BR112017005354B1 - Métodos de criação de um banco de células de densidade ultra-alta - Google Patents
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Abstract
"métodos de criação de um banco de células de densidade ultra-alta". são fornecidos métodos para a criação de bancos de células criopreservadas de densidade ultra-alta. em certas modalidades, estes métodos empregam técnicas de cultura de perfusão alteradas que levam em conta a produção de culturas de células de densidade ultra-alta que podem ser criopreservadas em densidades de células inesperadamente elevadas sem a necessidade de quaisquer etapas de concentração celular, enquanto retém uma excelente viabilidade e qualidade celular.
Description
[0001] Este pedido reivindica a prioridade para o Pedido Provisório U.S. No: 62/052.257, depositado em 18 de Setembro de 2014. Onde permitido, o pedido anterior é incorporado por referência para qualquer e todos os propósitos.
[0002] A criação de um banco de células é amplamente utilizada para manter estoques de células caracterizadas congeladas que podem ser descongeladas para uso em várias aplicações, incluindo a produção de proteínas terapeuticamente relevantes. Tipicamente, os estoques criopreservados são mantidos em densidades mais baixas (por exemplo, ao redor de 1 ou 2 x 107 células/ml) ou são centrifugados para criar alíquotas de maior densidade para armazenamento. Os estoques de densidade mais baixa não levam em conta a inoculação eficiente de grandes culturas em volume, e os métodos de concentração podem danificar as células, reduzindo assim a viabilidade celular do estoque congelado. Por estas razões, os métodos anteriores de criação de um banco de células são relativamente ineficientes e, em última análise, não permitem a produção rápida de culturas de células de alta densidade a partir dos estoques congelados. Consequentemente existe uma necessidade de métodos melhorados de criação de um banco de células.
[0003] A presente divulgação fornece métodos aperfeiçoados para a criação de um banco de células de densidade ultra-alta. Em certas modalidades, os métodos da invenção empregam técnicas de cultura de células de perfusão melhoradas que permitem a produção de culturas de células de densidade ultra-alta que podem ser criopreservadas em densidades de células inesperadamente elevadas sem a necessidade de quaisquer etapas de concentração celular, enquanto retém excelente viabilidade celular para posterior uso na cultura de células de produção.
[0004] Consequentemente, em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para a produção de um banco de células congeladas de densidade ultra-alta diretamente a partir de uma população de células cultivadas, o método compreendendo: o cultivo de células em um biorreator de perfusão para obter uma população de células de densidade ultra-alta com uma concentração de pelo menos 1,0 x 10A8 células/ml, em que dito biorreator de perfusão está acoplado a um sistema de retenção de células; e adição de protetor criogênico à população de células de densidade ultra-alta para produzir um banco de células congeladas de densidade ultra-alta, em que o banco de células congeladas de densidade ultra-alta possui uma concentração de pelo menos 1,0 x 10A8 células/ml, e em que nenhuma etapa de concentração adicional é executada entre o cultivo das células e a adição de protetor criogênico à população de células de densidade ultra-elevada.
[0005] Em certas modalidades, o sistema de retenção de células compreende um sistema de filtração de fluxo tangencial alternante compreendendo um filtro. Em certas modalidades, o filtro possui uma área de superfície de pelo menos cerca de 0,08 m2. Em certas modalidades, o filtro possui uma área superficial de cerca de 0,08 m2 a cerca de 0,3 m2, cerca de 0,3 m2 a cerca de 0,5 m2, cerca de 0,5 m2 a cerca de 1,0 m2, cerca de 0,7 m2 a cerca de 0,8 m2, cerca de 1,0 m2 a cerca de 2,0 m2, cerca de 2,0 m2 a cerca de 3,0 m2, cerca de 3,0 m2 a cerca de 4,0 m2, ou cerca de 4,0 m2 a cerca de 5,5 m2. Em certas modalidades, o filtro possui um tamanho de poro selecionado do grupo que consiste de 0,2 μm, 0,4 μm e 0,65 μm. Em outras modalidades, o filtro possui um tamanho de poro selecionado do grupo que consiste em 0,7 μm, 1,2 μm e 7 μm.
[0006] Em certas modalidades, a população de células de densidade ultra-alta possui uma densidade celular viável selecionada do grupo que consiste ao redor de 1,0 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,1 x 10A8 células/ml. ao redor de 1.2 x 10A8 células/ml. ao redor de 1.3 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,4 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,6 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,8 x 10A8 células/ml, e ao redor de 2,0 x
[0007] Em certas modalidades, adição de sulfóxido de dimetila (DMSO) à população de células de densidade ultra-alta em uma concentração final de cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol. Em certas modalidades, a criopreservação compreende o congelamento de pelo menos uma parte da população de células de densidade ultra-alta em um recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação.
[0008] Em certas modalidades, o recipiente é um frasco. Em certas modalidades, o banco de células congeladas de densidade ultra-alta compreende ao redor de 4,5 x 10A8 células/frasco.
[0009] Em certas modalidades, o recipiente é uma bolsa criogênica. Em certas modalidades, a bolsa criogênica possui um volume de cerca de 5 a cerca de 150 ml. Em certas modalidades, o banco de células congeladas de densidade ultra-alta possui uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 x 10A8 células/ml.
[00010] Em certas modalidades, a taxa de perfusão no biorreator de perfusão está entre cerca de 0,02 nl/célula/dia a cerca de 0,5 nl/célula/dia. Em certas modalidades, a taxa de perfusão no biorreator de perfusão está entre 0 e 15 volumes de reator por dia.
[00011] Em certas modalidades, a cultura de células do biorreator de perfusão possui um pH entre cerca de 6,8 a cerca de 7,2.
[00012] Em certas modalidades, a cultura de células do biorreator de perfusão possui uma concentração de oxigênio dissolvido (DO) de pelo menos cerca de 30%. Em certas modalidades, o biorreator é um biorreator de bolsa flexível. Em certas modalidades, o biorreator compreende um filtro incorporado.
[00013] Em certas modalidades, o banco de células congeladas de densidade ultra-alta possui uma viabilidade celular pós-descongela- mento de pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95%.
[00014] Em certas modalidades, as células são células de mamífero. Em certas modalidades, as células de mamífero são selecionadas do grupo que consiste de: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO- K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst cells, PER.C6, SP2/0-Agl4, e células do hibridoma. Em certas modalidades, as células são células transfectadas. Em certas concretizações, as células expressam uma proteína terapêutica.
[00015] Em certas modalidades: o biorreator de perfusão compreende um biorreator de bolsa flexível; o filtro possui uma área superficial de filtro de pelo menos 0,3 m2 e uma dimensão de corte de peso molecular (MWCO) de pelo menos 50 kDa; o protetor criogênico adicionado à população de células de densidade ultra-alta é DMSO; e o banco de células congeladas de densidade ultra-alta compreende cerca de 5% a cerca de 10% vol/vol de DMSO.
[00016] Em certas modalidades, o pH e o DO da cultura são controlados por métodos automatizados. Em certas modalidades, o pH e o DO da cultura são controlados por métodos não automatizados. Em certas modalidades, o pH e o DO são controlados através de qualquer um ou mais dos seguintes: ajuste da mistura de gases que são introduzidos na cultura, ajuste da taxa de oscilação do biorreator ou ajuste do ângulo de oscilação do biorreator. Em certas modalidades, o biorreator é agitado em 15 rpm com um ângulo de oscilação de 8 °. Em certas modalidades, o biorreator é agitado em 22 rpm com um ângulo de oscilação de 10 °. Em certas modalidades, o biorreator é agitado em 25 rpm com um ângulo de oscilação de 12 °.
[00017] Em certas modalidades, a população de células de densidade ultra-alta é esfriada e mantida em uma temperatura ao redor de 4°C antes e durante a adição do protetor criogênico e distribuição. Em certas modalidades, a população de células de densidade ultra-alta é mantida em uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 26°C durante a adição do protetor criogênico e distribuição. Em certas modalidades, a população de células de densidade ultra-elevada é mantida em uma temperatura fria não controlada mediante o uso de um banho de água gelada durante a adição do protetor criogênico e distribuição.
[00018] Figura 1: é um desenho de um processo de criação de um banco criogênico de células de densidade ultra-alta.
[00019] Figura 2: é um gráfico que representa a densidade celular viável (células/ml), a taxa de perfusão (RV/dia) e a taxa de perfusão específica de célula 10X (nl/célula-dia) em uma cultura exemplar da linhagem celular 1 de rCHO.
[00020] Figura 3: é um gráfico que representa o perfil de pH offline em uma cultura da linhagem celular 1 de rCHO.
[00021] Figura 4A-C: é uma série de gráficos que descrevem o perfil de crescimento de células pós-descongelamento (A), a porcentagem de células apoptóticas tardias pós-descongelamento (B), e a taxa de produção específica (unidades/células E9-dia) para uma alíquota de banco de células ultra-HD de 5 ml da linhagem celular 1 de rCHO.
[00022] Figura 5: é um gráfico que representa a densidade celular viável (células/ml), a taxa de perfusão (RV/dia) e a taxa de perfusão específica de células 10X (nl/célula-dia) em uma cultura exemplar da linhagem celular 2 de rCHO.
[00023] Figura 6: é um gráfico que representa o perfil de pH offline em uma cultura da linhagem celular 1 de rCHO.
[00024] Figura 7: é um gráfico que descreve o crescimento celular baseado na densidade de células viáveis Xv (células/ml, linhas contínuas) e viabilidade (linhas pontilhadas) para a linhagem celular 2 de rCHO quando semeadas em 0,5 x 10A6 vc/ml em frascos de agitação de 250 ml e 3 L.
[00025] Figura 8: é um gráfico que descreve o crescimento celular baseado na densidade de células viáveis Xv (células/ml, linhas contínuas) e viabilidade (linhas pontilhadas) para a linhagem celular 2 de rCHO quando semeadas em 1,0 x 10A6 vc/ml em frascos de agitação de 250 ml e 3 L.
[00026] Figura 9: é um gráfico que representa a porcentagem de células apoptóticas e mortas tardias em uma cultura da linhagem celular 2 de rCHO quando semeadas em 0,5 x 10A6 vc/ml em frascos de agitação de 250 ml e 3 L.
[00027] Figura 10: é um gráfico que representa a porcentagem de células apoptóticas e mortas tardias em uma cultura de linhagem celular 2 de rCHO quando semeadas em 1,0 x 10A6 vc/ml em frascos de agitação de 250 ml e 3 L.
[00028] Figura 11: é um gráfico que representa a taxa de produção específica (SPR) em culturas de frascos de agitação da linhagem celular 2 de rCHO quando semeadas a 0,5 x 10A6 vc/ml em frascos de agitação de 250 ml e 3 L.
[00029] Figura 12: é um gráfico que representa a taxa de produção específica (SPR) em culturas de frascos de agitação da linhagem celular 2 de rCHO quando semeadas em 1,0 x 10A6 vc/ml em frascos de agitação de 250 ml e 3 L.
