JP2012531930A - 真核生物細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その内容の全体を出典明示により本明細書中に援用する2009年7月6日出願の米国特許仮出願第61/223313号の優先権を主張するものである。
本発明は、培養培地へ塩基を直接添加することなく、細胞培養のpHを維持することを可能にする重炭酸塩含有培地において真核生物細胞を培養するための装置及び方法に関する。
本願明細書において記載又は参照される一般の細胞培養技術及び手順は、当業者に周知であり、また、一般的な方法論を使用して一般的に採用される。適宜、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、通常、特に明記しない限り、製造業者規定のプロトコル及び/又はパラメータに従って実施される。
「DO」は、溶存酸素を意味する。
ここで使用される場合、「真核生物細胞」は、無脊椎動物又は脊椎動物の細胞であり得る動物性細胞を意味する。
kLaは、体積測定酸素移動係数を意味する。
kLaCO2は、体積測定二酸化炭素移動係数を意味する。
LPMは、ガス流の1分当たりのリットルを意味する。
pCO2は、溶存CO2濃度の分圧を意味する。
(WAVE BioreactorTM培養におけるO2移動)
WAVE BioreactorTMのO2移動速度を決定するために、オンラインDOプローブに対する十分に速い応答時間、CellbagTMにおける理想的な混合、及び液相界面による物質移動抵抗の支配を仮定する。これらの仮定の下で、以下の物質収支式は、気相から液相へのO2移動の速度を概算する:
ここで、O2 *は、培地中の飽和DO濃度であり、またO2は、培地中のDO濃度である。時間ゼロでO2をゼロとすると、式は
となる。
時間の関数として、
をプロットすることにより、最適合線の傾きは、このシステムのkLaを提供する。
単純化されたモデルにおいて、CellbagTMのガス状CO2(CO2(g))は、培養培地の溶存CO2(CO2(aq))と平衡である。
次にCO2(aq)は、炭酸(H2CO3)と平衡に存在し、それは重炭酸塩(HCO3 −)に解離することができる
炭酸塩(CO3 2−)へのHCO3 −の更なる解離は、pH4−8の範囲では無視できる(Royce and Thornhill, 1991)。
ここで、kLaCO2は、体積測定溶解二酸化炭素移動係数である。
ここで、Hは、CO2に対するヘンリーの法則の定数である。
本発明の方法では、真核細胞が、細胞の生存を可能にする適切な培養培地及び温度で培養される。当業者に周知のように、様々な細胞タイプが様々な培地で増殖され得る。熟練した技術者は、どの培地が、特定の細胞種及び/又は特定の応用のために最適か容易に選択することができる。本発明の方法において、培地は、CO2によるpH調節を可能にするために、重炭酸塩緩衝系を含んでいなければならない。培地は、緩衝剤として作用する更なる薬剤を含み得る。
細胞培養培地を収容する容器は、いかなる特定のサイズにも限られない。本発明の容器は、当該技術分野で用いられる一般的に用いられるバイオリアクタ及びディスポーザブル培養バッグのサイズに適合化され得、またより大きな又はより小さな培養に適応させることもできる。
細胞は、容器(40)中の細胞培養培地(110)で培養される。容器(40)のヘッド空間(130)は、ガスで満たされる。ガス流入ポート(70)及び流出ポート(80)を通るガス流は、ガスが、ヘッド空間(130)内を流れ、培養物が、基台(10)に取り付けられたロッカー(20)上のプラットフォーム(30)の揺動動作によって撹拌されるに伴い、細胞培養培地(110)からヘッド空間(130)へ拡散するCO2を排出することを可能にする。細胞培養培地(110)の溶存CO2の減少は、細胞培養培地(110)のpHの増加を引き起こす。
