KR20020034944A

KR20020034944A - 발효 공정의 최적화

Info

Publication number: KR20020034944A
Application number: KR1020010067545A
Authority: KR
Inventors: 그루엔베르크마츠; 포슈텐클레멘스; 루에켈마르쿠스
Original assignee: 로슈 비타민즈 아게
Priority date: 2000-10-31
Filing date: 2001-10-31
Publication date: 2002-05-09
Also published as: CN1367252A; NO20015316L; AU8362101A; US20020138454A1; BR0104901A; AU783125B2; NO20015316D0; MXPA01011049A; JP2002153266A; TWI230199B; CN100342021C; CA2360041A1

Abstract

본 발명은 복합 영양원의 신규한 공급 농도가 최적화 루틴(routine)에 의해 계산되고 조절되며, 미생물의 대사 활성이 사전 설정된 백분율로 감소될 때까지 각각의 영양원의 공급이 주기적으로 교대로 정지되는, 복합 영양원 혼합물을 포함하는 생물 공정을 최적화시켜 실행하는 방법에 관한 것이다.

Description

발효 공정의 최적화{OPTIMIZATION OF FERMENTATION PROCESSES}

본 발명은 복합 영양원 혼합+물을 포함하는 생물 공정을 최적화시키는 방법에 관한 것이다.

발효 공정, 즉 미생물을 사용함으로써 물질을 전환시키는 공정(이후 생물 공정이라고 약기함)에서, 복합 영양원은 미생물에 대한 추가의 영양원으로서 이용되는 경우가 많다. 복합 영양원은 미생물의 성장에 필요하거나 성장을 촉진시키는 2개 이상의 물질을 포함하는 원료이다. 예로는, 특히 콘스팁(Cornsteep) 분말 또는 액체, 옥수수로부터 전분 추출시의 폐기물 또는 효모 추출물, 및 개별 물질의 합성 혼합물과 같은 천연 원료가 있다. 이러한 복합 영양원의 특별한 장점은 미생물의 접근성이 용이한 개별 물질로 아미노산, 단백질, 비타민, 무기염 또는 미량원소와 같은 다양한 물질이 사용된다는 것이다. 이로 인해, 화학적으로 정의된 최소 배지를 사용할 때와 비교해서 높은 성장률을 수득할 수 있는 장점이 있다.

그러나, 생물 공정에서 복합 천연 영양원을 사용하는데 있어 다양한 문제가 존재한다. 물질이 통상적으로 천연적이기 때문에, 복합 영양원의 품질은 제조 회사 및 배치(batch)에 따라서 넓고 다양하다. 또한, 복합 영양원의 천연 조성물은 미생물의 실제 요구에 관련하여 최적화시킬 필요는 없다. 몇 가지 구성성분은 아주 소량으로 존재하여 제한 효과를 갖는 반면에, 기타 구성성분은 과잉으로 존재하여 낭비되거나 또는 심지어 저해한다. 또한, 복합 영양원에서 많은 다양한 구성성분의 전반적인 대사 작용은 매우 복잡하고 부분적으로 알려져 있지 않다. 다양한 중첩 적응 공정은 이 공정에서 격렬한 방황 변이를 일으켜, 생물 공정에서 불규칙한 생산성 및 수율을 야기하는 결과를 초래한다. 특히, 다단계 제조 방법에 있어서, 후속적인 공정 단계가 영향을 받기 때문에 이는 심각한 문제일 수 있다. 또한 최적화하지 않은 작동 조건은 비용이 많이 든다. 복합 영양원의 특성이 다양하고, 그 자체가 대사 작용하는 미생물에 의해 나타나는 시스템이기 때문에, 몇 개의 중요한 물질에 관련하여 배지를 단 한 번 최적화하는 것은 충분하다고 간주될 수 없다.

공지된 최적화 방법은, 예컨대 완전한 공장 규모의 실험적 설계를 포함하여 통계학적인 접근에 있어서 독립 변수의 모든 가능한 조합물을 적합한 조건에서 조사하는 것이다. 그러므로, 시스템의 모델이 필수적이다. 최적 조건이 조사하는 중에 많은 물질 및 농도의 경우에 있어 신속히 달성될 수 있지만, 이러한 방법은 변수 및 조건의 수가 더 커지면 광범위한 실험이 필요하기 때문에 실행이 불가능하다. 더 효율적인 최적화 전략은 "반응 표면" 방법, 예컨대 플래킷-버만(Plackett-Burmann) 방법[Greasham 및 Inamine: Demain 및 Solomon 편집, Manual for industrial microbiology and biotechnology(미생물학 및 생명공학의 입문서), 워싱턴: ASM, 41-48, 1986] 또는 복스-벤켄(Box-Behnken) 방법[Greasham 및 Herber: Rhodes 및 Stanbury 편집, Applied microbiol physiology-a practical approach(응용 미생물 생리학-실용적 접근), 옥스퍼드: 옥스퍼드 대학 출판, 53-74, 1997]에 의해 몇몇 인자에 대한 시험을 계획하는 것이다. 이러한 방법에서 변수의 수는, 예를 들어 생장 또는 생성물 형성에 중요한 효과를 갖는 수로 감소된다.