[00030] Figura 13: é um gráfico que representa o crescimento de células em bolsas WAVE com base na densidade de células viáveis Xv (células/ml; linhas contínuas) e viabilidade (linhas pontilhadas) para a linhagem celular 2 de rCHO.
[00031] Figura 14: é um gráfico que representa a porcentagem de células apoptóticas e mortas tardias em uma cultura de linhagem celular 2 de rCHO.
[00032] Figura 15: é um gráfico que representa a densidade celular viável (células/ml), a taxa de perfusão (RV/dia) e a taxa de perfusão específica celular 10X (nl/célula-dia) em uma cultura exemplar da linhagem celular 3 de rCHO.
[00033] Figura 16: é um gráfico que representa o perfil de pH offline em uma cultura da linhagem celular 3 de rCHO.
[00034] Figura 17A-C: é uma série de gráficos que representam o crescimento de células (A) (linhas contínuas) e a viabilidade (linhas pontilhadas); (B) a porcentagem de células apoptóticas e mortas tardias; e (C) taxa de produção específica (SPR) em culturas de frascos de agitação da linhagem celular 3 de rCHO.
[00035] Figura 18: é um gráfico que compara a densidade celular viável (células/ml, linhas contínuas) e a viabilidade (linhas pontilhadas) com meio interno (preto) e meio CD CHO (cinzento) em uma cultura exemplar da linhagem celular 3 de rCHO.
[00036] Figura 19: é um gráfico que compara a taxa de perfusão (círculos, linhas contínuas) e a taxa de perfusão específica das células (triângulos, linhas pontilhadas) com meio interno (preto) e meio CD CHO (cinzento) em uma cultura exemplar da linhagem celular 3 de rCHO.
[00037] Figura 20: é um gráfico que compara a densidade celular viável (células/ml, linhas sólidas) e a viabilidade (linhas pontilhadas) com meio CD CHO suplementado com meio Efficient Feed B (preto) e CD CHO (cinzento) em uma cultura exemplar da linhagem celular 1 de rCHO.
[00038] Figura 21: é um gráfico que compara a taxa de perfusão (círculos, linhas contínuas) e a taxa de perfusão específica das células (triângulos, linhas pontilhadas) com meio CD CHO suplementado com meio Efficient Feed B (preto) e CD CHO (cinzento) em uma cultura exemplar da linhagem celular 1 de rCHO.
[00039] Figura 22: é um gráfico que representa a densidade celular viável (células/ml, linhas contínuas) e a viabilidade (linhas pontilhadas) utilizando o biorreator 20-L WAVE (volumes de trabalho 10-L, preto) e o biorreator 10-L WAVE (volume de trabalho 5-L, cinzento) em uma cultura exemplar da linhagem celular 3 de rCHO.
[00040] A presente divulgação fornece um método de criação de um banco criogênico de células de densidade ultra-alta que compreende o uso de um sistema de cultura de perfusão ligado a um dispositivo de retenção de células não centrífugas. I. Definições
[00041] Como aqui utilizado, o termo "cultura por batelada" refere-se a uma técnica de cultivo de células em que uma quantidade de meio de cultura fresco é inoculada com células que rapidamente entram em uma fase de crescimento logarítmico e em que o meio de crescimento da cultura não é continuamente removido e substituído com meio fresco.
[00042] Como aqui utilizado, o termo "cultura por batelada alimentada" refere-se a uma técnica de cultivo de células em que uma quantidade de meio de cultura fresco é inicialmente inoculada com células inicialmente, e nutrientes de cultura adicionais são alimentados (continuamente ou em incrementos discretos) à cultura durante o processo de cultivo, com ou sem colheita periódica de células e/ou produtos antes do término do cultivo.
[00043] Como aqui utilizado, o termo "cultura de perfusão" refere-se a uma técnica de cultivo de células em que uma quantidade de meio fresco é inoculada com células que rapidamente entram em uma fase de crescimento logarítmico (como acima) e em que o meio de crescimento é continuamente removido de uma cultura e substituído com meio fresco.
[00044] Como aqui utilizado, o termo "biorreator" deve referir-se a um recipiente para o cultivo de células.
[00045] Em uma modalidade, o biorreator é um "biorreator de bolsa flexível". Um "biorreator de bolsa flexível" é uma câmara estéril capaz de receber um meio líquido e inóculo de células que compreende adicionalmente conectores, orifícios, adaptadores e tubos flexíveis. Em uma modalidade, a câmara é feita de plástico. Em uma modalidade específica, a câmara é feita de plástico transparente laminado de múltiplas camadas. Em uma outra modalidade específica, a câmara é feita de plástico transparente laminado de múltiplas camadas e possui uma camada de contato fluida produzida de copolímero de acetato de etileno vinila/polietileno de baixa densidade USP Classe VI enquanto a camada externa é produzida de polietileno de baixa densidade.
[00046] Adicionalmente, os conectores, orifícios de admissão e adaptadores podem ser produzidos de qualquer tipo de plástico incluindo, mas não limitado a estes: polietileno, polipropileno e policarbonato, enquanto que a tubagem pode ser construída a partir de qualquer tipo de plástico, incluindo, mas não limitado a estes: elastômero termoplástico ou silicone (Por exemplo, silicone curado com platina).
[00047] Os biorreatores de bolsa flexível apropriados podem ser comumente encontrados na técnica e incluem, mas não são limitados a estes, aqueles descritos na Patente US No. 6.544.788, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[00048] O biorreator de bolsa flexível pode ser parcialmente carregado com meio de cultura e depois inflado para rigidez. Ele pode então ser colocado em uma plataforma de agitação (tal como uma unidade oscilante (tal como uma unidade oscilante BASE20/50EHT da GE Life Sciences) que se move para frente e para trás através de um ângulo de oscilação predefinido e taxa de oscilação predefinida. Este movimento oscilante induz movimentos semelhantes à onda nos meios de cultura, promovendo agitação e transferência de oxigênio para melhorar o desempenho da cultura celular. O ângulo de oscilação predefinido pode ser pelo menos ao redor de 4 graus, por exemplo, ao redor de 4 graus, 5 graus, 6 graus, 7 graus, 8 graus, 9 graus, 10 graus, 11 graus ou 12 graus. Além disso, a taxa de oscilação predefinida pode ser ajustada na taxa de oscilação por minuto (rpm) que é pelo menos ao redor de 6 rpm, por exemplo, ao redor de 6 rpm, ao redor de 7 rpm, 8 rpm, 9 rpm, 10 rpm, 11 rpm, 12 rpm, 13 rpm, 14 rpm, 15 rpm, 16 rpm, 17 rpm, 18 rpm, 19 rpm, 20 rpm, 21 rpm, 22 rpm, 23 rpm, 24 rpm, 25 rpm, 26 rpm, 27 rpm, 28 rpm, 29 rpm, 30 rpm, 31 rpm, 32 rpm, 33 rpm, 34 rpm, 35 rpm, 36 rpm, 37 rpm, 38 rpm, 39 rpm ou 40 rpm. Em uma modalidade específica, a taxa de oscilação por minuto é ao redor de 22 rpm.
[00049] Como aqui utilizado, o termo "sistema de retenção de células" refere-se a todos os dispositivos com a capacidade de separar células do meio e dos produtos residuais ali contidos através do uso de um filtro. Os filtros podem incluir filtros de membrana, cerâmicos ou de metal em qualquer forma incluindo enrolada em espiral, tubular ou lâmina. Os filtros podem ser de diferentes áreas de superfície. Por exemplo, a área de superfície do filtro pode ser de cerca de 0,08 m2 a cerca de 5,5 m2, por exemplo, ao redor de 0,08 m2, 0,09 m2, 0,1 m2, 0,2 m2, 0,3 m2, 0,4 m2, 0,5 m2, 0,6 m2, 0,7 m2, 0,77 m2, 0,8 m2, 0,9 m2, 1,0 m2, 1,1 m2, 1,2 m2, 1,3 m2, 1,4 m2, 1,5 m2, 1,6 m2, 1,7 m2, 1,8 m2, 1,9 m2, 2,0 m2, 2,1 m2, 2,2 m2, 2,3 m2, 2,4 m2, 2,5 m2, 2,6 m2, 2,7 m2, 2,8 m2, 2,9 m2, 3,0 m2, 3,1 m2, 3,2 m2, 3,3 m2, 3,4 m2, 3,5 m2, 3,6 m2, 3,7 m2, 3,8 m2, 3,9 m2, 4,0 m2, 4,1 m2, 4,2 m2, 4,3 m2, 4,4 m2, 4,5 m2, 4,6 m2, 4,7 m2, 4,8 m2, 4,9 m2, 5,0 m2, 5,1 m2, 5,2 m2, 5,3 m2, 5,4 m2, ou 5,5 m2. Em certas modalidades, o módulo de filtro possui uma dimensão de corte de peso molecular (MWCO) de cerca de 10 kilodaltons (kDa) a cerca de 100 kDa, por exemplo, está ao redor de 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa ou 100 kDa. Em outras modalidades, o módulo de filtro possui um tamanho de malha de cerca de 0,1 μm a cerca de 7 μm, por exemplo, ao redor de 0,1 μm, 0,2 μm, 0,3 μm, 0,4 μm, 0,5 μm, 0,6 μm, 0,7 μm, 0,8 μm, 0,9 μm, 1,0 μm, 1,1 μm, 1,2 μm, 1,3 μm, 1,4 μm, 1,5 μm, 1,6 μm, 1,7 μm, 1,8 μm, 1,9 μm, 2,0 μm, 2,1 μm, 2,2 μm, 2,3 μm, 2,4 μm, 2,5 μm, 2,6 μm, 2,7 μm, 2,8 μm, 2,9 μm, 3,0 μm, 3,1 μm, 3,2 μm, 3,3 μm, 3,4 μm, 3,5 μm, 3,6 μm, 3,7 μm, 3,8 μm, 3,9 μm, 4,0 μm, 4,1 μm, 4,2 μm, 4,3 μm, 4,4 μm, 4,5 μm, 4,6 μm, 4,7 μm, 4,8 μm, 4,9 μm, 5,0 μm, 5,1 μm, 5,2 μm, 5,3 μm, 5,4 μm, 5,5 μm, 5,6 μm, 5,7 μm, 5,8 μm, 5,9 μm, 6,0 μm, 6,1 μm, 6,2 μm, 6,3 μm, 6,4 μm, 6,5 μm, 6,6 μm, 6,7 μm, 6,8 μm, 6,9 μm ou 7,0 μm.
[00050] Como aqui utilizado, o termo "criopreservação" refere-se a um processo pelo qual as células, tecidos ou quaisquer outras substâncias susceptíveis a danos causados pelo tempo ou por atividade enzimática ou química são conservados através do esfriamento e sua armazenagem em temperaturas inferiores a zero.
