CN106795495A - 灌注培养方法及其用途 - Google Patents

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J·杨
Y·杨
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Abstract

本发明提供培养哺乳动物细胞的方法和利用这些培养方法的多种方法。还提供多孔细胞培养板用于例如灌注培养方法中。

Description

灌注培养方法及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求保护2014年6月6日提交的美国临时专利申请系列号62/009,058的优先权，其全部内容在本文通过提述并入。
技术领域
本发明涉及分子生物学方法、细胞培养工艺开发方法和重组蛋白的制造方法。
背景
含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞经常用于生产治疗上或商业上重要的蛋白质。虽然数种高通量(high throughput，HT)的细胞培养系统已在生物技术工业中用于补料分批方法数年，但是没有已知存在的使用多孔板用于基于灌注的细胞培养的HT模型。
概述
本发明(至少部分上)基于如下发现：在多孔板中以本文描述的具体方式培养哺乳动物细胞导致实质性改进的活细胞密度和重组蛋白产生，并提供了大规模灌注、生产生物反应器中培养表现的精确模型。鉴于这一发现，本文提供培养哺乳动物细胞的方法、产生重组蛋白的方法和用于测试制备重组蛋白的制造工艺的方法。还提供多孔细胞培养板系统，其能够用于例如实施任何本文所述的方法。
本发明提供培养哺乳动物细胞的方法，其包括：提供多孔板，所述多孔板包含至少一个含有置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的孔，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌将所述多孔板温育一段时间；和在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。在这些方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这些方法的一些实施方案中，所述CHO细胞含有编码重组蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白)的核酸。
还提供产生重组蛋白的方法，其包括：提供多孔板，所述板包含至少一个包含置于第一液体培养基中的一哺乳动物细胞的孔，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积，并且所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌将所述多孔板温育一段时间；在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；和从所述哺乳动物细胞或从所述第一或第二培养基回收所述重组蛋白。在这些方法的一些实施方案中，所述重组蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白)回收自所述哺乳动物细胞。在这些方法的一些实施方案中，所述重组蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)回收自所述第一或第二液体培养基。
还提供用于测试用于制备重组蛋白的制造工艺的方法，其包括：提供一多孔板，其包含至少一个包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的孔，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积，并且所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌将所述多孔板温育一段时间；在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测所述哺乳动物细胞中或所述第一或第二液体培养基中的所述重组蛋白；和将所述哺乳动物细胞中或所述第一或第二液体培养基中存在的重组蛋白的量与重组蛋白的参考水平进行比较。在这些方法的一些实施方案中，所述重组蛋白的参考水平是使用不同的培养方法产生的重组蛋白的水平。在这些方法的一些实施方案中，所述不同培养的方法利用不同的第一或第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的温度、不同的搅拌水平或不同的多孔板。在这些方法的一些实施方案中，所述不同的培养方法利用不同的原材料、抗结块剂或化学上限定的液体培养基。在一些实施方案中，这些方法用于例如进行高通量细胞培养实验来执行实验设计(design-of-experiment；DOE)或质量源于设计(quality-by-design；QDB)研究。在这些方法的一些实施方案中，在所述第一或第二液体培养基中检测所述重组蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)。在这些方法的一些实施方案中，在所述细胞中检测所述重组蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白)。
在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述第一体积的第一液体培养基基本上不含哺乳动物细胞。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述第一液体培养基占据约10％至约60％的孔体积。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述旋转搅拌为约320RPM至约400RPM。在本文描述的任何方法中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基同时进行。在本文描述的任何方法中，去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基连续或周期性进行。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积随时间增加。