유전학적인 알고리즘(algorithm)은 통계적인 방법과는 대조적으로 최적화의 비모델계 방법이다. 그의 적용과 관련하여, 이는 이들이 일반적으로 미생물의 대사 작용에 관련한 이론적인 고찰에 기초할 필요는 없음을 의미한다. 이러한 방법은 다수의 배지 구성성분을 수렴법으로 최적화할 수 있다. 수많은 유사한 셰이크(shake) 플라스크 실험에서 가장 좋은 것을 선택하였고, 이 배지는 다음 실험 세대를 위한 시작점이 된다. 수렴이 도달할 때까지 상기 절차를 반복하였다. 제 1 세대에서, 배지는 무작위로 변형되었다(문헌 [Weuster-Botz et al.,Biotechnol. Prog.13, 387-393, 1997]). 문헌 [Weuster-Botz et al.,Appl. Biotechnol.46, 209-219, 1996]에서는 L-이소류신 농도가 표준 배지와 비교해서 50% 개선된 유전학적인 알고리즘을 사용함으로써 180개의 셰이크 플라스크 실험 중에서 8개의 미량 원소가 최적화되었다. 웨스터-보츠 등(Weuster-Botz et al., 1996)은 472개의 표준화된 셰이크 플라스크 실험 중에서 13개의 배지 구성성분을최적화하기 위해 L-라이신 공정에서 동일한 방법을 사용하였다. L-라이신 농도는 결과적으로 2% 이상 개선되었다. 통상적인 완전한 2차 다항식 모델을 갖는 "반응 표면" 방법을 포함하는 통계학적인 배합물과 비교해서, 실험의 수는 2¹³= 8192개 대신에 분명히 472개 감소되었다. 이 파라미터의 모든 가능한 조합은 101¹³개의 실험을 포함할 수 있을 것이다. 그러나 배치 방식의 셰이크 플라스크 실험에 의해 배지 최적화하는 데 있어 중대한 단점이 있다. 통상적으로 pH를 일정하게 유지할 수 없다는 것이다. 산소 공급이 표면 가스 유입 때문에 매우 불충분하고 또한 스타터(starter) 배양시 변이 때문에 재현성이 불가능한 경우가 있다.

케모스태틱(chemostatic) 배양에서의 펄스 방법(문헌 [Kuhn et al.,Eur. J. Appl. Microbiol.6, 341-349, 1979]; [Goldberg and Er-el,Pro. Biochem.16, 2-81, 1981]; [Fiechter,Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.30, 7-60, 1984]; 및 [Reiling et al.,J. Biotechnol.2, 191-206, 1985])에서는 영양원에 따른 성장 반응을 수득하기 위해서 펄스 주입 기술이 사용된다. 이 방법은 필수 영양원을 확인하는 수단으로서, 그 수율은 필수 영양원이 제한 인자인 각각의 수많은 케모스태틱 실험 후에 결정될 수 있다. 수율은 최적화된 균형 배지를 수득하기 위해 사용될 수 있다. 그러나 필수 영양원을 먼저 확인해야 하기 때문에, 실험적 연구가 중요하다.

공지의 최적화 방법은 만족스럽지 못하므로, 본 발명의 목적은 공정 동안 배지에서 복합 영양원의 비율이 미생물의 실제 요구와 원료의 실제 품질에 일정하게 재적응되는, 복합 영양원을 사용하여 생물 공정을 최적으로 실행하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명을 수행하기 위한 자동화된 실험 시스템의 일례를 나타낸다.

본 발명에 의해, 미생물의 대사 활성이 사전 설정 백분율로 감소될 때까지 각각의 영양원의 공급을 주기적으로 교대로 정지시키면, 복합 영양원 혼합물을 사용하는 생물 공정을 최적화시킬 수 있음이 밝혀졌다. 각각의 경우에 걸린 시간은 복합 영양원의 신규한 공급 농도가 최적화 루틴에 의해 계산되고 조절되는 반응 신호로서 사용된다. 이 음성 펄스 사이의 대기 시간은 공정의 동력학에 따라서 유체 역학의 체류 시간의 1/4 내지 1이어야한다. 그러나, 어떤 경우는 대기 시간이 0 또는 심지어 5 유체 역학의 체류 시간 이상 더 길 수도 있다. 유체 역학의 체류 시간은 반응 부피(ℓ)에 대한 유속(ℓ/시간)의 비이다.

이상적으로 혼합 교반된 탱크(예를 들어, 생물 반응기가 사용됨)의 계속적인 작동 중에 있어, 반응기에서 이론적으로 완전한 부피 교환은 결코 일어날 수 없다. 그러나, 화학 반응 기술에서 근사치로서, 부피의 95%가 교환되는 것이 계산되기 때문에 연속적으로 교반된 탱크 반응기는 3 유체역학 체류 시간 후 준-정상상태로 된다. 그러나, 부피 교환 동안에 미생물이 변화된 환경에 반응하여 준-정상상태에 도달하는 것이 지연되기 때문에 생물 공정 기술에서 이 시간은 적어도 5 이상의 유체 역학의 체류 시간이다. 본 발명의 최적화 루틴에 있어서, 모든 음성 펄스 후 준-정상상태를 기다릴 필요는 없으므로 이것은 통상적인 펄스-반응 방법에 대한 장점이다.

