ES2890454T3 - Métodos de establecimiento de bancos de células de densidad ultraalta - Google Patents
Métodos de establecimiento de bancos de células de densidad ultraalta Download PDFInfo
- Publication number
- ES2890454T3 ES2890454T3 ES15774796T ES15774796T ES2890454T3 ES 2890454 T3 ES2890454 T3 ES 2890454T3 ES 15774796 T ES15774796 T ES 15774796T ES 15774796 T ES15774796 T ES 15774796T ES 2890454 T3 ES2890454 T3 ES 2890454T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- cells
- cell
- bioreactor
- culture
- density
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 111
- 238000013354 cell banking Methods 0.000 title description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 381
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims abstract description 92
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000035899 viability Effects 0.000 claims abstract description 28
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims abstract description 21
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 15
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims description 56
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 17
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 17
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 8
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 6
- 101001084702 Arabidopsis thaliana Histone H2B.10 Proteins 0.000 claims description 3
- 102220497176 Small vasohibin-binding protein_T47D_mutation Human genes 0.000 claims description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000005457 ice water Substances 0.000 claims description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 45
- 230000008569 process Effects 0.000 description 23
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 16
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 16
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 9
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 102100023580 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Human genes 0.000 description 6
- 101000905743 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Proteins 0.000 description 6
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 6
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 6
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 6
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 6
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 5
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 5
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 5
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 5
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000004812 Fluorinated ethylene propylene Substances 0.000 description 4
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N azocan-1-yl-(3,4,5-trimethoxyphenyl)methanone Chemical compound COC1=C(OC)C(OC)=CC(C(=O)N2CCCCCCC2)=C1 WZSDNEJJUSYNSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 4
- 229920009441 perflouroethylene propylene Polymers 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100040895 Growth/differentiation factor 10 Human genes 0.000 description 2
- 101710194458 Growth/differentiation factor 10 Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 241000514450 Podocarpus latifolius Species 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 2
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 2
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000098 polyolefin Polymers 0.000 description 2
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 2
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100023033 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100023583 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-6 alpha Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000974934 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000905751 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-6 alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000997829 Homo sapiens Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000000664 diazo group Chemical group [N-]=[N+]=[*] 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229920001684 low density polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 239000004702 low-density polyethylene Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 229920000379 polypropylene carbonate Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000004528 spin coating Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 229920002725 thermoplastic elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0236—Mechanical aspects
- A01N1/0242—Apparatuses, i.e. devices used in the process of preservation of living parts, such as pumps, refrigeration devices or any other devices featuring moving parts and/or temperature controlling components
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0278—Physical preservation processes
- A01N1/0284—Temperature processes, i.e. using a designated change in temperature over time
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/14—Bags
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/26—Constructional details, e.g. recesses, hinges flexible
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/16—Vibrating; Shaking; Tilting
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/10—Perfusion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
- C12M3/06—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with filtration, ultrafiltration, inverse osmosis or dialysis means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Thermal Sciences (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- Virology (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Un método para producir un banco de células congeladas de densidad ultraalta directamente a partir de una población de células cultivadas, comprendiendo el método: a) cultivar células en un biorreactor de perfusión para obtener una población celular de densidad ultraalta con una concentración de al menos aproximadamente 1,0 x 108 células/ml, estando dicho biorreactor de perfusión acoplado a un sistema de retención celular que comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante (ATF) que comprende un filtro, teniendo el cultivo celular de biorreactor de perfusión una concentración de oxígeno disuelto (OD) de al menos aproximadamente el 30%, y controlándose el OD en el biorreactor de perfusión a través del ajuste de la tasa de basculación y el ángulo de basculación del biorreactor, basculándose el biorreactor inicialmente a 22 rpm con un ángulo de basculación de 10º y basculándose posteriormente a 25 rpm con un ángulo de basculación de 12º, y suministrando manualmente oxígeno puro al espacio de cabeza cuando el OD es > 30%, siendo una tasa de flujo de gas total inicialmente de 0,2 litros por minuto (lpm) y aumentándose hasta 0,4 lpm cuando la concentración celular es >= 3 x 107 células/ml o > 4 x 107 células/ml; y b) añadir crioprotector a la población celular de densidad ultraalta para producir un banco de células congeladas de densidad ultraalta, teniendo el banco de células congeladas de densidad ultraalta una concentración de al menos aproximadamente 1,0 x 108 células/ml y una viabilidad tras la descongelación de al menos aproximadamente el 95%, y no realizándose ninguna etapa de concentración adicional entre el cultivo de las células y la adición de crioprotector a la población celular de densidad ultraalta.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de establecimiento de bancos de células de densidad ultraalta
ANTECEDENTES
El establecimiento de bancos de células se usa ampliamente para mantener reservas de células caracterizadas, congeladas, que pueden descongelarse para su uso en varias aplicaciones, incluyendo la producción de proteínas terapéuticamente relevantes. Normalmente, las reservas criopreservadas se mantienen a densidades menores (por ejemplo, aproximadamente 1 o 2 x107 células/ml) o se centrifugan para crear alícuotas de densidad mayor para su almacenamiento. Las reservas de densidad menor no permiten una inoculación eficiente de cultivos de gran volumen, y los métodos de concentración pueden dañar las células, reduciendo de ese modo la viabilidad celular de la reserva congelada. Por estos motivos, los métodos anteriores de establecimiento de bancos de células son relativamente ineficientes y en última instancia no permiten una producción rápida de cultivos celulares de alta densidad a partir de reservas congeladas. Por consiguiente, hay una necesidad de métodos de establecimiento de bancos de células mejorados.
SUMARIO
Basándose en la divulgación que está contenida en el presente documento, la presente invención proporciona un método para producir un banco de células congeladas de densidad ultraalta directamente a partir de una población de células cultivadas, comprendiendo el método:
a) cultivar células en un biorreactor de perfusión para obtener una población celular de densidad ultraalta con una concentración de al menos aproximadamente 1,0 x 108 células/ml, estando dicho biorreactor de perfusión acoplado a un sistema de retención celular que comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante (ATF, alternating tangential flow) que comprende un filtro,
teniendo el cultivo celular de biorreactor de perfusión una concentración de oxígeno disuelto (OD) de al menos aproximadamente el 30%, y controlándose el OD en el biorreactor de perfusión a través del ajuste de la tasa de basculación y el ángulo de basculación del biorreactor, basculándose inicialmente el biorreactor a 22 rpm con un ángulo de basculación de 10° y basculándose posteriormente a 25 rpm con un ángulo de basculación de 12°, y suministrando manualmente oxígeno puro al espacio de cabeza cuando el OD es > 30%, siendo una tasa de flujo de gas total inicialmente de 0,2 litros por minuto (lpm) y aumentando hasta 0,4 lpm cuando la concentración celular es > 3 x 107 células/ml o > 4 x 107 células/ml; y
b) añadir crioprotector a la población celular de densidad ultraalta para producir un banco de células congeladas de densidad ultraalta, teniendo el banco de células congeladas de densidad ultraalta una concentración de al menos aproximadamente 1,0 x 108 células/ml y una viabilidad tras la descongelación de al menos aproximadamente el 95%, y
no realizándose ninguna etapa de concentración adicional entre el cultivo de las células y la adición de crioprotector a la población celular de densidad ultraalta.
El método de la presente invención y algunas realizaciones preferidas del mismo se exponen en las reivindicaciones adjuntas.
La presente divulgación proporciona métodos mejorados para la creación de un banco de células de densidad ultraalta. En ciertos casos, los métodos emplean técnicas de cultivo celular por perfusión mejoradas que permiten la producción de cultivos celulares de densidad ultraalta que pueden criopreservarse a densidades celulares inesperadamente altas sin la necesidad de ninguna etapa de concentración celular, al tiempo que se conserva una viabilidad celular excelente para su uso posterior en cultivo celular de producción.
Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para producir un banco de células congeladas de densidad ultraalta directamente a partir de una población de células cultivadas, comprendiendo el método: cultivar células en un biorreactor de perfusión para obtener una población celular de densidad ultraalta con una concentración de al menos 1,0 x 10A8 células/ml, estando dicho biorreactor de perfusión acoplado a un sistema de retención celular; y añadir crioprotector a la población celular de densidad ultraalta para producir un banco de células congeladas de densidad ultraalta, teniendo el banco de células congeladas de densidad ultraalta una concentración de al menos 1,0 x 10A8 células/ml, y no realizándose ninguna etapa de concentración adicional entre el cultivo de las células y la adición de crioprotector a la población celular de densidad ultraalta.
En el método de la invención, el sistema de retención celular comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante que comprende un filtro. En determinadas realizaciones, el filtro tiene un área superficial de al menos aproximadamente 0,08 m2. En determinadas realizaciones, el filtro tiene un área superficial de aproximadamente 0,08 m2 a aproximadamente 0,3 m2, de aproximadamente 0,3 m2 a aproximadamente 0,5 m2, de aproximadamente 0,5 m2
a aproximadamente 1,0 m2, de aproximadamente 0,7 m2 a aproximadamente 0,8 m2, de aproximadamente 1,0 m2 a aproximadamente 2,0 m2, de aproximadamente 2,0 m2 a aproximadamente 3,0 m2, de aproximadamente 3,0 m2 a aproximadamente 4,0 m2, o de aproximadamente 4,0 m2 a aproximadamente 5,5 m2. En determinadas realizaciones, el filtro tiene un tamaño de poro seleccionado del grupo que consiste en 0,2 gm, 0,4 gm y 0,65 gm. En otras realizaciones, el filtro tiene un tamaño de poro seleccionado del grupo que consiste en 0,7 gm, 1,2 gm y 7 gm.
En determinadas realizaciones, la población celular de densidad ultraalta tiene una densidad celular viable seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1,0 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,1 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,2 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,3 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,4 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,5 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,6 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1.7 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,8 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,9 x 10A8 células/ml y aproximadamente 2,0 x 10A8 células/ml.
En determinadas realizaciones, criopreservar comprende añadir dimetilsulfóxido (DMSO) a la población celular de densidad ultraalta a una concentración final de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol. En determinadas realizaciones, criopreservar comprende congelar al menos una porción de la población celular de densidad ultraalta en un recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación.
En determinadas realizaciones, el recipiente es un vial. En determinadas realizaciones, el banco de células congeladas de densidad ultraalta comprende aproximadamente 4,5 x 10A8 células/vial.
En determinadas realizaciones, el recipiente es una bolsa de criopreservación. En determinadas realizaciones, la bolsa de criopreservación tiene un volumen de aproximadamente 5 a aproximadamente 150 ml. En determinadas realizaciones, el banco de células congeladas de densidad ultraalta tiene una densidad celular de al menos aproximadamente 1,0 x 10A8 células/ml.
En determinadas realizaciones, la tasa de perfusión en el biorreactor de perfusión es de entre aproximadamente 0,02 nl/célula/día y aproximadamente 0,5 nl/célula/día. En determinadas realizaciones, la tasa de perfusión en el biorreactor de perfusión es de entre 0 y 15 volúmenes de reactor por día.
En determinadas realizaciones, el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene un pH de entre aproximadamente 6.8 y aproximadamente 7,2.
En el método de la invención, el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene una concentración de oxígeno disuelto (OD) de al menos aproximadamente el 30%.
En determinadas realizaciones, el biorreactor es un biorreactor de bolsa flexible. En determinadas realizaciones, el biorreactor comprende un filtro incorporado.
En ciertos casos, el banco de células congeladas de densidad ultraalta tiene una viabilidad celular tras la descongelación de al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90% o al menos aproximadamente el 95%.
En determinadas realizaciones, las células son células de mamífero. En determinadas realizaciones, las células de mamífero se seleccionan del grupo que consiste en: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 y células de hibridoma. En determinadas realizaciones, las células son células transfectadas. En determinadas realizaciones, las células expresan una proteína terapéutica.
En determinadas realizaciones: el biorreactor de perfusión comprende un biorreactor de bolsa flexible; el filtro tiene un área superficial de filtro de al menos 0,3 m2 y un tamaño de límite de peso molecular (MWCO, molecular weight cut off) de al menos 50 kDa; el crioprotector añadido a la población celular de densidad ultraalta es DMSO; y el banco de células congeladas de densidad ultraalta comprende de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol., de DMSO.