在本文描述的任何方法的一些实施方案中，将所述多孔板温育超过7天的一段时间，并且在温育的第1至3天中的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约50％；在培养的第4至6天中的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约40％至约70％；并且从培养的第7天起的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约90％至约150％。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述孔具有约1mL至约18mL的体积(例如，约1mL至约7mL或约1mL至约3.5mL)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板是深孔板(deep-well plate)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中所述孔的底部直径为约6.0mm至约35mm(例如，约12mm至约50mm)。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述孔的高度为约12mm至约50mm。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞悬浮在约150μL至约15mL(例如，约150μL至约10mL，约150μL至约5mL或约150μL至约150μL)的第一培养基中。
在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上限定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质培养基。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在约最初的24至48小时的时间段之后，在每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约150％。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，在去除所述第一体积的第一液体培养基之前，使搅拌中止至少30秒的一段时间。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板用透气性抛弃式膜或透气性硅酮层(gas-permeable silicone layer)密封。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述孔具有平底或圆底。
本文描述的任何方法的一些实施方案包括周期性地添加额外体积的第二液体培养基至多个孔中的每个，从而抵消因蒸发所致的第一液体培养基体积的任何减少。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，去除第一体积的第一液体培养基和向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基使用自动化设备进行。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板是本文描述的任何多孔细胞培养板系统。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述方法在孔中产生15x106细胞/mL至60x106细胞/mL的活细胞密度。
还提供培养哺乳动物细胞的方法，其包括：在梯度灌注方法中培养悬浮在置于多孔板的孔中的液体培养基中的哺乳动物细胞，所述培养条件为在所述培养基中产生的流体剪切力(fluid sheer force)和溶解氧(O2)浓度与在占据具有约6.0mm至约35mm的直径和约40mm至约50mm的高度的方底孔约15％至约25％体积的培养基中当所述方底孔在约31℃至约40℃的温度温育并且以约320转每分钟(RPM)至约360RPM的频率旋转搅拌时所实现的基本上相同。在这些方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，含有编码重组蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白)的核酸的CHO细胞)。
还提供产生重组蛋白的方法，其包括：在梯度灌注方法方法中培养悬浮在置于多孔板的孔中的液体培养基中的哺乳动物细胞，所述培养条件为在所述培养基中产生的流体剪切力和溶解氧(O2)浓度与在占据具有约6.0mm至约35mm的直径和约40mm至约50mm的高度的方底孔约15％至约25％体积的培养基中当所述方底孔在约31℃至约40℃的温度温育并且以约320转每分钟(RPM)至约360RPM的频率旋转搅拌时所实现的基本上相同；和从所述哺乳动物细胞或所述液体培养基回收所述重组蛋白。在任何这些方法的一些实施方案中，所述重组蛋白(例如，免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白)回收自所述哺乳动物细胞。在任何这些方法的一些实施方案中，所述重组蛋白(例如，分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白)回收自所述液体培养基。在这些方法的一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板选自6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板是深孔板。