[00051] Como aqui utilizado, o termo "criação de um banco criogênico" refere-se a uma técnica através da qual as células são misturadas com um protetor criogênico (por exemplo, DMSO com ou sem amido de hidroxietila (HES)) e colocadas em um recipiente apropriado para armazenamento em condições de criopreservação. Estes recipientes são então congelados utilizando técnicas bem conhecidas na especialidade e armazenados em baixas temperaturas, tipicamente entre cerca de -130°C e cerca de -196°C. A coleta de células obtidas pelo processo é um banco de células.
[00052] Em uma modalidade, o banco de células é um banco de células de densidade ultra-alta. Como aqui utilizado, o termo "banco de células de densidade ultra-alta" irá se referir às alíquotas de células reunidas em banco criogênico que foram congeladas em uma densidade ultra-alta, em que a densidade é de pelo menos cerca de 1 x 10A8 células viáveis/ml, por exemplo, cerca de 1 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,1 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,2 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,3 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,4 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,5 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,6 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,7 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,8 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 1,9 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 2 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 3 x 10A8 células viáveis/ml, cerca de 4 x 10A8 células viáveis/ml, ou cerca de 5 x 10A8 células viáveis/ml. As células podem ser congeladas de acordo com qualquer método disponível na técnica e em qualquer recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação.
[00053] Em outra modalidade, o banco de células é um banco de células principal. Como aqui utilizado, o termo "banco de células principal" irá se referir a uma cultura de células (por exemplo, células completamente caracterizadas) que foram cultivadas a partir de um único clone, dispensadas em recipientes de armazenamento (por exemplo, dispensadas nos recipientes em uma única operação), e armazenadas sob condições de criopreservação como descrito acima. Em certas modalidades, as células são adequadas para uso posterior em uma cultura de células de produção e uma colheita adicional das proteínas terapeuticamente relevantes produzidas por elas.
[00054] Em outra modalidade, o banco de células é um banco de células de trabalho. Como aqui utilizado, o termo "banco de células de trabalho" irá se referir a uma cultura de células (por exemplo, células completamente caracterizadas) que foram cultivadas a partir de um único frasco do banco de células principal, ou de dois frascos agrupados do banco de células principal, dispensadas em recipientes de armazenamento (por exemplo, distribuídas nos recipientes em uma única operação), e armazenadas sob condições de criopreservação como descrito acima. Em certas modalidades, as células são adequadas para utilização posterior em uma cultura de células de produção e uma colheita adicional das proteínas terapeuticamente relevantes nelas produzidas.
[00055] Em outra modalidade, o banco de células é um pequeno banco de células. Como aqui utilizado, o termo "pequeno-banco" irá se referir às alíquotas de células que foram criopreservadas de acordo com os procedimentos de "criação de um banco criogênico" (como descrito acima), mas são compostas de menos amostras do que seriam normalmente utilizadas para criar um banco de células. Este tipo de banco pode ser geralmente utilizado para otimizar as condições que são consideradas para a criopreservação de uma linhagem celular antes dos bancos de células, tais como um "banco de células principal" é criado. Como um exemplo, um "pequeno-banco" é utilizado para determinar a densidade celular ideal para o procedimento de criação de um banco de células de densidade ultra-alta descrito nesta divulgação.
[00056] Como aqui utilizado, o termo "recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação" inclui qualquer recipiente que possa ser utilizado sob condições apropriadas para armazenamento de células entre cerca de -130°C e cerca de -196°C. Estes recipientes incluem, mas não são limitados a estes, frascos que são produzidos de materiais adequados para a criopreservação. Estes materiais incluem polímeros (por exemplo, politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno ou polipropileno). Além disso, os tratamentos de superfície podem ser aplicados a uma superfície do frasco de criopreservação de modo a melhorar as condições de criopreservação (por exemplo, revestimentos hidrófilos que reduzem a adsorção e a desnaturação). Nas modalidades exemplares, o frasco pode ter um volume de mais do que cerca de 0,1 ml, por exemplo, o frasco pode ter um volume ao redor de 0,1 ml, ao redor de 0,5 ml, ao redor de 0,75 ml, ao redor de 1 ml, ao redor de 1,5 ml, ao redor de 2 ml, ao redor de 2,5 ml, ao redor de 4,5 ml, ao redor de 10 ml, ao redor de 15 ml, ao redor de 20 ml, ao redor de 25 ml, ou ao redor de 50 ml. O recipiente também pode ser uma bolsa criogênica, que pode ter um volume de cerca de 30 ml, cerca de 50 ml, cerca de 100 ml, cerca de 150 ml, cerca de 200 ml, cerca de 300 ml, cerca de 400 ml ou cerca de 500 ml.
[00057] Como aqui utilizado, o termo "bolsa criogênica" é uma câmara estéril que é capaz de receber um meio líquido, é apropriado para armazenamento de células entre cerca de -130°C e cerca de - 196°C e pode adicionalmente compreender conectores, orifícios de admissão, adaptadores e tubos flexíveis. A bolsa criogênica pode ser construída de qualquer material apropriado incluindo, mas não limitado a estes, polímeros tais como politetrafluoroetileno (PTFE), poliestireno, polietileno, polipropileno, etileno propileno fluorado (FEP), poliolefina e acetato de etileno vinila (EVA). As bolsas criogênicas exemplares incluem, mas não são limitados a estas: bolsas KryoSure® Cryopreservation (Saint-Gobain), PermaLife™ Bags (OriGen Biomedical), bolsas de congelamento CryOStore (OriGen Biomedical), Freeze-Pak™ Biocontainers (Charter Medical) e as bolsas divulgadas no Pedido Provisório US No. 62/037.181 (Merial Ltd., uma empresa Sanofi), que é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, a bolsa criogênica pode sustentar um sistema de criação de um banco de células de fase fechada (por exemplo, através do uso de pelo menos dois condutos soldáveis estéreis que permite o carregamento do "sistema fechado" das bolsas).
[00058] Como aqui utilizado, o termo "frasco de agitação" irá se referir a um recipiente utilizado como um frasco de cultura em que o meio e a cultura de células são constantemente agitados durante a incubação.
[00059] Como aqui utilizado, o termo "grupo de sementes do frasco de agitação" deve referir-se a um método de expansão de células em que uma alíquota de células é em primeiro lugar cultivada (semeada) em um frasco de agitação e nele desenvolvida. As células são cultivadas de acordo com a sua taxa de crescimento e são geralmente divididas em recipientes maiores e/ou múltiplos durante o seu crescimento até a biomassa alcance um nível suficiente para inocular um biorreator. Como aqui utilizado, o termo "densidade de semente" irá se referir à densidade celular inicial em que um frasco ou biorreator é inoculado.
[00060] Como aqui utilizado, o termo "proteína terapeuticamente relevante" irá se referir a qualquer proteína que pode ser utilizada para criar um tratamento para uma doença ou distúrbio ou para tratar uma doença ou distúrbio em um animal, incluindo mamíferos tais como camundongos, ratos, macacos, primatas e seres humanos. Estas proteínas podem incluir, mas não são limitados a estas, polipeptídeos de ligação tais como anticorpos monoclonais, proteínas de fusão Fc, anticoagulantes, fatores sanguíneos, proteínas morfogenéticas ósseas, suportes de proteínas planejadas, enzimas, fatores de crescimento, hormônios, interferons, interleucinas e trombolíticos.
[00061] Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo de ligação" irá se referir a um polipeptídeo (por exemplo, um anticorpo) que contém pelo menos um sítio de ligação que é responsável pela ligação seletiva a um antígeno alvo de interesse (por exemplo, um antígeno humano). Sítios de ligação exemplares incluem um domínio variável de anticorpo, um sítio de ligação ao ligando de um receptor, ou um sítio de ligação de receptor de um ligando. Em certos aspectos, os polipeptídeos de ligação compreendem múltiplos sítios de ligação (por exemplo, dois, três, quatro ou mais).
[00062] Como aqui utilizado, o termo "anticorpo" refere-se a tais conjuntos (por exemplo, moléculas de anticorpo intactas, fragmentos de anticorpo ou suas variantes) que possuem atividade imunorreativa específica conhecida significativa para um antígeno de interesse (por exemplo, um antígeno associado a tumor). Os anticorpos e imunoglobulinas compreendem cadeias leves e pesadas, com ou sem uma ligação covalente intercadeia entre elas. As estruturas de imunoglobulina básicas nos sistemas vertebrados são relativamente bem compreendidas.
[00063] O termo genérico "anticorpo" compreende cinco classes distintas de anticorpos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Todas as cinco classes de anticorpos estão claramente dentro do escopo da presente divulgação, o seguinte debate geralmente será direcionado para a classe IgG de moléculas de imunoglobulina. Em relação à IgG, as imunoglobulinas compreendem duas cadeias leves idênticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, e duas cadeias pesadas idênticas de peso molecular 53.000 a 70.000. As quatro cadeias são unidas por ligações de dissulfeto em uma configuração "Y" em que as cadeias leves agrupam as cadeias pesadas começando na boca do "Y" e continuando através da região variável.
[00064] Como aqui utilizado, o termo "oxigênio dissolvido" ou "DO" é a porcentagem de gás de oxigênio dissolvido presente em um determinado líquido (tal como o meio de cultura de células) com base na saturação de ar.
[00065] Como aqui utilizado, o termo "taxa de perfusão específica da célula" (CSPR) irá se referir à taxa em que o meio de cultura celular é alimentado para a cultura celular expressa como o volume de meio adicionado por célula viável por dia (Ozturk, SS. Engineering challenges in high density culture systems. Cytotechnology. 1996; 22:3-16).
[00066] Como aqui utilizado, o termo "cerca de" irá se referir a uma faixa de tolerância de 10% em torno de um valor mencionado. Portanto, quando o termo "cerca de" é utilizado para modificar um valor mencionado, a faixa indicada abrangerá qualquer número dentro de ± 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% do valor mencionado. II. Cultura de Células de Perfusão
[00067] A cultura celular tradicional envolve um processo de cultivo por "batelada". Neste tipo de cultura, uma quantidade de meio fresco é inoculada com células que rapidamente entram em uma fase de crescimento logarítmico. À medida que essas células crescem e se dividem, consomem os nutrientes disponíveis do meio e excretam produtos residuais nocivos. Ao longo do tempo, a cultura entrará em uma fase de crescimento estacionária, e finalmente em uma fase de decadência. Embora as modificações no processo de cultura por "batelada" tenham se tornado mais eficientes ao longo do tempo, os protocolos de cultura por batelada modificados resultantes resultam ainda em ciclos rápidos de crescimento e decadência. Além disso, o processo de cultivo por "batelada" possui uma capacidade limitada para alcançar os níveis de densidade celular que são necessários para permitir a criação de um banco de células de alta densidade.
