JP6870629B2 - バイオリアクターバッグのスケールアップ方法 - Google Patents

Description

本発明は、バイオリアクターバッグ、及びバイオリアクターバッグのスケールアップ方法に関する。

細胞培養に用いられるバイオリアクターとして、時間のかかる洗浄と殺菌の工程をなくすために、プラスチックの一回で使い捨てされるバッグ及び配管材料が使用されるようになっている。
使い捨てのバッグを利用した培養方法として、シーソー運動で培養液が入ったバイオリアクターを揺動させることで、培養液に供給された栄養源等を混合するとともに液表面から酸素の供給及び炭酸ガスの供給あるいは除去を行うウェーブ式攪拌培養があり、動物細胞や昆虫細胞の培養、抗体医薬やワクチンの種培養などに用いられている。

例えば、ウェーブ式攪拌培養に用いるバイオリアクターバッグとして、特許文献１には、ボトムシートとトップシートの２枚で形成されており、互いに接合されて２つのエンドエッジ及び２つのサイドエッジを形成するバイオリアクターバッグであって、バッフルが２つのエンドエッジのいずれか１つまでの最短距離が２つのエンドエッジ間の距離の四分の一よりも大きい領域でボトムシートから伸延、膨張可能なバイオリアクターバッグが開示されている。バッフルの位置を上記の様にすることにより、攪拌強度が増大し、空気−液体界面でのガス交換が改良されると記載されている。

特表２０１４−５０７９５９号公報

ウェーブ式攪拌培養において、バイオリアクターバッグは、十分な攪拌を行うために、バイオリアクターバッグの容量に対する培養液容量が制限される。細胞が増加すると、より大きなバッグに、培養した細胞を移し変え、そのバッグ容量に合わせた新しい培地を供給して、スケールアップする必要がある。移し変える際は、バッグから培地を抜き出して遠心分離し、遠沈した細胞を新しい培地に播種する操作が必要であった。これは手作業の手間がかかる上、操作中に培地が外気に触れるため、コンタミネーションするリスクもあった。
本発明は、スケールアップする際の手間を低減し、汚染リスクを低減することができるバイオリアクターバッグ及びバイオリアクターバッグのスケールアップ方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するための本発明は、以下のとおりである。
（１）膜ろ過モジュールが取り付けられた、ボトムシート、トップシート、４つの面からなる側壁シートで形成された直方体型のバイオリアクターバッグであって、
前記側壁シートは、ボトムシートから垂直方向に伸縮可能であり、
前記側壁シートの少なくとも対向する２つの面は、伸長時はボトムシートの面積よりも大きな面積を有し、
ボトムシートを底面にした培養と、前記伸長時にボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートを底面にした培養のどちらも可能であるバイオリアクターバッグ。
（２）前記伸長時はボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートは、伸長時にボトムシートの面積の３倍以上の面積となる前記（１）に記載のバイオリアクターバッグ。
（３）前記膜ろ過モジュールがＡＴＦ式膜ろ過モジュールである前記（１）または（２）に記載のバイオリアクターバッグ。
（４）前記バイオリアクターバッグをウェーブ式攪拌培養に用いる前記（１）〜（３）の何れか一項に記載のバイオリアクターバッグ。
（５）前記（１）〜（４）の何れか一項に記載のバイオリアクターバッグを用いたバイオリアクターバッグのスケールアップ方法であって、以下のstep１〜５の工程を有するバイオリアクターバッグのスケールアップ方法。
step１．バイオリアクターバッグに、培地を入れ、細胞を播種し、側壁シートを収縮した状態で、ボトムシートを底面にした培養を行う（小スケール培養）
step２．培地を、膜ろ過モジュールを用いて膜ろ過し、膜ろ過によって膜を透過した培地は系外へ排出し、膜ろ過により膜を透過しなかった細胞および培地をバイオリアクターバッグに返送する
step３．側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長させ、ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートが底面となるように、９０度倒して設置する
step４．前記小スケール培養の培地よりも多い容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入する
step５．培養を再開する（大スケール培養）
（６）前記step３において、側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長させた際に、ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートの面積がボトムシートの面積の３倍以上であり、前記step４において、小スケールの培地の３倍以上の容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入する前記（５）に記載のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法。
（７）前記膜ろ過モジュールが、ＡＴＦ式膜ろ過モジュールである前記（５）または（６）に記載のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法。
（８）前記培養がウェーブ式攪拌培養である前記（５）〜（７）の何れか一項に記載のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法。