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述液体培养基选自下组：化学上限定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质培养基。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板用透气性抛弃式膜或透气性硅酮层密封。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板包含具有平底或圆底的孔。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述多孔板是本文描述的多孔细胞培养板系统之一。在本文描述的任何方法的一些实施方案中，所述培养在孔中产生15x106细胞/mL至60x106细胞/mL的活细胞密度。
还提供多孔细胞培养板系统，其包括：一体支持板(unitary support plate)，其包含包括多个孔(aperture)的第一平面；置于所述支持板内并配置以放置在体积方面具有约200μL至约18mL体积的细胞培养物的多个培养容器，其中每个孔与每个培养容器配对并且限定进入每个培养容器中的开口，并且其中每个培养容器进一步包含至少一个配置用于容纳流入和/或流出所述培养容器的流体流的端口。在本文描述的任何系统的一些实施方案中，配置所述一体支持板以包含用于放置液体和向所述端口供应液体的贮液器。在本文描述的任何系统的一些实施方案中，所述培养容器包含至少第一和第二端口，其中配置所述第一端口以容纳流体的单向流流入所述培养容器，并且配置所述第二端口以容纳流体的单向流流出所述培养容器。在本文描述的任何系统的一些实施方案中，所述端口包含配置用于选择性防止细胞流入和流出所述培养容器的过滤器。在本文描述的任何系统的一些实施方案中，所述第一和第二端口各自包含配置以选择性防止细胞流入和流出所述培养容器的过滤器。本文描述的任何系统的一些实施方案进一步包含至少一个置于所述一体支持板内并且与所述端口流体连接的导管，其中配置所述导管以使流体流至和/或流自所述培养容器。本文描述的任何系统的一些实施方案进一步包含至少一个与至少一个端口可操作地连接的流体流调节器。本文描述的任何系统的一些实施方案进一步包含至少一个与至少一个导管可操作地连接的流体流量计。
如用于本文，名词前的词语“一”代表一个或多个该特定名词。例如，短语“(一个)哺乳动物细胞”代表“一个或多个哺乳动物细胞”。
术语“哺乳动物细胞”意为任何来自或源自任何哺乳动物(例如，人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、牛或兔)的细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是分化细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是未分化细胞。
术语“第0天”意为将哺乳动物细胞接种到第一液体培养基中的时间点。
术语“第1天”意为在将哺乳动物细胞接种到第一液体培养基中后在第0天与约24个小时之间的时间段。
术语“第2天”意为在将哺乳动物细胞接种到第一液体培养基中后在约24小时至约48个小时之间的时间段。
术语“第3天”意为在将哺乳动物细胞接种到第一液体培养基中后在约48小时至约72个小时之间的时间段。
术语“第4天”意为在将哺乳动物细胞接种到第一液体培养基中后在约72小时至约96个小时之间的时间段。对于每多一天的术语(“第5天”、“第6天”、“第7天”等)意为从紧邻的前一天结束起范围在额外约24小时期间的时间段。
术语“基本上不含”意为至少或约90％不含(例如，至少或约95％、96％、97％、98％，或至少或约99％不含或约100％不含)特定物质(例如，哺乳动物细胞)的组合物。
术语“0.5x体积”意为体积的约50％。术语“0.6x体积”意为体积的约60％。类似地，0.7x、0.8x、0.9x和1.0x分别意为体积的约70％、80％、90％，或100％。
术语“培养”或“细胞培养”意为在一组受控的物理条件下哺乳动物细胞的维持或生长。
术语“液体培养基”意为含有允许哺乳动物细胞在体外生长的充足营养物的流体。例如，液体培养基可含有下列一种或多种：氨基酸(例如，20种氨基酸)、嘌呤(例如，次黄嘌呤)，嘧啶(例如，胸苷)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸苷、氰钴胺素、丙酮酸(盐)、硫辛酸、镁、葡萄糖、钠、钾、硫酸铁、硫酸铜、硫酸锌和碳酸氢钠。在一些实施方案中，液体培养基可含有来自哺乳动物的血清。在一些实施方案中，液体培养基不含血清或另一种来自哺乳动物的提取物(确定的液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可含有痕量金属、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的非限制性实例在本文中描述。液体培养基的另外的实例是本领域已知的，并且是市售的。液体培养基可含有任何密度的哺乳动物细胞。例如，如本文所使用的，从孔中去除的第一体积的第一培养基可基本上不含哺乳动物细胞。
术语“第一液体培养基”意为适合用于哺乳动物细胞培养的一定体积的液体培养基。
术语“第二液体培养基”意为在第一和第二液体培养基进行任何混合之前与一定体积的第一液体培养基分开的适合用于哺乳动物细胞培养的一定体积的液体培养基。
术语“无动物来源组分的液体培养基”意为不含任何源自哺乳动物的组分(例如，蛋白质或血清)的液体培养基。
术语“无血清液体培养基”意为不含哺乳动物血清的液体培养基。
术语“含血清液体培养基”意为含有哺乳动物血清的液体培养基。
术语“化学上限定的液体培养基”意为其中全部化学成分均已知的液体培养基。例如，化学上限定的液体培养基不含胎牛血清、牛血清白蛋白、或人血清白蛋白，因为这些制备物通常含有白蛋白和脂质的复杂混合物。
术语“无蛋白质液体培养基”意为不含任何蛋白质(例如，任何可检测蛋白)的液体培养基。