[00068] O processo de cultivo por "batelada alimentada" refere-se a uma melhora adicional na técnica de cultivo de células sobre as técnicas de cultivo por "batelada" tradicionais. Embora este processo leve em conta um maior crescimento da densidade celular, ele ainda é limitado na sua capacidade de permitir o crescimento eficiente das culturas de células de alta densidade e, portanto, gerar células de forma eficiente para a criação de um banco de células de alta densidade.
[00069] Nas modalidades preferidas, a invenção emprega um processo de cultivo de perfusão. O cultivo de perfusão é um método para o crescimento de células no qual uma quantidade de meio fresco é inoculada com células que rapidamente entram em uma fase de crescimento logarítmico (como acima) e em que o meio de crescimento é continuamente removido de uma cultura e substituído por meio fresco. Desta forma, a cultura constantemente recebe meio fresco com altos níveis de nutrientes, enquanto que o meio contendo produtos residuais e com menores níveis de nutrientes é removido. Este tipo de cultivo permite a manutenção do crescimento logarítmico das células nas quais pelo menos um meio volume de cultura é trocado por dia e as densidades celulares podem ser muito mais elevadas do que aquelas alcançadas na cultura por batelada tradicional ou modificada (um aumento entre 2 a mais do que 10 vezes). Em uma modalidade da presente invenção, a taxa de perfusão específica da célula (CSPR) pode estar entre cerca de 0,02 nl de célula-1 dia-1 e cerca de 0,5 nl de célula-1 dia-1, e pode ser ao redor de 0,02 nl de célula-1 dia-1, 0,025 nl de célula- 1 dia-1,0,05 nl de célula-1 dia-1, 0,1 nl de célula-1 dia-1, 0,2 nl de célula-1 dia-1, 0,3 nl de célula-1 dia-1, 0,4 nl de célula-1 dia-1, ou 0,5 nl de célula-1 dia-1. Em outra modalidade da presente invenção, a taxa de perfusão pode ser medida em volumes de reator por dia e pode estar entre 0 e 15 volumes de reator por dia, por exemplo, pode ser cerca de 0 volumes de reator por dia, cerca de 0,5 volumes de reator por dia, cerca de 1 volume de reator por dia, cerca de 2 volumes de reator por dia, cerca de 3 volumes de reator por dia, cerca de 4 volumes de reator por dia, cerca de 5 volumes de reator por dia, cerca de 6 volumes de reator por dia, cerca de 7 volumes de reator por dia, cerca de 8 volumes de reator por dia, cerca de 9 volumes de reator por dia, cerca de 10 volumes de reator por dia, cerca de 11 volumes de reator por dia, cerca de 12 volumes de reator por dia, cerca de 13 volumes de reator por dia, cerca de 14 volumes de reator por dia, ou cerca de 15 volumes de reator por dia. Em uma modalidade específica, a cultura de perfusão pode ser realizada em um biorreator com um mínimo de um tubo de imersão.
[00070] Em certas modalidades, o pH, a temperatura, a concentração de oxigênio dissolvido (OD) e a osmolaridade da cultura podem ser ajustados para maximizar a saúde e a produtividade da cultura. Um método de controle do DO e do pH das culturas é através de um controlador de realimentação automatizado. Este tipo de controlador automatizado opera utilizando computadores baseados em microprocessador para monitorar e ajustar o pH e o DO da cultura e assim manter as condições ideais para o crescimento celular. No entanto, estes sistemas automatizados de controle de realimentação são dispendiosos. Consequentemente, em certas modalidades, um método não automatizado de controle destes parâmetros pode ser empregado. Em uma modalidade exemplar, qualquer um de: ajuste da mistura de gás que flui sobre a cultura, ajuste da taxa de oscilação WAVE® ou ajuste do ângulo de oscilação da cultura pode ser utilizado para controlar os parâmetros selecionados (por exemplo, pH ou DO). Em certas modalidades, tanto o controle automático de realimentação quanto o controle não automático podem ser aplicados.
[00071] Em uma modalidade, o nível de partida de gás de dióxido de carbono é de cerca de 10% e o nível de partida de gás de oxigênio é de cerca de 20% com uma taxa de fluxo de ar de cerca de 0,2 litros por minuto (lpm). Se o pH não for mais do que cerca de 6,9, o ponto de ajuste de CO2 pode ser reduzido de 10% para 5%. Se o pH ainda não for mais do que cerca de 6,9 em um momento posterior, o ponto de ajuste de CO2 pode ser ainda reduzido de 5% para 0%. Se o pH ainda não for mais do que cerca de 6,9, a taxa de perfusão pode ser aumentada. Se o DO não for mais do que cerca de 45%, o ponto de ajuste de O2 deve ser aumentado de 20% para 30%. Se o DO não for mais do que cerca de 45% em um momento posterior, o nível de O2 deve ser aumentado de 30% para 40%, a velocidade de oscilação deve ser aumentada para cerca de 25 rpm e o ângulo de oscilação deve ser alterado para cerca de 12°. i. Meios de cultura celular
[00072] Qualquer tipo de meio de cultura celular adequado para o cultivo de células pode ser utilizado nos métodos da presente invenção. As diretrizes para a escolha de um meio celular apropriado são bem conhecidas na técnica e são fornecidas, por exemplo, nos capítulos 8 e 9 de Freshney, R. I. Culture of Animal Cells (a manual of basic techniques), 4th edition 2000, Wiley-Liss; e em Doyle, A., Griffiths, J.B., Newell, D.G. Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons. Cada uma destas referências é aqui incorporada na sua totalidade. Existem outros métodos na técnica para a preparação e a manutenção de culturas de células sob condições livres de componentes e livres de proteínas derivadas de animais (incluindo métodos concernentes às células CHO) tais como aqueles observados no Pedido de Patente Internacional No. WO 97/05240, No. WO 96/26266 e No. WO 00/11102, e Patentes US No. 6.100.061, No. 6.475.725 e 8.084.252. Cada um dos documentos precedentes é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Em uma modalidade da presente invenção, o meio livre de componente derivado de animal (ADC) pode ser utilizado. Os meios mínimos sintéticos convencionais podem conter sais inorgânicos, aminoácidos, vitaminas, uma fonte de carboidrato e água. Em uma modalidade específica da presente invenção, o meio que pode ser utilizado é CD-CHO (GIBCO, Invitrogen Corp., um meio livre de fonte animal que é quimicamente definido e não contém nenhuma proteína, hidrolisados ou componentes de origem desconhecida). Adicionalmente, o meio pode ter componentes adicionais incluindo glutamina e/ou metotrexato ou outros fatores que podem ajudar no crescimento ou na aderência. Em uma modalidade específica, o componente adicional pode ser GLUTAMAX-1 ou L- glutamina adicionada entre cerca de 2 mM e cerca de 8 mM, por exemplo, ao redor de 2 mM, ao redor de 3 mM, ao redor de 4 mM, ao redor de 5 mM, ao redor de 6 mM, ao redor de 7 mM ou ao redor de 8 mM. ii. Células hospedeiras e vetores de expressão
[00073] Em certas modalidades, as células empregadas no processo de criação de um banco de células da invenção são células hospedeiras que abrigam uma construção de expressão para a expressão de uma proteína terapeuticamente relevante ou outro polipeptídeo de interesse. Qualquer célula que pode ser utilizada para expressar um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um polipeptídeo de ligação) pode ser utilizada de acordo com os métodos aqui descritos. As células podem opcionalmente conter sequências de ácido nucleico de ocorrência natural ou recombinante, por exemplo, um vetor de expressão que codifica um polipeptídeo de interesse. O vetor de expressão pode opcionalmente conter controles de transcrição e de translação apropriados e pode ser construído utilizando tecnologia de DNA recombinante conhecida na técnica. Os vetores de expressão podem ser transferidos para qualquer célula de hospedeira por técnicas conhecidas na especialidade, e as células transformadas podem então ser cultivadas de acordo com o método da presente invenção para criar um banco de células de alta densidade. Além disso, o banco de células de alta densidade pode então ser descongelado e cultivado de acordo com as técnicas conhecidas na especialidade para produzir a proteína codificada de interesse e, quando desejado, esta proteína pode ser subsequentemente purificada.
[00074] Em certas modalidades, uma variedade de sistemas de expressão de hospedeiro pode ser utilizada para produzir proteínas terapeuticamente relevantes. Além disso, o sistema de expressão de hospedeiro pode ser um sistema de células de mamífero (por exemplo, CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4, e células do hibridoma) que abriga construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero. Os sistemas de expressão baseados em vírus também podem ser utilizados em conjunto com células de mamífero (ver, por exemplo, Logan et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:355-359, aqui incorporado por referência na sua totalidade). A eficiência da expressão pode ser aumentada pela inclusão de elementos incluindo (mas não limitado a estes) elementos intensificadores de transcrição apropriados e terminadores da transcrição (ver, por exemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544, aqui incorporado por referência na sua totalidade).
[00075] Em outras modalidades, uma cepa de célula hospedeira pode ser selecionada a qual modula a expressão das sequências inseridas ou que modifica e processa o produto genético na forma específica desejada. Diferentes células hospedeiras possuem mecanismos característicos e específicos para o processamento pós- translação e modificação de proteínas e produtos genéticos. As linhagens celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para garantir a modificação correta e processamento do polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo de ligação) expresso. Tais células incluem, por exemplo, linhagens celulares de mamífero estabelecidas e células animais, assim como linhagens celulares de inseto, células fúngicas e células de levedura. iii. Biorreatores
[00076] Qualquer biorreator adequado para o cultivo de células sob condições de cultura de perfusão pode ser utilizado nos métodos da invenção. O biorreator pode ser inoculado utilizando uma alíquota de células em uma densidade de semente apropriada (tal como um frasco de células ou células de uma cultura de partida, por exemplo, um frasco de agitação ou um conjunto de sementeira de frasco de agitação, que foram cultivadas para nessa densidade). A densidade de sementes apropriada para uma cultura depende de vários fatores incluindo o tipo de células utilizadas e o biorreator a ser inoculado. A densidade de sementes apropriada pode ser determinada utilizando métodos disponíveis na técnica.
[00077] Em certas modalidades, o biorreator pode ser de uma natureza descartável, por exemplo, o biorreator pode ser uma bolsa flexível ou um frasco de plástico que está conectado ao dispositivo de retenção de células por meio de tubos flexíveis. O projeto pode incluir, mas não é necessário incluir, um conduto de entrada e um conduto de saída ou de inoculação, que pode ser soldado de forma estéril ou conectado à fonte das células eucarióticas. Em certas modalidades, o biorreator possui um volume de pelo menos cerca de 1 L, por exemplo, cerca de 1 L, 2 L, 5 L, 10 L, 20 L, 50 L, 75 L, 85 L, 100 L, 150 L ou 400 L. Em uma modalidade específica da invenção, o biorreator é uma bolsa flexível de 10 L que foi personalizada com um ou dois tubos de imersão que são utilizados para remover o meio ou o produto. Os biorreatores descartáveis exemplares são biorreatores da bolsa de células WAVE® (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) tais como o biorreator WAVE® 20 L. Estes são os sistemas de biorreator de perfusão descritos, entre outros documentos: em Singh,1999, Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation, Cytotechnology, p.149-158, aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[00078] O volume de trabalho do reator é o volume ocupado pela cultura. O volume de trabalho pode ser, por exemplo, ao redor de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou mais da cultura, mas de preferência não mais do que cerca de 75%.