本発明によると、スケールアップする際の手間を軽減し、汚染リスクを低減することができるバイオリアクターバッグ及びバイオリアクターバッグのスケールアップ方法を提供することができる。

本発明のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法のstep１の一例を示す図である。 本発明のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法のstep２の一例を示す図である。 本発明のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法のstep３〜step５の一例を示す図である。 実施例における細胞培養の時間と細胞密度の関係を示すグラフである。

本発明のバイオリアクターバッグは、膜ろ過モジュールが取り付けられた、ボトムシート、トップシート、４つの面からなる側壁シートで形成された直方体型のバイオリアクターバッグであって、前記側壁シートは、ボトムシートから垂直方向に伸縮可能であり、前記側壁シートの少なくとも対向する２つの面は、伸長時はボトムシートの面積よりも大きな面積を有し、ボトムシートを底面にした培養と、前記伸長時にボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートを底面にした培養のどちらも可能であるバイオリアクターバッグである。
前記伸長時はボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートは、伸長時にボトムシートの面積の３倍以上の面積となることが好ましく、３倍以上５倍以下の面積となることがより好ましい。

前記バイオリアクターバッグのボトムシート、トップシート、側壁シートとしては、通常のバイオリアクターバッグのトップシート、ボトムシートに用いられている材料と同じものを用いることができる。
側壁シートは、伸縮可能とするために、折り畳み可能なものが好ましく、例えば、プラスチックフィルム又はラミネート材料のようなポリマー材料が挙げられ、可撓性であり、また、中が見えるように透明であるシートを有することが好ましい。
前記バイオリアクターバッグのボトムシート、トップシート、側壁シートとしては、好ましくは、エチレン・酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）等を挙げることができる。

ボトムシート、トップシート、４つの面からなる側壁シートは、継ぎ合わされ、直方体型となる。
前記直方体型としては、伸長時はボトムシートの面積よりも大きな面積となる少なくとも対向する２つの側壁シートを有する。伸長時に、ボトムシートの面積よりも大きな面積となる側壁シートを有することにより、前記側壁シートを底面にした場合、面積が増加し、培地の容量を増やすことができる。

側壁シートが、ボトムシートから垂直方向に伸縮可能とするには、例えば、側壁シートが、ボトムシートから垂直方向に伸縮可能となるように、蛇腹折り構造部分を有することが挙げられる。蛇腹折り構造にすることにより、伸長した時の長さを調節することができる。
前記蛇腹折り構造部分は、バイオリアクターバッグのトップシートに近い部分に設けることが好ましい。
ボトムシートを底面とした培養を行う際は、蛇腹折り構造部分の蛇腹を折りたたんだ状態で培養を行い、側壁シートを底面とした培養を行う際は、蛇腹折り構造部分の蛇腹を引き伸ばし、伸長させて、培養を行う。蛇腹折り構造部分は伸長させて、ガスを入れることにより膨らみ、膨らんだ状態で培養を行うことができる。
蛇腹折り構造部分を伸長させた際のバイオリアクターバッグの容量は５L〜５０Ｌとなることが好ましい。
また、バイオリアクターバッグを用いた培養において、液体部分（培地＋細胞）と空間の部分は、体積比で、液体部分：空間の部分＝０．３：１〜１：１が好ましい。従って、垂直方向に伸縮可能とする部分の長さは、液体部分：空間の部分が、前記の範囲となるように設けることが好ましい。
伸縮可能とする部分の長さが短いと、側壁シートを伸長した際の容量を大きくしようとする場合、ボトムシートを底面とした際の、バイオリアクターバッグ内の培地上の空間の部分が大きくなり、ＣＯ_２等を多く入れる等の無駄が生じるので、好ましくない。
伸縮可能とする部分の長さは、ボトムシートを底面とした際のバイオリアクターバッグ内の液体部分と空間の部分を、前記液体部分：空間の部分＝０．３：１〜１：１の範囲にすることができ、伸長時に側壁シートの面積がボトムシートの面積よりも大きくなり、液体部分：空間の部分＝０．３：１〜１：１の範囲としても、収縮時の５倍程度の容量の液体を入れることができるような長さであることが好ましい。
前記側壁シートが、ボトムシートから垂直方向に伸縮可能とすることにより、ボトムシートを底面とした際のバイオリアクターバッグ内の空間部分を小さくし、前記液体部分：空間の部分＝０．３：１〜１：１の範囲にすることができ、ガス空間の無駄を省くことができる。また、伸長時に側壁シートの面積がボトムシートの面積よりも大きくなることにより、液体部分：空間の部分＝０．３：１〜１：１の範囲であっても、収縮時の５倍程度の容量の液体を入れることができ、スケールアップすることができる。
前記蛇腹折り構造は、予め、側壁シートに折り目を設けておき、ボトムシートおよびトップシートと継ぎ合わせた後に折り畳み、蛇腹折り構造とすることが好ましい。