En determinadas realizaciones, el pH y el OD del cultivo se controlan mediante métodos automatizados. En determinadas realizaciones, el pH y el OD del cultivo se controlan mediante métodos no automatizados. En ciertos casos, el pH y el OD se controlan a través de uno cualquiera o más de los siguientes: ajuste de la mezcla de gases que se introducen en el cultivo, ajuste de la tasa de basculación del biorreactor o ajuste del ángulo de basculación del biorreactor. En ciertos casos, el biorreactor se bascula a 15 rpm con un ángulo de basculación de 8°. En ciertos casos, el biorreactor se bascula a 22 rpm con un ángulo de basculación de 10°. En ciertos casos, el biorreactor se bascula a 25 rpm con un ángulo de basculación de 12°.
En determinadas realizaciones, la población celular de densidad ultraalta se enfría hasta y se mantiene a una temperatura de aproximadamente 4°C antes de y durante la adición del crioprotector y la dispensación. En determinadas realizaciones, la población celular de densidad ultraalta se mantiene a una temperatura de
aproximadamente 20°C a aproximadamente 26°C durante la adición del crioprotector y la dispensación. En determinadas realizaciones, la población celular de densidad ultraalta se mantiene a una temperatura fría no controlada usando un baño de agua helada durante la adición del crioprotector y la dispensación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1: es un dibujo de un proceso de establecimiento criogénico de bancos de células de densidad ultraalta. Figura 2: es un gráfico que representa la densidad celular viable (células/ml), tasa de perfusión (RV/día) y tasa de perfusión específica de célula 10X (nl/célula-día) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 1 de rCHO.
Figura 3: es un gráfico que representa el perfil de pH fuera de línea en un cultivo de línea celular 1 de rCHO.
Figura 4A-C: es una serie de gráficos que representan el perfil de crecimiento celular tras la descongelación (A), porcentaje de células apoptóticas tardías tras la descongelación (B) y la tasa de producción específica (unidades/células E9-día) para una alícuota de banco de células ultra-HD de 5 ml de línea celular 1 de rCHO.
Figura 5: es un gráfico que representa la densidad celular viable (células/ml), tasa de perfusión (RV/día) y tasa de perfusión específica de célula 10X (nl/célula-día) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 2 de rCHO.
Figura 6: es un gráfico que representa el perfil de pH fuera de línea en un cultivo de línea celular 2 de rCHO.
Figura 7: es un gráfico que representa el crecimiento celular basado en la densidad celular viable Xv (células/ml; líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas) para la línea celular 2 de rCHO cuando se siembra a 0,5 x 10A6 vc/ml en matraces de agitación de 250 ml y 3 l.
Figura 8: es un gráfico que representa el crecimiento celular basado en la densidad celular viable Xv (células/ml; líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas) para la línea celular 2 de rCHO cuando se siembra a 1,0 x 10A6 vc/ml en matraces de agitación de 250 ml y 3 l.
Figura 9: es un gráfico que representa el porcentaje de células apoptóticas tardías y muertas en un cultivo de línea celular 2 de rCHO cuando se siembra a 0,5 x 10A6 vc/ml en matraces de agitación de 250 ml y 3 l.
Figura 10: es un gráfico que representa el porcentaje de células apoptóticas tardías y muertas en un cultivo de línea celular 2 de rCHO cuando se siembra a 1,0 x 10A6 vc/ml en matraces de agitación de 250 ml y 3 l.
Figura 11: es un gráfico que representa la tasa de producción específica (SPR, specific production rate) en cultivos en matraces de agitación de línea celular 2 de rCHO cuando se siembra a 0,5 x 10A6 vc/ml en matraces de agitación de 250 ml y 3 l.
Figura 12: es un gráfico que representa la tasa de producción específica (SPR) en cultivos en matraces de agitación de línea celular 2 de rCHO cuando se siembra a 1,0 x 10A6 vc/ml en matraces de agitación de 250 ml y 3 l.
Figura 13: es un gráfico que representa el crecimiento celular en bolsas WAVE basado en la densidad celular viable Xv (células/ml; líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas) para la línea celular 2 de rCHO.
Figura 14: es un gráfico que representa el porcentaje de células apoptóticas tardías y muertas en un cultivo de línea celular 2 de rCHO.
Figura 15: es un gráfico que representa la densidad celular viable (células/ml), tasa de perfusión (RV/día) y tasa de perfusión específica de célula 10X (nl/célula-día) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 3 de rCHO.
Figura 16: es un gráfico que representa el perfil de pH fuera de línea en un cultivo de línea celular 3 de rCHO. Figura 17A-C: es una serie de gráficos que representan (A) el crecimiento celular (líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas); (B) el porcentaje de células apoptóticas tardías y muertas; y (C) la tasa de producción específica (SPR) en cultivos en matraces de agitación de línea celular 3 de rCHO.
Figura 18: es un gráfico que compara la densidad celular viable (células/ml, líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas) con medio interno (negro) y medio CD CHO (gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 3 de rCHO.
Figura 19: es un gráfico que compara la tasa de perfusión (círculos, líneas continuas) y tasa de perfusión específica de célula (triángulos, líneas discontinuas) con medio interno (negro) y medio CD CHO (gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 3 de rCHO.
Figura 20: es un gráfico que compara la densidad celular viable (células/ml, líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas) con medio CD CHO suplementado con Efficient Feed B (negro) y medio CD CHO (gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 1 de rCHO.
Figura 21: es un gráfico que compara la tasa de perfusión (círculos, líneas continuas) y la tasa de perfusión específica de célula (triángulos, líneas discontinuas) con medio CD CHO suplementado con Efficient Feed B (negro) y medio CD CHO (gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 1 de rCHO.
Figura 22: es un gráfico que representa la densidad celular viable (células/ml, líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas) usando el biorreactor WAVE de 20 l (volúmenes de trabajo de 10 l, negro) y el biorreactor WAVE de 10 l (volumen de trabajo de 5 l, gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 3 de rCHO.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente divulgación proporciona un método de establecimiento criogénico de bancos de células de densidad ultraalta que comprende el uso de un sistema de cultivo por perfusión vinculado a un dispositivo de retención de células no centrífugo.
I. Definiciones
Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo por lotes” se refiere a una técnica de cultivo celular en la que una cantidad de medio de cultivo nuevo se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico y en la que el medio de crecimiento del cultivo no se retira ni se sustituye de manera continua por medio nuevo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo por lotes con alimentación” se refiere a una técnica de cultivo celular en la que una cantidad de medio de cultivo nuevo se inocula con células inicialmente, y se alimentan nutrientes de cultivo adicionales (de manera continua o en incrementos discretos) al cultivo durante el proceso de cultivo, con o sin recogida de células y/o producto periódica antes de la terminación de cultivo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cultivo por perfusión” se refiere a una técnica de cultivo celular en la que una cantidad de medio nuevo se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico (tal como anteriormente) y en la que el medio de crecimiento se retira de manera continua removed de un cultivo y se sustituye por medio nuevo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “biorreactor” hará referencia a un receptáculo para cultivar células.
En una realización, el biorreactor es un “biorreactor de bolsa flexible”. Un “biorreactor de bolsa flexible” es una cámara estéril capaz de recibir un medio líquido e inóculo celular que comprende adicionalmente conectores, puertos, adaptadores y tubos flexibles. En una realización, la cámara está hecha de plástico. En una realización específica, la cámara está hecha de plástico transparente laminado de múltiples capas. En una realización específica adicional, la cámara está hecha de plástico transparente laminado de múltiples capas y tiene una capa de contacto fluida hecha de copolímero de acetato de etilenvinilo/polietileno de baja densidad de clase VI USP, mientras que la capa externa está hecha de polietileno de baja densidad.
Adicionalmente, los conectores, puertos y adaptadores pueden estar hechos de cualquier tipo de plástico incluyendo, pero sin limitarse a: polietileno, polipropileno y policarbonato, mientras que los tubos pueden estar construidos de cualquier tipo de plástico incluyendo, pero sin limitarse a: elastómero termoplástico o silicona (por ejemplo, silicona curada con platino).
Biorreactores de bolsa flexible apropiados pueden encontrarse comúnmente en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la patente estadounidense n.° 6.544.788.
El biorreactor de bolsa flexible puede llenarse parcialmente con medios de cultivo y entonces inflarse hasta la rigidez. Entonces puede colocarse sobre una plataforma de basculación (tal como una unidad de basculación BASE20/50EHT de GE Life Sciences) que se mueve en vaivén a través de un ángulo de basculación fijado previamente y una tasa de basculación fijada previamente. Este movimiento de basculación induce movimientos de tipo onda en los medios de cultivo, promoviendo la agitación y la transferencia de oxígeno con el fin de mejorar el rendimiento del cultivo celular. El ángulo de basculación fijado previamente puede ser de al menos aproximadamente 4 grados, por ejemplo, aproximadamente 4 grados, 5 grados, 6 grados, 7 grados, 8 grados, 9 grados, 10 grados, 11 grados o 12 grados. Además, la tasa de basculación fijada previamente puede fijarse a una tasa de basculación por minuto (rpm) que sea de al menos aproximadamente 6 rpm, por ejemplo, aproximadamente 6 rpm, aproximadamente 7 rpm, 8 rpm, 9 rpm, 10 rpm, 11 rpm, 12 rpm, 13 rpm, 14 rpm, 15 rpm, 16 rpm, 17 rpm, 18 rpm, 19 rpm, 20 rpm, 21 rpm, 22 rpm, 23 rpm, 24 rpm, 25 rpm, 26 rpm, 27 rpm, 28 rpm, 29 rpm, 30 rpm, 31 rpm, 32 rpm, 33 rpm, 34 rpm, 35 rpm, 36 rpm, 37 rpm, 38 rpm, 39 rpm o 40 rpm. En un caso específico, la tasa de basculación por minuto es de aproximadamente 22 rpm.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sistema de retención celular” se refiere a todos los dispositivos con la capacidad de separar células del medio y los productos residuales en el mismo mediante el uso de un filtro. Los filtros pueden incluir filtros de membrana, cerámicos o metálicos en cualquier forma incluyendo enrollada en espiral, tubular o laminar. Los filtros pueden ser de diferentes áreas superficiales. Por ejemplo, el área superficial de filtro puede ser de aproximadamente 0,08 m2 a aproximadamente 5,5 m2, por ejemplo, aproximadamente 0,08 m2, 0,09 m2,
0,1 m2, 0,2 m2, 0,3 m2, 0,4 m2, 0,5 m2, 0,6 m2, 0,7 m2, 0,77 m2, 0,8 m2, 0,9 m2, 1,0 m2, 1,1 m2, 1,2 m2, 1,3 m2, 1,4 m 1.5 m2, 1,6 1,7 m2, 1,8 m2, 1,9 m2, 2,0 m2 , 2,1 m2 , 2,2 m2, 2,3 m2, 2,4 m2, 2,5 m2, 2,6 m2, 2,7 m2, 2,8 m2, 2,9 m 3.0 m2, 3,1 
3,2 m2, 3,3 m2, 3,4 m2, 3,5 m2, 3,6 m2, 3,7 m2, 3,8 m2, 3,9 m2, 4,0 m2, 4,1 m2, 4,2 m2, 4,3 m2, 4,4 m 4.5 m2, 4,6 m2, 4,7 m2, 4,8 m2, 4,9 m2, 5,0 m2, 5,1 m2, 5,2 m2, 5,3 m2, 5,4 m2 o 5,5 m2. En determinadas realizaciones, el módulo de filtro tiene un tamaño de límite de peso molecular (MWCO) de desde aproximadamente 10 kilodaltons
(kDa) hasta aproximadamente 100 kDa, por ejemplo, es de aproximadamente 10 kDa, 20 kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa o 100 kDa. En otras realizaciones, el módulo de filtro tiene un tamaño de malla de desde aproximadamente 0,1 pm hasta aproximadamente 7 pm, por ejemplo, aproximadamente 0,1 pm, 0,2 pm,
0,3 pm, 0,4 pm, 0,5 pm, 0,6 pm, 0,7 pm, 0,8 pm, 0,9 pm, 1,0 pm, 1,1 pm, 1,2 pm, 1,3 pm, 1,4 pm, 1,5 pm, 1,6 pm, 1,7 pm, 1,8 pm, 1,9 pm, 2,0 pm, 2,1 pm, 2,2 pm, 2,3 pm, 2,4 pm, 2,5 pm, 2,6 pm, 2,7 pm, 2,8 pm, 2,9 pm, 3,0 pm, 3,1 pm,
3.2 pm, 3,3 pm, 3,4 pm, 3,5 pm, 3,6 pm, 3,7 pm, 3,8 pm, 3,9 pm, 4,0 pm, 4,1 pm, 4,2 pm, 4,3 pm, 4,4 pm, 4,5 pm, 4,6 pm, 4,7 pm, 4,8 pm, 4,9 pm, 5,0 pm, 5,1 pm, 5,2 pm, 5,3 pm, 5,4 pm, 5,5 pm, 5,6 pm, 5,7 pm, 5,8 pm, 5,9 pm, 6,0 pm,
6.1 pm, 6,2 pm, 6,3 pm, 6,4 pm, 6,5 pm, 6,6 pm, 6,7 pm, 6,8 pm, 6,9 pm o 7,0 pm.