术语“搅拌”意为为了增加液体培养基中的溶解O2浓度而使含有至少一个包含所述液体培养基的孔的多孔板进行的运动。搅拌，如旋转搅拌，可以使用任何本领域已知方法进行，例如，以圆形或椭圆形移动多孔板的设备，如旋转振荡器(rotary shaker)。能够用于搅拌多孔板的示例性装置在本文描述。这些装置的其他实例是本领域已知的，并且是市售的。
术语“免疫球蛋白”意为含有免疫球蛋白的至少15个氨基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)的氨基酸序列的多肽(例如，可变结构域序列、框架序列或恒定结构域序列)。例如，免疫球蛋白可包括轻链免疫球蛋白的至少15个氨基酸，例如重链免疫球蛋白的至少15个氨基酸。免疫球蛋白可为分离的抗体(例如，IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)。免疫球蛋白可为IgG的亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可以是抗体片段，例如，Fab片段、F(ab′)2片段或scFv片段。免疫球蛋白也可以是双特异性抗体或三特异性抗体，或二聚体、三聚体或多聚体抗体，或双抗体、或免疫球蛋白还可为含有至少一个免疫球蛋白结构域的工程化蛋白(例如，融合蛋白)。免疫球蛋白的非限制性实例在本文描述，并且免疫球蛋白的其他实例是本领域已知的。
术语“蛋白片段”或“多肽片段”意为多肽序列的一部分，其长度为至少或约4个氨基酸、至少或约5个氨基酸、至少或约6个氨基酸、至少或约7个氨基酸、至少或约8个氨基酸、至少或约9个氨基酸、至少或约10个氨基酸、至少或约11个氨基酸、至少或约12个氨基酸、至少或约13个氨基酸、至少或约14个氨基酸、至少或约15个氨基酸、至少或约16个氨基酸、至少或约17个氨基酸、至少或约18个氨基酸、至少或约19个氨基酸或至少或约20个氨基酸，或长度超过20个氨基酸。重组蛋白片段可使用任何本文描述的方法产生。
术语“工程化蛋白”意为不是由生物体(例如，哺乳动物)内存在的内源核酸天然编码的多肽。工程化蛋白的实例包括酶(例如，具有导致工程化的酶的稳定性和/或催化活性增加的一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加)、融合蛋白、抗体(例如，二价抗体、三价抗体或双抗体)和包含至少一种重组支架序列的抗原结合蛋白。
术语“流体剪切力”意为由与表面(例如，细胞的表面或孔的表面)大致上平行流动的液体引起的应力。流体剪切力通常被定义为所施加的力除以材料的截面积和与施加的力向量平行的面积。计算流体剪切力的示例性方法在本文中描述并且是本领域已知的。
术语“溶解O2浓度”或“溶解氧浓度”意为氧气溶解在液体培养基中的量(例如，任何本文描述的或本领域已知的液体培养基)。非限制性的用于测量液体培养基中溶解O2浓度的方法在本文中描述，并且其它的方法是本领域已知的。
术语“回收”意为从细胞培养基中存在的一种或多种其他组分(例如，哺乳动物细胞或培养基蛋白质)或哺乳动物细胞裂解物中存在的一种或多种其他组分(例如，DNA，RNA或其他蛋白质)部分地纯化或分离(例如，按重量计至少或约5％，例如，至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或至少或约95％纯的)重组蛋白。用于从液体培养基或从哺乳动物细胞裂解物回收蛋白质的非限制性方法在本文中描述，并且其它的方法是本领域已知的。
术语“分泌的蛋白”或“分泌的重组蛋白”意为这样的蛋白质或重组蛋白，当其在哺乳动物细胞内被翻译时原始含有至少一个分泌信号序列，并且在哺乳动物细胞中(至少部分)通过酶促切割分泌信号序列释放到胞外空间(例如，液体培养基)中。
短语“梯度灌注”指在培养期间的时间段内(例如，约24小时的时间段、约1分钟至约24小时的时间段或超过24小时的时间段)去除和添加的培养基体积的增量变化(例如，增加或减少)(例如，每日的培养基再补料速率)。例如，梯度灌注方法的一个实施方案可能需要如下的再补料方案：第1-3天约0.5x反应器体积的培养基(RV)/天的再补料，第4-6天约0.7x RV/天的再补料，并且第7天起约1.0x RV/天的再补料。这个特定实例可在具有某些再补料速率的天数方面和/或在任何特定的24小时时间段内的再补料速率方面有所变化。每天去除和替换的培养基所占分数可根据培养的特定细胞、初始接种密度和特定时间的细胞密度而改变。“RV”或“反应器体积”意为在培养过程开始时存在的培养基体积(例如，接种之后的培养基总体积)。
术语“补料分批培养”意为向初始细胞培养物递增或连续添加第二液体培养基，而不实质或显著地从细胞培养物去除第一液体培养基。在补料分批培养的一些实施方案中，所述第二液体培养基与所述第一液体培养基相同。在补料分批培养的一些实施方案中，所述第二液体培养基浓缩自所述第一液体培养基。在补料分批培养的一些实施方案中，所述第二液体培养基作为干粉添加。
“比生产率(specific productivity rate)”或“SPR”如用于本文指每天每个哺乳动物细胞产生的重组蛋白的量或酶活性。重组抗体的SPR通常作为量/细胞/天测量。重组酶的SPR通常作为单位/细胞/天或(单位/量)/细胞/天测量。
“体积生产率”或“VPR”如用于本文指每天每体积的培养物(例如，每L的生物反应器、容器或管体积)产生的重组蛋白的质量或酶活性。重组抗体的VPR通常作为量/L/天测量。重组酶的VPR通常作为单位/L/天或量/L/天测量。
术语“微载剂”意为具有20μm至约1000μm的尺寸的颗粒(例如，有基聚合物)，其含有容许性(permissive)的表面或促进哺乳动物细胞的附着(例如，本文描述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞)。微载剂可含有一个或多个孔(例如，具有约10μm至约100μm平均直径的孔)。微载剂的非限定性实例在本文描述。微载剂的其他实例是本领域已知的。例如，微载剂可含有聚合物(例如，纤维素、聚乙二醇或聚乳酸-羟基乙酸共聚物)。