미생물의 성장 속도가 영양원 펄스에 의해 일시적으로 증가되는 양성 펄스 반응에 기초한 방법과 비교시, 본 발명에 따른 방법은 또한 측정된 반응 시간이 미생물의 유도기(lag phase)에 의해 오판되지 않는 이점을 갖고 있다. 유도기는 변화된 주위 조건에 적응하는 미생물에 의해 취해지는 시간이다. 미생물의 성장은 초기에 거의 변화하지 않은 채 머무르는 것을 특징으로 한다. 양성 영양원 펄스에서, 펄스된 영양원에 대한 측정할 수 있는 반응은 통상적으로 재현 불가능한 방법으로 지연되므로, 반응 시간을 오판하게 된다.

대사 활성을 관찰 가능한 공정 파라미터(예를 들어, 산소 전송 속도 또는 이산화탄소 전송 속도)를 통하여 측정할 수 있다. 여기서 "이산화탄소 전송 속도" 는 액체상(발효 배양액)에서 기체상(배기 가스)으로 단위 시간당 이동하는 이산화탄소의 양을 의미한다. 배기 가스에 의해 직접 이산화탄소 전송 속도를 측정할 수 있다. 이산화탄소의 양은 배기 가스 분석에 의해 검출할 수 없고, 용해된 형태로 반응기를 떠나는 것은 통상적으로 무시해도 좋으며, 이산화탄소 형성 속도는 본 발명의 목적을 위한 측정된 이산화탄소 전송 속도와 동일할 수 있다. 공정을 제어하기 위해 사용하는 기타 파라미터로는, 예를 들어 pH, 용해된 산소의 농도 및 온도가 있다. 상기 공정 파라미터에서 변화를 통해 측정된 대사 활성의 백분율 감소는 공정의 주요 기질(예를 들어, 실시예 중의 소르비톨)이 완전히 전환되지 않는조건으로 몰아가지 않도록 비교적 작은 값(예를 들어, 1 내지 5%)에서 선택되어야 한다.

본 발명에 따른 최적화 공정의 산업적 완성에 있어서, 복합 영양원의 공급 농도와 복합 영양원의 총량의 비율은 독립 제어 변수로서 간주되나 동시에 조절되는 것이 바람직하다.

본 발명에 따라서 다중 구성성분 제어기 상에 바람직하게 수렴된 최적화 루틴에 의해 비율 및 총량을 동시에 조절할 수 있다. 다중 구성성분 제어기는, 예를 들어 퍼지이론(문헌 [Zadeh, Inf. Control 8, 338 내지 353, 1965] 참조)에 기초한다. 최적화 루틴은 하기 3개 수준을 포함하는 것이 바람직하다:

1. 제어 변수를 산출하기 위한 조정 제어기;

2. 다중 구성성분 제어기(예를 들면, 퍼지이론 제어기); 및

3. 복합 영양원의 공급 농도 제어.

"최적화 루틴"은 상호 작동시 공정을 바람직하게 제어하는데 사용될 수 있는 부재의 배열을 의미한다. 본 발명에 따른 최적화 루틴은, 예를 들어 음성-펄스 반응 기술을 사용하여 반응 시간을 산출하고 이를 사용하여 입력 변수(Q_sens)를 형성하는 조정 제어기를 포함한다. 모든 경우에서, 펄스 반응 시간은 하나의 영양원에 대하여 측정되고 이때 나머지 영양원은 정지된다. 역수(Q'_sens)는 정지된 영양원에 대한 입력 변수로서 사용된다. 조정 제어기는 또한 총량(Ψ_GM)을 조절하기 위해 설정값에 대한 입력 변수를 계산한다. 다중 구성성분 제어기는 2개의 영양원(C_N1,F,I및 C_N2,F,I는 복합 영양원의 공급 농도; 이때, 아래 첨자 N1 및 N2는 다양한 복합 영양원을 나타내고, F는 공급 농도를 나타내며, I는 최적화 루틴 내에 있는 일련의 아래 첨자를 나타낸다) 각각에 대해 1회 실행된다. 복합 영양원의 각각의 공급 농도는 제어기 출력을 통하여 이때 다시 계산된다.

양적인 비율을 최적화하기 위한 제어 변수

음성 펄스는 다른 것이 정지해 있는 동안에 각각의 복합 영양원에 대해 달성된다. 이 경우에 있어, 제어 변수는 CO₂(전송 속도로 측정되었음) 형성 속도이다. 예를 들어 복합 영양원을 공급한 후, 이산화탄소 형성 속도가 3%까지 감소되기 전에 시간을 측정한다. 이때, 최적화 알고리즘은 2개의 복합 영양원의 신규한 공급 농도를 계산한다. 고정된 대기 시간(이 예에 있어, 체류 시간의 반에 상응하는 5 시간) 후, 음성 펄스는 다른 복합 영양원에 대해 달성된다. 이 방법은 수렴법이기 때문에, 각각 음성 펄스 후에 정상 상태에 도달할 필요는 없다.