Tal como se usa en el presente documento, el término “criopreservación” se refiere a un proceso mediante el que células, tejidos o cualquier otra sustancia susceptible a daño provocado por el tiempo o por actividad enzimática o química se preservan enfriándolos y almacenándolos hasta temperaturas bajo cero.
Tal como se usa en el presente documento, el término “establecimiento criogénico de bancos” se refiere a una técnica mediante la que se mezclan células con un crioprotector (por ejemplo, DMSO con o sin hidroxietilalmidón (HES)) y se colocan en un recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación. Estos recipientes se congelan entonces usando técnicas ampliamente conocidas en la técnica y se almacenan a bajas temperaturas, normalmente entre aproximadamente -130°C y aproximadamente -196°C. La colección de células obtenida mediante el proceso es un banco de células.
En el método de la invención, el banco de células es un banco de células de densidad ultraalta. Tal como se usa en el presente documento, el término “banco de células de densidad ultraalta” hará referencia a alícuotas de establecimiento criogénico de bancos de células que se han congelado a una densidad ultraalta, siendo la densidad de al menos aproximadamente 1 x 10A8 células viables/ml, por ejemplo, aproximadamente 1 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 1,1 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 1,2 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente
1.3 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 1,4 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 1,5 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 1,6 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 1,7 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 1,8 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 1,9 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 2 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 3 x 10A8 células viables/ml, aproximadamente 4 x 10A8 células viables/ml o aproximadamente 5 x 10A8 células viables/ml. Las células pueden congelarse según cualquier método disponible en la técnica y en cualquier recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación.
En otro caso, el banco de células es un banco de células maestras. Tal como se usa en el presente documento, el término “banco de células maestras” hará referencia a un cultivo de células (por ejemplo, células completamente caracterizadas) que se ha hecho crecer a partir de un único clon, se ha dispensado a recipientes de almacenamiento
(por ejemplo, dispensado a los recipientes en una única operación) y se ha almacenado en condiciones de criopreservación tal como se describió anteriormente. En ciertos casos, las células son adecuadas para su uso posterior en un cultivo celular de producción y una recogida adicional de las proteínas terapéuticamente relevantes producidas de ese modo.
En otro caso, el banco de células es un banco de células de trabajo. Tal como se usa en el presente documento, el término “banco de células de trabajo” hará referencia a un cultivo de células (por ejemplo, células completamente caracterizadas) que se han hecho crecer a partir de un único vial del banco de células maestras, o a partir de dos viales agrupados del banco de células maestras, dispensado a recipientes de almacenamiento (por ejemplo, dispensado a los recipientes en una única operación) y almacenado en condiciones de criopreservación tal como se describió anteriormente. En ciertos casos, las células son adecuadas para su uso posterior en un cultivo celular de producción y una recogida adicional de las proteínas terapéuticamente relevantes producidas de ese modo.
En otro caso, el banco de células es un minibanco de células. Tal como se usa en el presente documento, el término “minibanco” hará referencia a alícuotas de células que se han criopreservado según procedimientos de “establecimiento criogénico de bancos” (tal como se describió anteriormente) pero están compuestos por menos muestras que las que se usarían normalmente para crear un banco de células. Este tipo de banco puede usarse generalmente para optimizar las condiciones que estén considerándose para la criopreservación de una línea celular antes de crear bancos de células tal como un “banco de células maestras”. Como ejemplo, un “minibanco” se usa para
determinar la densidad celular óptima para el procedimiento de establecimiento de bancos de células de densidad ultraalta descrito en esta divulgación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación” incluye cualquier recipiente que pueda usarse en condiciones apropiadas para el almacenamiento celular entre aproximadamente -1302C y aproximadamente -1962C. Estos recipientes incluyen, pero no se limitan a, viales que están hechos de materiales adecuados para la criopreservación. Estos materiales incluyen polímeros (por ejemplo, politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno o polipropileno). Además, pueden aplicarse tratamientos superficiales a una superficie del vial de criopreservación con el fin de mejorar las condiciones de criopreservación (por ejemplo, recubrimientos hidrófilos que reducen la adsorción y desnaturalización). En realizaciones a modo de ejemplo, el vial puede tener un volumen de más de aproximadamente 0,1 ml, por ejemplo, el vial puede tener un volumen de aproximadamente 0,1 ml, aproximadamente 0,5 ml, aproximadamente 0,75 ml, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 1,5 ml, aproximadamente 2 ml, aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 4,5 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 15 ml, aproximadamente 20 ml, aproximadamente 25 ml o aproximadamente 50 ml. El recipiente también puede ser una bolsa de criopreservación, que puede tener un volumen de aproximadamente 30 ml, aproximadamente 50 ml, aproximadamente 100 ml, aproximadamente 150 ml, aproximadamente 200 ml, aproximadamente 300 ml, aproximadamente 400 ml o aproximadamente 500 ml.
Tal como se usa en el presente documento, el término “bolsa de criopreservación” es una cámara estéril que es capaz de recibir un medio líquido, es apropiada para el almacenamiento celular entre aproximadamente -130°C y aproximadamente -196°C, y puede comprender adicionalmente conectores, puertos, adaptadores y tubos flexibles. La bolsa de criopreservación puede estar construida de cualquier material apropiado incluyendo, pero sin limitarse a, polímeros tales como politetrafluoroetileno (PTFE), poliestireno, polietileno, polipropileno, etileno-propileno fluorado (FEP), poliolefina y acetato de etilenvinilo (EVA). Las bolsas de criopreservación a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: bolsas de criopreservación KryoSure® (Saint-Gobain), bolsas PermaLife™ (OriGen Biomedical), bolsas de congelación CryoStore (OriGen Biomedical), biorrecipientes Freeze-Pak™ (Charter Medical) y las bolsas dadas a conocer en la solicitud provisional estadounidense n.° 62/037.181 (Merial Ltd., una empresa de Sanofi).
En determinadas realizaciones, la bolsa de criopreservación puede soportar un sistema de establecimientos de bancos de células de fase cerrada (por ejemplo, a través del uso de al menos dos conductos estériles soldables que permiten un llenado “de sistema cerrado” de las bolsas).
Tal como se usa en el presente documento, el término “matraz de agitación” hará referencia a un receptáculo usado como matraz de cultivo en el que el medio y el cultivo celular se agitan constantemente durante la incubación.
Tal como se usa en el presente documento, el término “tren de siembra de matraz de agitación” hará referencia a un método de expansión celular en el que una alícuota de células se cultiva en primer lugar (se siembra) en un matraz de agitación y se hace crecer en el mismo. Las células se cultivan según su tasa de crecimiento y se dividen habitualmente en receptáculos más grandes y/o múltiples durante su crecimiento hasta que la biomasa alcanza un nivel suficiente para inocular un biorreactor.
Tal como se usa en el presente documento, el término “densidad de siembra” hará referencia a la densidad celular inicial a la que se inocula un matraz o biorreactor.
Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína terapéuticamente relevante” hará referencia a cualquier proteína que pueda usarse para crear un tratamiento para una enfermedad o trastorno o para tratar una enfermedad o trastorno en un animal, incluyendo mamíferos tales como ratones, ratas, monos, simios y seres humanos. Estas proteínas pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos de unión tales como anticuerpos monoclonales, proteínas de fusión Fc, anticoagulantes, factores sanguíneos, proteínas capaces de inducir hueso, andamiajes proteicos modificados mediante ingeniería, enzimas, factores de crecimiento, hormonas, interferones, interleucinas y trombolíticos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido de unión” o “polipéptido de unión” hará referencia a un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) que contiene al menos un sitio de unión que es responsable de la unión selectiva a un antígeno diana de interés (por ejemplo, un antígeno humano). Los sitios de unión a modo de ejemplo incluyen un dominio variable de anticuerpo, un sitio de unión a ligando de un receptor, o un sitio de unión a receptor de un ligando. En ciertos aspectos, los polipéptidos de unión comprenden múltiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro o más) sitios de unión.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a aquellos conjuntos (por ejemplo, moléculas de anticuerpo intactas, fragmentos de anticuerpo o variantes de los mismos) que tienen una actividad inmunorreactiva específica conocida significativa frente a un antígeno de interés (por ejemplo, un antígeno asociado a tumor). Los anticuerpos y las inmunoglobulinas comprenden cadenas ligeras y pesadas, con o sin un enlace covalente intercatenario entre las mismas. Las estructuras de inmunoglobulina básicas en sistemas vertebrados se entienden relativamente bien.
El término genérico “anticuerpo” comprende cinco clases distintas de anticuerpo que pueden distinguirse bioquímicamente. Las cinco clases de anticuerpos están claramente dentro del alcance de la presente divulgación, la siguiente discusión se referirá generalmente a la clase IgG de moléculas de inmunoglobulina. Con respecto a IgG, las inmunoglobulinas comprenden dos cadenas ligeras idénticas de peso molecular de aproximadamente 23.000 Daltons, y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular de 53.000-70.000. Las cuatro cadenas están unidas mediante enlaces disulfuro en una configuración “Y” en la que las cadenas ligeras soportan las cadenas pesadas empezando en la boca de la “Y” y continuando a través de la región variable.
Tal como se usa en el presente documento, el término “oxígeno disuelto” u “OD” es el porcentaje de gas de oxígeno disuelto presente en un líquido dado (tal como medio de cultivo celular) basado en la saturación de aire.
Tal como se usa en el presente documento, el término “tasa de perfusión específica de célula” (CSPR) hará referencia a la tasa en la que el medio de cultivo celular se alimenta al cultivo celular expresada como volumen de medio añadido por célula viable por día (Ozturk, SS. Engineering challenges in high density culture systems. Cytotechnology. 1996; 22:3-16).
Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” hará referencia a un intervalo de tolerancia del 10% alrededor de un valor establecido. Por tanto, cuando el término “aproximadamente” se usa para modificar un valor establecido, el intervalo indicado abarcará cualquier número dentro del ± 0,01%, 0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0. 5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10% del valor establecido.
II. Cultivo celular por perfusión
El cultivo celular tradicional implica un proceso de cultivo “por lotes”. En este tipo de cultivo, una cantidad de medio nuevo se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico. A medida que estas células crecen y se dividen, consumen nutrientes disponibles del medio y excretan productos residuales nocivos. Con el tiempo, el cultivo entrará en una fase de crecimiento estacionaria y finalmente en una fase de decrecimiento. Aunque modificaciones al proceso de cultivo “por lotes” lo han hecho más eficiente con el tiempo, los protocolos de cultivo por lotes modificados resultados todavía dan como resultado ciclos de crecimiento y decrecimiento rápidos. Además, el proceso de cultivo “por lotes” tiene una capacidad limitada para alcanzar los niveles de densidad celular que se requieren para permitir establecimiento de bancos de células de alta densidad.
El proceso de cultivo “por lotes con alimentación” se refiere a una mejora adicional en la técnica de cultivo celular con respecto a las técnicas de cultivo “por lotes” tradicionales. Aunque este proceso permite un crecimiento de densidad celular mayor, todavía está limitado en su capacidad para permitir un crecimiento eficiente de cultivos celulares de alta densidad y, por tanto, para generar de manera eficiente células para el establecimiento de bancos de células de alta densidad.