大部分の哺乳類細胞培養系は、重炭酸塩を含有する細胞培養培地を利用するので、哺乳類細胞培養におけるpH制御は、塩基/CO2添加によって主に実施される。pH制御は、炭酸-重炭酸塩緩衝液系を利用する。このようなシステム、例えばディスポーザブル型バイオリアクタバッグ等では、培養のpHを、培地の溶存CO2の濃度を操作することによって調節でき、これはヘッド空間のCO2の濃度を調節することによって調節されうることが発見された。双方向pH調節は、本願明細書の実施例において、ヘッド空間のCO2濃度を調節することによって可能であることが示される。この方法は、細胞培養バイオリアクタシステムのpHを増加するための、塩基の使用を排除する。ディスポーザブル型バイオリアクタの細胞培養のpHを減少させる必要がある場合、ヘッド空間のCO2の濃度を、CO2を含む流入ガスを補充することによって増加させることができる。これは、CO2を細胞培養に移動せしめることを可能にする。ディスポーザブル型バッグの細胞培養のpHが増加される必要がある場合、細胞培養からのCO2の除去を促進するために、ヘッド空間のCO2濃度を減少させ又はヘッド空間クリアランス速度を増加させることができる。
細胞培養の初期段階の間、比較的少ない数の細胞が存在する時に、細胞培養のpHは概して上昇する。pHを制御するために、CO2を典型的にはバイオリアクタに加えてpHを低減させる。通常、この添加は、通常の攪拌タンクバイオリアクタにおいて細胞培養へCO2ガスを散布することによって達成される。本発明のディスポーザブル型バイオリアクタでは、ヘッド空間中のCO2濃度は、CO2移動の方向が気相から液相へとなるように変更される。細胞濃度が培養の経過に伴って増加するにつれて、細胞培養のCO2濃度も増加し、これにより典型的にはpHが減少する。通常のpHフィードバック制御を伴う通常の撹拌タンクバイオリアクタでは、pHを制御するために塩基が加えられる。塩基の添加は、細胞培養のpHを増加させる。本発明のディスポーザブル型バイオリアクタでは、pHの増加は、ヘッド空間中のCO2の濃度を減少させること、並びにヘッド空間のクリアランス速度を増加させることによって、CO2移動の方向を逆転させることによって達成することができる。培地中のCO2濃度を管理することによって細胞培養のpHを維持するこの方法は、塩基の使用を排除することを可能にする。要求(pHを増加又は減少させる)に基づいて、ヘッド空間中のCO2濃度を、それぞれ減少又は増加させることができる。
(1.CHO細胞株及び細胞培地)
実施例において使用される全ての細胞株は、無血清浮遊培養において増殖するよう適合されたCHOジヒドロ葉酸還元酵素欠失(DHFR−)宿主に由来した。特異的モノクローナル抗体(MAb)を生産する各細胞株は、DHFR、MAb軽鎖(LC)及びMAb重鎖(HC)をコードするDNAプラスミドを用いてDHFR-宿主をトランスフェクトすることによって生成された。安定にトランスフェクトされた細胞は、メトトレキセートを含む私有の既知組成選択培地において、2−5日毎に継代することによってその後維持された。私有の混合養分に加えて、1.0g/LのプルロニックF-68、2.44g/Lの重炭酸ナトリウム、及び15mMのHEPESを含む同じ培地が、バッチ及び潅流モード双方での、WAVE BioreactorTMにおける細胞培養のために使用された。
バッチ又は潅流モードでCHO細胞を培養するために使用されるWAVE BioreactorTMシステム(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)は、揺動プラットフォーム、制御ユニット、及び流出入ガスフィルタ及び複数のサンプリングポートを有する、予め殺菌され、可撓性であり、またディスポーザブルであるバッグから構成された(Singh, 1999; Tang等, 2007)。各システムは、それぞれ、温度制御及び必要とされる流入ガス組成(空気と混合されたO2及び/又はCO2)を提供するために、加熱パッド及びガス混合ボックスを備えた。全ての細胞培養実験は、6又は20Lの作用体積である50LのCellbagTMを使用して、37℃の温度設定値、19−25rpmの揺動速度、及び8−12°の揺動角度で実施された。オンラインpH又はDOプローブは、WAVE BioreactorTMに設置されなかった;代わりに、異なるガス混合及びガス流量ストラテジーが、培養pH及びDOレベルを目標の範囲内に維持するそれらの能力のために試験された。
