CN1044676A - 固定化α-葡糖基转移酶制备帕拉金糖 - Google Patents

Abstract

一种利用固定化α-葡萄基转移酶制备帕拉金糖的方法，属生物技术中的酶工程。该方法包括α—葡糖基转移酶的菌种发酵，固定化，使蔗糖溶液转化，浓缩结晶而制得帕拉金糖产品，该方法采用流加营养源发酵培养菌体细胞，细胞固定化技术中使用高岭土为主要成分的粘土类作为添加剂吸附细胞等以及提供一套优化的工艺条件，还提出了非传统的内胶凝法细胞固化工艺。以上方法工艺简单，材料便宜易得，酶活高，有利于提高帕拉金糖的转化率和产量，便于广泛推广应用。

Description

本发明属生物技术中的酶工程，涉及微生物细胞固化技术及固化酶的工业利用。

帕拉金糖，学名为异麦芽酮糖（Isomaltulose）是一种不产生龋齿，有益于健康的甜味剂，该糖是蔗糖的同分异构体，可以利用α-葡糖基转移酶（α-glucosyltransferase）转化蔗糖来获得帕拉金糖，该酶存在于某些微生物菌种的细胞周质中，工业上通常采用固定化酶技术生产帕拉金糖，其工艺包括，选择某种含有α-葡糖基转移酶的菌种，经发酵增殖菌体细胞，将经离心的菌体细胞固定化，将蔗糖溶液流加到装有固定酶的反应柱，使蔗糖转化为帕拉金糖，再将帕拉金糖转化液浓缩后使其结晶而获得帕拉金糖产品。目前各国在帕拉金糖的生产中已形成了多个具体的技术方案。美国专利（U.S.pat.NO.4359531）公开了一种用固定化整个细胞生产帕拉金糖的方法，该专利使用E.rhapontici NCPPB1578菌株，其培养基为蔗糖4%、蛋白胨1%，牛肉抽提物0.4%，细胞于培养基中培养70小时，在稳定期收获细胞，细胞得率为1%（WWC%），固化技术为：海藻酸钠用量5%，0.1MCaCl₂，于30℃下搅拌1小时，将固化细胞装在有夹层的φ5×30cm柱中，流速为空柱体积的0.01（V＝0.01ecv/h，empty column Volumn/h）蔗糖转化为帕拉金糖和其他糖达到平衡，其酶活性为0.325g产物/g湿细胞·小时。美国专利（U.S.Pat.NO.4390627）提出了一种固定化含有α-葡萄基转移酶的p.rubrum菌整个细胞的方法包括使用单宁（Tannic Acid）吸附，加聚乙烯亚胺（polyethylemine）絮凝，再加入表卤醇/多胺聚合物（epihalohydrin/polyamine Copolymer）和戊二醛（glutaraldehyde）于培养液中，得到反应产物，过滤或离心浓缩收集湿菌饼，于55℃下干燥即得固化细胞，该专利的聚合物要求使用美国市售商标为BETZ1180的产品。英国专利（U.K.Pat.Appl.GB.NO.2082591）又提出一种改进的固定化α-葡糖基转移酶的方法，将具有α-葡糖基转移酶的微生物细胞，包埋于海藻酸钙中后用聚乙烯亚胺和戊二醛处理，该专利使用S.Plymuthica菌、培养基为蔗糖5%，玉米浆3%，Na₂HPO₄0.3%，NaCl 0.2%，用30升罐装15升发酵培养基，在28℃下培养16小时，经离心浓缩收获细胞浆，再用海藻酸钙包埋固化。上述技术普遍存在下述问题：（1）在细胞发酵时一次供给营养源，造成细胞得率低，一般只有1～3%（WWC%）;（2）固化方法所用材料有特定要求，价格贵（U.S.Pat.NO4390627），并且一般获得的固化酶酶活较低，导致实际在反应柱中帕拉金糖转化液流速低，转化时间长，难以提高帕拉金糖的产量。

本发明针对上述现有技术的问题，提出一种改进的利用固定化酶转化并制备帕拉金糖的新方法，该方法以简化的工艺，便宜易得的材料，制备具有较高得率和酶活的固化酶，提高帕拉金糖的转化率和产量并降低成本，使其便于推广泛应用。