除非另行限定，本文使用的科技术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本文描述了用于本发明中的用途的方法和材料；也可使用其他本领域已知的合适的方法和材料。所述材料、方法和实例仅为说明性的而不意图进行限制。本文提及的全部出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过提述以其整体并入。如有冲突，以包括定义在内的本发明说明书为准。
本发明的其他特征和优势从如下详述和附图以及从权利要求中将是显而易见的。
附图说明
图1是示例性多孔板系统的顶视图的示意图。
图2是示例性多孔板系统的侧视图的示意图。
图3是另一多孔板系统的侧视图的示意图。
图4是另一多孔板系统的侧视图的示意图。
图5是在历时两天的细胞灌注中的活细胞密度图，所述细胞灌注培养在含有10-mL培养基并以160RPM搅拌的50-mL摇管中或含有200μL或300μL培养基并以330RPM搅拌的圆底96深孔板中，并且以不同分批再补料速率培养。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图6是细胞灌注的两天培养物的终点活细胞密度图，所述培养物培养在含有200μL或300μL培养基并以330RPM搅拌的圆底96深孔板中，并且以不同分批再补料速率培养(2x0.5反应器体积/天或1反应器体积/天)。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图7是细胞灌注的11天培养物的百分比细胞活力图，所述培养物培养在含有300μL培养基并以360RPM搅拌的圆底96深孔板中，或在含有10mL培养基并以160RPM搅拌的摇管中。误差棒表示n＝2的标准偏差(对于振荡烧瓶培养物)和n＝8的标准偏差(对于圆底96深孔板培养物)。
图8是细胞灌注的11天培养物的活细胞密度，所述培养物培养在含有300μL培养基并以360RPM搅拌的圆底96深孔板中，或在含有10mL培养基并以160RPM搅拌的摇管中。误差棒表示n＝2的标准偏差(对于振荡烧瓶培养物)和n＝8的标准偏差(对于圆底96深孔板培养物)。
图9是在修改的再补料速率方案中和对照再补料速率方案中15天培养的每一天所用的再补料速率(以反应器体积表示)图。
图10是在含有200μL、300μL或500μL培养基、以330RPM或360RPM搅拌并使用Applikon系统或抛弃式膜密封的方底或圆底96深孔板中培养的；或在对照摇管中培养的细胞随时间的活细胞密度图。误差棒表示n＝3的标准偏差。
图11是在含有200μL、300μL或500μL培养基、以330RPM或360RPM搅拌并使用Applikon系统或抛弃式膜密封的方底或圆底96深孔板中培养的；或在对照摇管中培养的细胞随时间的活细胞百分比图。误差棒表示n＝3的标准偏差。
图12是在含有200μL、300μL或500μL培养基、以330RPM或360RPM搅拌并使用Applikon系统或抛弃式膜密封的方底或圆底96深孔板中培养的；或在对照摇管中培养的细胞随时间的活细胞密度图。误差棒表示n＝3的标准偏差。
图13是在含有200μL、300μL或500μL培养基、以330RPM或360RPM搅拌并使用Applikon系统或抛弃式膜密封的方底或圆底96深孔板中培养的；或在对照摇管中培养的细胞随时间的活细胞百分比图。误差棒表示n＝3的标准偏差。
图14是在含有300μL或500μL培养基并以320RPM、330RPM或340RPM搅拌的方底96深孔板中培养的；或在对照摇管中培养的细胞随时间的活细胞密度图。误差棒表示n＝3的标准偏差。
图15是在含有100μL、200μL或300μL CD CHO培养基并以320RPM、340RPM或360RPM搅拌的圆底96深孔板中培养的细胞，或在摇管(带有使用对照再补料速率或修改的再补料速率进行的培养基灌注)中培养的细胞随时间的活细胞密度图。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图16是在含有200μL、400μL或600μL CD CHO培养基并以320RPM、340RPM或360RPM搅拌的方底96深孔板中培养的细胞，或在摇管(带有使用对照再补料速率或修改的再补料速率进行的培养基灌注)中培养的细胞随时间的活细胞密度图。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图17是在含有100μL、200μL或300μL CD CHO培养基并以320RPM、340RPM或360RPM搅拌的圆底96深孔板中培养的细胞，或在摇管(带有使用对照再补料速率或修改的再补料速率进行的培养基灌注)中培养的细胞的整体/积分的活细胞密度图。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图18是在含有200μL、400μL或600μL CD CHO培养基并以320RPM、340RPM或360RPM搅拌的方底96深孔板中培养的细胞，或在摇管(带有使用对照再补料速率或修改的再补料速率进行的培养基灌注)中培养的细胞的整体/积分的活细胞密度图。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图19是在含有100μL、200μL或300μL CD CHO培养基并以320RPM、340RPM或360RPM搅拌的圆底96深孔板中培养的细胞，或在摇管(带有使用对照再补料速率或修改的再补料速率进行的培养基灌注)中培养的细胞的体积生产率图。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图20是在含有200μL、400μL或600μL CD CHO培养基并以320RPM、340RPM或360RPM搅拌的方底96深孔板中培养的细胞，或在摇管(带有使用对照再补料速率或修改的再补料速率进行的培养基灌注)中培养的细胞的体积生产率图。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图21是在含有100μL、200μL或300μL CD CHO培养基并以320RPM、340RPM或360RPM搅拌的圆底96深孔板中培养的细胞，或在摇管(带有使用对照再补料速率或修改的再补料速率进行的培养基灌注)中培养的细胞的比生产率图。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图22是在含有200μL、400μL或600μL CD CHO培养基并以320RPM、340RPM或360RPM搅拌的方底96深孔板中培养的细胞，或在摇管(带有使用对照再补料速率或修改的再补料速率进行的培养基灌注)中培养的细胞的比生产率图。误差棒表示n＝2的标准偏差。