[00079] Alternativamente, o biorreator pode ser de uma natureza não descartável. Por exemplo, o biorreator pode ser produzido de aço inoxidável ou vidro. Os biorreatores alternativos adequados para uso na presente invenção incluem, mas não são limitados a estes: frascos de agitação, recipientes de tanque de agitação, recipientes de transporte pelo ar e sacos descartáveis que podem ser misturados por oscilação, sacudidela ou agitação.
[00080] Em uma modalidade, o biorreator pode ser acoplado a um sistema de retenção de células, incluindo, mas não limitado a estes, filtros incorporados, cestos de rotação, sistemas de filtração de fluxo tangencial (TFF) e sistemas de filtração de fluxo tangencial alternante (ATF). III. Retenção celular
[00081] A cultura de perfusão depende da capacidade de remover o meio desgastado de nutrientes e contendo o produto residual da cultura enquanto minimiza os danos nas células. Métodos iniciais de retenção celular, em que o meio desgastado foi separado das células cultivadas, frequentemente danificam as células através, por exemplo, da criação de forças de cisalhamento. Este dano celular resultou na obstrução de filtros e na falha dos dispositivos de perfusão, muitos dos quais eram internos ao sistema de cultura. Consequentemente, em um aspecto, a presente divulgação fornece um método que faz uso de um "sistema de retenção de células" que permite a troca de meios.
[00082] Em uma modalidade, o tipo de sistema de retenção de células utilizado é um filtro do tipo "incorporado", em que o filtro está disposto na câmara do biorreator e está livre para se mover dentro da câmara. O filtro pode ser acoplado a um dos tubos que levam para fora da câmara, permitindo assim que o meio filtrado seja extraído da cultura. Um exemplo de um filtro do tipo "incorporado" pode ser observado na Patente U.S. No. 6.544.788, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[00083] Em outra concretização, o sistema de retenção de células utilizado é um sistema de filtração de fluxo tangencial (TFF). Em um sistema de TFF, o meio de cultura é circulado a partir de um recipiente de cultura através de um módulo de filtração, e depois volta para o recipiente de cultura por meio de uma bomba ligada ao tubo entre o módulo de filtração e o recipiente de cultura, produzindo um fluxo tangencial através do módulo de filtro. Uma segunda bomba é posicionada no lado do filtrado do módulo de filtro e é utilizada para controlar a taxa na qual o filtrado é removido. O uso de filtros de membrana de fibra oca é preferível neste sistema, visto que eles são mais fáceis de esterilizar e permitem a manutenção de um fluxo uniforme através do módulo de filtro. No entanto, quando filtros de fibra oca são empregados neste sistema, eles são propensos a obstrução quando o fluxo mono-direcional leva à agregação da matéria particulada na entrada do lúmen.
[00084] Em uma modalidade específica, o tipo de sistema de retenção de células utilizado é um sistema de fluxo tangencial alternante (ATF). No tipo de ATF do sistema de retenção de células, um compartimento de filtragem está conectado a um recipiente de armazenamento em uma extremidade e uma bomba de diafragma na outra. A bomba em primeiro lugar move o meio do recipiente através do elemento filtrante para a bomba e depois inverte para enviar o meio da bomba através do filtro e volta para o recipiente, criando um fluxo bidirecional ou alternado. Isto é referido como fluxo tangencial alternante (ATF), já que existe um fluxo tangencial alternante no módulo de filtro, isto é, existe um fluxo na mesma direção para as superfícies da membrana do módulo de filtro (tangente a essa superfície) e que existe outro fluxo que é substancialmente perpendicular a essas superfícies. Este tipo de filtração tem sido existente na literatura desde 2000 e resulta em fluxo rápido, de baixo cisalhamento, uniforme. A filtração de ATF pode ser obtida por métodos conhecidos na técnica, tais como são descritos na Patente U.S. Número 6.544.424, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Além disso, os sistemas de fluxo tangencial alternantes estão disponíveis comercialmente de fabricantes tais como Refine Technology e incluem vários modelos tais como os sistemas ATF2, ATF4, ATF6, ATF8 e ATF10.
[00085] Em outra modalidade específica da invenção, o filtro é um filtro de membrana tubular e, além disso, pode ser um filtro de fibra oca.
[00086] Como indicado acima, os métodos da invenção permitem o crescimento eficiente de células em densidades ultra-altas. Em uma modalidade particular da invenção, a cultura é desenvolvida em uma densidade de pelo menos cerca de 1 x 10A8 células/ml, por exemplo, ao redor de 1 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,1 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,2 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,3 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,4 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,5 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,6 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,7 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,8 x 10A8 células/ml, ao redor de 1,9 x 10A8 células/ml, ou ao redor de 2 x 10A8 células/ml. O crescimento da cultura para estas concentrações elevadas permite a criopreservação imediata de estoques de alta densidade sem concentração adicional da população de células através de métodos centrífugos ou não centrífugos. IV. Criopreservação e Criação de um Banco de Células
[00087] A criopreservação refere-se a um processo pelo qual as células, tecidos ou quaisquer outras substâncias susceptíveis a danos provocados pelo tempo ou pela atividade enzimática ou química são preservados através do esfriamento e seu armazenamento em temperaturas abaixo de zero. A importância da criopreservação das linhagens celulares importantes não pode ser subestimada, pois (entre outras vantagens importantes) isso permite manter essas linhagens sem mantê-las em cultura constante, diminui o risco de contaminação e reduz o risco de deriva genética.
[00088] Quando se utilizam métodos de criopreservação, é vital alcançar e permanecer nessas baixas temperaturas sem causar danos adicionais através da formação de gelo durante o processo de congelamento. Métodos na técnica tradicionalmente utilizam substâncias que diminuem os danos por congelamento nas células chamadas protetores criogênicos. Os protetores criogênicos podem ser adicionados ao meio de culturas de células antes do processo de congelamento. Em uma modalidade específica, o protetor criogênico utilizado pode ser um ou mais de: glicerol ou sulfóxido de dimetila (DMSO). Adicionalmente, o protetor criogênico pode ser adicionado com ou sem amido de hidroxietila (HES). Em uma outra modalidade específica, o DMSO pode ser adicionado em uma concentração de pelo menos cerca de 5%, por exemplo, pode ser adicionado ao redor de 5%, ao redor de 6%, ao redor de 7%, ao redor de 8%, ao redor de 9%, ao redor de 10%, ao redor de 11%, ao redor de 12%, ao redor de 13%, ao redor de 14%, ao redor de 15%, ao redor de 16%, ao redor de 17%, ao redor de 18%, ao redor de 19% ou ao redor de 20%.
[00089] A cultura com protetor criogênico adicionado pode então ser dispensada em recipientes apropriados para armazenamento sob condições de criopreservação. Em uma modalidade, este recipiente pode ser um frasco produzido de um material que pode incluir (mas não é limitado a estes) polímeros tais como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno ou polipropileno. Em uma modalidade específica, o frasco pode ter um tratamento de superfície adicional para melhorar as condições de criopreservação (por exemplo, revestimentos hidrófilos que reduzem a adsorção e a desnaturação). Nas modalidades exemplares, o frasco pode ter um volume de mais do que cerca de 0,1 ml, por exemplo, o frasco pode ter um volume de cerca de 0,1 ml, cerca de 0,5 ml, cerca de 0,75 ml, cerca de 1 ml, cerca de 1,5 ml, cerca de 2 ml, cerca de 2,5 ml, cerca de 4,5 ml, cerca de 10 ml, cerca de 15 ml, cerca de 20 ml, cerca de 25 ml, ou cerca de 50 ml. Em outra modalidade, o recipiente também pode ser uma bolsa criogênica que possui um volume de mais do que cerca de 30 ml, por exemplo, a bolsa criogênica pode ter um volume de cerca de 30 ml, cerca de 50 ml, cerca de 100 ml, cerca de 150 ml, cerca de 200 ml, cerca de 300 ml, cerca de 400 ml, ou cerca de 500 ml. A bolsa criogênica pode ser construída de qualquer material apropriado incluindo, mas não limitado a estes, polímeros tais como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno, polipropileno, etileno propileno fluorado (FEP), poliolefina e acetato de etileno vinila (EVA). Os biorreatores descartáveis exemplares incluem, mas não são limitados a estes: sacos KryoSure® Cryopreservation, PermaLife™ Bags (OriGen Biomedical), bolsas de congelamento CryOStore (OriGen Biomedical), Freeze-Pak™ Biocontainers (Charter Medical), e bolsas divulgadas no Pedido Provisório US No. 62/037.181 (Merial Ltd., uma empresa Sanofi), que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[00090] Estes recipientes são então congelados utilizando técnicas e dispositivos bem conhecidos na especialidade antes de serem armazenados em baixas temperaturas, tipicamente entre cerca de - 130°C e cerca de -196°C. Em uma modalidade, a técnica de congelamento utilizada pode ser congelamento de taxa de controle e lento (também denominada congelamento programável lento, ou SPF). A coleta de células obtidas pelo processo é um banco de células.
[00091] Em uma modalidade, o banco de células pode ser, mas não é limitado a estes, um banco de células de densidade ultra-alta, um banco de células principal, um banco de células de trabalho ou um pequeno banco. V. Determinação da viabilidade celular
[00092] Conforme indicado acima, os métodos da invenção permitem a criação de um banco de células em densidades elevadas enquanto retêm uma excelente viabilidade celular para uso posterior. Como aqui utilizado, o termo "viabilidade celular" pode ser definido como o número ou a porcentagem de células saudáveis em uma dada amostra. A viabilidade das células pode ser determinada utilizando qualquer método disponível na técnica em qualquer ponto no processo de criação de um banco de células de densidade ultra-alta descrito. Os métodos comumente utilizados para a determinação da viabilidade celular são principalmente baseados no princípio de que as células vivas possuem membranas celulares intactas que excluem determinados corantes, tais como azul de tripano (um corante diazo), Eosina ou propídio, enquanto que as células mortas não.
[00093] Em uma modalidade, o azul de tripano pode ser utilizado para manchar uma quantidade de células e assim indicar a presença de células com membranas intactas (não coloridas) e a presença de células com membranas rompidas (azul). Estas células podem então ser contadas para determinar os números de células tanto vivas quanto mortas na cultura, e apresentadas como uma porcentagem para indicar a saúde relativa da cultura.
