JPH0310679A

JPH0310679A - 細胞培養バッグ

Info

Publication number: JPH0310679A
Application number: JP14712189A
Authority: JP
Inventors: Yuji Hamazaki; 勇二濱崎; Takashi Ikegami; 池上　孝; Nami Tozaki; 戸崎　奈美; Jun Takano; 純高野; Koichi Yamagata; 浩一山形
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1989-06-09
Filing date: 1989-06-09
Publication date: 1991-01-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野〕本発明は、細胞培養バッグ、特に、細胞と培養液とを入
れて細胞を培養するための細胞培養バッグに関する。

〔従来の技術〕

たとえば、モノクローナル抗体、リンフォ力イン、サイ
ト力イン、インターロイキンやインターフェロンを製造
する際に使用される細胞培養バッグとして、外側の樹脂
バッグと、樹脂バッグ内に収容された隔膜バッグとを備
えたものが知られている。

この細胞培養バッグを使用する際には、隔膜バッグ内に
ハイブリドーマ及び血清等を入れ、樹脂バッグ内に培養
液を入れる。そして、細胞培養バッグを所定温度で揺動
させることにより、ハイブリドーマを培養する０次に、
細胞培養バッグからハイブリドーマ培養液を取り出す、
そして、その培養液を遠心分離することにより細胞を除
去し、上清を得る。得られた上清を、逆浸透膜を用いて
濃縮する。そして、０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７゜５）
を用いて透析し、さらに脱気処理する。

上述のような前処理を施した後、液体クロマトグラフィ
ーで分画する。この場合には、０．２Ｍ燐酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）で平衡化されたヒドロキシアパタイト等を含
むカラムが用いられる。カラム内に高分子を吸着させた
後、燐酸緩衝液の濃度を種々変更することによって、分
画されたフラクシヨンを得る。たとえばサイト力インは
燐酸緩衝液濃度０．４Ｍのときに溶出するので、サイト
カインを得たい場合には、０．４Ｍ燐酸緩衝液を用いて
サイト力インを溶出させる。さらに、必要に応じて、ア
フィニティクロマトグラフィー等の処理を行うことによ
り、所望物質の精製を行う。

（発明が解決しようとする課題〕前記従来の構成では、遠心処理によって上清を得、さら
に上清中に含まれる目的物質をクロマトグラフィー等を
用いて得る必要がある。このため、長時間の作業が必要
となり、またその作業は煩雑なものとならざるを得ない
、さらに、培養液中に有用物質が分泌されてから液体ク
ロマトグラフィーの樹脂に吸着させるまでに複雑な工程
を経るため、上清の温度やｐＨが変化し、有用物質が失
活してしまうことも多い。

本発明の目的は、培養液から目的物質を得る工程を簡略
化でき、しかも目的物質の活性が低下しにくい細胞培養
バッグを提供することにある。

［課題を解決するための手段］本゛発明に係る細胞培養バッグは、細胞と培養液とを入
れて細胞を培養するためのバッグである。

このバッグは、袋状のバッグ本体と、バッグ本体内に収
納され細胞から分泌された有用物質を特異的に吸着する
吸着材とを備えている。

〔作用〕

本発明に係る細胞培養バッグでは、バッグ本体内に細胞
と培養液とが入れられて細胞培養が行われる。この細胞
培養の際に細胞から分泌された有用物質は、バッグ本体
内に収納された吸着材に吸着される。このように、細胞
培養期間において有用物質が吸着材に吸着されるため、
細胞培養液の上清を得る処理から液体クロマトグラフィ
ー〇カラム内の樹脂に有用物質を吸着させるまでの作業
が省略できる。

充分に有用物質が吸着材に吸着されれば、細胞培養バッ
グから吸着材を取り出し、吸着材から有用物質を溶出さ
せて得る。

このように、本発明に係る細胞培養バッグを用いた場合
には、簡便かつ迅速に所望の有用物質を得ることができ
るので、当該物質の活性が低下しにくい。

（実施例）本発明の一実施例を第１図及び第２図に示す。

図において、培養バッグ１は、可撓性樹脂（たとえば塩
化ビニル）からなる袋状の樹脂バッグ２と、樹脂バッグ
２内に収納されたたとえば再生セルロースからなる隔膜
バッグ３とを備えている。