また、本発明のバイオリアクターバッグには、膜ろ過モジュールが取り付けられている。
膜ろ過モジュールは、ボトムシートを底面にした培養、及び側壁シートを底面にした培養の際に、培地上の空間部分となる位置であり、ボトムシートを底面にした培養の際に、前記蛇腹折り構造となる部分以外の位置に取り付けられることが好ましい。
膜ろ過モジュールの取り付け方法としては、従来公知の方法を用いることができる。
膜ろ過モジュールにより、操作中に細胞が外気に触れることなく、培地の交換が可能となる。膜ろ過モジュールとしては、ＡＴＦ（交互接線流）膜ろ過モジュールが一般的に広く使用されており、好ましい。

また、本発明のバイオリアクターバッグには、バイオリアクターバッグに取り付け可能な公知の装置、例えば、二酸化炭素（５％）等のガスを、バッグ上部の空間部分に、連続的に通気し、連続的に排出するための注入口／排出口、細胞・培地注入口、サンプリングのためのサンプリング口等が取り付けられていても良い。
前記ガスの注入口／排出口、細胞・培地注入口、サンプリング口は、ボトムシートを底面にした培養、及び側壁シートを底面にした培養の際に、培地上の空間となる位置であり、ボトムシートを底面にした培養の際に、前記蛇腹折り構造となる部分以外の位置に取り付けられることが好ましい。
また、前記膜ろ過モジュール等に取り付けられ、バイオリアクターバッグ内部の培地中に導かれているチューブは、チューブ先端に重量物がついており、バッグ内部でチューブが垂れ下がっているような構造にすることにより、ボトムシートを底面にした場合と、側壁シートを底面にした場合、どちらにおいても、重力によってチューブが液面に漬かる状態にすることができる。

本発明のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法は、本発明のバイオリアクターバッグを用いたバイオリアクターバッグのスケールアップ方法であって、以下のstep１〜５の工程を有する。
step１．バイオリアクターバッグに、培地を入れ、細胞を播種し、側壁シートを収縮した状態で、ボトムシートを底面にした培養を行う（小スケール培養）
step２．培地を、膜ろ過モジュールを用いて膜ろ過し、膜ろ過によって膜を透過した培地は系外へ排出し、膜ろ過により膜を透過しなかった細胞および培地をバイオリアクターバッグに返送する
step３．側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長させ、ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートが底面となるように、９０度倒して設置する
step４．前記小スケール培養の培地よりも多い容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入する
step５．培養を再開する（大スケール培養）
前記step３において、側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長させた際に、ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートの面積がボトムシートの面積の３倍以上であり、前記step４において、小スケールの培地の３倍以上の容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入することが好ましい。

本発明のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法について、図面を用いて説明する。
図１Ａ〜図１Ｃは本発明のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法の一例である。図１Ａは、step１を、図１Ｂはstep２を、図１Ｃはstep３〜step５を示す。
図１Ａに示すstep１では、バイオリアクターバッグ１は、ＡＴＦ式膜ろ過モジュール２が取り付けられており、ボトムシート３、トップシート４、側壁シート５で形成された直方体型のバイオリアクターバッグであって、前記側壁シートは、ボトムシートから垂直方向に伸縮可能な部分６を有する。