本发明的方法，包括对含有α-葡糖基转移酶的菌种进行发酵使其增殖细胞，离心浓缩收获细胞后，将收集的细胞固定化制成固定化酶（或称固化细胞），将固化酶装入反应柱，流加蔗糖溶液，使其转化成帕拉金糖液，再将帕拉金糖转化液浓缩、结晶或直接凝固、干燥而制得帕拉金糖产品，本发明的特点之一在于菌种在培养基中发酵培养时采用边发酵边流加营养源的方法促进菌种细胞增殖，以制备α-葡糖基转移酶（α-glucosyltanferase）。所使用的菌种为Serratiaplymuthica菌种（该菌种保存于美国标准菌库（ATCC），其标准样品号码为ATCC15928）的培养物，采用的菌种发酵培养基组分含1～6%（W/V）蔗糖、0.5～5%（W/V）玉米浆（过滤除去沉淀物）、0.01～0.4%（W/V）KCl，流加的营养源为浓度1～7%的酵母膏或浓度1～8%的玉米浆（过滤除去沉淀物）（氮源），以及浓度1～15%的蔗糖溶液，流加方式可为连续流加或间隔流加。下述为一组较好的参数指标，培养基组分：2%（W/V）蔗糖、2%（W/V）玉米浆（过滤除去沉淀物）、0.2%（W/V）KCL，连续流加或间隔流加浓度为2～3%的酵母膏或2%的玉米浆（过滤除去沉淀物）以及2%的蔗糖溶液。

其工艺条件为：可用任何容积发酵培养菌种以增殖细胞，发酵过程温度为25～35℃，PH5.0～8.5，搅拌，在1～20小时内边发酵边流加营养源，发酵时间为8～24小时，于对数生长期收获菌体细胞。

本发明特点之二在于α-葡糖基转移酶或菌体细胞的固化过程包括：使用以高岭土为主要成份的粘土类的添加剂作为支撑物并吸收附菌体细胞，用海藻酸钠包埋整个菌体细胞，再用CaCl₂溶液将所包埋的材料固化成型，再用戊二醛处理、再交联，同时杀灭活细胞以制备葡糖基转移酶的固化酶。

所说的用于吸附菌体细胞的添加剂可为陶土、粘土、高岭土等。

添加剂用量可为发酵液的2～30%，而以6～9%为佳，粒度可为100～300目，而以150～200目为佳。

α-葡糖基转移酶或菌体细胞固定化以制备固化酶的具体工艺过程为：（1）、将添加剂加入发酵液中充分搅拌混合吸附细胞后，离心收获添加剂及其所吸附的细胞，或者先将发酵液离心得细胞浆，再将添加剂加入其中，充分搅拌混合吸附细胞;（2）、将（1）收获的材料（包括添加剂及所吸附的细胞）和海藻酸钠混合，形成凝胶，充分搅拌。海藻酸钠的用量为1～6%（W/V），细胞包埋量为5～50%（WWC）;（3）、用颗粒挤压器将包埋材料挤入浓度为0.1～0.8%的CaCl₂中固化成型，边挤压边搅拌2小时以上;（4）、抽滤吸干收集已固化好的固定化酶，用生理盐水或磷酸缓冲液（PH7.0）洗涤;（5）、将此固化酶用戊二醛处理，再交换，同时杀死活细胞，再用生理盐水或磷酸缓冲液洗，低温干燥即得固化酶。

本发明将蔗糖转化为帕拉金糖以及帕拉金糖产品的回收工艺，是将固化酶装在填充床式柱反应器内，柱的体积不限，任何径高，容积均可。该反应器酶柱单向流加或循环连续流加蔗糖溶液，蔗糖溶液浓度可为5～75%，蔗糖溶液流过酶柱即转化为帕拉金糖转化液，通过调整流速，控制转化率在60～100%间。