图23是实时数据拟合至活细胞密度的模型预测的图。
图24是实时数据拟合至体积生产率的模型预测的图。
图25是一组12幅图，显示了基于输入考虑了标准偏差的统计学模型的经验数据的最佳操作条件。
图26是产生重组单克隆抗体的哺乳动物细胞系在置于方底96深孔板中并以330RPM的频率搅拌的500μL的多种不同培养基之一中的活细胞密度概貌图。对照数据代表CD CHO培养基。
图27是产生重组酶的哺乳动物细胞系在置于方底96深孔板中并以330RPM的频率搅拌的活细胞密度概貌图。对照数据代表CD CHO培养基。
图28是产生重组单克隆抗体的哺乳动物细胞系在置于方底96深孔板中并以330RPM的频率搅拌的500μL的多种不同培养基之一中的培养物的滴度/效价(mg/mL)图。对照数据代表CD CHO培养基。
图29是产生重组酶的哺乳动物细胞系在置于方底96深孔板中并以330RPM的频率搅拌的500μL的多种不同培养基之一中的培养物的滴度/效价(mg/mL)图。对照数据代表CDCHO培养基。
详述
本文提供在多孔板中培养哺乳动物细胞的改进的方法。所述培养方法可以实现与较大规模生产灌注生物反应器所实现的类似的活哺乳动物细胞浓度(例如，在液体培养基，例如第一液体培养基，或第一和第二液体培养基的组合中)，例如，大于10x106细胞/mL、大于15x106细胞/mL、大于20x106细胞/mL、大于25x106细胞/mL、大于30x106细胞/mL、大于35x106细胞/mL、大于40x106细胞/mL、大于45x106细胞/mL、大于50x106细胞/mL、大于55x106细胞/mL或大于60x106细胞/mL的哺乳动物细胞密度。例如，所述培养方法能够产生10x106细胞/mL至70x106细胞/mL、10x106细胞/mL至65x106细胞/mL、10x106细胞/mL至60x106细胞/mL、10x106细胞/mL至50x106细胞/mL、10x106细胞/mL至40x106细胞/mL、10x106细胞/mL至30x106细胞/mL、15x106细胞/mL至70x106细胞/mL、15x106细胞/mL至65x106细胞/mL、15x106细胞/mL至60x106细胞/mL、15x106细胞/mL至55x106细胞/mL、15x106细胞/mL至50x106细胞/mL、15x106细胞/mL至45x106细胞/mL、15x106细胞/mL至40x106细胞/mL、15x106细胞/mL至35x106细胞/mL、20x106细胞/mL至70x106细胞/mL、20x106细胞/mL至65x106细胞/mL、20x106细胞/mL至60x106细胞/mL、20x106细胞/mL至55x106细胞/mL、20x106细胞/mL至50x106细胞/mL、20x106细胞/mL至45x106细胞/mL、20x106细胞/mL至40x106细胞/mL、25x106细胞/mL至70x106细胞/mL、25x106细胞/mL至65x106细胞/mL、25x106细胞/mL至60x106细胞/mL、25x106细胞/mL至55x106细胞/mL、25x106细胞/mL至50x106细胞/mL、25x106细胞/mL至45x106细胞/mL、30x106细胞/mL至70x106细胞/mL、30x106细胞/mL至65x106细胞/mL、30x106细胞/mL至60x106细胞/mL、30x106细胞/mL至55x106细胞/mL、30x106细胞/mL至50x106细胞/mL、35x106细胞/mL至70x106细胞/mL、35x106细胞/mL至65x106细胞/mL、35x106细胞/mL至60x106细胞/mL、35x106细胞/mL至55x106细胞/mL、40x106细胞/mL至70x106细胞/mL、40x106细胞/mL至65x106细胞/mL、40x106细胞/mL至60x106细胞/mL、40x106细胞/mL至55x106细胞/mL、45x106细胞/mL至70x106细胞/mL或45x106细胞/mL至65x106细胞/mL的活哺乳动物细胞浓度。多种不同的方法可以用于测定细胞密度或活细胞密度。例如，可以将细胞培养物的样品在生理缓冲液中稀释，将稀释的细胞悬浮液置于血细胞计数器中，并使用光学显微术计数细胞。在另一方法中，活细胞密度可以使用类似的方法确定，但在生理缓冲液中包括染料，所述染料被非存活细胞选择性地摄取(例如，锥虫蓝(trypan blue)，如来自Beckman Coulter的Vi-CELL方法(见Beckman Coulter网站))。在又另一实例中，细胞密度或活细胞密度可以使用荧光辅助流式细胞术(例如，来自Merck Millipore的GUAVA(参见Millipore网站))和其他细胞计数方法确定。
在一些实施方案中，所述培养方法产生显著改进的比生产率。例如，本文提供的方法实现的比生产率与在基本上相同的培养条件下、但不去除某个体积的第一培养基并添加第二体积的第二培养基所实现的比生产率相比是至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍大。本发明的方法实现的生产力可以是至少10,000单位/L、至少15,000单位/L、至少约20,000单位/L、至少约25,000单位/L、至少约30,000单位/L、至少约35,000单位/L或至少约40,000单位/L(在所述第一和/或第二液体培养基中)。在一些实施方案中，本发明的方法实现的生产力可以是至少1g/L、至少1.5g/L、至少2.0g/L、至少2.5g/L、至少3.0g/L、至少4.0g/L、至少4.5g/L或至少5.0g/L。