先ず、バイオリアクターバッグに、培地を入れ、細胞を播種し、側壁シートを収縮した状態で、ボトムシートを底面にした培養を行う（小スケール培養）（step１）。
前記細胞としては、ＣＨＯ細胞をはじめとする、浮遊培養が可能な細胞が挙げられ、ＮＳＯ細胞も含まれる。
小スケールの際の培地の深さは、液体部分：空間の部分＝０．３：１〜１：１となるようにすることが好ましく、細胞密度は、１．０〜２．０×１０⁵cells／mLとなるように播種することが好ましい。
細胞が増殖（あるいはその後、細胞濃度が停滞）して、培地の栄養が不足してきたらスケールアップを行う。培地を、膜ろ過モジュール２を用いて膜ろ過し、膜ろ過によって膜を透過した培地は系外へ排出し、膜ろ過により膜を透過しなかった細胞および培地をバイオリアクターバッグに返送する（図１Ｂ、step２）。
ＡＴＦ膜ろ過モジュールにおけるろ過プロセスにおいて、細胞と培地が、チューブ１１を透過して膜ろ過され、膜を透過した培地はチューブ１２を通過し、系外へ排出される。膜を透過せず残った細胞と培地は、再びチューブ１１を通り、培養バッグへ返送される。このチューブ１１内を（培地＋細胞）が往復を繰り返し、古い培地を排出する。
側壁シートをボトムシートの垂直方向に引き伸ばし、ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートが底面となるように、９０度倒して設置する（図１Ｃ、step３）。
この時、膜ろ過モジュールの取り付け位置が、培地を注入した際に空間部分となるようにする。
次に、前記小スケール培養の培地よりも多い容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入する（図１Ｃ、step４）。
新しい培地は、細胞・培地注入口に取り付けられたチューブを用いて注入することができる。

通常スケールアップの際は、培地の容量が５倍程度に増加するようスケールアップを行う。前記step３において、側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長させた際に、ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートの面積がボトムシートの３倍以上となることで、培地の深さを変えずに、前記step４において、小スケールの培地の３倍以上の容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入することができ、また、前記step４において、小スケールの培地の５倍程度の容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入しやすくなる。
そして、培養を再開する（図１Ｃ、step５）。
例えば、前記step１．及びstep５において、液体部分：空間部分＝１：１の状態を想定した場合、伸長時の側壁のシート面積が伸長前の側壁シート面積の５倍となるような面積となる側壁シートを有し、伸長時にボトムシートの面積の５倍とすることにより、新しい培地の容量を５倍とすることができる。

前記培養は、ウェーブ式攪拌培養であることが好ましい。ウェーブ式攪拌培養は、動物細胞や昆虫細胞の培養、抗体医薬やワクチンの製造などに理想的なシステムであり、バイオリアクターバッグを穏やかに揺り動かし、緩やかな波をおこして、培養に理想的な環境を保つことができる。

スケールアップを行う際は、培養環境が同等になるように調整することが好ましい。
本発明のバイオリアクターバッグにより、ボトムシートを底面として小スケール培養を行った後、側壁シートを底面として大スケール培養を行うことができる。従って、ボトムシートを底面とした際と、側壁シートを底面とした際の底面は、同じ長さの辺を有する。ウェーブ式攪拌培養において、小スケール培養、大スケール培養の際に、バイオリアクターバックを揺り動かす方向を、前記同じ長さの辺の方向に揃えることにより、攪拌条件を同じにしやすくなる。

一般的な、ボトムシートとトップシートの２枚で形成されたバイオリアクターバッグを用いた場合は、スケールアップする際に、大きなバッグに、培養した細胞を移し変え、そのバッグ容量に合わせた新しい培地を供給して、スケールアップする必要があった。移し変える際は、バッグから培地を抜き出して遠心分離し、遠沈した細胞を新しい培地に播種する操作が必要であった。これは手作業の手間がかかる上、操作中に培地が外気に触れるため、コンタミネーションするリスクもあった。
しかし、本発明のバイオリアクターバッグを用いることにより、培養した細胞を移し変ええる操作が減少し、コンタミネーションするリスクも低減することができる。