El método de la invención emplea un proceso de cultivo por perfusión. El cultivo por perfusión es un método para hacer crecer células en el que una cantidad de medio nuevo se inocula con células que entran rápidamente en una fase de crecimiento logarítmico (tal como anteriormente) y en el que el medio de crecimiento se retira de manera continua de un cultivo y se sustituye por medio nuevo. De esta manera, el cultivo recibe constantemente medio nuevo con altos niveles de nutrientes, mientras que el medio que contiene productos residuales y con niveles menores de nutrientes se retira. Este tipo de cultivo permite el mantenimiento del crecimiento logarítmico de células en las que al menos la mitad del volumen de cultivo se cambia por día y las densidades celulares pueden ser mucho mayores que las conseguidas en el cultivo por lotes tradicional o modificado (un aumento de entre 2 y más de 10 veces). En una realización de la presente invención, la tasa de perfusión específica de célula (CSPR) puede ser de entre aproximadamente 0,02 nl célula-1día-1 y aproximadamente 0,5 nl célula-1día-1, por ejemplo, puede ser de aproximadamente 0,02 nl célula-1día-1, 0,025 nl célula-1 día-1, 0,05 nl célula-1día-1, 0,1 nl célula-1día-1, 0,2 nl célula-1día-1, 0,3 nl célula-1día-1, 0,4 nl célula-1día-1 o 0,5 nl célula-1día-1. En otra realización de la presente invención, la tasa de perfusión puede medirse en volúmenes de reactor por día y puede ser de entre 0 y 15 volúmenes de reactor por día, por ejemplo, puede ser de aproximadamente 0 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 0,5 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 1 volumen de reactor por día, aproximadamente 2 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 3 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 4 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 5 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 6 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 7 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 8 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 9 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 10 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 11 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 12 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 13 volúmenes de reactor por día, aproximadamente 14 volúmenes de reactor por día o aproximadamente 15 volúmenes de reactor por día. En una realización específica, el cultivo por perfusión puede llevarse a cabo en un biorreactor con un mínimo de un tubo de inmersión.
El pH, la temperatura, la concentración de oxígeno disuelto (OD) y la osmolaridad del cultivo pueden ajustarse para maximizar la salud y la productividad del cultivo. Un método de control del OD y pH de los cultivos es a través de un controlador de realimentación automatizado. Este tipo de controlador automatizado opera usando ordenadores basados en microprocesador para monitorizar y ajustar el pH y el OD del cultivo y mantener de ese modo condiciones
óptimas para el crecimiento celular. Sin embargo, estos sistemas de control de realimentación automatizados son costosos. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, puede emplearse un método no automatizado de control de estos parámetros. En una realización a modo de ejemplo, cualquiera de: ajuste de la mezcla de gas que fluye sobre el cultivo, ajuste de la tasa de basculación WAVE® o el ajuste del ángulo de basculación del cultivo puede usarse para controlar parámetros seleccionados (por ejemplo, pH u OD). En determinadas realizaciones, pueden aplicarse tanto control de realimentación automatizado como control no automático.
En una realización, el nivel de partida de gas de dióxido de carbono está a aproximadamente el 10% y el nivel de partida de oxígeno gas está a aproximadamente el 20% con una tasa de flujo de aire de aproximadamente 0,2 litros por minuto (lpm). Si el pH no es más de aproximadamente 6,9, el punto de referencia de CO2 puede reducirse desde el 10% hasta el 5%. Si el pH todavía no es más de aproximadamente 6,9 en un punto de tiempo posterior, el punto de referencia de CO2 puede reducirse adicionalmente desde el 5% hasta el 0%. Si el pH todavía no es más de aproximadamente 6,9, puede aumentarse la tasa de perfusión. Si el OD no es más de aproximadamente el 45%, el punto de referencia de O2 debe elevarse desde el 20% hasta el 30%. Si el OD no es más de aproximadamente el 45% en un punto de tiempo posterior, el nivel de O2 debe elevarse desde el 30% hasta el 40%, la velocidad de basculación debe aumentarse hasta aproximadamente 25 rpm y el ángulo de basculación debe cambiarse a aproximadamente 12°.
i. Medios de cultivo celular
Puede usarse cualquier tipo de medio de cultivo celular adecuado para el cultivo de células en los métodos de la presente invención. Las directrices para elegir un medio celular apropiado se conocen ampliamente en la técnica y se proporcionan en, por ejemplo, los capítulos 8 y 9 de Freshney, R. I. Culture of Animal Cells (a manual of basic techniques), 4a edición 2000, Wiley-Liss; y en Doyle, A., Griffiths, J.B., Newell, D.G. Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures 1993, John Wiley & Sons. Cada una de estas referencias se incorpora por la presente en su totalidad. Hay métodos adicionales en la técnica para la preparación y el mantenimiento de cultivos celulares en condiciones libres de proteínas y libres de componentes derivados de animales (incluyendo métodos relativos a células CHO) tal como los observados en la solicitud de patente internacional n ° WO97/05240, n ° WO 96/26266 y n.° WO 00/11102, y la patente estadounidense mo 6.100.061, mo 6.475.725 y 8.084.252.
En una realización de la presente invención, puede usarse medio libre de componentes derivados de animales (ADC, animal-derived component). Los medios mínimos sintéticos convencionales pueden contener sales inorgánicas, aminoácidos, vitaminas, una fuente de carbohidratos y agua. En una realización específica de la presente invención, el medio que puede usarse es CD-CHO (GIBCO, Invitrogen Corp.; un medio libre de origen animal que está definido químicamente y no contiene proteínas, hidrolizados o componentes de origen desconocido). Adicionalmente, el medio puede tener componentes adicionales incluyendo glutamina y/o metotrexato u otros factores que pueden ayudar al crecimiento o la adherencia. En una realización específica, el componente adicional puede ser GLUTAMAX-1 o L-glutamina añadida a entre aproximadamente 2 mM y aproximadamente 8 mM, por ejemplo, a aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 6 mM, aproximadamente 7 mM o aproximadamente 8 mM.
ii. Células huésped y vectores de expresión
En determinadas realizaciones, las células empleadas en el proceso de establecimiento de bancos de células de la invención son células huésped que albergan una construcción de expresión para la expresión de una proteína terapéuticamente relevante u otro polipéptido de interés. Cualquier célula que pueda usarse para expresar un polipéptido de interés (por ejemplo, un polipéptido de unión) puede usarse según los métodos descritos en el presente documento. Las células pueden contener opcionalmente secuencias de ácido nucleico que se producen de manera natural o recombinantes, por ejemplo, un vector de expresión que codifica para un polipéptido de interés. El vector de expresión puede contener opcionalmente controles de transcripción y de traducción apropiados y puede construirse usando tecnología de ADN recombinante conocida en la técnica. Los vectores de expresión pueden transferirse a cualquier célula huésped mediante técnicas conocidas en la técnica, y las células transformadas pueden cultivarse entonces según el método de la presente invención para crear un banco de células de alta densidad. Además, el banco de células de alta densidad puede entonces descongelarse y cultivarse según técnicas conocidas en la técnica con el fin de producir la proteína codificada de interés y, cuando se desee, esta proteína puede purificarse posteriormente.
En determinadas realizaciones, pueden usarse una variedad de sistemas de expresión huésped para producir proteínas terapéuticamente relevantes. Además, el sistema de expresión huésped puede ser un sistema celular de mamífero (por ejemplo, CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 y células de hibridoma) que alberga constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero. También pueden utilizarse sistemas de expresión de base viral conjuntamente con células de mamífero (véase, por ejemplo, Logan et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:355-359).
La eficiencia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de elementos que incluyen (pero no se limitan a) elementos potenciadores de la transcripción y terminadores de transcripción apropiados (véase, por ejemplo, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).
En otras realizaciones, puede elegirse una cepa de células huésped que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto génico en el modo específico deseado. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación postraduccionales de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de unión) expresado. Tales células incluyen, por ejemplo, líneas celulares de mamífero y células de animales establecidas, así como líneas celulares de insecto, células fúngicas y células de levadura.
iii. Biorreactores
Puede emplearse cualquier biorreactor adecuado para cultivar células en condiciones de cultivo por perfusión en los métodos de la invención. El biorreactor puede inocularse usando una alícuota de células a una densidad de siembra apropiada (tal como un vial de células o células de un cultivo iniciador, por ejemplo, un matraz de agitación o un tren de siembra de matraz de agitación que se han cultivo hasta esa densidad). La densidad de siembra apropiada para un cultivo depende de varios factores incluyendo el tipo de células usado y el biorreactor que está inoculándose. La densidad de siembra apropiada puede determinarse usando métodos disponibles en la técnica.
En determinadas realizaciones, el biorreactor puede ser de naturaleza desechable, por ejemplo, el biorreactor puede ser una bolsa flexible o un matraz de plástico que está conectado al dispositivo de retención celular por medio de tubos flexibles. El diseño puede incluir, pero no se requiere que incluya, un conducto de entrada y un conducto de salida o de inoculación, que pueden estar conectados o soldados de manera estéril a la fuente de las células eucariotas. En determinadas realizaciones, el biorreactor tiene un volumen de al menos aproximadamente 1 l, por ejemplo, aproximadamente 1 l, 2 l, 5 l, 10 l, 20 l, 50 l, 75 l, 85 l, 100 l, 150 l o 400 l. En una realización específica de la invención, el biorreactor es una bolsa flexible de 10 l que se ha personalizado con uno o dos tubos de inmersión que se usan para retirar medio o producto. Biorreactores desechables a modo de ejemplo son biorreactores de bolsa celular WAVE® (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) tal como el biorreactor WAVE® de 20 l. Estos son los sistemas de biorreactor de perfusión descritos en, entre otros documentos: Singh ,1999, Disposable bioreactor for cell culture using waveinduced agitation, Cytotechnology, págs.149-158, incorporado por la presente mediante referencia en su totalidad.
El volumen de trabajo del reactor es el volumen ocupado por el cultivo. El volumen de trabajo puede ser, por ejemplo, de aproximadamente el 10%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70% o más del cultivo, pero preferiblemente no más de aproximadamente el 75%.
Alternativamente, el biorreactor puede ser de naturaleza no desechable. Por ejemplo, el biorreactor puede estar hecho de acero inoxidable o vidrio. Los biorreactores alternativos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a: matraces de agitación, receptáculos de tanque con agitación, receptáculos con agitación por aire y bolsas desechables que pueden mezclarse mediante basculación, sacudida o agitación.
En una realización, el biorreactor puede estar acoplado a un sistema de retención celular, incluyendo, pero sin limitarse a, filtros incorporados, cestas de centrifugación, sistemas de filtración de flujo tangencial (TFF, tangential flow filtration) y sistemas de filtración de flujo tangencial alternante (ATF, tangential flow filtration).
III. Retención celular
El cultivo por perfusión depende de la capacidad de eliminación de medios agotados en nutrientes y que contienen productos residuales del cultivo al tiempo que minimiza el daño a las células. Los métodos iniciales de retención celular, en los que el medio agotado se separaba de las células cultivadas, dañaban frecuentemente las células a través de, por ejemplo, la creación de fuerzas de cizalladura. Este daño celular daba como resultado la obstrucción de los filtros y el fallo de los dispositivos de perfusión, muchos de los cuales eran internos al sistema de cultivo. Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgación proporciona un método que hace uso de un “sistema de retención celular” que permite el intercambio de medios.
En un caso, el tipo de sistema de retención celular usado es un filtro de tipo “incorporado”, estando dispuesto el filtro en la cámara del biorreactor y siendo libre para moverse dentro de la cámara. El filtro puede estar acoplado a uno de los tubos que conducen fuera de la cámara, permitiendo de ese modo la extracción de medio filtrado del cultivo. Un ejemplo de un filtro de tipo “incorporado” puede encontrarse en la patente estadounidense n .o 6.544.788.
En otro caso, el sistema de retención celular usado es un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF). En un sistema TFF, el medio de cultivo se hace circular desde un receptáculo de cultivo a través de un módulo de filtración, y entonces de vuelta al receptáculo de cultivo por medio de una bomba unida a los tubos entre el módulo de filtración y el receptáculo de cultivo, produciendo un flujo tangencial por el módulo de filtro. Una segunda bomba está situada en el lado de filtrado del módulo de filtro y se usa para controlar la tasa a la que se retira el filtrado. El uso de filtros de
membrana de fibras huecas se prefiere en este sistema ya que son más fáciles de esterilizar y permiten el mantenimiento de un flujo uniforme por el módulo de filtro. Sin embargo, cuando se emplean filtros de fibras huecas en este sistema, tienden a obstruirse ya que el flujo unidireccional conduce a la agregación de materia particulada en la entrada de la luz.