[00094] Em uma concretização específica, a viabilidade celular pode ser determinada utilizando uma cultura que foi cultivada em uma densidade ultra-alta, mas ainda não foi congelada (isto é, uma cultura pré-congelamento ou pré-descongelamento). Em uma modalidade específica, a viabilidade celular pode ser determinada utilizando uma cultura que foi congelada e depois descongelada (isto é, uma cultura pós-congelamento ou pós-descongelamento).
[00095] Em uma modalidade específica, a viabilidade celular é de pelo menos cerca de 60%, por exemplo, ao redor de 60%, ao redor de 65%, ao redor de 70%, ao redor de 75%, ao redor de 80%, ao redor de 85%, ao redor de 90% ou ao redor de 95%. Em certas modalidades, a viabilidade pós-descongelamento das células é pelo menos cerca de 80%, por exemplo, é pelo menos ao redor de 85%, 90% ou 95% incluindo até 100%. VI. Proteínas terapeuticamente relevantes
[00096] As células derivadas do método de criação de um banco criogênico de células de densidade ultra-alta da invenção podem ser empregadas em uma fase de produção posterior para a fabricação de uma proteína. Por exemplo, as células propagadas no biorreator e congeladas em alíquotas de banco de alta densidade de acordo com os métodos da presente invenção podem ser utilizadas para a produção de substâncias biológicas incluindo proteínas terapeuticamente relevantes. Estas substâncias biológicas podem incluir, mas não são limitados a estas: vírus (ver, por exemplo, a WO 200138362), polipeptídeos de ligação tais como anticorpos, por exemplo, anticorpos monoclonais e seus fragmentos, por exemplo, fragmentos Fab; proteínas de fusão Fc, anticoagulantes, fatores sanguíneos, proteínas morfogenéticas ósseas, suportes de proteína planejados, enzimas, fatores de crescimento, hormônios, interferons, interleucinas e trombolíticos. Estas substâncias biológicas podem ser colhidas utilizando qualquer método disponível na técnica. Em uma modalidade, a invenção fornece um método de produção de uma substância biológica, o método compreendendo: o cultivo de células capazes de expressar uma substância biológica sob condições adequadas para a produção de uma substância biológica, em que as células foram obtidas de um banco de células congeladas de densidade ultra-alta produzido utilizando cultura de perfusão. A substância biológica pode ser (mas não é limitada a esta) uma proteína (por exemplo, qualquer proteína terapeuticamente relevante). EXEMPLOS
[00097] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitação adicional. Os conteúdos das figuras e todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados ao longo deste pedido são aqui expressamente incorporados por referência na sua totalidade. Exemplo 1: Métodos gerais
[00098] As seguintes condições foram comuns às experiências apresentadas nos Exemplos de 3 a 6 abaixo.
[00099] O valor do pH foi de 7,0 ± 0,1. O pH da cultura foi mantido neste valor através do controle de realimentação automático por um controlador WAVE POD. O controlador automático alterou a concentração de CO2 no gás no volume remanescente e regulou ainda a adição de base (esquema de controle de CO2/base). Quando o controlador detectou um pH abaixo do valor de pH selecionado, uma tentativa foi feita primeiro alcançar o valor do pH ajustado através da diminuição do nível de CO2. Se o nível de pH solicitado não foi alcançado dentro do tempo especificado, a base foi adicionada. Em um pH acima do valor de pH selecionado, a concentração de CO2 foi aumentada.
[000100] O valor de DO (oxigênio dissolvido) foi > 40%. O DO da cultura foi mantido no valor através do controle de realimentação automático por um controlador WAVE POD. A concentração de oxigênio foi automaticamente alterada de 21% para 50% (esquema de controle da concentração de O2). O gás de oxigênio puro adicional foi fornecido manualmente no volume remanescente em combinação com ajustes manuais para a condição de oscilação de modo a manter o DO > 40%. Especificamente, quando o DO conectado foi de aproximadamente 40% e a concentração de O2 do controlador POD aumentou de 21% para > 30%, a velocidade e o ângulo de oscilação da onda aumentaram de 22 rpm/10° para 25 rpm/12°. Se o POD O2 se tornar novamente > 30%, a velocidade e o ângulo de oscilação da onda aumentaram de 25 rpm/12° para 30 rpm/12° ou o O2 puro foi fornecido ao volume remanescente (este último sendo preferido). Finalmente, a porcentagem de volume de O2 puro no gás foi gradualmente aumentada para aumentar o O2 total no volume remanescente. A estratégia de adição manual resultou em um aumento de aproximadamente 10% por dia através do ajuste da relação de controle de volume entre o gás oxigênio POD (21% a 50%, fornecido pelo controlador de POD) e o gás de oxigênio puro adicional (100%, controlado por um rotâmetro). A taxa de fluxo de gás total foi aumentada ligeiramente para facilitar a transferência de gás.
[000101] A CSPR (taxa de perfusão específica da célula) das culturas foi mantida quase constante através do aumento da taxa de perfusão diariamente com base na densidade celular medida. Exemplo 2: Concepção e implementação de um protocolo de criação de um banco de células de densidade ultra-alta
[000102] Este protocolo de criação de um banco criogênico de células de densidade ultra-alta começa com um frasco de células do banco de células principal de 2 ml (volume de trabalho 1,5 ml) em uma densidade aproximada de 2,0 a 2,4 x 10A7 células viáveis/ml (condição de criopreservação de células normais). Subsequentemente, as células são cultivadas na cultura de perfusão. Após a adição de DMSO na cultura de células, esta cultura de células de densidade ultra-alta é dispensada em frascos separados de 5 ml (aproximadamente 4,5 ml de volume de trabalho) ou bolsas criogênicas (aproximadamente 100 ml de volume de trabalho) apropriadas para a criopreservação e armazenamento como um banco de células de densidade ultra-alta (pelo menos cerca de 10 x 10A7 células/ml). Uma representação esquemática deste protocolo é mostrada na Figura 1. Exemplo 3: Desempenho do banco de cultura de células e de células de densidade ultra-alta utilizando rCHO1.
[000103] Os parâmetros para a seguinte experiência foram como se segue: 1) o CO2 foi reduzido para 0% quando Xv > cerca de 3 x 107 células viáveis/ml (vc/ml) (no dia 9), a base foi então adicionada posteriormente quando necessário; 2) Velocidade e ângulo de oscilação WAVE: inicialmente 22 rpm/10° (do dia 0 ao dia 8); aumentou para 25 rpm/12° quando o POD O2 aumentou de 21% para > 30% (no dia 8), e depois para 30 rpm/12° (no dia 9) para facilitar a transferência de gás (fornecimento de O2 e remoção de CO2); 3) O2 puro adicional (100%): fornecido manualmente ao volume remanescente quando POD O2 > 30% e Xv > cerca de 6 x 107 vc/ml (no dia 11); 4) Taxa de fluxo de gás total: 0,2 lpm (litros por minuto) do dia 0 ao dia 10, aumentado para 0,4 lpm no dia 10 quando Xv > 4 x 107 vc/ml e depois para cerca de 0,5 lpm no dia 11 (POD O2: O2 puro = 3:1, O2 total: ao redor de 62%); e 5) Taxa de perfusão celular específica: alvo em > cerca de 0,2 nL/célula-dia inicialmente; a taxa de perfusão foi aumentada aos poucos até 12 RV/dia (nota: RV é definido como volume do reator). A CSPR no dia final estava entre 0,1 nl/célula-dia e 0,2 nl/célula-dia. 6) Conjunto de sementes e meio de Biorreator: CD CHO com L-glutamina 4 mM 7) Biorreator: GE personalizado 10-L biorreator de perfusão Cellbag com dois tubos de imersão; volume de trabalho: 5 L; 8) Inóculo do biorreator: conjunto de sementes do frasco de agitação; densidade da semente: ao redor de 5 x 105 vc/mi 9) Métodos de retenção celular: ATF4 (tamanho de poro de 0,2 μm) 10) Temperatura da cultura celular: 37°C 11) Congelamento: congelador de taxa controlada CryoMed™
[000104] A cultura de células de densidade ultra-alta (UHD) e o desempenho do banco de células (pós-congelamento e descongelamento) foram testados para a linhagem celular rCHO 1. A cultura de perfusão atingiu Xv de cerca de 1,11 x 108 vc/ml no dia 12 com elevada viabilidade (> 97% ao longo de todo o processo). A densidade celular viável (células/ml), a taxa de perfusão nos volumes do reator/dia e a 10X CSPR (taxa de perfusão específica de células 10X em nl/célula-dia) da cultura de perfusão de densidade ultra-alta são mostradas na Figura 2. A Figura 3 mostra o perfil de pH desconectado da cultura. A cultura foi colhida diretamente sem concentração para gerar dois bancos de UHD em frascos de 5 ml em duas temperaturas de retenção de DMSO: temperatura fria bem controlada utilizando um rotor giratório revestido a 4°C e temperatura fria não controlada utilizando um rotor giratório resfriado por um banho de água gelada. A Figura 4A-C mostra o desempenho pós-congelamento dos frascos de UHD de 5 ml criados a partir das condições de cultura celular anteriormente mencionadas. Ambos os bancos de UHD tiveram crescimento celular rápido pós-congelamento, viabilidade muito elevada e uma baixa taxa de apoptose. Contudo, o controle mais ativo da temperatura no rotor giratório revestido resultou em uma recuperação ligeiramente melhorada pós-banco e crescimento quando comparado com um controle de temperatura mais passivo no banho de água gelada. Exemplo 4: Cultura de células de densidade ultra-alta e o desempenho do banco de células utilizando rCHO 2.