그러므로, 양적인 비율을 최적화하기 위한 하기 수학식 1의 관련 제어 변수는 각각 기타 복합 영양원으로 측정된, 실제 펄스 반응 시간(△t_i)을 이전 주기의 펄스 반응 시간(△t_i-1)으로 나눔으로써 수득되었다. 정지된 영양원의 경우는, 하기 수학식 2의 Q_sens의 역수가 사용된다. 그러므로, 동일한 퍼지이론 제어기가 사용되어 제어기를 조율하는데 드는 노력을 상당히 감소시킬 수 있다. 교반된 탱크 반응기의 유체 역학적 성질 때문에, 반응 시간, 및 따라서 수학식 1 및 2에서 분모는결과적으로 0이 될 수 없다:

총량에 대한 제어 변수

총량에 대한 제어 변수는 공정 동안 관찰할 수 있는 파라미터의 값(X_GM)이고, 예를 들어 생체량 또는 생성물의 수율, 예를 들어 산소 소비 속도 또는 이산화탄소 실제 농도와 서로 관련이 있다. 퍼지이론 제어기로 입력하는 동안, 제어 변수는 하기 수학식 3의 일반적인 입력 변수를 산출하는 사전 설정으로 표준화된다:

2개 이상의 복합 영양원으로 확장

최적화하기 위해 2개의 복합 영양원이 있을 때, 그 결과는 2개의 상이한 단계 중의 주기이다. 그러나, 주로 루프(loop)는 수많은 단계, 즉 복합 영양원으로 확장될 수 있다. n개의 복합 영양원의 일반화된 경우에 있어, 우리는 하기 수학식 4와 같이 나타낼 수 있다:

이것은 총량을 제어하기 위한 파라미터(Ψ_GM)를 변화시키지 않는다. 장시간 상수 때문에, 3 또는 4개 이상의 영양원을 최적화하는 것은 실용적인 비율이 아니다.

공급 농도의 제어:

다중 구성성분 제어기의 출력(X_a)에 따라서, 복합 영양원의 공급 농도는 하기 수학식 5와 같이 제어된다:

본 발명의 공정은 복합 영양원, 예를 들어 미생물을 사용하여 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환함을 포함하는 모든 발효 공정에 적용할 수 있다. 미생물은 각각의 전환에 유용한 임의의 미생물일 수 있고, 예를 들어 글루코노박터 서복시단스(Gluconobacter suboxydans) 균주는 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환하는데 사용될 수 있다(예컨대, 일본 오사카 소재의 발효 연구소(Institute for Fermentation)에 1954년 4월 5일자로 기탁되어 있거나, 또는 일본 소재의 FRI(Fermentation Research Institute)에서 FERM BP-3813으로 부타페스트 협약하에글루코노박터 옥시단스(Oxydans) DSM 4025와의 혼합 배양물로서 1992년 3월 30일자로 기탁되어 있는 글루코노박터 서복시단스 IFO 3291).

미생물(예를 들어, 글루코노박터 서복시단스)의 연속적인 배양을 위해서, 그리고 원하는 최적화 공정을 수행하기 위해서, 발효계는

1. 연속적인 작동을 위한 장비를 갖춘 생물 반응기;

2. 배지의 조성이 공정 동안 개질될 수 있도록 다수의 개별 구성성분 스트림 내로 배지 공급물을 분리하기 위한 수단;

3. pH, pO₂및 온도를 측정 제어하기 위한 수단;

4. 효율적이고 연속적인 작동을 확실하게 해주기 위해 생물 반응기의 충전 수준을 측정 제어하기 위한 장치;

5. 상응하는 가스 전송 속도가 측정 신호로서 이용될 수 있도록 공급 스트림을 제어하고 배기 가스 조성을 측정하기 위한 수단; 및

6. 생물 공정의 설정을 제어하기 위한 자동 시스템을 포함한다.

생물 반응기는, 예를 들어 표준 반응기, 예를 들어 적합한 추가의 장치 및 자동 시스템을 갖춘 실험실용 생물 반응기, 예를 들어 자동화된, 예를 들어 실험실용 시스템 저장 병 및 부식성 소다 용액용 병, 생물 반응기의 제어 장치, 측정 탐침과 함께 자체의 생물 반응기 및 생성물 용기, 질량 유동 제어기 및 무균 필터 및 배기 가스에 대한 CO₂및 O₂분석과 함께 가스 유입 라인, 공정 조작 컴퓨터 및 직렬 인터페이스, 데이타 전송을 위한 전선, 상응하는 전송 형태(예컨대 RS-232, RS-422 또는 Mettler Local-CAN)일 수 있다.

본 발명은 글루코노박터 서복시단스를 사용하여 D-소르비톨을 L-소르보스로 전환하는 실시예에 의해 지금부터 추가로 더 설명된다.

실시예: D-소르비톨이 L-소르보스로 전환되는 글루코노박터 서복시단스의 연속적인 배양

발효를 하기 위해 도 1에 따른 추가의 장치 및 자동화 시스템 구성성분을 갖춘 표준 실험용 생물 반응기를 사용하였다.