隔膜バッグ３としては、分隔条件に応じて、メンブレン
膜、限外濾過膜、逆浸透膜等を適宜使用することができ
る。

樹脂バッグ２は概ね正方形状であり、その四隅には、バ
ッグ固定のための孔４が設けられている。

樹脂バッグ２の一辺には、その中央部に培地導入口５と
培地排出口６とが形成されている。バッグ２内において
、培地導入口５及び培地排出口６の両端は互いに離れる
方向に屈曲しており、その先端部に開口が設けられてい
る。また、培地導入口５及び培地排出口６の外側端部に
は、樹脂製の栓５ａ、６ａが圧入状態で嵌め込まれてい
る。これによって、培地導入口５及び培地排出口６は液
密状態で封止されていることになる。

隔膜バッグ３の培地導入口５側端部には、紐９の一端が
固定されている。紐９の他端は、樹脂バッグ２の一辺に
固定されている。一方、紐９と反対側において、隔膜バ
ッグ３には出入ボート１０が接続されている。出入ボー
ト１０は隔膜バッグ３から樹脂バッグ２を貫通して外部
に突出している。出入ボート１０の外側端部には、樹脂
製の栓１０ａが圧入状態で嵌め込まれている。これによ
って、出入ボート１０は液密性を保持した状態で封止さ
れている。隔膜バッグ３は、紐９と出入ボート１０とに
よって樹脂バッグ２の概ね中央に位置決めされている。

なお、隔膜バッグ３には、その損傷と乾燥とを防ぐため
グリセリンが塗布されている。

隔膜バッグ３内には粒状の吸着材９０が充填されている
。この吸着材は、相互作用に関与するりガント部分と関
与しないマトリクス部分とから構成されている。リガン
ドとしては、所望の生理活性物質に応じて種々の種類の
ものが使用可能である。たとえばサイト力インを得たい
場合には、ヒドロキシル・アパタイト（Ｃａ＋ｏ　（Ｐ
　０４　）　ｂ（ＯＨ）ｚ　）が使用される。マトリク
スとしては、機械的強度が大でありしかもリガンドとの
結合以外化学的には反応を示さないものが使用される。

たとえば、マトリクスとして、アルミナ、シリカ等の無
機物や、ポリスチレン、ポリビニル樹脂等の有機物が使
用される。吸着材の形状としては、球形や破砕形のもの
が使用される。また、３〜８−程度のものが好ましい。

また、吸着材９０の量は、隔膜バッグ３の容量を１００
とした場合に、１〜２０程度が好ましい。

次に、培養バッグ１を使用する際に用いられる細胞培養
装置の一例を説明する。第３図において、この細胞培養
装置は、培養室１１と、培養室１１に隣接して配置され
た培地調整槽１２と、培地調整槽１２に連結された新鮮
培地タンク１３と、培養室１１の培養液排出側に連結さ
れた回収培地タンク１４とを主として有している。

培養室１１は、温度制御可能なりリーンベンチタイプの
ものであり、たとえば３７°Ｃに培養部１６内の温度が
設定されている。培養部１６内には、図示しないフィル
ターを通過してきた浄化空気が僅かな高圧状態で導入さ
れており、これによって培養部１６は無菌状態に維持さ
れている。また、培養室１１は、揺動装置（後に詳述）
を有しており、培養部１６内に配置された複数の培養バ
ッグ１が揺動され得るようになっている。

培地調整槽１２には、各培養バッグ１の培地導入口５に
連結される培地導入パイプ２３が接続されている。培養
室１外において各培地導入パイプ２３の途中には、扱き
ポンプ２４がそれぞれ設置されており、この扱きポンプ
２４によって培地調整槽１２から培養バッグ１へ培養液
が搬送され得るようになっている。培地調整槽１２内に
は、培養バッグ１に供給するための基本培地２５が貯留
されている。なお、基本培地２５の状態を検知するため
、培地調整槽１２には、温度センサ、ｐＨセンサ、ＤＯ
センサ及びグルコースセンサ等の種々のセンサが設けら
れている（図示せず）。培地調整槽１２には、また、新
鮮培地タンク１３がバイブ３０を介して連結されている
。培地排出バイブ３２の途中には、前記扱きポンプ２４
が設けられており、これによって培養バッグ１７から回
収培地タンク１４へ基本培地が搬送され得るようになっ
ている。

第４図に示すように、培養部１６の床面４０には、角度
θに首を振った回転軸４１が回転自在に支持されている
。回転軸４１の床面４０から下方に突出した部分には傘
歯車４２が固定されている。