En el método de la invención, el tipo de sistema de retención celular usado es un sistema de flujo tangencial alternante (ATF). En el tipo ATF de sistema de retención celular, un compartimento de filtración está conectado a un receptáculo de almacenamiento en un extremo y una bomba de diafragma en el otro. La bomba mueve en primer lugar medio desde el receptáculo a través del elemento de filtro hasta la bomba y entonces se invierte para enviar el medio desde la bomba a través del filtro y de vuelta al receptáculo, creando un flujo bidireccional o alternante. Esto se denomina flujo tangencial alternante (ATF) ya que hay flujo tangencial alternante en el módulo de filtro, es decir, hay un flujo en la misma dirección a las superficies de membrana del módulo de filtro (tangencial a esa superficie), y que hay otro flujo que es sustancialmente perpendicular a esas superficies. Este tipo de filtración ha existido en la bibliografía desde 2000 y da como resultado un flujo rápido, de baja cizalladura, uniforme. La filtración ATF puede obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describen en la patente estadounidense número 6.544.424. Además, sistemas de flujo tangencial alternante están disponibles comercialmente de fabricantes tales como Refine Technology e incluyen diversos modelos tales como los sistemas ATF2, ATF4, ATF6, ATF8 y ATF10.
En otro caso específico de la divulgación, el filtro es un filtro de membrana tubular, y además puede ser un filtro de fibras huecas.
Tal como se indicó anteriormente, los métodos de la invención permiten un crecimiento eficiente de células hasta densidades ultraaltas. En una realización particular de la invención, el cultivo se hace crecer hasta una densidad de al menos aproximadamente 1 x 10A8 células/ml, por ejemplo, hasta aproximadamente 1 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,1 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,2 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,3 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,4 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,5 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,6 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,7 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,8 x 10A8 células/ml, aproximadamente 1,9 x 10A8 células/ml o aproximadamente 2 x 10A8 células/ml. El crecimiento del cultivo hasta estas altas concentraciones permite la criopreservación inmediata de reservas de alta densidad sin concentración adicional de la población celular a través de métodos centrífugos o no centrífugos.
IV Criopreservación y establecimiento de bancos de células
La criopreservación se refiere a un proceso mediante el que células, tejidos o cualquier otra sustancia susceptible a daño provocado por el tiempo o por actividad enzimática o química se preservan enfriándolos y almacenándolos a temperaturas bajo cero. La importancia de la criopreservación de líneas celulares importantes no puede subestimarse, ya que (entre otras ventajas importantes) esto permite el mantenimiento de estas líneas sin mantenerlas en cultivo constante, disminuye el riesgo de contaminación y reduce el riesgo de deriva genética.
Cuando se usan métodos de criopreservación, es vital alcanzar y permanecer a estas bajas temperaturas sin provocar un daño adicional a través de la formación de hielo durante el proceso de congelación. Los métodos en la técnica usan tradicionalmente sustancias que disminuyen el daño por congelación a células denominadas crioprotectores. Los crioprotectores pueden añadirse al medio de cultivos celulares antes del proceso de congelación. En una realización específica, el crioprotector usado puede ser uno o más de: glicerol o dimetilsulfóxido (DMSO). Adicionalmente, el crioprotector puede añadirse con o sin hidroxietilalmidón (HES). En una realización específica adicional, puede añadirse DMSO a una concentración de al menos aproximadamente el 5%, por ejemplo, puede añadirse a aproximadamente el 5%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%, a aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19% o a aproximadamente el 20%.
El cultivo con crioprotector añadido puede dispensarse entonces a recipientes apropiados para su almacenamiento en condiciones de criopreservación. En una realización, este recipiente puede ser un vial hecho de un material que puede incluir (pero no se limita a) polímeros tales como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno o polipropileno. En una realización específica, el vial puede tener un tratamiento superficial adicional con el fin de mejorar las condiciones de criopreservación (por ejemplo, recubrimientos hidrófilos que reducen la adsorción y desnaturalización). En realizaciones a modo de ejemplo, el vial puede tener un volumen de más de aproximadamente 0,1 ml, por ejemplo, el vial puede tener un volumen de aproximadamente 0,1 ml, aproximadamente 0,5 ml, aproximadamente 0,75 ml, aproximadamente 1 ml, aproximadamente 1,5 ml, aproximadamente 2 ml, aproximadamente 2,5 ml, aproximadamente 4,5 ml, aproximadamente 10 ml, aproximadamente 15 ml, aproximadamente 20 ml, aproximadamente 25 ml o aproximadamente 50 ml. En otra realización, el recipiente también puede ser una bolsa de criopreservación que tiene un volumen de más de aproximadamente 30 ml, por ejemplo, la bolsa de criopreservación puede tener un volumen de aproximadamente 30 ml, aproximadamente 50 ml, aproximadamente 100 ml, aproximadamente 150 ml, aproximadamente 200 ml, aproximadamente 300 ml, aproximadamente 400 ml o aproximadamente 500 ml. La bolsa de criopreservación puede estar construida de cualquier material apropiado incluyendo, pero sin limitarse a, polímeros tales como politetrafluoroetileno, poliestireno, polietileno, polipropileno, etileno-propileno fluorado (FEP), poliolefina y
acetato de etilenvinilo (EVA). Los biorreactores desechables a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: bolas de criopreservación KryoSure®, bolsas PermaLife™ (OriGen Biomedical), bolsas de congelación CryoStore (OriGen Biomedical), biorrecipientes Freeze-Pak™ (Charter Medical) y las bolsas dadas a conocer en la solicitud provisional estadounidense n.° 62/037.181 (Merial Ltd., una empresa de Sanofi).
Estos recipientes se congelan entonces usando técnicas y dispositivos ampliamente conocidos en la técnica antes de almacenarse a bajas temperaturas, normalmente entre aproximadamente -130°C y aproximadamente -196°C. En una realización, la técnica de congelación usada puede ser de tasa controlada y congelación lenta (también denominada congelación programable lenta, o SPF). La colección de células obtenida mediante el proceso es un banco de células.
En un caso, el banco de células puede ser, pero no se limita a, un banco de células de densidad ultraalta, un banco de células maestras, un banco de células de trabajo o un mini banco.
V. Determinación de la viabilidad celular
Tal como se indicó anteriormente, los métodos de la invención permiten el establecimiento de bancos de células a altas densidades al tiempo que conservan una viabilidad celular excelente para su uso posterior. Tal como se usa en el presente documento, el término “viabilidad celular” puede definirse como el número o porcentaje de células sanas en una muestra dada. La viabilidad de las células puede determinarse usando cualquier método disponible en la técnica en cualquier punto en el proceso de establecimiento de bancos de células de densidad ultraalta descrito. Los métodos usados comúnmente para la determinación de la viabilidad celular se basan en gran medida en el principio de que las células vivas presentan membranas celulares intactas que excluyen ciertos colorantes, tales como azul de tripano (un colorante diazoico), eosina o propidio, mientras que las células muertas no.
En una realización, puede usarse azul de tripano para teñir una cantidad de células e indicar de ese modo la presencia de células con membranas intactas (no coloreadas) y la presencia de células con membranas alteradas (azules). Estas células pueden contarse entonces para determinar los números de células tanto vivas como muertas en el cultivo, y presentarse como porcentaje para indicar la salud relativa del cultivo.
En una realización específica, la viabilidad celular puede determinarse usando un cultivo que se ha hecho crecer hasta una densidad ultraalta, pero que aún no se ha congelado (es decir un cultivo precongelación o predescongelación). En una realización específica, la viabilidad celular puede determinarse usando un cultivo que se ha congelado y entonces descongelado (es decir, un cultivo postcongelación o postdescongelación).
En una realización específica, la viabilidad celular es de al menos aproximadamente el 60%, por ejemplo, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90% o aproximadamente el 95%. En ciertos casos, la viabilidad postdescongelación de las células es de al menos aproximadamente el 80%, por ejemplo, es de al menos aproximadamente el 85%, el 90% o el 95% incluyendo hasta el 100%.
VI. Proteínas terapéuticamente relevantes
Pueden emplearse células derivadas del método de establecimiento criogénico de bancos de células de densidad ultraalta de la invención en una fase de producción posterior para la fabricación de una proteína. Por ejemplo, las células propagadas en el biorreactor y congeladas en alícuotas de banco de alta densidad según los métodos de la presente invención pueden usarse para la producción de sustancias biológicas incluyendo proteínas terapéuticamente relevantes. Estas sustancias biológicas pueden incluir, pero no se limitan a: virus (véase, por ejemplo, el documento WO200138362), polipéptidos de unión tales como anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, y fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab; proteínas de fusión Fc, anticoagulantes, factores sanguíneos, proteínas capaces de inducir hueso, andamiajes proteicos modificados mediante ingeniería, enzimas, factores de crecimiento, hormonas, interferones, interleucinas y trombolíticos. Estas sustancias biológicas pueden recogerse usando cualquier método disponible en la técnica. En un caso, la divulgación proporciona un método de producción de una sustancia biológica, comprendiendo el método: cultivar células capaces de expresar una sustancia biológica en condiciones adecuadas para la producción de una sustancia biológica, habiéndose obtenido las células de un banco de células congeladas de densidad ultraalta producidas usando cultivo por perfusión. La sustancia biológica puede ser (pero no se limita a) una proteína (por ejemplo, cualquier proteína terapéuticamente relevante).
EJEMPLOS
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como que limitan adicionalmente.
Ejemplo 1: Métodos generales
Las siguientes condiciones eran comunes para los experimentos expuestos en los ejemplos 3-6 a continuación.
El punto de referencia de pH era de 7,0 ± 0,1. El pH del cultivo se mantuvo al punto de referencia a través de control de realimentación automático mediante un controlador WAVE POD. El controlador automático cambió la concentración de CO2 en el gas al espacio de cabeza y reguló adicionalmente la adición de base (CO2/esquema de control de base). Cuando el controlador detectó un pH por debajo del punto de referencia de pH seleccionado, se hizo en primer lugar un intento para alcanzar el valor de pH fijado disminuyendo el nivel de CO2. Si el nivel de pH solicitado no se alcanzaba dentro del tiempo especificado, se añadía base. A un pH por encima del punto de referencia de pH seleccionado, se aumentaba la concentración de CO2.
El punto de referencia de OD (oxígeno disuelto) era de > 40%. El OD del cultivo se mantuvo al punto de referencia a través de control de realimentación automático mediante un controlador WAVE POD. La concentración de oxígeno se alteró automáticamente desde el 21% hasta el 50% (esquema de control de concentración de O2). Se suministró manualmente gas de oxígeno puro adicional al espacio de cabeza en combinación con ajustes manuales a la condición de basculación con el fin de mantener el OD > 40%. Específicamente, cuando el OD en línea era de aproximadamente el 40%, y se aumentó la concentración de O2 del controlador POD desde el 21% hasta >30%, la velocidad y el ángulo de basculación ondulada se aumentaron desde 22 rpm/10° hasta 25 rpm/12°. Si el O2 del POD pasaba a ser >30% de nuevo, la velocidad y el ángulo de basculación ondulada se aumentaron desde 25 rpm/12° hasta 30 rpm/12° o se suministró O2 puro al espacio de cabeza (prefiriéndose esto último). Finalmente, el porcentaje en volumen de O2 puro en el gas se aumentó gradualmente para aumentar el O2 total con respecto al espacio de cabeza. La estrategia de adición manual dio como resultado un aumento de aproximadamente el 10% por día ajustando la relación de control de volumen entre el gas de oxígeno de POD (21%-50%, suministrado por el controlador POD) y el gas de oxígeno puro adicional (100%, controlado mediante un rotámetro). La tasa de flujo de gas total se aumentó ligeramente con el fin de facilitar la transferencia de gas.
La CSPR (tasa de perfusión específica de célula) de los cultivos se mantuvo casi constante aumentando la tasa de perfusión diariamente basándose en la densidad celular medida.
