行接口的下面。细线指示用于数据传输的电线，显示传输的相应形式(RS-232、RS-422或Mettler Local-CAN)。
所述过程控制计算机是商用Server-PC。为过程控制计算机选用的设备如下：Server-PC’Dell PowerEdge 2200’；两个Intel PentiumII 300MHz CPU；128MB主存储器，两个图形卡和两个显示器(21”)；两个Control RocketPort 16ISA多端口串行卡，用于共32个串行接口，每个在RS-232和RS-422之间是可换向的。
软件：过程控制计算机的操作系统是Microsoft Windows NT4.0(Service Pack 3)。
自动化基于工业软件BridgeVIEW，Version 1.1，由NationalInstruments生产。
模糊逻辑借助于BridgeVIEW extension DataEngine VI1.5(MITGmbH，Aachen生产)而应用的。
生物反应器：该生物反应器是B.Braun Biotech International生产的标准的Biostat B标准搅拌釜反应器，工作体积为2升。入口空气通过硅挠性管和灭菌过滤器(孔径0.2μm)引入生物反应器。气体引入装置是气化环(gasification ring)，同样在6叶片盘式搅拌器的下面提供和安置。废气首先通过生物反应器上面的冷凝器输送，然后通过挠性硅管和灭菌过滤器(孔径0.2μm)到达废气分析仪。每个生物反应器装配有pH电极和pO2探头(都由Ingold生产)和温度探头(PT100)。在工厂里，生物反应器都装配有一个控制单元，含有用于pH、pO2和温度探头的测定放大器以及用于这些参数的初始需要的标准控制器。控制器和过程控制计算机之间的工艺数据和设定值的传递借助于串行RS-422接口发生。在每次灭菌操作之前校正(在pH＝7.00和pH＝4.01处的两点校正)pH电极。灭菌后校正pO2探头(在培养基中用100％空气饱和度进行单点校正)。
生物反应器的填充水平的控制：借助重量控制生物反应器的填充水平。一个秤(Mettler Toledo SG32001)置于反应器下面并产生数字信号(串行RS-232接口)，这些数字信号在数字/模拟变换器中变换为一个4-20mA信号。将该模拟信号与一个硬件控制器(Eurotherm)的输入连接，它启动生物反应器的排出泵(Gilson Minipuls 3蠕动泵)，采用一个模拟0-10V信号。
储藏溶液：用五种不同的储藏溶液配制培养基，他们各自是独立地添加的。
质量流量测定是根据重量分析。将来自秤的信号借助于串行RS-232接口传输给过程控制计算机。使用的各种秤列于表1。将Mettler Toledo生产的LC-RS转接器(adapter)用于SG和PG型秤。
为防止密度梯度的形成，通过位于秤和瓶之间的磁性搅拌器(由Variomag生产)搅拌D-山梨糖醇储藏瓶。
用蠕动泵(Gilson MiniPuls 3)将培养基通过挠性硅管输送到生物反应器。为与蠕动泵连通，使用一条串行RS-422总线。可以向该总线连接至多十个泵。既然这些泵具有一个所谓的GSIOC接口，在每个RS-422总线上使用一个合适的转接器。
表1：采用的泵[Mettler-Toledo]和最大负荷[ML]
  编号   内容物   秤的类型   ML   准确度
  1   D-山梨糖醇   KCC 150s，带ID 5   150kg   1g
  2   玉米浸渍液   SG32001DR   32kg   0.1g
  3   酵母提取物   SG32001DR   32kg   0.1g
  4   水   SG32001DR   32kg   0.1g
  5   苛性苏打溶液   PG8002   8kg   0.01g