重组蛋白的生物活性可使用本领域已知的多种方法评估，并且会依赖于特定重组蛋白的活性。例如，作为免疫球蛋白(例如，抗体或抗体片段)的重组蛋白的生物活性可以通过测量所述抗体与其特异性表位的亲和力来测定(例如，使用Biocore或竞争性酶联吸附测定法)。所述重组蛋白可为酶(例如，重组半乳糖苷酶，例如，重组α-半乳糖苷酶)，而生物活性可通过测量酶的活性测定(例如，通过测量可检测底物的浓度的减少或可检测产物的浓度的增加(例如，使用分光光度法或光发射)来测定酶的催化速率常数)。例如，重组半乳糖苷酶的生物活性可通过测量神经酰胺三己糖苷(globotriasylceramide)(GL-3)或半乳糖二糖基神经酰胺(galabiosylceramide)水平的减少，或神经酰胺二己糖苷或半乳糖水平的增加来检测。
还提供能够用于进行例如本文描述的任何方法的多孔细胞培养板系统。
用于测试制造工艺的方法
本文还提供用于测试制备重组蛋白(例如，本文所述的或本领域已知的任何重组蛋白)的制造工艺的方法。这些方法包括实施本文所述的产生重组蛋白的方法，在所述方法的过程中和/或在那之后，检测或测量至少一种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种或十四种)培养读数(例如，细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白量、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸产生、体积生产率、比生产率、从葡萄糖产生乳酸的产率、谷氨酰胺浓度、谷氨酸浓度、培养基的pH、溶解CO2的分压或浓度、溶解O2的分压或浓度、代谢物质量转移和代谢物质量平衡)；并将所述至少一种培养读数与所述至少一种(例如，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或十三种)培养读数的参照水平(例如，细胞中或第一和/或第二培养基中存在的(例如，检测的)重组蛋白量、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸产生、体积生产率、比生产率、从葡萄糖产生乳酸的产率、谷氨酰胺浓度、谷氨酸浓度、培养基的pH、溶解CO2的分压或浓度、溶解O2的分压或浓度、代谢物质量转移和代谢物质量平衡的参照水平)进行比较。
熟练的操作者会理解本文描述的多种培养参数中的任何参数(例如，多孔板、体积、替代培养液体积的速率或频率、搅拌频率、温度、培养基、CO2浓度和反应器角度)能够以任何组合使用以实施这些方法。另外，本文描述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞可用于所述方法中。
至少一种培养读数(例如，细胞中或第一和/或第二培养基中存在的(例如，细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白量、葡萄糖消耗、活细胞浓度、乳酸产生、体积生产率、比生产率、从葡萄糖产生乳酸的产率、谷氨酰胺浓度、谷氨酸浓度、培养基的pH、溶解CO2的分压或浓度、溶解O2的分压或浓度、代谢物质量转移和代谢物质量平衡)的参照水平可为使用不同培养方法产生的水平，所述培养方法例如利用至少一种不同的培养参数(例如，不同的第一和/或第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的频率和/或搅拌类型、不同的多孔板、不同的分批再补料或灌注速率(例如，在24小时时间段或其他递增的时间段内10％至200％的孔体积或第一液体培养基体积)和任何其他本文描述的培养参数)的培养方法。例如，重组蛋白的参照量可为使用一组产生不同水平的溶解O2和/或不同水平的液体剪切应力的培养参数产生的重组蛋白水平。
本文描述的方法可用于测试制造方法的任何组分或特征的效果。例如，本文描述的方法可用于测试不同的原料、搅拌水平、多孔板、抗结块剂、培养基(例如，化学上限定的培养基)或营养元素或化合物对至少一种培养读数的作用(例如，本文描述的任何培养读数，例如，对重组蛋白产生和/或哺乳动物细胞生长的效果)。例如，本文提供测试第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原始成分或补充剂或哺乳动物细胞的来源用于在产生重组蛋白的方法中的用途的效力的方法，所述方法包括提供包含至少一个包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的孔的多孔板，所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积；在约31℃至约40℃并伴随约320RPM至约500RPM旋转搅拌将所述多孔板温育一段时间；在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测或测定至少一种培养读数(例如，本文描述的任何培养读数，例如，细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白的量)；将所述至少一种培养读数与通过不同培养方法产生的该至少一种培养读数(例如，本文描述的任何培养读数，例如，细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白的量)的参照水平比较，所述不同培养方法使用不同的第一或第二液体培养基或不同的哺乳动物细胞来源中的一种或多种；并将与所述至少一种培养读数相较于参照水平的有利变化(例如，增加或减少)(例如，增加的重组蛋白量)相关的第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的原始成分或补充剂或哺乳动物细胞来源鉴定为对于在产生重组蛋白的方法中的使用而言是有效的。例如，相较于参照水平的重组蛋白水平的增加、活细胞浓度的增加、体积生产率的增加、比生产率的增加和葡萄糖消耗的增加指示该第一或第二液体培养基、第一或第二液体培养基中存在的该原始成分或补充剂或该哺乳动物细胞来源对于在产生重组蛋白的方法中的使用而言是有效的。