回分培養は、通常の又は潅流CellbagTMを〜7.5×105細胞/mLで接種をすることによって、WAVE BioreactorTMにおいて6Lで始められた。接種の2、3後日、培養組織が充分な細胞集団を蓄積した時に、新鮮培地が、作用体積を20Lに増加するために加えられた。各継代で、培養組織は、回分モードで2−5日保たれた。
他に明記しない限り、回分培養が、潅流CellbagTMにおいて20Lの作用体積での充分な細胞集団を蓄積した後、23rpmの揺動速度、及び10°の揺動角度、及び一日当たり1作用体積の潅流流量で開始された。潅流CellbagTMにおける細胞保持機器は、培養プロセスの間、液表層を浮遊するフィルタから成った(Tang等, 2007)。潅流フィルタは、細胞をCellbagTMに保持するが、新鮮培地が添加され、また濾過物は連続的に除去された。一日当たりの一作用体積の、新しいメディアの添加と、濾過物除去率とを一致させることによって、一定の体積が、潅流WAVE BioreactorTMにおいて維持された。
WAVE BioreactorTM及び撹拌タンク・バイオリアクタにおける培養の性能を比較するために、同じシードトレインソース(seed train source)からの細胞が、WAVE BioreactorTMバイオリアクタ及び20Lのステンレス鋼撹拌タンク・バイオリアクタ(Applikon, Foster City, CA, USA)に、〜7.5×105細胞/mlで接種された。細胞は、まず回分モードで培養され、そして、十分な細胞集団の蓄積の上で潅流は開始された。作用体積は、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、回分モードで7Lであり、潅流モードでは15Lであった。培養温度、DO及び攪拌は、それぞれ37℃、空気飽和の30%及び125rpmに保たれた。培養pHは7.15に保たれ、不感帯は0.03であり、pHを増加するために1Mの炭酸ナトリウムの添加又はpHを減少させるためにCO2ガスの散布によって維持された。潅流動作の間、Centritech遠心分離システム(Centritech AB, Norsborg, Sweden)が、増殖培地から細胞を分離するために使用された;細胞は遠心分離機により保持されバイオリアクタに戻され、上澄みは取り除かれた(Johnson等, 1996)。一日当たりの一作用体積の、新鮮培地の添加の割合と上澄み除去率とを一致させることによって、バイオリアクタにおける一定の体積が保たれた。
培養組織は、生細胞濃度(VCC)及び生存率(Vi-Cell AS, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA)、並びにpH、DO、pCO2、ブドウ糖及び乳酸塩に対して、サンプルが採られ分析された(Bioprofile 400, Nova Biomedical, Waltham, MA, USA)。
CellbagTMにおけるガス移動特性は、それらのDO及びpHレベルへの影響のため、培養性能に影響を及ぼす。我々の所望の範囲内にpH及びDOを維持することに対する第1のステップとして、CellbagTMにおける無細胞研究が、O2及びCO2移動を測定するために実施された。
50LのCellbagTMにおけるO2移動が、模擬培養培地を使用して、揺動速度(20、30及び40rpm)、揺動角度(8°、10°及び12°)及びガス流量(0.1、0.2及び0.3L/分)の様々な組合せで、体積測定O2移動係数(kLa)を算出することによって特徴づけられた。古典的な動的ガス放出方法が、kLaを算出するために用いられた(Dunn and Einsele, 1975)。これらの研究のために使用された試験培地は、専有の細胞培養培地をシミュレーションするように設計された:1.0g/LのプルロニックF-68、2.44g/Lの重炭酸ナトリウム及び15mMのHEPESから成った。同じ製造業者(Broadley-James Corporation, Irvine, CA, USA)からの、Model40トランスミッターに連結されたOxyProbe(登録商標)DOプローブが、オンラインDO測定を提供するために使用された。