入口空气控制：通过1179型气体质量流量控制器(由MKS，Munich生产，按热线风速计的原理操作)控制入口空气流。借助于一个647B型的四通道控制装置(由MKS生产，借助于RS-232连接到过程控制计算机上)进行动力供应和模拟控制以及气体质量流量控制器的评估。既然利用控制器进行的测定基于被测气体的热容量，建立了适当的气体校正因子。气体的质量流量表示为标准体积/单位时间(Ncm3min-1，标准条件，T＝273.14K；p＝0.101325MPa)。量程为2000Ncm3min-1，准确度为最大量程的1.0％。在氮工厂校准测定的气体质量流量。对空气来说，气体校正因子为1.0。
废气分析仪：该废气分析仪包括一个微处理机控制的氧分析仪OXOR 610和一个用于测定二氧化碳的微处理机控制的NDIR气体分析仪(由Maihak，Hamburg生产的UNOR 610)。这两个装置都借助于RS-232连接到过程控制计算机上。
灭菌：生物反应器、所有的进料管和排出管以及用于产物的容器都在饱和蒸汽气氛中(0.2MPa，121℃)灭菌20分钟。无菌储藏溶液以及空气进料管线和废气管线借助于特种钢无菌连接器连接。
微生物：使用微生物弱氧化葡糖杆菌，IFO 3291，它于1992年3月30日按照布达佩斯条约的规定保藏在日本发酵研究所，作为FERMBP-3813。
培养基：连续培养基由四种独立的储藏溶液配制。对干生物量的简单测定而言，所有溶液必须不含固体物。既然玉米浸渍液粉含有高比例的不溶性成分，将玉米浸渍溶液适当地加工(见下文)。所得培养基的浓度用g/L-1表示。然而，用于配制所得培养基的各种储藏溶液以重量百分数计算，以通过称量各组分简化其生产。使用了如下的溶液：
1.D-山梨糖醇溶液，50.4％D-山梨糖醇，ρ＝1.22kgl-1；批量：20l
 2.玉米浸渍溶液：在软化水中的2％玉米浸渍液粉(Roquette，France)和按表2的各种盐；批量：20l。灭菌前将该溶液在4000g下离心10分钟。将灭菌后的溶液经过在0.2μm膜滤器组件(Gelman Supor DCF CFS92DS，无菌的)之前的3μm深床滤器组件(Sartorius 5521307P900A，无菌的)滤入一个空的无菌20l瓶中；ρ＝1.01kgl-1。
3.酵母提取物溶液：在软化水中的4％酵母提取物粉，Oxoid，和按表2的各种盐；ρ＝1.01kgl-1；批量：10l。
4.水：在软化水中的按表2的各种盐；ρ＝1.00kgl-1；批量：20l。
5.用于调节pH的3N苛性苏打溶液；ρ＝1.25kgl-1；批量：2l。
由于所用的微生物总是产生少量的酸代谢物，不需酸调节pH。复合营养素溶液的浓度与称入的相应的干粉有关。在玉米浸渍溶液的情况，这意味着被分离的固体物也含于所述浓度内。然而，由于固体物通常是不能生物利用的，在中间工厂规模或生产规模使用时，就应该对含固体物的玉米浸渍溶液作对比。
表2：储藏溶液2-4[A]中以及所得培养基[B]中的盐的浓度
  盐   A，csit，F＝275g/l/％   A，csit，F＝137.5g/l/％   B/(gl-1)
  MgCl2·6H2O   0.029   0.021   0.176
  KH2PO4   0.055   0.039   0.330
  CaCl2·2H2O   0.014   0.010   0.083
所得培养基中的盐浓度应与合成水中的盐浓度相似。从表2可获得溶液2和4中的盐浓度以及由前四种溶液获得的培养基中的盐浓度。既然D-山梨糖醇溶液(溶液1)不含任何盐，溶液2至4的盐浓度相应地必然更高。溶液5的消耗可以忽略，在计算盐浓度时不考虑在内。
所有溶液都在饱和蒸汽气氛中(0.2MPa，121℃)灭菌20分钟。
选定进料中的恒定的稀释率D＝0.1h-1和恒定的D-山梨糖醇浓度csit，F＝275gl-1。玉米浸渍液和酵母提取物的进料浓度由最优化方法预定。在每一场合，生物工艺自动化系统利用预定的浓度和稀释率来计算每种储藏溶液所需的质量流量。在并入该生物工艺自动化系统的控制器中，变换计算出的质量流量并保持恒定。循环时间为1秒。这确保由最优化程序产生的负脉冲和新计算的复合营养素进料浓度被精确保持。
为该特例实施最优化程序：选定的用于代谢活动的特征性测定信号是二氧化碳生成速率CPR。
用于总量的特征性测定信号为有效二氧化碳浓度(D-山梨糖醇当量/体积)
既然稀释率D一般是恒定的，二氧化碳生成速率CPR和有效二氧化碳浓度Cco2，virt的变动按线性方式变化。