도 1은 자동화된 실험 시스템으로서, 하부 열은 4개의 보관 병(좌측) 및 부식성 소다 용액 병을 나타내고, 우측으로 생물 반응기의 제어 장치, 측정 탐침과 함께 자체의 생물 반응기 및 생성물 용기가 있다. 질량 유동 제어기 및 무균 필터 및 배기 가스에 대한 CO₂및 O₂분석과 함께 가스 유입 라인은 공정 조작 컴퓨터 및 직렬 인터페이스 아래에 나타나 있다. 가는 선은 데이타 전송을 위한 전선을 나타내고 상응하는 전송 형태를 보여준다(RS-232, RS-422 또는 Mettler Local-CAN).

공정 조작 컴퓨터는 시판용 서버-PC(Server-PC)이었다. 공정 조작 컴퓨터용으로 선택된 장치는 다음과 같다: 서버-PC(델 파워엣지(Dell PowerEdge) 2200); 2개의 인텔 펜티엄(Intel Pentium) II 300 MHz CPU; 128 MB 주메모리, 2개의 그래픽 카드 및 2개의 스크린(21인치); 전체 32 직렬 인터페이스용 2개의 컨트롤 로켓포트(Control RocketPort) 16 ISA 멀티포트(multiport) 직렬 카드, RS-232와 RS-422 사이에 각각 스위치 가능.

소프트웨어: 공정 조작 컴퓨터의 작동 시스템은 마이크로소프트 윈도우즈(Microsoft Windows) NT 4.0(서비스 팩 3).

자동화는 산업용 소프트웨어 브릿지뷰(BridgeVIEW), 버전 1.1(내셔널 인스트루먼츠(National Instruments)사 제품)에 기초하였다.

퍼지이론은 브릿지뷰 확장 데이타엔진(DataEngine) VI 1.5(아켄 소재의 MIT GmbH)에 의해 적용되었다.

생물 반응기: 생물 반응기는 2ℓ의 작업 용량을 갖는 표준 바이오스태트 B(Biostat B) 표준 교반된 탱크 반응기(비. 브라운 바이오테크 인터내셔널(B. Braun Biotech International)사 제품). 유입구 공기는 실리콘 연성 튜브 및 무균 필터(구멍 크기 0.2 ㎛)를 통해 생물 반응기로 도입되었다. 가스 도입 수단은 6개의 블레이드를 갖는 디스크 모양의 교반기 아래에 공급되고 배치된 가스화 고리이다. 배기 가스는 먼저 응축기를 통하여 생물 반응기 상으로 운반되고, 이어서 연성의 실리콘 튜브 및 무균 필터(구멍 크기 0.2㎛)를 통하여 배기 가스 분석기로 운반된다. 생물 반응기는 pH 전극봉, pO₂탐침(둘다 인골드(Ingold)사 제품) 및 온도 탐침(PT100)의 장비를 갖추고 있다. pH, pO₂및 온도 탐침용 측정 증폭기, 및 이러한 파라미터를 위해 초기에 필요한 표준 제어기를 포함하는 제어 장치를 갖는 생물 반응기가 공장에 설치되어 있다. 공정 데이터, 및 제어기와 공정 조작 컴퓨터 사이의 설정 값의 전송은 직렬 RS-422 인터페이스를 통하여 발생한다. pH 전극봉은 각각 살균 작업을 하기 전에 보정(pH 7.00과 pH 4.01에서의 2점 보정)되었다.pO₂탐침은 살균 후 보정(배지 중의 100% 포화된 공기로 1점 보정)되었다.

생물 반응기의 충전 수준의 제어: 생물 반응기의 충전 수준은 중량에 의해 제어되었다. 저울(메틀러 톨레도(Mettler Toledo)사 제품의 SG32001)은 반응기 아래에 배치되었고, 디지털/아날로그 변환기 내에서 4 내지 20 mA의 신호로 변환되는 디지털 신호(직렬 RS-232 인터페이스)를 산출하였다. 아날로그 신호는 아날로그 0 내지 10 V의 신호를 사용하여 생물 반응기의 배출 펌프(길손 미니펄스 3(Gilson Minipuls 3)사 제품의 연동식 펌프)에 작용하는 하드웨어 제어기(유로테름(Eurotherm)사 제품)의 입력에 연결되었다.

저장 용액: 5종의 상이한 저장 용액을 배지를 구성하는데 사용하였고 독립적으로 각각 첨가하였다.

질량 유동 측정은 중량에 의해 측정되었다. 저울의 신호는 직렬 RS-232 인터페이스로부터 공정 조작 컴퓨터로 전송되었다. 사용된 다양한 저울은 하기 표 1에 나타내었다. LC-RS 어댑터(adapter)(메틀러 톨레도사 제품)는 SG 형 및 PG 형 저울에 사용되었다.

밀도 구배의 형성을 방지하기 위해, D-소르비톨 저장 병을 저울과 병 사이에 배치된 자기 교반기(바리오마그(Variomag)사 제품)로 교반시켰다.