O2移動研究で使用された方法によって、模擬培地が脱酸素化された後、N2を供給するために使用された同じ流入ポートを通してCO2がCellbagTMに供給された。オンラインpHプローブが7.0を読んだ時に、CO2の供給が止められ、ヘッド空間はO2移動研究に記載されている同じ方法を使用して除去された。バッグが十分に膨らまされた時に、CO2移動試験が、揺動速度、揺動角度及びガス流量の規定された条件で開始された。pHに生じた増加は、同じ製造業者(E Healthcare, Piscataway, NJ, USA)によって提供されるpH20トランスミッターに連結されたディスポーザブルのオンラインpHプローブを用いて記録された。CO2が重炭酸塩塩基の模擬培地から除去されたので、pHは増加した。オンラインpH計測の精度を検証するために、模擬培地のオフラインのpHが、最初の5分の間毎分、その後、5分毎に測定された。時間に対するオンラインpH測定をプロットすることにより、ベストフィットラインの傾きは、pH変化の割合を提供し、またこれにより、模擬培地からCellbagTMのヘッド空間へのCO2移動の割合を示した。
最初の速いガス移動は、ディスポーザブル型バッグの大きい表面積を作る特性の結果である。この最初のガス移動は、主に揺動条件(揺動速度及び揺動角度)に依存する。しかしながら、培地からのCO2の継続した除去は、ヘッド空間CO2濃度に依存する。ヘッド空間クリアランスの速度は、ガス流量に依存する。
(A.回分培養)
(1.初期実験)
(細胞培養培地)
無血清細胞培養培地が、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を増殖するために使用された。細胞培養培地は、DMEM及びハムF-12の1:1混成に基づく培地を、幾つかの構成要素、例えばアミノ酸、塩類、糖及びビタミンを変更することによって得られた。この培地は、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く。この培地は、15mMのHEPES(4(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)及び2.44g/Lの重炭酸ナトリウムから成った。これらの塩類の濃度は、変更されうる。培地は、微量元素、組換えヒトインスリン及び細胞保護剤、Lutrol F-68 Prill(同等のものが使用されうる)で補充された。
トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、液体窒素に貯蔵された1mL又は10mLのバイアルバンクから増殖された。選択された冷凍バイアルは、スピナーフラスコ、振とうフラスコ、又は撹拌タンクバイオリアクタの、重炭酸ナトリウムを含有する培養培地に解凍された。細胞は、2−7日毎に継代された。この培養は、「シードトレイン」と呼ばれる。シードトレインからの細胞は、ディスポーザブル型バッグにおいて細胞培養を開始するために、ディスポーザブル型バッグへ移された。
血液ガス分析定装置(NOVA BioProfileR 400)が、オフライン分析のために用いられた。細胞培養物pH、溶存酸素及びCO2の分圧、ブドウ糖、乳酸塩及びアンモニアの濃度が、このオフライン分析定装置を使用して測定された。細胞生存率及び生細胞濃度(VCC)測定は、Beckman-Coulter’s ViCellTM AS又はViCellTM XRを使用して成された。細胞濃度測定に加えて、バイオマスの量が、また、血中血球容積(%PCV)を記録することによって測定された。
(A.バッチ・プロセス)