[000105] Os parâmetros para a seguinte experiência foram como se segue: 1) o CO2 foi reduzido para 0% quando Xv > cerca de 5 x 107 vc/ml (vc/ml) (no dia 9), a base foi então adicionada posteriormente quando necessário; 2) Velocidade e ângulo de oscilação WAVE: inicialmente 22 rpm/10° (do dia 0 ao dia 7); aumentou para 25 rpm/12° quando o POD O2 aumentou de 21% para > 30% (no dia 7) para facilitar a transferência de gás (para o fornecimento de O2 e remoção de CO2); 3) O2 puro adicional (100%): foi fornecido manualmente ao volume remanescente quando POD O2 > 30% e Xv > cerca de 3 x 107 vc/ml (no dia 8); 4) Taxa de fluxo de gás total: 0,2 lpm inicialmente (do dia 0 ao dia 8), aumentado para 0,4 lpm no dia 8 quando Xv > 4 x 107 vc/ml (POD O2: O2 puro = 3:1, O2 total: ao redor de 62%); e depois ao redor de 0,5 lpm no dia 9 (POD O2: O2 puro = 1:1, O2 total: ao redor de 75%). 5) Taxa de perfusão celular específica: alvo em > cerca de 0,2 nL/célula-dia inicialmente; a taxa de perfusão foi aumentada aos poucos até 12 RV/dia. No último dia, 0,1 nl/célula-dia < CSPR < 0,2 nl/célula-dia. 6) Conjunto de sementes e meio de Biorreator: CD CHO com L-glutamina 4 mM 7) Biorreator: GE personalizado 10-L biorreator de perfusão Cellbag com dois tubos de imersão; volume de trabalho: 5 L; 8) Inóculo do biorreator: conjunto de sementes do frasco de agitação; densidade da semente: ao redor de 5 x 105 vc/mi 9) Métodos de retenção celular: ATF4 (tamanho de poro de 0,2 μm) 10) Temperatura da cultura celular: 37 °C 11) Congelamento: congelador de taxa controlada CryoMed™
[000106] A cultura de células de ultra HD (UHD) e o desempenho do banco de células (pós-congelamento e descongelamento) foram testados para a linhagem celular rCHO 2. A densidade celular viável (células/ml), a taxa de perfusão nos volumes do reator/dia, e 10X CSPR (taxa de perfusão específica da célula 10X em nl/célula-dia) para a cultura de perfusão de densidade ultra-alta são mostradas na Figura 5. A Figura 6 mostra o perfil de pH desconectado da cultura. A cultura foi colhida para produzir frascos UHD (densidade ultra-alta) de 5 ml e bolsas criogênicas de UHD de 100 ml para a criopreservação em duas condições de retenção de DMSO diferentes: 1) temperatura ambiente (RT, aproximadamente 22 a 25°C); e 2) uma temperatura fria controlada (CT, aproximadamente 5°C utilizando um rotor giratório revestido a 4°C).
[000107] As Figuras 7 e 8 são gráficos que demonstram os perfis de crescimento celular (Xv; linhas sólidas) e de viabilidade (linhas pontilhadas) em frascos de agitação de 250 ml e 3 L para frascos de UHD e bolsas criadas a partir das condições de cultura celular anteriormente mencionadas na temperatura ambiente e em condições de retenção fria bem controladas (RT e CT, respectivamente). Estes frascos e bolsas de UHD recuperaram bem com crescimento celular rápido pós-congelamento, alta viabilidade, baixa apoptose e produtividade comparável quando semeados em 0,5 x 10A6 vc/ml e 1,0 x 10A6 vc/ml em frascos de agitação de 250 ml e 3 L. Nenhuma diferença foi observada entre as bolsas criogênicas e frascos criogênicos de UHD em cada uma das condições de retenção em termos de crescimento pós-descongelamento, viabilidade, apoptose e produtividade. No entanto, os frascos e as bolsas produzidos na baixa temperatura bem controlada por um rotor giratório revestido a 4°C tiveram crescimento mais rápido, maior viabilidade e menor apoptose quando comparados com aqueles produzidos na temperatura ambiente. A Figura 9 e a Figura 10 mostram perfis de apoptose pós- descongelamento de bancos de UHD quando semeados em 0,5 x 10A6 vc/ml e 1,0 x 10A6 vc/ml, respectivamente, e as Figuras 11 e 12 representam a Taxa de Produção Específica (SPR, RT - temperatura ambiente, CT - temperatura fria bem controlada). Exemplo 5: Desempenho do banco de células de densidade ultra-alta no biorreator de 20 L WAVE utilizando rCHO2.
[000108] Os parâmetros para a seguinte experiência foram como se segue: 1) Banco de células: bolsa criogênica de UHD de 100 ml produzidas no exemplo 2 2) Meio do biorreator: CD CHO com L-glutamina 4 mM. 3) Biorreator pós-congelamento: GE 20-L Cellbag; Volume de trabalho: 10 L. 4) Inóculo do biorreator: cultura pós-descongelação do bolsa criogênica descongelado; densidade da semente: cerca de 5 x 105 vc/ml. 5) Temperatura do biorreator: 37°C, O2: 20%, CO2: 5%, velocidade e ângulo de oscilação: 22 rpm/8o.
[000109] Uma bolsa criogênica de UHD de 100 ml foi descongelada. 50 ml da cultura descongelada foi inoculada em um biorreator de 20 L WAVE (A) diretamente com um volume de trabalho total de 10 L. Outros 50 ml foram diluídos lentamente com o primeiro meio frio para reduzir o potencial de dano celular induzido pelo grande gradiente osmótico, o qual foi então inoculado em um segundo biorreator WAVE de 20 L (B) com um volume de trabalho total de 10 L. Ambos os biorreatores foram operados nas mesmas condições. Alíquotas de ambos os biorreatores foram transferidas para frascos de agitação acompanhantes (60 ml de volume de trabalho) para comparação de crescimento. As culturas de biorreator também foram comparadas com as culturas do frasco de agitação (frascos de agitação de 60 ml/250 ml e frascos de agitação de 1,5 L/3 L) com inóculo de outro bolsa criogênica descongelado de 100 ml.
[000110] As duas culturas WAVE executaram de forma muito comparável em termos de crescimento de células pós- descongelamento, viabilidade e apoptose. E as culturas em ambos os biorreatores eram muito comparáveis não apenas com aqueles frascos de agitação acompanhantes, mas também com aqueles frascos de agitação descongelados e cultivados. Esses dados sugerem que uma bolsa criogênica de UHD pode ser diretamente descongelada em biorreatores 2 x 20-L WAVE sem a diluição lenta do meio frio com desempenho comparável aos frascos de agitação, o que fará com que o processo de conjunto de sementes completamente fechado da bolsa descongele na expansão do biorreator WAVE.
[000111] A Figura 13 é um gráfico que demonstra o perfil de crescimento celular (Xv; linhas contínuas) e de viabilidade (linhas pontilhadas) em bolsas de 20 L WAVE para bolsa criogênica de UHD da linhagem celular rCHO 2 criada após as condições de cultura celular anteriormente mencionadas na temperatura ambiente mostradas no exemplo 2. Exemplo 6: Cultura de células de densidade ultra-alta e desempenho do banco de células utilizando rCHO 3.
[000112] Os parâmetros para a seguinte experiência foram como se segue: 1) o CO2 foi reduzido para 0% quando Xv > cerca de 2 x 107 vc/ml (no dia 8), a base foi então adicionada posteriormente quando necessário; 2) Velocidade e ângulo de oscilação WAVE: inicialmente 22 rpm/10° (do dia 0 ao dia 7); aumentou para 25 rpm/12° quando o POD O2 aumentou de 21% para > 30% (no dia 7) para facilitar a transferência de gás (para o fornecimento de O2 e remoção de CO2); 3) O2 puro adicional (100%) foi fornecido manualmente ao volume remanescente quando POD O2 > 30% e Xv > cerca de 3 * 107 vc/ml (no dia 9). 4) Taxa de fluxo de gás total: 0,2 lpm inicialmente (do dia 0 ao dia 9), aumentado para 0,4 Ipm no dia 9 quando Xv > 3 x 107 vc/ml (POD O2: O2 puro = 3:1, O2 total: ao redor de 62%); e depois ao redor de 0,5 lpm no dia 10 (POD O2: O2 puro = 1:1, O2 total: ao redor de 75%), para cerca de 0,6 lpm no dia 12 (POD O2: O2 puro = 1:2, O2 total: ao redor de 83%). 5) Taxa de perfusão específica da célula: a perfusão foi iniciada em 0,5 RV/dia no dia 2 e aumentou aos poucos pra manter uma CSPR baixa de > 0,05 nL/célula-dia. 6) Conjunto de sementes e meio de Biorreator: CD CHO com L-glutamina 4 mM. 7) Biorreator: GE personalizado 10-L biorreator de perfusão Cellbag com um tubo de imersão; volume de trabalho: 5 L; 8) Inóculo do biorreator: conjunto de sementes do frasco de agitação; densidade da semente: ao redor de 5 x 105 vc/ml. 9) Métodos de retenção celular: ATF4 (tamanho de poro de 0,2 μm). 10) Temperatura da cultura celular: 37 °C. 11) Congelamento: congelador de taxa controlada CryoMed™. 12) Avaliação após a criação de um banco: frasco de agitação (duas passagens) e 20 L WAVE (uma passagem), Xv, viabilidade, apoptose, produtividade foram avaliadas. 13) Meio de avaliação após criação de um banco: CD CHO com L-glutamina 4 mM.
[000113] A cultura de células ultra HD e o desempenho do banco de células (pós-congelamento e descongelamento) foram testados com relação à linhagem celular rCHO 3. A densidade de células viáveis (células/ml), a taxa de perfusão em volumes de reator/dia, e 10X CSPR (taxa de perfusão específica de células 10X em nl/célula-dia) para a cultura de perfusão de densidade ultra-alta são mostradas na Figura 15. A Figura 16 mostra o perfil de pH desconectado da cultura. Frascos de UHD (densidade ultra-alta) de 5 ml e bolsas de UHD de 100 ml foram produzidos utilizando a cultura de perfusão de densidade ultra-alta em duas condições diferentes de retenção de DMSO: 1) temperatura ambiente (RT, aproximadamente 22 a 25 °C); e 2) uma temperatura fria controlada (CT, aproximadamente 5°C utilizando um rotor giratório de 4°C).
[000114] Todas as culturas pós-descongelamento de frascos de UHD e bolsas de UHD recuperaram bem com crescimento rápido, baixa apoptose e produtividade comparável. As bolsas e os frascos de UHD produzidos na condição de retenção fria bem controlada foram comparáveis, com um crescimento ligeiramente mais rápido e maior viabilidade (> 95%) na primeira passagem do que aqueles produzidos na temperatura ambiente. A bolsa de UHD teve desempenho pós- descongelamento comparável em frascos de agitação e biorreatores WAVE. Isso então também sugere que uma bolsa criogênica de UHD pode ser diretamente descongelada nos biorreatores 2 x 20 L WAVE, o que fará o processo de conjunto de sementes completamente fechado a partir do descongelamento da bolsa para expansão de biorreator WAVE. A Figura 17A é um gráfico que demonstra os perfis de crescimento celular (Xv; linhas contínuas) e de viabilidade (linhas pontilhadas) em frascos de agitação de 250 ml e 3 L e WAVEs de 20 L para frascos e bolsas de UHD criados a partir das condições de cultura celular anteriormente mencionadas na temperatura ambiente e em condições de retenção fria bem controladas (RT e CT, respectivamente). As figuras 17B e C mostram perfis de apoptose pós- descongelamento e taxa de produção específica (SPR). Exemplo 7: Redução do uso médio no processo de cultura de perfusão de densidade ultra-alta utilizando rCHO 3.