배지를 연동식 펌프(길손 미니펄스 3)로 연성 실리콘 튜브를 통하여 생물 반응기로 운반시켰다. 연동식 펌프와 연통하기 위하여, 직렬 RS-422 모선을 사용하였다. 이 모선을 10개의 펌프에 연결할 수 있었다. 펌프는 소위 GSIOC 인터페이스를 갖기 때문에, 적합한 어댑터를 각각의 RS-422 모선에 사용하였다:

사용된 저울(메틀러-톨레도) 및 최대 하중

번호	내용물	저울 유형	최대 하중	정확도
1	D-소르비톨	KCC 150s with ID5	150 kg	1 g
2	콘스팁	SG32001 DR	32 kg	0.1 g
3	효모 추출물	SG32001 DR	32 kg	0.1 g
4	물	SG32001 DR	32 kg	0.1 g
5	부식성 소다 용액	PG8002	8 kg	0.01 g

유입구 공기 제어:유입구 공기의 흐름은 고온-전선 풍력계의 원리로 작동하는 질량 유동 제어기 1179 형(독일 뮌헨 소재의 MKS사 제품)에 의해 제어된다. 전원 공급 장치, 아날로그 제어 및 가스 질량 흐름 제어기의 평가는 RS-232를 통하여 공정 조작 컴퓨터에 연결된 647B 형 4-채널조절 장치(MKS사 제품)에 의해 영향을 받는다. 제어기에 의한 측정은 측정되는 가스의 열용량에 기초하기 때문에, 적합한 가스 교정 계수는 설정되어 있다. 가스의 물질 유동은 단위 시간당 표준 부피로 표현되었다(Ncm³/분, 표준 조건, T= 273.14K, P= 0.101325 MPa). 측정 범위는 최대 범위의 정확도 1.0%에서 2000 Ncm³/분이었다. 가스의 측정된 질량 유동은 질소로 공장에서 보정되었다. 공기에 대하여 가스 보정 계수는 1.0이었다.

배기 가스 분석기:배기 가스 분석기는 이산화탄소 측정을 위해 마이크로프로세서-제어되는 산소 분석기 OXOR 610 및 마이크로프로세서-제어되는 NDIR 가스 분석기(독일 함부르크 소재의 마이하크(Maihak)사 제품, UNOR 610)를 포함하였다. 두 창치 모두는 RS-232를 통하여 공정 조작 컴퓨터에 연결되어 있다.

살균: 생물 반응기, 모든 공급 및 배출 파이프, 및 생성물을 위한 용기를 포화 증기압(121℃에서 0.2 MPa)에서 20분 동안 살균하였다. 살균 저장 용액, 및 공기 공급 및 배기 가스 라인을 특별한 강철 살균 커플링을 통하여 연결하였다.

미생물:미생물 글루코노박터 서복시단스인 IFO 3291은 1992년 3월 30일자로 일본 발효 연구소(Fermentation Research Institute)에서 FERM BP-3813으로 부타페스트 협약하에 기탁되어 사용되었다.

배지:연속적인 배지는 4개의 각각의 저장 용액으로 이루어졌다. 건조 생체량을 간단히 결정하기 위해서, 모든 용액을 고체로부터 유리해야 했다. 콘스팁 분말은 높은 비율의 불용성 구성성분을 포함하고, 콘스팁용액은 적합하게 처리되었다(본원 이후 참조). 생성된 배지의 농도는 g/ℓ로 주어진다. 그러나 생성된 배지가 구성된 각각의 저장 용액은 각각의 구성성분을 무게를 재어서 그의 제조를 간단히 하기 위하여 중량%로서 계산되었다. 하기 용액이 사용되었다:

1: D-소르비톨 용액, 50.4% D-소르비톨, ρ는 1.22 kg/ℓ; 로트(lot) 크기 20ℓ

2: 콘스팁 용액: 2% 콘스팁 분말(프랑스 소재의 로퀘트(Roquette)사 제품) 및 탈염수 중의 표 2 당 염; 배치 크기: 20ℓ. 살균하기 전에, 용액을 4000g을 10분 동안 원심 분리시켰다. 살균한 용액을 20ℓ의 빈 살균 병속으로 0.2㎛ 막 필터 모듈(젤만 수포르(Gelman Supor) DCF CFS92DS, 살균)의 정면에 3㎛ 깊이-층 필터 모듈(사토리우스(Sartorius) 5521307P900A, 살균)을 통하여 여과시켰다; ρ는 1.01kg/ℓ.

3. 효모 추출물 용액; 4% 효모 추출물 분말, 옥소이드(Oxoid), 및 탈염수 중의 표 2 당 염; ρ는 1.01 kg/ℓ; 배치 크기: 10ℓ

4. 물: 탈염수 중의 표 2 당 염; ρ는 1.00 kg/ℓ; 배치: 20ℓ

5. pH 조정용 3N 부식성 소다 용액; ρ는 1.25 kg/ℓ; 배치 크기: 2ℓ

사용된 미생물이 항상 소량의 산 대사산물을 생산하기 때문에, pH를 조절하는데 산은 필요하지 않았다. 복합 영양원의 용액 농도는 중량을 재었을 때 상응하는 건조 분말에 관한 것이다. 콘스팁 용액의 경우에서, 이는 단리된 고체는 규정 농도 중에 포함됨을 의미한다. 그러나, 고체는 통상적으로 생물이 이용하지 못하기 때문에, 실험 또는 생산 규모에 사용된 고체를 함유하는 콘스팁 용액과 비교될 수 있다.