回分培養の過程において、CellbagTMに供給されるガスにおけるCO2濃度を減少させることによって、我々は、最初の高いpH(>7.3)を低下させ、そして、WAVE BioreactorTMシステムのその後のpH低下少を最小化することが可能となる。幾つかのCHO細胞株を用いた、WAVE BioreactorTM回分培養において、異なるCO2ガスストラテジーを試験した後(データは示さない)、我々は、接種及びスケールアップステージ双方に対する、「8-5-2」段階的ストラテジーを規定した:CellbagTMにポンプで送りこまれる空気は、1日目の間8%(v/v)で、2日目の間の5%(v/v)で、その後2%(v/v)でCO2ガスが補充された。
WAVE BioreactorTMでの、潅流培養の我々の最初の試みにおいて、6日目の潅流開始後、培養pHは概して6.8を下回り、DOはしばしば空気飽和の30%を下回った(図5)。潅流流量を上げることなくpH低下を最小化するために、CellbagTMへの空気流量の増加の実施可能性を調査し、これは無細胞研究が、増加空気流量はpHを増加することを示したからである(図3)。DO低下を克服するために、我々は、潅流の開始の2日後に、30%O2(v/v)で、CellbagTMへの気流を補充した。観察されたDO低下(図5)と一致したため、我々はこのタイミングを選択した。
この潅流プロセスは、2つのバッチステップとその後の潅流ステップから成った。50Lのディスポーザブル型バッグは、接種ステップで、5から7.5×105細胞/mLの標的細胞密度で、6Lの作用体積で接種をされた。接種3日後に、スケールアップステップのため、新鮮培地が、ディスポーザブル型バッグの体積を20Lに増加するために加えられた。接種ステップ及びスケールアップステップがバッチステップを構成した。バッチステップでのCO2段階的低減ストラテジーが、バッチプロセスにて説明したように、使用された。3日のスケールアップステップの終りに、潅流が開始された。新鮮培地がディスポーザブル型バッグに連続的に加えられ、そして、細胞を保持すると共に、使用された培養培地はディスポーザブル型バッグから連続的に除去された。細胞培養培地は、1日当たり20リットル(1日当たり1体積)の割合で潅流された。潅流培地pH設定値は7.2単位であった。潅流の開始で、流入ガスのCO2濃度は、ゼロに設定された。ヘッド空間クリアランス速度は、CO2除去を促進するために増加された。図7に示すように、ヘッド空間クリアランス速度の増加は、単ステップ増加もしくはマルチステップ増加が続いた。揺動速度範囲は、19〜25rpmの間であった。揺動角度範囲は、8及び12度の間であった。温度は37℃に維持された。細胞の酸素要求量を満たすために、酸素が、潅流開始の48時間後に補充された。流入ガスにおける酸素濃度は、潅流開始の48時間後で、30%に設定された。
細胞増殖の支持、及び所望の範囲にpH及びDOを維持することにおける、このWAVE BioreactorTMプロセスの信頼性を試験するために、我々のインハウスCHO細胞株で典型的に観察される細胞増殖及び代謝挙動の範囲を包含する、6つのCHO細胞株を選択した。
pH及びDO制御を用いた、発明者のWAVE BioreactorTMプロセスと撹拌タンク・バイオリアクタプロセスとの培養性能を比較するため、我々は両システムにおいて、平行培養を実施した(図9)。増殖長及び生存率プロファイルは、2つのバイオリアクタ・システムの間で類似だった:WAVE BioreactorTM及び撹拌タンク・バイオリアクタにおける増殖率は、〜0.5日−1で同程度であった。WAVE BioreactorTMシステムのpH及びDOのオンライン・フィードバック制御の欠如にもかかわらず、pH及びDOプロファイルは、2つのバイオリアクタ培養間で有意に異ならなかった。
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Claims (43)
- 真核生物細胞を回分培養するための方法において、
重炭酸塩含有培養液中に真核生物細胞を含んでなる細胞培養接種物を、容器に供給する工程であって、