收集帕拉金糖转化液，直接将其浓缩后，可通过有机溶剂如酒精抽提结晶或加晶种结晶或将转化液直接凝固干燥即可获得帕拉金糖产品。

本发明还可采用非传统的海藻酸盐内胶凝法固定化α-葡糖基转移酶（或细胞），使用该法除细胞固定化过程外，其余工艺过程与上述方法相同。

所说的非传统海藻酸盐内胶凝法工艺方法包括将一份菌体细胞浆与一份海藻酸钠混匀后加入一份CaCO₃溶液，充分搅拌均匀，然后加一份葡萄糖酸内酯溶液，快速搅拌均匀后静置2小时以上，将固好的材料制成颗粒，再浸入CaCl₂溶液，滤干或低温下干燥即成。

采用内胶凝法的具体工艺条件为：海藻酸钠用量为1～5%（W/V），以2%为佳，CaCO₃的用量为0.5～8.0%，以3%为佳，葡萄糖酸内脂的用量为0.5～4.0%，以0.5～1%为佳，细胞包埋浓度可为1～30%（WWC%），以11～14%为佳，CaCl₂溶液浓度为0.1～0.6M，以0.2M为佳。

本发明在菌种发酵过程中，采用连续或间隔流加营养源的方法，使加入的营养被充分用于细胞的生理代谢而增殖细胞，因而细胞增殖快，本发明在发酵6～10小时，细胞得率可达3～8%，大大高于现有技术。本发明的细胞固化方法，包括传统的外胶凝法和非传统的内胶凝法，其外胶凝法采用了性能好、材料便宜易得的添加剂，该添加剂对细胞的吸附率可达98～100%，使固化酶的酶活大大提高，可达0.42～0.49g帕糖/g湿细胞·小时，从而使该固化酶用于帕拉金糖转化的效率得以提高，反映在实际生产中，蔗糖流经酶柱的流速可达0.1ecv/h～0.14ecv/h，转化时间为5～8小时，指标均优于现有技术，有利于提高帕拉金糖的产量，本发明提出的内胶凝法，也具有使固化酶的酶活稳定，酶活力下降慢等优点，大有推广应用的前景。应用本发明帕拉金糖的转化率可达80～100%，回收率80%以上，产品纯度85～100%，符合食用要求，完全可与国外产品媲美。

附图为本发明的工艺流程简图。

实施例一

用MSJ-N₂20L型发酵罐，装发酵液12～14升，菌种为Serratia Plymuthica（ATCC15928），培养基成份：蔗糖2%（W/V）、玉米浆2%（W/V）、KCL0.2%，通气1∶1，搅拌速度300rpm，温度28～31℃;PH7.0，在细胞对数生长期流加3%的酵母膏和2%的蔗糖溶液，搅拌发酵8～16小时，在对数生长期收获细胞，将8%的高岭土加入发酵液中，充分搅拌混合，用离心机在3000～4000r/min离心收获添加剂吸附的细胞浆，将此材料用生理盐水洗涤2～3次，再用去离子水制成浆状，加入海藻酸钠包埋，其用量为3%充分搅拌均匀，用挤压器将包埋材料注入0.2MCaCl₂液中，搅拌2小时，过滤、吸干即得固化好的固化酶，将此固化酶用戊＝醛处理，再交联，同时杀死活细胞，形成粒度为2～5mm的固化酶颗粒。将此湿固化酶装入25升填充床式酶反应柱，湿固化酶装柱量为52.6%（W/V），向酶柱单向流加浓度为50%的蔗糖溶液，调整流速为0.12ecv/h，将酶柱流出液收集，真空低温（60～70℃）直接浓缩至原体积的50～70%，加浓度为85～95%的酒精，搅拌、静置、结晶、抽滤、洗涤1～2次，于50℃干燥或真空干燥，即得90～100%的试剂纯和色谱纯的帕拉金糖白色结晶。

实施例二

细胞固定化采用非传统的内胶凝法，其他工艺流程同实施例一。

附所用量度单位说明：W/V表示：重量/体积，WWC%表示：湿细胞重%，ecv/h表示：空柱体积/小时。

Claims (13)

1、一种利用固定化酶使蔗糖转化并制备帕拉金糖的方法，包括含有α-葡糖基转移酶的菌种发酵增殖、浓缩、固定化、转化蔗糖溶液为帕拉金糖、帕拉金糖转化液浓缩、结晶或直接凝固、干燥等步骤，其特征在于：(1)采用在培养基中边发酵边流加营养源的方法发酵增殖菌体细胞，以制备α-葡糖基转移酶(α-glucosyltranferase)；