Ejemplo 2: Diseño e implementación de un protocolo de establecimiento de bancos de células de densidad ultraalta
Este protocolo de establecimiento criogénico de bancos de células de densidad ultraalta empieza con un vial de células de banco de células maestras de 2 ml (volumen de trabajo 1,5 ml) a una densidad apropiada de 2,0-2,4 x 10A7 células viables/ml (condición de criopreservación de células normal). Posteriormente, las células se hacen crecer en cultivo por perfusión. Tras la adición de DMSO al cultivo celular, este cultivo celular de densidad ultraalta se dispensa a viales de 5 ml independientes (aproximadamente 4,5 ml de volumen de trabajo) o bolsas de criopreservación (aproximadamente 100 ml de volumen de trabajo) apropiadas para la criopreservación y el almacenamiento como banco de células de densidad ultraalta (al menos aproximadamente 10 x 10A7 células/ml). Una representación esquemática de este protocolo se muestra en la Figura 1.
Ejemplo 3: Rendimiento de banco de células y de cultivo celular de densidad ultraalta usando rCHO 1.
Los parámetros para el siguiente experimento fueron tal como sigue:
1) Se disminuyó el CO2 hasta el 0% cuando Xv > aproximadamente 3x105678células viables/ml (vc/ml) (el día 9), entonces se añadió base después cuando fue necesario;
2) Velocidad y ángulo de basculación WAVE: inicialmente 22 rpm/10° (desde el día 0 hasta el día 8); se aumentaron hasta 25 rpm/12° cuando el O2 de POD aumentó desde el 21% hasta >30% (el día 8), y entonces hasta 30 rpm/12° (el día 9) para facilitar la transferencia de gas (suministrando O2 y retirando CO2);
3) O2 puro adicional (100%): suministrado manualmente al espacio de cabeza cuando el O2 de POD > 30% y Xv > aproximadamente 6x107 vc/ml (el día 11);
4) Tasa de flujo de gas total: 0,2 lpm (litros por minuto) desde el día 0 hasta el día 10, se aumentó hasta 0,4 lpm el día 10 cuando Xv > 4x107 vc/ml, y entonces hasta aproximadamente 0,5 lpm el día 11 (O2 de POD:O2 puro = 3:1, O2 total: aproximadamente el 62%); y
5) Tasa de perfusión específica de célula: objetivo a > aproximadamente 0,2 nl/célula-día inicialmente; la tasa de perfusión se aumentó paso a paso hasta 12 RV/día (nota: RV se define como el volumen del reactor). La CSPR el día final era de entre 0,1 nl/célula-día y 0,2 nl/célula-día.
6) Tren de siembra y medio de biorreactor: CD CHO con L-glutamina 4 mM
7) Biorreactor: biorreactor de perfusión Cellbag de 10 l GE custom con dos tubos de inmersión; volumen de trabajo: 5 l;
8) Inóculo de biorreactor: tren de siembra de matraz de agitación; densidad de siembra: aproximadamente 5x105 vc/ml
9) Métodos de retención celular: ATF4 (0,2 pm de tamaño de poro)
10) Temperatura de cultivo celular: 37°C
11) Congelación: congelador de tasa controlada CryoMed™
Se sometieron a prueba el rendimiento de banco de células y de cultivo celular de densidad ultraalta (UHD) (tras la congelación y descongelación) para la línea celular 1 de rCHO. El cultivo por perfusión alcanzó una Xv de aproximadamente 1,11 x 108 vc/ml el día 12 con alta viabilidad (>97% a lo largo de todo el proceso). La densidad de celular viable (células/ml), la tasa de perfusión en volúmenes de reactor/día y la CSPR 10X (tasa de perfusión específica de célula 10X en nl/célula-día) del cultivo por perfusión de densidad ultraalta se muestran en la Figura 2. La Figura 3 muestra el perfil de pH fuera de línea del cultivo. El cultivo se recogió directamente sin concentración para generar dos bancos UHD en viales de 5 ml a dos temperaturas de conservación de DMSO: temperatura fría bien controlada usando un centrifugador revestido a 4°C y temperatura fría no controlada usando un centrifugador enfría mediante un baño de agua helada. La Figura 4A-C muestra el rendimiento tras la congelación de viales UHD de 5 ml creados a partir de las condiciones de cultivo celular mencionadas anteriormente. Ambos bancos UHD tenían un crecimiento celular tras la congelación rápido, una viabilidad muy alta y una tasa de apoptosis baja. Sin embargo, el control de temperatura más activo en el centrifugador revestido dio como resultado una recuperación y un crecimiento tras el banco ligeramente mejorados en comparación con el control de temperatura más pasivo en el baño de agua helada.
Ejemplo 4: Rendimiento de banco de células y de cultivo celular de densidad ultraalta usando rCHO 2.
Los parámetros para el siguiente experimento fueron tal como sigue:
1) Se disminuyó el CO2 hasta el 0% cuando Xv> aproximadamente 5x107 vc/ml (el día 9), entonces se añadió base después cuando fue necesario.
2) Velocidad y ángulo de basculación WAVE: inicialmente 22 rpm/10° (desde el día 0 hasta el día 7); se aumentaron hasta 25 rpm/12° cuando aumento el O2 de POD desde el 21% hasta > 30% (el día 7) para facilitar la transferencia de gas (para suministrar O2 y retirar CO2).
3) O2 puro adicional (100%) se suministró manualmente al espacio de cabeza cuando el O2 de POD > 30% y Xv > aproximadamente 3x107 vc/ml (el día 8).
4) La tasa de flujo de gas total era de 0,2 lpm inicialmente (desde el día 0 hasta el día 8) y se aumentó hasta 0,4 lpm el día 8 cuando Xv > aproximadamente 3x107 vc/ml (O2 de P O D O puro = 3:1, O2 total: aproximadamente el 62%), y entonces hasta aproximadamente 0,5 lpm el día 9 (O2 de P O D O puro = 1:1, O2 total: aproximadamente el 75%).
5) Tasa de perfusión específica de célula: objetivo a > aproximadamente 0,2 nl/célula-día al principio, pero la tasa de perfusión se aumentó paso a paso hasta 12 Rv/día. El último día, 0,1 nl/célula-día < CSPR < 0,2 nl/célula-día.
6) Tren de siembra y medio de biorreactor: CD CHO con L-glutamina 4 mM
7) Biorreactor: biorreactor de perfusión Cellbag de 10 l GE custom con un tubo de inmersión; volumen de trabajo: 5 l;
8) Inóculo de biorreactor: tren de siembra de matraz de agitación; densidad de siembra: aproximadamente 5x105 vc/ml
9) Métodos de retención celular: ATF4 (0,2 pm de tamaño de poro)
10) Temperatura de cultivo celular: 37°C
11) Congelación: congelador de tasa controlada CryoMed™
Se sometieron a prueba el rendimiento de banco de células y de cultivo celular ultra-HD (tras la congelación y descongelación) para la línea celular 2 de rCHO. La densidad de celular viable (células/ml), la tasa de perfusión en volúmenes de reactor/día y la CSPR 10X (tasa de perfusión específica de célula 10X en nl/célula-día) para el cultivo por perfusión de densidad ultraalta se muestran en la Figura 5. La Figura 6 muestra el perfil de pH fuera de línea del cultivo. El cultivo se recogió para preparar viales de 5 ml UHD (densidad ultraalta) y bolsas de criopreservación UHD de 100 ml para la criopreservación en dos condiciones de conservación de DMSO diferentes: 1) temperatura ambiente (TA, aproximadamente 22-25°C); y 2) una temperatura fría controlada (TF, aproximadamente 5°C usando un centrifugador revestido a 4°C).
Las Figuras 7 y 8 son gráficos que demuestran los perfiles de crecimiento celular (Xv; líneas continuas) y de viabilidad (líneas discontinuas) en matraces de agitación de 250 ml y 3 l para viales y bolsas UHD creados a partir de las condiciones de cultivo celular mencionadas anteriormente a temperatura ambiente y en condiciones de conservación
en frío bien controladas (TA y TF, respectivamente). Estos viales y bolsas UHD se recuperaron bien con un crecimiento celular tras la congelación rápido, una alta viabilidad, una baja apoptosis y una productividad comparable cuando se siembra a 0,5 x 10A6 vc/ml y 1,0 x 10A6 vc/ml en matraces de agitación de 250 ml y 3 l. No se observó ninguna diferencia entre bolsas de criopreservación y viales de criopreservación UHD en cada condición de conservación en términos de crecimiento, viabilidad, apoptosis y productividad tras la descongelación. Sin embargo, los viales y las bolsas preparados a la baja temperatura bien controlada mediante un centrifugado revestido a 4°C tenían un crecimiento más rápido, una mayor viabilidad y una menor apoptosis en comparación con los preparados a temperatura ambiente. La Figura 9 y la Figura 10 muestran perfiles de apoptosis tras la descongelación de bancos UHD cuando se siembra a 0,5 x 10a6 vc/ml y 1,0 x 10A6 vc/ml respectivamente, y las Figuras 11 y la Figura 12 representan la tasa de producción específica (SPR, TA- temperatura ambiente; TF- temperatura fría bien controlada)
Ejemplo 5: Rendimiento de banco de células de densidad ultraalta en el biorreactor WAVE de 20 l usando rCHO 2.
Los parámetros para el siguiente experimento fueron tal como sigue:
1) Banco de células: bolsa de criopreservación UHD de 100 ml preparada en el ejemplo 2
2) Medio de biorreactor: CD CHO con L-glutamina 4 mM.
3) Biorreactor tras la congelación: Cellbag de 20 l GE; volumen de trabajo: 10 l.
4) Inóculo de biorreactor: cultivo tras la descongelación de la bolsa de criopreservación descongelada; densidad de siembra: aproximadamente 5x1045 *vc/ml.
5) Temperatura del biorreactor: 37°C, O2 : 20%, CO2 : 5%, velocidad y ángulo de basculación: 22 rpm/82
Se descongeló una bolsa de criopreservación UHD de 100 ml. Se inocularon 50 ml del cultivo descongelado en un bioreactor WAVE de 20 l (A) directamente con un volumen de trabajo de 10 l total. Se diluyeron otros 50 ml lentamente con medio frío en primer lugar para reducir el daño celular potencial inducido por el gran gradiente osmótico, que se inocularon entonces a un segundo biorreactor WAVE de 20 l (B) con un volumen de trabajo de 10 l total. Ambos biorreactores se operaron en las mismas condiciones. Se transfirieron alícuotas de ambos biorreactores a matraces de agitación satélite (60 ml de volumen de trabajo) para la comparación del crecimiento. Los cultivos de biorreactor también se compararon con cultivos de matraz de agitación (matraces de agitación de 60 ml/250 ml y matraces de agitación de 1,5 l/3 l) con inóculo de otra bolsa de criopreservación de 100 ml descongelada.
Los dos cultivos WAVE tuvieron un rendimiento muy comparable en términos de crecimiento, viabilidad y apoptosis celular tras la descongelación. Y los cultivos en ambos biorreactores eran muy comparables no solo con aquellos en los matraces de agitación satélite, sino también aquellos descongelados y hechos crecer en matraces de agitación. Estos datos sugieren que una bolsa de criopreservación UHD podía descongelarse directamente en 2x biorreactores WAVE de 20 l sin la dilución lenta en medio frío con un rendimiento comparable con matraces de agitación, lo que hará que el proceso de tren de siembra sea completamente cerrado desde la descongelación de la bolsa hasta la expansión en el biorreactor WAVE.
La Figura 13 es un gráfico que demuestra el perfil de crecimiento celular (Xv; líneas continuas) y de viabilidad (líneas discontinuas) en bolsas WAVE de 20 l para bolsa de criopreservación UHD de línea celular 2 de rCHO creada siguiendo las condiciones de cultivo celular mencionadas anteriormente a temperatura ambiente mostradas en el ejemplo 2.
Ejemplo 6: Rendimiento de banco de células y de cultivo celular de densidad ultraalta usando rCHO 3.