傘歯車４２には、モータ４３の出力軸に固定された傘歯
車４４が噛み合っている。傘歯車４２の下方において、
回転軸４１には第５図に示すようなカム４５が固定され
ている。カム４５は、その外周面４６が回転軸４１と同
心に形成されている。

外周面４６の一部分には、内周側に窪んだ切欠き４７が
形成されている。また、外周面４６には、マイクロスイ
ッチ４８の端子４９が当接しており、端子４９が切欠き
４７を含む外周面４６に常時弾性的に当接するようにな
っている。なお、マイクロスイッチ４８は、端子４９が
第５図に示すように切欠き４７内に配置されている間の
み接続状態となるように設定されている。

回転軸４１の上端部は、クランク状に屈曲して、培養バ
ッグ台支持部５０となっている。支持部５０の中心線Ｏ
１（Ｌは、回転軸４１の回転中心０□−Ｏｘに対して角
度θだけ傾いている。支持部５０の上端外周部には、ボ
ールベアリング５１を介して培養バッグ台５２が回転自
在に支持されている。培養バッグ台５２の上端面のコー
ナーには、培養バッグ固定部材５３がそれぞれ設けられ
ている。

培養バッグ台５２の右側部下端には、下方に突出するブ
ラケット５４が設けられている。ブラケット５４には、
培養バッグ台５２の回転を阻止するための回転阻止機構
５５が連結されている。回転阻止機構５５は、第６図に
示すように、横方向のビン５６を介してブラケット５４
に回転自在に支持されたレバー５７と、床面４０に固定
された１対のガイド板５８とを主として有している。レ
バー５７の下端には、ガイド板５日に挟まれた状態で横
方向に伸びる摺動部材５９が設けられている。ガイド板
５８のレバー５７に対応する位置には、切欠き６０が設
けられており、これによって摺動部材５９を中心とした
レバー５７の回動がガイド板５８により阻止されないよ
うになっている。

次に、上述の実施例の使用方法及びその動作を説明する
。

培養バッグ１を使用する際には、培地導入口５及び培地
排出口６の栓５ａ、６ａを除去し、培地導入口５から燐
酸緩衝液を培養バッグ１内に導入することによって、隔
膜バッグ３に塗布されたグリセリンを洗浄する。グリセ
リンの洗浄が終われば、樹脂バッグ２内に基本培地を入
れるとともに、隔膜バッグ３内にハイブリドーマ及び血
清等の物質を入れる。

次に、培養バッグ台５２上に培養バッグ１を載せ、固定
部材５３を孔４に挿通することによって、培養バッグ１
を培養バッグ台５２上に固定する。

そして、培地導入バイブ２３を培地導入口５に連結し、
培地排出バイブ３２を培地排出口６に連結する。

モータ４３を回転させると、回転軸４１が回転する。こ
のとき、支持部５０は回転軸４１に対して傾いているの
で、両者の中心線の交点を中心として、培養バッグ台５
２が揺動する。このとき、培養バッグ台５２の揺動に応
じてレバー５７が駆動されるが、レバー５７はガイド板
５８に保持された状態に維持される。この結果、回転軸
４１が回転したとしても培養バッグ台５２は回転しない
ので、回転軸４１の回転にしたがって培養バッグ台５２
は揺動のみを繰り返すことになる。

回転軸４１が回転するとカム４５も回転するので、その
回転に応じてマイクロスイッチ４８がＯＮ・ＯＦＦする
。マイクロスイッチ４８の端子４９が切欠き４７内に入
り込み、マイクロスイッチ４日がＯＮ状態となると、図
示しない制御装置によって扱きポンプ２４が駆動される
。これにより、樹脂バッグ１８内にバイブ２３を通じて
新鮮培地が導入されるとともに、培地排出パイプ３２を
通じて古い培地が排出される。この扱きポンプ２４の動
作時には、培養バッグ台５２のロ５，６側が下方に配置
された状態にある。したがって、培養バッグ１内の気体
部分が培地導入口５及び培地排出口６側にあるときに、
扱きポンプ２４が作動してしまうことはない、樹脂バッ
グ２内に導入された基本培地は、隔膜バッグ３の隔壁を
通過してバッグ３内に入り、細胞培養の養分として使用
される。また、隔膜バッグ３内で生じた老廃物質は、隔
壁を通り樹脂バッグ２内に排出される。この隔膜を通じ
た物質交換は、濃度勾配による拡散現象に基づいて行わ
れる。樹脂バッグ２内の基本培地は、培地排出口６を通
じて回収培地タンク１４に排出される。