前記容器は、前記細胞培養物及び前記細胞培養物上部の気相ヘッド空間を封入する壁部を有し、かつ前記容器は、前記ヘッド空間に対するガスの流出入を提供する少なくとも一のポートを有する工程;
前記容器を攪拌する工程;及び
前記ポートを通して前記ヘッド空間にガスを供給する工程であって、前記ガスは所定量のCO2を含み、前記ガス中のCO2の前記量は、前記ガスの前記細胞培養物の所定のpHを維持するために、前記細胞培養物の予め定められたpHを維持するために、経時的に調節される工程
を含んでなる方法。 - 前記攪拌が、前記容器を、15から30rpmの揺動速度及び5°から15°の揺動角度で揺動することによる請求項1に記載の方法。
- 揺動速度が19及び25rpmの間であり、揺動角度が8°から12°の間である請求項2に記載の方法。
- 前記CO2が、前記ガスの10%及び0%(v/v)の間の量で供給される請求項1に記載の方法。
- 前記CO2が、前記ガスの8%及び2%(v/v)の間の量で供給される請求項4に記載の方法。
- 前記CO2が、1日目に前記ガスの8%(v/v)の量で、2日目に前記ガスの5%(v/v)の量で、その後は、前記ガスの2%(v/v)の量で供給される請求項5に記載の方法。
- 前記ガスの流量が、0から1.0hvmの間である請求項1に記載の方法。
- 前記ガスの流量が、0.001及び0.002hvmの間である請求項7に記載の方法。
- 前記ガスの流量が、0.007hvmである請求項8に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が、脊椎動物細胞である請求項1に記載の方法。
- 前記脊椎動物細胞が、カエル細胞、ウサギ細胞、齧歯類細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、非ヒト霊長類細胞及びヒト細胞からなる群から選択される請求項10に記載の方法。
- 真核生物細胞を灌流培養するための方法において、
重炭酸塩含有培養液中に真核生物細胞を含んでなる細胞培養接種物を、容器に供給する工程であって、
前記容器は、前記細胞培養物及び前記細胞培養物上部の気相ヘッド空間を封入する壁部を有し、かつ前記容器は、前記ヘッド空間に対するガスの流出入を提供する少なくとも一のポートを有する工程;
前記容器を攪拌する工程;
前記容器に新鮮培地を灌流し、前記容器から使用済み培養培地を除去する工程;及び
前記容器のヘッド空間から蓄積CO2をスイープするために、前記ポートを通して前記ヘッド空間にガスを供給し、これにより、前記細胞培養物の所定pHを維持するために、前記細胞培養物のpHを調節する工程
を含んでなる方法。 - 前記攪拌が、前記容器を、15から30rpmの揺動速度及び5°から15°の揺動角度で揺動することによる請求項12に記載の方法。
- 揺動速度が19及び25rpmの間であり、揺動角度が12°から8°の間である請求項12に記載の方法。
- 前記ガスが、前記ガスの0%及び50%(v/v)の間のO2の量を含む請求項12に記載の方法。
- O2が、前記ガスの20%及び40%(v/v)の間の量で供給される請求項15に記載の方法。
- O2が、1日目及び2日目に前記ガスの0%(v/v)の量において、その後は前記ガスの30%(v/v)の量において提供される請求項12に記載の方法。
- 前記ガスの流量が、0から1.0hvmの間である請求項12に記載の方法。
- 前記ガスの流量が、0.001及び0.03hvmの間である請求項18に記載の方法。
- 前記ガスの流量が、0.02hvmである請求項19に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が脊椎動物細胞である請求項12に記載の方法。
- 前記脊椎動物細胞が、カエル細胞、ウサギ細胞、齧歯類細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、非ヒト霊長類細胞及びヒト細胞からなる群から選択される請求項21に記載の方法。
- 前記容器が、硬質コンテイナである請求項1又は12に記載の方法。
- 前記容器が、柔質コンテイナである請求項1又は12に記載の方法。