Los parámetros para el siguiente experimento fueron tal como sigue:
1) Se disminuyó el CO2 hasta el 0% cuando Xv > aproximadamente 2x107 vc/ml (el día 8), entonces se añadió base después cuando fue necesario;
2) Velocidad y ángulo de basculación WAVE: inicialmente 22 rpm/10° (desde el día 0 hasta el día 7); se aumentaron hasta 25 rpm/12° cuando el O2 de POD aumentó desde el 21% hasta >30% (el día 7) para facilitar la transferencia de gas (para suministrar O2 y retirar CO2);
3) O2 puro adicional (100%) se suministró manualmente al espacio de cabeza cuando el O2 de POD > 30% y Xv > aproximadamente 3x107 vc/ml (el día 9).
4) Tasa de flujo de gas total: 0,2 lpm inicialmente (desde el día 0 hasta el día 9) y se aumentó hasta 0,4 lpm el día 9 cuando Xv> aproximadamente 3x107 vc/ml (O2 de POD:O2 puro = 3:1, O2 total: aproximadamente el 62%), y entonces hasta aproximadamente 0,5 lpm el día 10 (O2 de POD:O2 puro = 1:1, O2 total: aproximadamente el 75%), hasta aproximadamente 0,6 lpm el día 12 (O2 de POD:O2 puro = 1:2, O2 total: aproximadamente el 83%).
5) Tasa de perfusión específica de célula: la perfusión se inició a 0,5 RV/día el día 2 y se aumentó paso a paso para mantener una CSPR baja de > 0,05 nl/célula-día
6) Tren de siembra y medio de biorreactor: CD CHO con L-glutamina 4 mM
7) Biorreactor: biorreactor de perfusión Cellbag de 10 l GE custom con un tubo de inmersión; volumen de trabajo: 5 l;
8) Inóculo de biorreactor: tren de siembra de matraz de agitación; densidad de siembra: aproximadamente 5x105 vc/ml
9) Métodos de retención celular: ATF4 (0,2 pm de tamaño de poro)
10) Temperatura de cultivo celular: 37°C
11) Congelación: congelador de tasa controlada CryoMed™
12) Evaluación tras el establecimiento de bancos: matraz de agitación (dos pases) y WAVE de 20 l (un pase), se evaluaron la Xv, viabilidad, apoptosis, productividad.
13) Medio de evaluación tras el establecimiento de bancos: CD CHO con L-glutamina 4 mM
Se sometieron a prueba el rendimiento de banco de células y de cultivo celular ultra-HD (tras la congelación y descongelación) para la línea celular 3 de rCHO. La densidad de celular viable (células/ml), la tasa de perfusión en volúmenes de reactor/día y la CSPR 10X (tasa de perfusión específica de célula 10X en nl/célula-día) para el cultivo por perfusión de densidad ultraalta se muestran en la Figura 15. La Figura 16 muestra el perfil de pH fuera de línea del cultivo. Se prepararon viales de 5 ml UHD (densidad ultraalta) y bolsas UHD de 100 ml usando el cultivo por perfusión de densidad ultraalta en dos condiciones de conservación de DMSO diferentes: 1) temperatura ambiente (TA, aproximadamente 22-25°C); y 2) una temperatura fría controlada (TF, aproximadamente 5°C usando un centrifugador revestido a 4°C).
Todos los cultivos tras la descongelación de viales UHD y bolsas UHD se recuperaron bien con un crecimiento rápido, un baja apoptosis y una productividad comparable. Las bolsas y viales UHD preparados en la condición de conservación en frío bien controlada eran comparables, con un crecimiento ligeramente más rápido y una mayor viabilidad (>95%) en el primer pase que en los preparados a temperatura ambiente. La bolsa UHD tenía un rendimiento tras la descongelación comparable en matraces de agitación y biorreactores WAVE. Entonces también sugiere que una bolsa de criopreservación UHD podía descongelarse directamente en 2x biorreactores WAVE de 20 l, lo que hará que el proceso de tren de siembra sea completamente cerrado desde la descongelación de la bolsa hasta la expansión en el biorreactor WAVE. La Figura 17A es un gráfico que demuestra los perfiles de crecimiento celular (Xv; líneas continuas) y de viabilidad (líneas discontinuas) en matraces de agitación de 250 ml y WAVE de 3 l y 20 l para viales y bolsas UHD creados a partir de las condiciones de cultivo celular mencionadas anteriormente a temperatura ambiente y en condiciones de conservación en frío bien controladas (TA y TF, respectivamente). La Figura 17 B y C muestran perfiles de apoptosis tras la descongelación y tasa de producción específica (SPR).
Ejemplo 7: Reducción de la utilización de medios en el proceso de cultivo por perfusión de densidad ultraalta usando rCHO 3.
La línea celular 3 de rCHO se hizo crecer a una baja tasa de perfusión específica de célula (CSPR) de >0,025 nl/céluladía usando un medio desarrollado internamente. Se usó una Cellbag WAVE custom de 10 l acoplada con ATF4 para el cultivo por perfusión. El cultivo alcanzó la densidad celular viable de aproximadamente 1,25 x 108vc/ml el día 11 con una tasa de perfusión de hasta 3 volúmenes de reactor/día. La viabilidad del cultivo era >97% durante todo el proceso de cultivo en biorreactor. La utilización de medios se redujo hasta aproximadamente el 50% en comparación con las mismas condiciones de cultivo usando el medio comercial. Sin embargo, se observó que el crecimiento celular era ligeramente más rápido que cuando se usa el medio comercial CD CHO. El cultivo se recogió directamente (y sin concentración) para generar bancos UHD en viales de 5 ml y bolsas de criopreservación de 100 ml a la temperatura de conservación de DMSO fría bien controlada usando un centrifugador revestido a 4°C. Estudios tras el establecimiento de bancos demostraron que los bancos UHD tanto de vial como de bolsa de criopreservación se recuperaron bien tras la descongelación en matraces de agitación, con un rápido crecimiento, una alta viabilidad (>95%) y una productividad comparable. Adicionalmente, se descongeló una bolsa de criopreservación en dos biorreactores WAVE de 20 l y demostró un crecimiento celular y una viabilidad comparables con los matraces de agitación. La Figura 18 es un gráfico que compara la densidad celular viable (células/ml, líneas continuas) y viabilidad (líneas discontinuas) con medio interno (negro) y medio CD CHO (gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 3 de rCHO. La Figura 19 es un gráfico que compara la tasa de perfusión (círculos, líneas continuas) y la tasa de perfusión específica de célula (triángulos, líneas discontinuas) con medio interno (negro) y medio CD CHO (gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 3 de rCHO.
Ejemplo 8: Reducción de la utilización de medios en el proceso de cultivo por perfusión de densidad ultraalta usando rCHO 1.
La línea celular 1 de rCHO se hizo crecer usando medio comercial CD CHO suplementado con Efficient Feed B (EFB) y se mantuvo a una baja tasa de perfusión específica de célula (CSPR) a >0,04 nl/célula-día. Se usó la Cellbag de perfusión WAVE de 10 l GE con un filtro incorporado como biorreactor de cultivo por perfusión. Para la comparación, también se sometió a prueba el medio comercial CD CHO sin ningún suplemento de nutrientes. El cultivo sin adición de EFB alcanzó una densidad celular viable de aproximadamente 1,0 x 108 vc/ml el día 13 con una tasa de perfusión de hasta 8 volúmenes de reactor/día. Añadiendo un 10% de EFB al medio CD CHO desde el día 5 hasta el día 10 y un 20% de EFB desde el día 10 hasta el día 14, el cultivo alcanzó una densidad celular viable de aproximadamente 1,03 x108 vc/ml el día 14 con una tasa de perfusión de hasta 4 volúmenes de reactor/día. Por tanto, con la adición de EFB, se consiguió un cultivo celular por perfusión UHD comparable con una reducción aproximada del 50% en la utilización de medio. La Figura 20 es un gráfico que compara la densidad celular viable (células/ml, líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas) con medio CD CHO suplementado con Efficient Feed B (negro) y medio CD CHO (gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 1 de rCHO. La Figura 21 es un gráfico que compara la tasa de perfusión (círculos, líneas continuas) y la tasa de perfusión específica de célula (triángulos, líneas discontinuas) con medio CD CHO suplementado con Efficient Feed B (negro) y medio CD CHO (gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 1 de rCHO.
Ejemplo 9: Aumento a escala del proceso de perfusión de densidad ultraalta usando rCHO 3.
Se personalizó una Cellbag WAVE de 20 l para acoplarse con ATF4 para soportar cultivo por perfusión UHD de 10 l. Se sometió a prueba la línea celular 3 de rCHO hecha crecer en medio comercial CD CHO. El cultivo alcanzó una densidad celular viable de aproximadamente 1,1 x108 vc/ml el día 14 con una tasa de perfusión de hasta 5 volúmenes de reactor/día. La tasa de perfusión específica de célula (CSPR) se mantuvo a >0,04 nl/célula-día y la viabilidad era de >97%. El crecimiento celular era comparable al usando una Cellbag WAVE de 10 l con un volumen de trabajo de 5 l. La Figura 22 representa la densidad celular viable (células/ml, líneas continuas) y la viabilidad (líneas discontinuas) usando el biorreactor WAVE de 20 l (volúmenes de trabajo de 10 l, negro) y el biorreactor WAVE de 10 l (volumen de trabajo de 5 l, gris) en un cultivo a modo de ejemplo de línea celular 3 de rCHO. El cultivo podía recogerse directamente para preparar aproximadamente 90x bolsas de criopreservación de 100 ml.
Ejemplo 10: Evaluación de bancos de bolsas de criopreservación de densidad ultraalta tras un año de almacenamiento en congeladores de almacenamiento de nitrógeno líquido en fase de vapor usando rCHO 2 y rCHO 3.
Se sometieron a prueba bolsas de criopreservación UHD de 100 ml (aproximadamente 1,0x108 vc/ml, 100 ml por bolsa de criopreservación) de la línea celular 2 y 3 de rCHO para el rendimiento tras la descongelación y se compararon con el punto de tiempo 0 (cuando los bancos se congelaron y se transfirieron al almacenamiento en N2 líquido en fase de vapor durante la noche). Se observaron un crecimiento, una viabilidad y una productividad celulares tras la descongelación comparables para las células en el punto de tiempo 0 y al año.
Claims (22)
- REIVINDICACIONES1 Un método para producir un banco de células congeladas de densidad ultraalta directamente a partir de una población de células cultivadas, comprendiendo el método:a) cultivar células en un biorreactor de perfusión para obtener una población celular de densidad ultraalta con una concentración de al menos aproximadamente 1,0 x 108 células/ml, estando dicho biorreactor de perfusión acoplado a un sistema de retención celular que comprende un sistema de filtración de flujo tangencial alternante (ATF) que comprende un filtro,teniendo el cultivo celular de biorreactor de perfusión una concentración de oxígeno disuelto (OD) de al menos aproximadamente el 30%, y controlándose el OD en el biorreactor de perfusión a través del ajuste de la tasa de basculación y el ángulo de basculación del biorreactor, basculándose el biorreactor inicialmente a 22 rpm con un ángulo de basculación de 10° y basculándose posteriormente a 25 rpm con un ángulo de basculación de 12°, y suministrando manualmente oxígeno puro al espacio de cabeza cuando el OD es > 30%,siendo una tasa de flujo de gas total inicialmente de 0,2 litros por minuto (lpm) y aumentándose hasta 0,4 lpm cuando la concentración celular es > 3 x 107 células/ml o > 4 x 107 células/ml; yb) añadir crioprotector a la población celular de densidad ultraalta para producir un banco de células congeladas de densidad ultraalta, teniendo el banco de células congeladas de densidad ultraalta una concentración de al menos aproximadamente 1,0 x 108 células/ml y una viabilidad tras la descongelación de al menos aproximadamente el 95%, yno realizándose ninguna etapa de concentración adicional entre el cultivo de las células y la adición de crioprotector a la población celular de densidad ultraalta.
- 2. - El método según la reivindicación 1, en el que el filtro tiene un área superficial de al menos aproximadamente 0,08 m2, de aproximadamente 0,3 m2 a aproximadamente 0,5 m2, de aproximadamente 0,5 m2 a aproximadamente 1,0 m2, de aproximadamente 0,7 m2 a aproximadamente 0,8 m2, de aproximadamente 1,0 m2 a aproximadamente 2,0 m2, de aproximadamente 2,0 m2 a aproximadamente 3,0 m2, de aproximadamente 3,0 m2 a aproximadamente 4,0 m2 o de aproximadamente 4,0 m2 a aproximadamente 5,5 m2.