（実施例１）
エチレン・酢酸ビニル共重合体（ＥＶＡ）で作製された、１０ｃｍ×１０ｃｍのトップシートおよびボトムシート（２枚）と、１０ｃｍ×５０ｃｍの側壁シート（４枚）を準備した。前記側壁シートのトップシート側に折り目を入れ、継ぎ合わせ、直方体に成形した。
次に側壁シートのトップシート側に折り目に沿って、蛇腹折り構造部分を設け、伸縮可能とした。収縮時の大きさは、高さが１０ｃｍとした。
１０ｃｍ×５０ｃｍの側壁シートの蛇腹折り構造部分の下に、ＡＴＦ式膜ろ過モジュール、二酸化炭素（５％）注入口／排出口、細胞・培地注入口、サンプリング口を取り付けた。
１．５×１０⁵cells／mlとなるように細胞を、培養液の入ったバッグに播種し、ボトムシートを底面としたＷＡＶＥ式攪拌培養で培養した（小スケール培養）。この時、液体部分の深さは５ｃｍであり、バイオリアクターバッグの液体部分（培地＋細胞）と空間の部分は、体積比で、液体部分：空間の部分＝１：１であった。２日目終了時に、細胞濃度が増大し、栄養成分が枯渇したことを確認し、膜ろ過により培地を排出し、細胞と一部の培地を返送した上で、側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長し、面積がボトムシートよりも大きくなる側壁シートが底面となるように、９０度倒して設置した。新しい培地を継ぎ足し、液体部分の深さを５ｃｍ、前記液体部分：空間の部分＝１：１とし、細胞密度を２．０×１０⁵cells／mlに調整した。以降、細胞濃度が増大し、栄養成分が枯渇するまで、ＷＡＶＥ式攪拌培養を行った（大スケール培養）。
前記小スケール培養、及び大スケール培養は、底面の１０ｃｍとなる辺がロッキング方向となるように設置して培養を行った。
側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長させた際に、側壁シートの面積がボトムシートの面積の５倍であり、小スケールの培地の５倍の容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入することができた。
図２に、培養時間と細胞密度の関係を示す。

１ バイオリアクターバッグ
２ ＡＴＦ式膜ろ過モジュール
３ ボトムシート
４ トップシート
５ 側壁シート
６ 伸縮可能な部分
１１、１２ チューブ

Claims (4)

1. バイオリアクターバッグを用いたバイオリアクターバッグのスケールアップ方法であって、
   前記バイオリアクターバッグは、膜ろ過モジュールが取り付けられた、ボトムシート、トップシート、４つの面からなる側壁シートで形成された直方体型であって、
   前記側壁シートは、前記ボトムシートから垂直方向に伸縮可能であり、
   前記側壁シートの少なくとも対向する２つの面は、伸長時は前記ボトムシートの面積よりも大きな面積を有し、
   前記ボトムシートを底面にした培養と、前記伸長時に前記ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する前記側壁シートを底面にした培養のどちらも可能であるバイオリアクターバッグであり、
   以下のstep１〜５の工程を有するバイオリアクターバッグのスケールアップ方法。
   step１．バイオリアクターバッグに、培地を入れ、細胞を播種し、側壁シートを収縮した状態で、ボトムシートを底面にした培養を行う（小スケール培養）
   step２．培地を、膜ろ過モジュールを用いて膜ろ過し、膜ろ過によって膜を透過した培地は系外へ排出し、膜ろ過により膜を透過しなかった細胞および培地をバイオリアクターバッグに返送する
   step３．側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長させ、ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートが底面となるように、９０度倒して設置する
   step４．前記小スケール培養の培地よりも多い容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入する
   step５．培養を再開する（大スケール培養）
2. 前記step３において、側壁シートをボトムシートの垂直方向に伸長させた際に、ボトムシートの面積よりも大きな面積を有する側壁シートの面積がボトムシートの面積の３倍以上であり、前記step４において、小スケールの培地の３倍以上の容量となる新しい培地をバイオリアクターバッグ内に注入する請求項１に記載のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法。
3. 前記膜ろ過モジュールが、ＡＴＦ式膜ろ過モジュールである請求項１または２に記載のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法。
4. 前記培養がウェーブ式攪拌培養である請求項１〜３の何れか一項に記載のバイオリアクターバッグのスケールアップ方法。

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