上述のような培養動作を続けると、隔膜バッグ３内に収
納されたハイブリドーマがサイト力イン等の生理活性物
質を分泌する。分泌された生理活性物質は、吸着材９０
に吸着される。吸着材９０のリガンドであるヒドロキシ
ル・アパタイトは、燐酸カルシウム結晶の一つであり、
培養液との相互作用は、主としてカルシウム原子の持つ
正電荷と培養液中のカルボキシル基、燐酸基等の負電荷
との間の相互作用によるものと考えられている。

ただし、培養液中の正電荷と担体中の負電荷との相互作
用も無関係ではなく、さらに培養液中の分子の立体構造
の相違によっても吸着性の大小に影響があるものと考え
られている。第７図に細胞培養時における隔膜バッグ３
内での状況を模式的に示す、第７図において、９１はハ
イブリドーマ（細胞）、９２は生理活性物質である。第
７図に示すように、ハイブリドーマ９１で生産されかつ
ハイブリドーマ９１から分泌された所望の生理活性物質
９２は、吸着材９０に吸着される。細胞培養を続けて、
充分に生理活性物質が吸着材９０に吸着されれば、培養
バッグ１を細胞培養装置から取り外す、そして、隔膜バ
ッグ３の内容物を取り出し、遠心処理を行うことによっ
て吸着材９０を分離する。分離された吸着材９０をビー
カー等に入れ、所望の生理活性物質が溶出する濃度の燐
酸緩衝液を用いて吸着材から所望の生理活性物質を溶出
させる。このように、）容出を行う際には、燐酸の濃度
勾配を用いる。また、酢酸や炭酸イオンを用いた溶出を
行うことも可能である。

〔他の実施例〕

（ａ）吸着材９０としては、粒状のものに限られること
はなく、たとえば第８図に模式的に示すようなカラム状
とすることもできる。

（ｂ）第９図に示すようなバッチ式培養装置に使用され
る培養バッグにも本発明を同様に採用し得る。

第９図において、３７°Ｃに温度制御された培養室７１
内には矢印方向に回転する培養バッグ台７２が配置され
ている。培養バッグ台７２は、図示しない回転機構によ
って駆動されるようになっている。また、培養バッグ台
７２には、培養バッグ７３が取り付けられ、台７２が回
転することによって培養バッグ７３内の液体が攪拌され
るようになっている。培養バッグ７３は、外側の樹脂バ
ッグ７４と、樹脂バッグ７４内に収納された隔膜バッグ
７５とを備えている。隔膜バッグ７５内には、第７図に
示す上述の実施例と同様に吸着材９０が収納されている
。

このようなバッチ式培養装置において使用される培養バ
ッグ７３でも、隔膜バッグ７５内に吸着材９０を入れて
おくことによって、本発明を同様に実施することが可能
である。

（Ｃ）吸着材９０の比重を溶液の比重約１．０５よりも
大きくするか中空状にし小さくすることにより、内袋中
の攪拌効果も得られる。

〔発明の効果〕

本発明に係る細胞培養バッグによれば、バッグ本体内に
吸着材が収納されているので、遠心処理により細胞培養
液から上清を分離したり、液体クロマトグラフィー〇カ
ラムを用いて有用物質を吸着させたりする作業が不要と
なる。このため、本発明によれば、細胞から分泌された
有用物質を簡便かつ迅速に得ることが可能となる。また
、複雑な処理が不要となるので、有用物質の活性が低下
しにくい。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施例の平面図、第２図は第１図の
■−■断面図、第３図は本発明の一実施例が使用される
細胞培養装置の概略構成図、第４図は揺動機構の一部切
欠き側面部分図、第５図は第４図の■−■断面図、第６
図は第４図の■矢視部分図、第７図は細胞培養状態を示
す模式図、第８図は他の実施例の第７図に相当する図、
第９図はさらに他の実施例が採用される細胞培養装置の
縦断面概略図である。１．７３・・・培養バッグ、２，７４・・・樹脂バッグ
、３．７５・・・隔膜バッグ、９０・・・吸着材。でて３１　図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）細胞と培養液とを入れて細胞を培養するための細
胞培養バッグであって、袋状のバッグ本体と、前記バッグ本体内に収納され、前記細胞から分泌された
有用物質を特異的に吸着する吸着材と、を備えた細胞培
養バッグ。