- 3. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el filtro tiene un tamaño de poro seleccionado del grupo que consiste en 0,7 gm, 1,2 gm y 7 gm.
- 4. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población celular de densidad ultraalta tiene una densidad celular seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1,0 x 108 células/ml, aproximadamente 1,1 x 108 células/ml, aproximadamente 1,2 x 108 células/ml, aproximadamente 1,3 x 108 células/ml, aproximadamente 1,4 x 108 células/ml, aproximadamente 1,5 x 108 células/ml, aproximadamente 1,6 x 108 células/ml, aproximadamente 1,7 x 108 células/ml, aproximadamente 1,8 x 108 células/ml, aproximadamente 1,9 x 108 células/ml y aproximadamente 2,0 x 108 células/ml.
- 5. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha criopreservación comprende añadir dimetilsulfóxido (DMSO) a la población celular de densidad ultraalta a una concentración final de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol.
- 6. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha criopreservación comprende congelar al menos una porción de la población celular de densidad ultraalta en un recipiente apropiado para su almacenamiento en condiciones de criopreservación.
- 7. - El método según la reivindicación 6, en el que el recipiente es un vial o una bolsa de criopreservación.
- 8. - El método según la reivindicación 7, en el que el banco de células congeladas de densidad ultraalta comprende aproximadamente 4,5 x 108 células/vial o aproximadamente 100 x 108 células/bolsa de criopreservación.
- 9. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el banco de células congeladas de densidad ultraalta tiene una densidad celular de al menos aproximadamente 1,1 x 108 células/ml.
- 10. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la tasa de perfusión en el biorreactor de perfusión es de entre aproximadamente 0,02 nl/célula/día y aproximadamente 0,5 nl/célula/día y/o entre 0 y 15 volúmenes de reactor por día.
- 11. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cultivo celular de biorreactor de perfusión tiene un pH de entre aproximadamente 6,8 y aproximadamente 7,2.
- 12. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el biorreactor es un biorreactor de bolsa flexible.
- 13. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células son células de mamífero, seleccionándose opcionalmente dichas células de mamífero del grupo que consiste en: CHO, CHO-DBX11, CHO-DG44, CHO-S, CHO-K1, Vero, BHK, HeLa, COS, MDCK, HEK-293, NIH-3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20, T47D, NS0, CRL7030, células HsS78Bst, PER.C6, SP2/0-Agl4 y células de hibridoma.
- 14. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células son células transfectadas.
- 15. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células expresan una proteína terapéutica.
- 16. - El método según la reivindicación 1, en el que:a) el biorreactor de perfusión comprende un biorreactor de bolsa flexible;b) el filtro tiene un área superficial de filtro de al menos 0,08 m2 y un tamaño de límite de masa molecular (MWCO) de al menos 50 kDa;c) el crioprotector añadido a la población celular de densidad ultraalta es DMSO; yd) el banco de células congeladas de densidad ultraalta comprende de aproximadamente el 5% a aproximadamente el 10%, vol./vol., de DMSO.
- 17. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pH y el OD del cultivo se controlan mediante métodos automatizados.
- 18. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población celular de densidad ultraalta se enfría hasta y se mantiene a una temperatura de aproximadamente 4°C antes de y durante la adición del crioprotector y la dispensación.
- 19. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población celular de densidad ultraalta se mantiene a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 26°C antes de y durante la adición del crioprotector y la dispensación.
- 20. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la población celular de densidad ultraalta se mantiene a una temperatura fría no controlada usando un baño de agua helada antes de y durante la adición del crioprotector y la dispensación.
- 21. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el biorreactor comprende un filtro incorporado.
- 22. - El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, tras la basculación a 25 rpm con un ángulo de basculación de 12°, el biorreactor se bascula a 30 rpm con un ángulo de basculación de 12°.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462052257P | 2014-09-18 | 2014-09-18 | |
| PCT/US2015/050817 WO2016044670A1 (en) | 2014-09-18 | 2015-09-17 | Ultra-high density cell banking methods |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2890454T3 true ES2890454T3 (es) | 2022-01-19 |
Family
ID=54249621
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES15774796T Active ES2890454T3 (es) | 2014-09-18 | 2015-09-17 | Métodos de establecimiento de bancos de células de densidad ultraalta |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20160100570A1 (es) |
| EP (2) | EP3957173A1 (es) |
| JP (3) | JP6760927B2 (es) |
| KR (3) | KR102619142B1 (es) |
| CN (2) | CN117958251A (es) |
| AU (3) | AU2015317530A1 (es) |
| BR (1) | BR112017005354B1 (es) |
| CA (1) | CA2962262A1 (es) |
| CY (1) | CY1124672T1 (es) |
| DK (1) | DK3193594T3 (es) |
| ES (1) | ES2890454T3 (es) |
| HU (1) | HUE055676T2 (es) |
| IL (5) | IL303768B1 (es) |
| MX (2) | MX2017003651A (es) |
| RU (2) | RU2723129C2 (es) |
| SG (2) | SG10201902355VA (es) |
| TW (2) | TWI781387B (es) |
| WO (1) | WO2016044670A1 (es) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112410279A (zh) | 2013-03-15 | 2021-02-26 | 建新公司 | 高密度细胞存储方法 |
| KR101813048B1 (ko) * | 2014-10-30 | 2017-12-29 | 린나이코리아 주식회사 | 플레이트 접합형 열교환기 |
| AU2017249402A1 (en) | 2016-04-12 | 2018-10-04 | Artemis Biosystems, Inc. | Perfusion filtration systems |
| JP6870629B2 (ja) * | 2018-02-09 | 2021-05-12 | Ｊｆｅエンジニアリング株式会社 | バイオリアクターバッグのスケールアップ方法 |
| JP7333930B2 (ja) * | 2019-01-07 | 2023-08-28 | 独立行政法人国立高等専門学校機構 | ミミズ細胞の保存方法及びミミズ培養細胞の形質転換方法 |
| CN109892321A (zh) * | 2019-04-17 | 2019-06-18 | 中国科学技术大学 | 一种大体积生物样本低温保存的方法 |
| CN110628700B (zh) * | 2019-10-14 | 2023-10-17 | 广东省中医院（广州中医药大学第二附属医院、广州中医药大学第二临床医学院、广东省中医药科学院） | 一种用于筛选细胞培养条件的标准方法 |
| IL300531A (en) * | 2020-08-10 | 2023-04-01 | Angiocrine Bioscience Inc | Endothelial cell assemblies are cryopreserved |
| CN116179464A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-05-30 | 无锡药明生物技术股份有限公司 | 提高培养液细胞密度和高密度细胞培养的方法 |
| CN115644172A (zh) * | 2022-12-27 | 2023-01-31 | 江苏赛孚士生物技术有限公司 | 细胞冻存方法和细胞复苏方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0811056B1 (en) | 1995-02-23 | 2000-05-31 | Quest International B.V. | Peptides for tissue and cell culture media |
| AUPN442295A0 (en) | 1995-07-26 | 1995-08-17 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Regulated autocrine growth of mammalian cells |
| AT407255B (de) | 1997-06-20 | 2001-02-26 | Immuno Ag | Rekombinanter zellklon mit erhöhter stabilität in serum- und proteinfreiem medium und verfahren zur gewinnung des stabilen zellklons |
| US6475725B1 (en) | 1997-06-20 | 2002-11-05 | Baxter Aktiengesellschaft | Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same |
| US6391257B1 (en) | 1998-08-19 | 2002-05-21 | Prestone Products Corporation | Antifreeze compositions comprising carboxylic acid and cyclohexenoic acid |
| EP1103610A1 (en) | 1999-11-26 | 2001-05-30 | Introgene B.V. | Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines |
| US6544424B1 (en) | 1999-12-03 | 2003-04-08 | Refined Technology Company | Fluid filtration system |
| US6544788B2 (en) | 2001-02-15 | 2003-04-08 | Vijay Singh | Disposable perfusion bioreactor for cell culture |
| AU2005229359C1 (en) * | 2004-03-05 | 2011-07-28 | Patheon Holdings I B.V. | Process for cell culturing by continuous perfusion and alternating tangential flow |
| RU2290808C2 (ru) * | 2004-12-06 | 2007-01-10 | Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской Академии Наук | Криопротекторный раствор для замораживания лейкоцитов при низкой температуре |
| RU2314687C1 (ru) * | 2006-07-13 | 2008-01-20 | Институт биологии моря имени А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук (статус государственного учреждения) | Способ криосохранения клеток морских беспозвоночных |
| EP3643773A1 (en) * | 2009-07-06 | 2020-04-29 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method of culturing eukaryotic cells |
| WO2013006461A1 (en) * | 2011-07-01 | 2013-01-10 | Biogen Idec Ma Inc. | Cholesterol-based media supplementals for cell culture |
| RU2554405C2 (ru) * | 2012-03-22 | 2015-06-27 | Борис Лаврович Макеев | Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови |
| CN112410279A (zh) * | 2013-03-15 | 2021-02-26 | 建新公司 | 高密度细胞存储方法 |
-
2015
- 2015-09-17 AU AU2015317530A patent/AU2015317530A1/en not_active Abandoned
- 2015-09-17 WO PCT/US2015/050817 patent/WO2016044670A1/en active Application Filing
- 2015-09-17 CA CA2962262A patent/CA2962262A1/en active Pending
- 2015-09-17 SG SG10201902355VA patent/SG10201902355VA/en unknown
- 2015-09-17 CN CN202410031600.8A patent/CN117958251A/zh active Pending
- 2015-09-17 IL IL303768A patent/IL303768B1/en unknown
- 2015-09-17 CN CN201580062059.6A patent/CN107426990A/zh active Pending
- 2015-09-17 RU RU2017113076A patent/RU2723129C2/ru active
- 2015-09-17 ES ES15774796T patent/ES2890454T3/es active Active
- 2015-09-17 HU HUE15774796A patent/HUE055676T2/hu unknown
- 2015-09-17 EP EP21176085.5A patent/EP3957173A1/en active Pending
- 2015-09-17 JP JP2017515201A patent/JP6760927B2/ja active Active
- 2015-09-17 KR KR1020237003199A patent/KR102619142B1/ko active IP Right Grant
- 2015-09-17 IL IL287921A patent/IL287921B2/en unknown
- 2015-09-17 DK DK15774796.5T patent/DK3193594T3/da active
- 2015-09-17 US US14/857,766 patent/US20160100570A1/en not_active Abandoned
- 2015-09-17 SG SG11201702087QA patent/SG11201702087QA/en unknown
- 2015-09-17 IL IL311946A patent/IL311946A/en unknown
- 2015-09-17 EP EP15774796.5A patent/EP3193594B1/en active Active
- 2015-09-17 BR BR112017005354-3A patent/BR112017005354B1/pt active IP Right Grant
- 2015-09-17 KR KR1020177010180A patent/KR20170054507A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-09-17 KR KR1020237044671A patent/KR20240005197A/ko active Application Filing
- 2015-09-17 MX MX2017003651A patent/MX2017003651A/es unknown
- 2015-09-17 RU RU2020116448A patent/RU2020116448A/ru unknown
- 2015-09-18 TW TW109109470A patent/TWI781387B/zh active
- 2015-09-18 TW TW104130938A patent/TWI709646B/zh active
-
2017
- 2017-03-16 IL IL251206A patent/IL251206B/en active IP Right Grant
- 2017-03-17 MX MX2021007613A patent/MX2021007613A/es unknown
-
2019
- 2019-11-08 AU AU2019261787A patent/AU2019261787B2/en active Active
-
2020
- 2020-05-05 IL IL274458A patent/IL274458B/en unknown
- 2020-09-01 JP JP2020146461A patent/JP7104116B2/ja active Active
-
2021
- 2021-09-30 CY CY20211100848T patent/CY1124672T1/el unknown
-
2022
- 2022-06-14 AU AU2022204128A patent/AU2022204128A1/en active Pending
- 2022-07-06 JP JP2022108739A patent/JP7487263B2/ja active Active
-
2023
- 2023-02-23 US US18/113,281 patent/US20230309551A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2890454T3 (es) | Métodos de establecimiento de bancos de células de densidad ultraalta | |
| ES2894633T3 (es) | Métodos de establecimiento bancos de células de alta densidad | |
| TWI844120B (zh) | 超高密度細胞儲存方法 |