저장 용액 2 및 4, 및 생성된 배지 중에서 염의 농도

염	C_sit.F에서 저장 용액=275 g/ℓ/%	C_sit.F에서 저장 용액=137.5 g/ℓ/%	배지/(g/ℓ)
MgCl₂ㆍ6H₂O	0.029	0.021	0.176
KH₂PO₄	0.055	0.039	0.330
CaCl₂ㆍ2H₂O	0.014	0.010	0.083

생성된 배지에서의 염 농도는 합성된 물의 농도와 유사해야 한다. 용액 2 및 4, 및 처음 4개의 용액으로부터 생성된 배지에서의 염 농도는 표 2에서 수득될 수 있다. D-소르비톨 용액(용액 1)은 어떠한 염도 함유하고 있지 않기 때문에, 용액 2 및 4의 염 농도는 상응하게 더 높아져야 한다. 용액 5의 소비는 염 농도를 계산할 때 무시해도 좋고 무시되어야 한다.

모든 용액을 포화 증기압(121℃에서 0.2 MPa)에서 20분 동안 살균하였다.

공급시 일정한 희석 속도(D= 0.1h^-1) 및 일정한 D-소르비톨 농도(C_sit.F= 275 g/ℓ)가 선택되었다. 콘스팁 및 효모 추출물의 공급 농도는 최적화 공정에 의해 사전 설정되었다. 사전 설정된 농도 및 희석률을 사용하여 각 경우에 따라 생물 공정 자동화 시스템은 각각의 저장 용액에 대한 필요한 질량 유량을 계산하였다. 계산된 질량 유량은 생물 공정 자동화 시스템에 결합된 제어기 내에서 전환되고 일정하게 유지된다. 순환 시간은 1 초이었다. 이는 최적화 루틴에 의해 산출된 음성 펄스 및 복합 영양원의 신규하게 계산된 공급 농도가 정확하게 지지됨을 보증한다.

이러한 특별한 실시예에 대한 최적화 루틴의 완성: 대사 활성에 대한 선택된 특징적인 측정 신호는 이산화탄소 생성 속도(CPR)이었다.

총량에 대한 특징적인 측정 신호는 가상의 이산화탄소 농도이었다(부피 당 D-소르비톨 당량):

희석률(D)은 일반적으로 일정하였기 때문에, 이산화탄소 생성 속도(CPR) 및 가상의 이산화탄소 농도(C_CO2.virt)에서의 변화는 선형 방식으로 달라진다.

그러므로, 이러한 실시예의 특별한 경우에서, 총량에 대한 제어 변수는 실제 가상의 이산화탄소 농도 및 가상의 이산화탄소 농도에 대한 설정 값으로부터 계산되었다:

이러한 특별한 예에서, 다중 구성성분 제어기는, 예컨대 다음 퍼지 상관관계 함수를 갖는 퍼지이론 제어기의 형태로 구성되었다: 예를 들어, 함수의 수치 0.7은 "매우 낮은" 0.33의 상관관계를 나타내고, "낮은" 0.67의 상관관계를 나타냈다. 바꾸어 말하면, 언어의 의미에서 Ψ_GM의 수치가 0.7일 경우, "매우 낮은" 33% 및 "낮은" 67%를 의미한다.

제어 변수 Q_sens및 Ψ_GM또는 Q'_sens및Ψ_GM의 수치는 소위 대응 함수를 포함하는 퍼지이론 언어 변수로 번역된다. 이러한 공정은 또한 "퍼지이론화"로도 명명된다. 제어 변수만이 다른 동일한 퍼지이론 제어기는 정지된 복합 영양원, 및 펄스 반응 시간이 실제 순환 동안에 측정되는 복합 영양원에 사용되었기 때문에, 다음부터는 Q_sens와 Q'_sens사이에 구분이 없어진다. 언어 입력 변수 Q_sens및 Ψ_GM은 연결되어 있고 언어 출력 변수는 "만일...이면" 규칙에 의해 관련되어 있다. 상관 함수와의 연관성이 가파르기 때문에, 많은 규칙들은 동시에 적용될 수 있다.

규칙은 상관 값의 기초로 무게를 잰다. 언어 출발 변수는 제어기 출력(X_a)을 나타내는 수치로 변형되어 되돌아온다. 이 공정을 또한 "퍼지이론화"라고도 한다.

퍼지이론에 대한 추가의 정보는 관련된 문헌으로부터 수득될 수 있다(문헌[Zimmermann(Ed): Fuzzy-Technologien-Prinzipien, Werkzeuge, Potentiale. Dusseldorf: VDI-Verlag, 1993]).