- 前記容器が、ディスポーザブル培養バッグである請求項24に記載の方法。
- 細胞培養物のpHを連続的に又は断続的にモニタするための、pHモニタを更に含んでなる請求項1又は12に記載の方法。
- 前記細胞培養のpHを調節するために、前記新鮮培養培地が、予め定められたpHを有する請求項12に記載の方法。
- 前記新鮮培養培地の潅流が、前記培養培地での細胞の残留を可能にする潅流機器を介して実施される請求項12に記載の方法。
- 細胞培養物が溶存CO2の分圧を約1から200mmHgのレベルに維持するように、前記ガスが、前記ヘッド空間に供給される請求項1に記載の方法。
- 細胞培養物が溶存CO2の分圧を約10から150mmHgのレベルに維持するように、前記ガスが、前記ヘッド空間に供給される請求項29に記載の方法。
- 細胞培養物が溶存CO2の分圧を約20から120mmHgのレベルに維持するように、前記ガスが、前記ヘッド空間に供給される請求項30に記載の方法。
- 細胞培養物が溶存CO2の分圧を約20から80mmHgのレベルに維持するように、前記ガスが、前記ヘッド空間に供給される請求項1に記載の方法。
- 真核生物細胞を培養するための装置において、
容器の内部空間を画成し、前記内部空間を周囲の環境から隔離する壁部を有する容器;
前記容器に対するガスの流出入を提供する少なくとも一つのポート;
前記容器に可逆的に取付けられたアジテータ;及び
場合によっては、前記内部空間に位置させられたプローブを有するpHモニタ
を具備してなる装置。 - 前記容器が、ディスポーザブル型バイオリアクタバッグである請求項33に記載の装置。
- 前記容器が、該容器に対するガスの流出入を提供する複数のポートを有する請求項33に記載の装置。
- 前記容器が、前記容器から使用済み培地を除去するための使用済み培地ポートと、前記容器に新鮮培地を提供する潅流ポートを更に有する請求項33に記載の装置。
- 前記pHモニタが、コンピュータ化された自動化システムに接続され、該システムが、前記容器のヘッド空間クリアランスを調節し、前記pHモニタで測定されるpHの調節に応答して前記容器中のCO2濃度を調節する請求項33に記載に装置。
- ガス流、温度、攪拌、新鮮培地の潅流流量、及び溶存CO2からなる群から選択されるパラメータをモニタするための、少なくとも一つの他のモニタを更に具備してなる請求項37に記載の装置。
- 真核生物細胞を回分培養するための方法において、
重炭酸塩含有培養液中に真核生物細胞を含んでなる細胞培養接種物を、容器に供給する工程であって、
前記容器は、前記細胞培養物及び前記細胞培養物上部の気相ヘッド空間を封入する壁部を有し、かつ前記容器は、前記ヘッド空間に対するガスの流出入を提供する少なくとも一のポートを有する工程;
前記容器を攪拌する工程;及び
前記ポートを通して前記ヘッド空間にガスを供給する工程であって、前記ガスは、1日目の間は8%のCO2(v/v)のガスを、2日目には5%のCO2(v/v)のガスを、その後は2%のCO2(v/v)のガスを含む工程
を含んでなる方法。 - 前記容器が、21から23rpmの揺動速度で、ロッカー上で攪拌される請求項39に記載の方法。
- 前記容器が、8から12°の揺動角度で、ロッカー上で攪拌される請求項39に記載の方法。
- 前記容器が、10°の揺動角度で、ロッカー上で攪拌される請求項41に記載の方法。
- 真核生物細胞を灌流培養するための方法において、
重炭酸塩含有培養液中に真核生物細胞を含んでなる細胞培養接種物を、容器に供給する工程であって、
前記容器は、前記細胞培養物及び前記細胞培養物上部の気相ヘッド空間を封入する壁部を有し、かつ前記容器は、前記ヘッド空間に対するガスの流出入を提供する少なくとも一のポートを有する工程;
前記容器を攪拌する工程;
前記ポートを通して前記ヘッド空間にガスを供給する工程であって、前記ガスは、灌流の開始2日後に、少なくとも30%O2(v/v)で補充される工程
を含んでなる方法。
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