[000115] A linhagem celular rCHO 3 foi desenvolvida em uma taxa de perfusão específica de células baixa (CSPR) de > 0,025 nl/célula-dia utilizando um meio desenvolvido interno. Um WAVE Cellbag personalizado de 10 L acoplado com ATF4 foi utilizado para a cultura de perfusão. A cultura atingiu densidade celular viável de cerca de 1,25 x 108 vc/ml no dia 11 com taxa de perfusão até 3 volumes de reator/dia. A viabilidade da cultura foi > 97% ao longo do processo de cultura do biorreator. O uso médio foi reduzido para cerca de 50% quando comparado com as mesmas condições de cultura utilizando o meio comercial. No entanto, o crescimento celular foi observado de ser ligeiramente mais rápido do que quando se utilizava o meio CD CHO comercial. A cultura foi colhida diretamente (e sem concentração) para gerar bancos de UHD em frascos de 5 ml e bolsas criogênicas de 100 ml na temperatura de retenção de DMSO fria bem controlada mediante o uso de um rotor giratório revestido a 4°C. Estudos pós-criação de um banco demonstraram que os bancos de UHD tanto do frasco quanto da bolsa criogênica se recuperaram bem após o descongelamento em frascos de agitação, com crescimento rápido, alta viabilidade (> 95%) e produtividade comparável. Adicionalmente, um bolsa criogênica foi descongelada em dois biorreatores de 20 L WAVE e demonstraram crescimento celular e viabilidade comparáveis aos frascos de agitação. A Figura 18 é um gráfico que compara a densidade celular viável (células/ml, linhas contínuas) e a viabilidade (linhas pontilhadas) com meio interno (preto) e meio CD CHO (cinzento) em uma cultura exemplar da linhagem celular rCHO 3. A Figura 19 é um gráfico que compara a taxa de perfusão (círculos, linhas contínuas) e a taxa de perfusão celular específica (triângulos, linhas pontilhadas) com o meio interno (preto) e o meio CD CHO (cinzento) em uma cultura exemplar da linhagem celular rCHO 3. Exemplo 8: Redução do uso médio no processo de cultura de perfusão de densidade ultra-alta utilizando rCHO 1.
[000116] A linhagem celular rCHO 1 foi cultivada utilizando meio CD CHO comercial suplementado com Efficient Feed B (EFB) e mantida em uma taxa de perfusão celular específica baixa (CSPR) em > 0,04 nl/célula-dia. O GE 10-L WAVE perfusion Cellbag com um filtro incorporado foi utilizado como o biorreator de cultura de perfusão. Para comparação, o meio CD CHO comercial sem qualquer suplemento de nutriente também foi testado. A cultura sem adição de EFB atingiu densidade celular viável de cerca de 1,0 x 108 vc/ml no dia 13 com taxa de perfusão até 8 volumes de reator/dia. Ao adicionar 10% de EFB em meio CD CHO do dia 5 ao dia 10 e 20% de EFB do dia 10 ao dia 14, a cultura atingiu uma densidade de células viáveis de cerca de 1,03 x io8 vc/ml no dia 14 com uma taxa de perfusão de até 4 volumes do reator/dia. Consequentemente, com a adição de EFB, a cultura de células de perfusão de UHD comparável foi alcançada com uma redução aproximada de 50% no uso do meio. A Figura 20 é um gráfico que compara a densidade de células viáveis (células/ml, linhas contínuas) e viabilidade (linhas pontilhadas) com meio CD CHO suplementado com meio Efficient Feed B (preto) e CD CHO (cinza) em uma cultura exemplar de linhagem celular rCHO 1. A Figura 21 é um gráfico que compara a taxa de perfusão (círculos, linhas contínuas) e taxa de perfusão específica da célula (triângulos, linhas pontilhadas) com meio CD CHO suplementado com meio Efficient Feed B (preto) e CD CHO (cinza) em uma cultura exemplar da linhagem celular rCHO 1. Exemplo 9: Ampliação do processo de perfusão de densidade ultra-alta utilizando rCHO 3.
[000117] Um 20-L WAVE Cellbag foi personalizado para acoplar com ATF4 para suportar 10 L de cultura de perfusão de UHD. O crescimento da linhagem celular rCHO 3 em meio CD CHO comercial foi testado. A cultura atingiu densidade celular viável de cerca de 1,1 x 108 vc/ml no dia 14 com uma taxa de perfusão de até 5 volumes de reator/dia. A taxa de perfusão celular específica (CSPR) foi mantida em > 0,04 nl/célula- dia e a viabilidade foi > 97%. O crescimento celular foi comparável àquele utilizando um 10-L WAVE Cellbag com 5 L de volume de trabalho. A Figura 22 representa a densidade celular viável (células/ml, linhas contínuas) e viabilidade (linhas pontilhadas) utilizando o biorreator WAVE de 20 L (10 L de volumes de trabalho, preto) e o biorreator WAVE de 10 L (volume de trabalho de 5 L, cinza) em uma cultura exemplar da linhagem celular rCHO 3. A cultura foi capaz de ser colhida diretamente para preparar cerca de 90x 100 ml de bolsas criogênicas. Exemplo 10: Avaliação do banco de bolsa criogênica de densidade ultraalta após um ano de armazenamento em congeladores de armazenamento de nitrogênio líquido de fase vapor utilizando rCHO2 e rCHO3.
[000118] 100 ml de bolsas criogênicas de UHD (cerca de 1,0 x 108 vc/ml, 100 ml por bolsa criogênica) da linhagem celular rCHO 2 e 3 foram testados com relação ao desempenho pós-descongelamento e comparados com o ponto temporal 0 (quando os bancos foram congelados e transferidos para o armazenamento de N2 líquido de fase vapor durante a noite). O crescimento, viabilidade e produtividade de células pós-descongelamento comparáveis foram observados para as células no momento 0 e em um ano.
Claims (23)
1. Método para a produção de um banco de células congeladas de densidade ultra-alta diretamente de uma população de células cultivadas, caracterizado pelo fato de que compreende: a) cultivar as células em um biorreator de perfusão para obter uma população de células de densidade ultra-alta com uma concentração de pelo menos cerca de 1,0 x 108 células/mL, em que dito biorreator de perfusão está acoplado a um sistema de retenção celular compreendendo um sistema de filtragem de fluxo tangencial alternado (ATF) compreendendo um filtro, em que o oxigênio dissolvido (DO) no biorreator de perfusão é mantido em >30%, definindo o ângulo de oscilação a 10° e a velocidade de oscilação a 22 rpm para um primeiro período de tempo, definindo manualmente o ângulo de oscilação a 12° e a velocidade de oscilação a 25 rpm por um segundo período de tempo e fornecendo manualmente oxigênio puro quando a DO for <30%, em que uma vazão total de gás é inicialmente definida em 0,2 litros por minuto (lpm), seguido pelo aumento da taxa total de fluxo de gás para 0,4 lpm quando a concentração de células é de cerca de 3 x 107 células/mL a cerca de 4 x 107 células/mL; e b) adicionar protetor criogênico à população de células de densidade ultra-alta para produzir um banco de células congeladas de densidade ultra-alta, em que o banco de células congeladas de densidade ultra-alta possui uma concentração de pelo menos cerca de 1,0 x 108 células/mL e pelo menos 95% de viabilidade pós descongelamento, e em que nenhuma etapa de concentração adicional é executada entre o cultivo das células e a adição de protetor criogênico na população de células de densidade ultra-alta.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o filtro possui uma área superficial de pelo menos cerca de 0,08 m2, cerca de 0,3 m2 a cerca de 0,5 m2, de cerca de 0,5 m2 a cerca de 1,0 m2, de cerca de 0,7 m2 a cerca de 0,8 m2, de cerca de 1,0 m2 a cerca de 2,0 m2, de cerca de 2,0 m2 a cerca de 3,0 m2, de cerca de 3,0 m2 a cerca de 4,0 m2, ou de cerca de 4,0 m2 a cerca de 5,5 m2.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o filtro possui um tamanho de poro selecionado do grupo que consiste em 0,7 μm, 1,2 μm e 7 μm.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a população de células de densidade ultra-alta possui uma densidade celular selecionada do grupo que consiste em cerca de 1,0 x 108 células/mL, cerca de 1,1 x 108 células/mL, cerca de 1,2 x 108 células/mL, cerca de 1,3 x 108 células/mL, cerca de 1,4 x 108 células/mL, cerca de 1,5 x 108 células/mL, cerca de 1,6 x 108 células/mL, cerca de 1,7 x 108 células/mL, cerca de 1,8 x 108 células/mL, cerca de 1,9 x 108 células/mL, e cerca de 2,0 x 108 células/mL.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita criopreservação compreende a adição de sulfóxido de dimetila (DMSO) à população de células de densidade ultra-alta em uma concentração final de cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a dita criopreservação compreende o congelamento de pelo menos uma parte da população de células de densidade ultra-alta em um recipiente apropriado para armazenamento sob condições de criopreservação.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o recipiente é um frasco ou uma bolsa criogênica.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o banco de células congeladas de densidade ultra-alta compreende cerca de 4,5 x 108 células/frasco ou cerca de 100 x 108 células/bolsa criogênica.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o banco de células congeladas de densidade ultra-alta possui uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,1 x 108 células/mL.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a taxa de perfusão no biorreator de perfusão é entre cerca de 0,02 nL/célula/dia a cerca de 0,5 nL/célula/dia ou entre 0 e 15 volumes de reator por dia.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a cultura de células no biorreator de perfusão possui um pH entre cerca de 6,8 a cerca de 7,2.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o biorreator é um biorreator de bolsa flexível.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que as células são células de mamíferos, opcionalmente em que as ditas células de mamífero são selecionadas do grupo consistindo em: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 e células de hibridoma.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que as células são células transfectadas.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que as células expressam uma proteína terapêutica.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: a) o biorreator de perfusão compreende um biorreator de bolsa flexível; b) o filtro possui uma área superficial de filtro de pelo menos 0,08 m2 e um tamanho de corte de massa molecular (MWCO) de pelo menos 50 kDa; c) o protetor criogênico adicionado na população de células de densidade ultra-alta é DMSO; e d) o banco de células congeladas de densidade ultra-alta compreende cerca de 5% a cerca de 10%, vol/vol de DMSO.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o pH e a DO da cultura são controlados por métodos automatizados.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o pH e a DO da cultura são controlados através de qualquer um ou mais dos seguintes: ajuste da mistura de gases que são introduzidos na cultura, ajuste da taxa de oscilação do biorreator ou ajuste do ângulo de oscilação do biorreator.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a população de células de densidade ultra-alta é resfriada e mantida em uma temperatura de cerca de 4°C antes e durante a adição do protetor criogênico e distribuição.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a população de células de densidade ultra-alta é mantida em uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 26°C antes e durante a adição do protetor criogênico e distribuição.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a população de células de densidade ultra-alta é mantida em uma temperatura fria não controlada através do uso de um banho de água gelada antes e durante a adição do protetor criogênico e distribuição.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o biorreator compreende um filtro incorporado.
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o biorreator é ainda abalado a uma velocidade de oscilação de 30 rpm e um ângulo de oscilação de 12 ° seguindo a velocidade de oscilação de 25 rpm e o ângulo de oscilação de 12 °.
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