최적화 루틴을 사용함으로써 완성된 발효 유출량: 조절된 공정을 13일의 기간에 걸쳐서 관찰하였다. 제어 변수(C_co2.virt) 및 2개의 보정 변수는 서로 약 1/2 일의 시간 벌충으로 변동한다. 외관상으로 퍼지이론 제어기는 설정 값으로부터 제어 변수(C_co2.virt)가 일탈할 정도로 다소 너무 급격하게 반응한다. 그러나, 이러한 변동은 증가하지 않고 전체 공정은 여전히 안정하다. 제어 변수(Q_sens)는 불규칙한 간격으로 설정 값 주위에서 변동한다. 여기에서 심지어, 불안정한 움직임을 관찰하지 못하였다.

양적인 비율의 최적화:제어 변수(Q_sens)를 완전히 안정화시키기 위해서, 복합 영양원의 품질에서 인위적인 변동을 만들었다. 이 때문에, 복합 영양원의 저장 병을 다른 제조 회사로부터 상이한 품질의 복합 영양원을 포함하는 병으로 각각 대체하였다.

특별히 유익한 예는 옥소이드(Oxoid) 효모 추출물을 로트(Roth) 효모 추출물로의 변경이다. 효모 추출물에 대한 콘스팁의 비는 약 3:1 내지 1:1로 변경하였다. 옥소이드 효모 추출물로 다시 바꾼 후, 예전의 비율을 회복시켰다. 조절은 약 3일 내지 7 유체 역학의 체류 시간이 걸렸다.

효모 추출물에서의 변경은 설정 값으로부터 상당한 편차를 갖는 몇몇 경우를야기하였다. 그러나, 최적화 공정은 심지어 이러한 상황에서도 안정한 공정을 유지할 수 있다.

총량의 조정: 총량의 복합 영양원(C_co2.virt)에 대한 제어 변수의 전이로 최적화 공정을 교체한 후, 가상의 이산화탄소 농도(C_co2.virt) 및 복합 영양원(C_CS,F및 C_YE,F)의 공급 농도의 시간에 있어서 가상의 이산화탄소 농도(C_co2.virt)의 조정을 초기 설정값 6 g/ℓ에 대하여 비교적 높은 출발 값 약 13 g/ℓ로부터 변화. 파트 7의 우측에서 초과량이 명백히 인지되었다. 조정은 4일 또는 약 10 체류 시간이 걸린다.

설정 값에 도달한 후, L-소르보스와 관련한 몰 수율은 90.3%에서 91.1%로 향상되었다. 공급시 복합 영양원(C_CS,F및 C_YE,F)의 농도는 평균적으로 각각 51% 및 56% 만큼 감소하였다.

본 발명에 의하여 공정 동안 배지에서 복합 영양원의 비율이 미생물의 실제 요구와 실제 품질에 일정하게 재적응되게 함으로써 생물 공정을 최적으로 실행하는 개선된 최적화 방법이 제공된다.

Claims

복합 영양원의 신규한 공급 농도가 최적화 루틴(routine)에 의해 계산되고 조절되며, 미생물의 대사 활성이 사전 설정된 백분율로 감소될 때까지 각각의 영양원의 공급이 주기적으로 교대로 정지되는, 복합 영양원 혼합물을 포함하는 생물 공정을 최적화시켜 실행하는 방법.
제 1 항에 있어서,

최적화 루틴이 제어 변수를 산출하기 위한 조정 제어기, 복합 구성성분 제어기, 및 복합 영양원의 공급 농도를 제어하기 위한 수단을 포함하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

2개의 상이한 복합 영양원 혼합물을 사용하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

최적화 루틴이, 음성-펄스 반응 기술(negative-pulse response technique)을 사용하여 반응 시간을 산출하고 이를 사용하여 입력 변수(Q_sens)를 형성하는 조정 제어기를 포함하는 플로차트(flow chart)에 상응하는 방법.
제 2 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,

복합 구성성분 제어기가 퍼지이론 제어기인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

복합 영양원의 공급 농도와 복합 영양원의 총량의 비가 독립 제어 변수로서 간주되나 동시에 조절되는 방법.
제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,

미생물이 글루코노박터 서복시단스(Gluconobacter suboxydans)인 방법.
제 7 항에 있어서,

D-소르비톨이 L-소르보스로 전환되는 방법.
복합 영양원의 신규한 공급 농도가 최적화 루틴에 의해 계산되고 조절되며, 미생물의 대사 활성이 사전 설정된 백분율로 감소될 때까지 각각의 영양원의 공급이 주기적으로 교대로 정지되고,

(a) 미생물 공정을 수행하고 영양원을 공급하기 위한 2개 이상의 개별 공급 라인을 포함하는 반응기;

(b) 미생물의 대사 활성을 측정하기 위한 감지기(sensor);

(c) 감지기에 의해 제어되는 조정 제어기;

(d) 복합 구성성분 제어기; 및

(e) 복합 영양원의 공급 농도를 제어하기 위한 부재를

포함하는, 복합 영양원 혼합물을 포함하는 미생물 공정을 최적화시켜 실행하기 위한 장치.
제 9 항에 있어서,

(b) 내지 (e)가 도 1에 도시된 바와 같이 배치되어 있는 장치.
특히 실시예 및 도면에서 기재된 전술한 바와 같은 발명.