因此，在该实施例的特殊情况中，用于总量的控制变量是
Ψ GM = C C O 2 , virt C CO 2 , virt , soll - - - ( 7 )
它是从实际有效二氧化碳浓度以及用于有效二氧化碳浓度的设定值计算的。
在该特例中，多元控制器构造成模糊逻辑控制器的形式，带有例如如下的模糊相关函数：例如，函数“很低”的数值0.7被赋予0.33的相关性，函数“低”的数值0.7被赋予0.67的相关性。换言之，从语言学意义上说，数值ΨGM＝0.7表示33％“很低”和67％“低”。
控制变量Qsens和ΨGM或Q’sens和ΨGM的数值被翻译成含有所谓相应函数(correspondence functions)的模糊逻辑语言变量。该过程被称为“模糊化”。既然仅有不同控制变量的相同的模糊逻辑控制器被用于停止的复合营养素和在实际循环过程中测定了脉冲响应时间的复合营养素，因此，在下文中Qsens和Q’sens之间没有区别。语言输入变量Qsens和ΨGM被联系起来，语言输出变量由“如果…则”规则相联系。既然与相关函数的联系是敏锐的(sharp)，可以同时适用一些规则。
这些规则是在相关值的基础上加权的。语言起始变量被转换回代表控制器输出xa的数值。该过程被称为“去逻辑化”。
关于模糊逻辑的进一步的资料可从相关文献获得[Zimmermann(编辑)：Fuzzy-Technologien-Prinzipien，Werkzeuge，Potentiale.Düsseldorf：VDI-Verlag(1993)]。
发酵完全通过利用最优化程序操作：在13天的期间内观察被调节的过程。控制变量cCO2，virt和两个校正变量以相互约半天的时间偏移波动。显然，模糊逻辑控制器对控制变量cCO2，virt与设定值之间的偏离的反应有点太敏锐。然而，这些波动不增大，该过程总体上保持稳定。控制变量csens围绕其设定值以不规则间隔波动。即使这时，也没有观察到不稳定行为。
对定量比例进行最优化：完全为了稳定控制变量Qsens，在复合营养素质量上产生人工波动。为此，复合营养素的储藏瓶分别被含得自其它生产商、因而质量也不同的复合营养素的瓶代替。
一个特地提供资料的实例是从Oxoid酵母提取物变为Roth酵母提取物。玉米浸渍液与酵母提取物的比率从约3∶1变为1∶1。又一次变回Oxoid酵母提取物后，恢复老比例。该调节历时大约3天或7个流体停留时间。
在一些情形中，酵母提取物的变化导致与设定值的相当大的偏差。然而，即使在这些情况下，最优化方法可保持工艺稳定。
总量的调节：接通最优化方法(具有用于复合营养素总量的控制变量cco2，virt的偏差)后，有效二氧化碳浓度cco2，virt和复合营养素进料浓度cCS，F和cYE，F的时间变化。将有效二氧化碳浓度cco2，virt从大约13gl-1的较高起始值调节为6gl-1的设定值.在部件7(part 7)的右手，超调清楚可辨。该调节历时4天或大约10个停留时间。
达到设定值后，关于L-山梨糖的摩尔收率从90.3％改善为91.1％。进料中的复合营养素的浓度cCS，F和cYE，F分别平均降低51％和56％。

Claims (5)

1.一种对涉及复合营养素混合物的发酵工艺的性能进行最优化的方法，其中周期地、交替地停止每种营养素的供应直到微生物的代谢活动减少一个预定的百分数，随后借助一个最优化程序计算和调节复合营养素的新的进料浓度，其中所述最优化程序包括一个用于产生控制变量的协调控制器、一个多元控制器和一个用于控制复合营养素的进料浓度的装置，所述协调控制器采用负脉冲响应技术，产生响应时间并利用它们形成输入变量Qsens；其中复合营养素的进料浓度之间的比率和复合营养素的总量被视为分离的控制变量，但被同时调节。
2.根据权利要求1的方法，其中使用两种不同的复合营养素混合物。
3.根据权利要求1的方法，其中所述多元控制器是一种模糊逻辑控制器。
4.根据权利要求1的方法，其中所述微生物是弱氧化葡糖杆菌。
5.根据权利要求4的方法，其中D-山梨糖醇被转化成L-山梨糖。
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