(2)使用以高岭土为主要成份的粘土类的添加剂作为支撑物并吸附菌体细胞，用海藻酸钠包埋、再用CaCl₂溶液将所包埋材料固定成型，再用戊二醛处理，再交联，同时杀灭活细胞以制备α-葡糖基转化酶的固定化酶。

2、按权利要求1所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于使用的菌种为Serratia        plymuthica（ATCC15928）菌株的培育物。

3、按权利要求1所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于发酵培养基组分含1～6%（W/V）蔗糖、0.5～5%（W/V）玉米浆（过滤除去沉淀物）、0.01～0.4%（W/V）KCl流加的营养源为浓度1～7%的酵母膏或1～8%的玉米浆以及1～15%的蔗糖溶液，可连续流加或间隔流加。

4、按权利要求1所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于发酵培养基组分含2%（W/V）蔗糖、2%（W/V）玉米浆（过滤除去沉淀物）、0.2%（W/V）KCl，流加的营养源为浓度2～3%的酵母膏或2%的玉米浆以及2%的蔗糖溶液，可连续流加或间隔流加。

5、按权利要求1或3或4所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于可用任何容积发酵培养菌种，发酵过程温度为25～35℃，PH5.0～8.5，搅拌，在1～20小时内边发酵边流加营养源，发酵时间为8～24小时，于对数生长期收获菌体细胞。

6、按权利要求1所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于所说的用于吸附菌体细胞的添加剂可为陶土、粘土、高岭土。

7、按权利要求1或6所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于所说的添加剂的加入量为发酵液的2～30%（W/V），最佳为6～9%，粒度可为100～300目，最佳为150～200目。

8、按权利要求1所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于α-葡糖基转移酶固定化酶的制备包括（1）、将添加剂加入发酵液中充分搅拌吸附细胞后，离心收获添加剂及吸附的细胞，或者先将发酵液离心得细胞浆，再将添加剂加入其中，充分搅拌混合吸附细胞;（2）、将（1）收获的材料（添加剂及所吸附的细胞）和海藻酸钠混合，形成凝胶，充分搅拌，海藻酸钠的用量为1～6%（W/V），细胞包埋量为5～50%（WWC%）;（3）、用颗粒挤压器将包埋材料挤入浓度为0.1～0.8%的CaCl₂中固化成型，边挤压边搅拌2小时以上，（4）、抽滤吸干收集已固化好的固定化酶，用生理盐水或磷酸缓冲液（PH7.0）洗涤;（5）、将固化酶用戊二醛处理、再交联，同时杀死活细胞，再用生理盐水或磷酸缓冲液洗涤。

9、按权利要求1所述的制备帕拉金糖的方法，其特征为在装有α-葡糖基转移酶的固化酶的填充式柱反应器中，单向流加或循环连续流加蔗糖溶液，调整流速控制转化率在60～100%之间。

10、按权利要求1所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于可将帕拉金糖转化液直接浓缩后通过酒精抽提结晶或加晶种结晶或将转化液直接凝固、干燥制备帕拉金糖产品。

11、一种制备权利要求1所述的帕拉金糖的方法，其特征在于通过非传统的内胶凝法固定化菌体细胞以制备α-葡糖基转移酶的固定化酶，其他工艺过程同权利要求1。

12、按权利要求11所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于所说的非传统内胶凝法包括将一份菌体细胞浆与一份海藻酸钠混匀后加入一份CaCO₃溶液，充分搅拌均匀，然后加一份葡萄糖酸内酯溶液，快速搅拌均匀后静置2小时以上，将固化好的材料制成颗粒，再浸入CaCl₂溶液中固化，滤干或低温干燥即成。

13、按权利要求12所述的制备帕拉金糖的方法，其特征在于所说的内胶凝法工艺中，海藻酸钠用量为1～5%（W/V），以2%为佳，CaCO₃的用量为0.5～8.0%，以3%为佳，葡萄糖酸内酯的用量为0.5～4.0%，以0.5～1%为佳，细胞包埋浓度，可为1～30%（WWC%），以11～14%为佳，CaCl₂溶液的浓度可为0.1～0.6M，以0.2M为佳。