本文描述的方法还可用于测试改变本文描述的或本领域已知的多种细胞培养参数(例如，孔的体积、高度、直径或底部形状、搅拌的频率或类型、剪切力、培养接种密度、第一或第二液体培养基的pH、溶解O2浓度或分压、孔的内表面涂层、液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)内的多种内容物、哺乳动物细胞类型或细胞系、CO2暴露或溶解CO2浓度或分压、温度、液体培养基的体积(例如，第一和/或第二液体培养基的体积)和/或去除第一体积的第一培养基和添加第二体积的第二培养基至第一培养基的速率或频率)中的任何参数的效果。所述方法还可用于测试用于制备液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)的水质和/或液体培养基中的不同痕量金属对至少一种培养读数的效果(例如，本文描述的任何培养读数，例如，对重组蛋白产生和/或哺乳动物细胞生长的效果)。所述方法还可用于测试生长因子或生长激素对至少一种培养读数的效果(例如，本文描述的任何培养读数，例如，对重组蛋白产生和/或哺乳动物细胞生长的效果)。所述方法还可用于测试用于制备第一和/或第二液体培养基的过滤方法和过滤器。所述方法还可用于测试液体培养基稳定性和液体培养基对生物学功能的效果(例如，本文描述的任何培养读数中的至少一种，例如，对重组蛋白产生和/或哺乳动物细胞生长的效果)。所述方法还可用于筛选多种重组细胞系和细胞库产生期望的重组蛋白(例如，期望的分泌性治疗蛋白)的能力。如本文所注意到的，所述方法还可用于筛选任何细胞培养方法参数，包括但不限于，搅拌的类型和频率、剪切力、灌注速率和体积、培养物接种密度等。
本文描述的方法还可用于测试第一或第二液体培养基中污染物的存在、用于生成第一或第二液体培养基的原材料或哺乳动物细胞的来源。例如，本文提供测试第一或第二液体培养基中污染物的存在、用于生成第一或第二液体培养基的原材料或哺乳动物细胞的来源的方法，所述方法包括提供包含至少一个含有悬浮于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的孔的多孔板，所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM搅拌将所述多孔板温育一段时间；在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测或测定至少一种培养读数(例如，本文描述的任何培养读数，例如，细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白的量)；将所述至少一种培养读数与通过不同培养方法产生的至少一种培养读数(例如，本文描述的任何培养读数，例如，细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白的量)的参照水平比较，所述不同培养方法使用不同的第一或第二液体培养基、生成所述第一或第二液体培养基的不同原材料或不同的哺乳动物细胞来源中的一种或多种；并且当所述至少一种培养参数的水平相较于参照水平不利变化(例如，增加或减少)时，将该第一或第二液体培养基、生成该第一或第二液体培养基的原材料或该哺乳动物细胞来源鉴定为含有污染物。例如，与参照水平比较重组蛋白产生的减少(例如，细胞中或第一和/或第二培养基中的重组蛋白的减少)、体积生产率的减少或活细胞浓度的减少是不利的变化，其指示在该第一或第二液体培养基、用于生成该第一或第二液体培养基的原材料或该哺乳动物细胞来源中污染物的存在。一些方法进一步包括一种或多种测定该第一或第二液体培养基、用于生成该第一或第二液体培养基的原材料或该哺乳动物细胞来源中存在的污染物的身份的测定法。污染物可能是生物污染物(例如，分枝杆菌、真菌、细菌、病毒或不希望的哺乳动物细胞)。污染物也可为物理上未表征的物质。
所述方法可用于进行高通量细胞培养实验来执行对细胞培养方法的实验设计(design-of-experiment；DOE)或质量源于设计(quality-by-design；QBD)优化。例如，本文提供优化产生重组蛋白的制造工艺的方法，所述方法包括提供包含至少一个含有悬浮于第一液体培养基中的哺乳动物细胞的孔的多孔板，所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积；在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌将所述多孔板温育一段时间；在该段时间过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；检测至少一种培养读数(例如，本文描述的任何培养读数，例如，细胞中或第一和/或第二液体培养基中的重组蛋白的量)；将所述至少一种培养读数与通过不同培养方法产生的至少一种培养读数(例如，本文描述的任何培养读数，例如，细胞中或第一和/或第二培养基中存在的重组蛋白的量)的参照水平比较；并且鉴定和去除或改变制造方法中与相较于至少一种培养读数(例如，本文描述的任何培养读数，例如，产生的重组蛋白量)的参照水平的至少一种培养读数的不利变化(例如，增加或减少)相关的任何培养组分或参数，或鉴定并向制造方法添加与相较于至少一种培养读数(例如，本文描述的任何培养读数，例如，产生的重组蛋白量)的参照水平的至少一种培养读数的有利变化(例如，增加或减少)相关的任何培养组分或参数。例如，产生的重组蛋白量、体积生产率、比生产率或活细胞浓度的增加是培养读数中的有利变化，而产生的重组蛋白量、体积生产率、比生产率或活细胞浓度的减少是培养读数中的不利变化。在一些情况中，所述方法用于以高通量方式鉴定能够用于重组蛋白的规模放大(例如，生物反应器)生产的优化的细胞培养条件。
在本节描述的任何方法中，至少一种培养读数的参照水平可来自较大规模培养(例如，灌注生物反应器，例如，2000-L灌注生物反应器、40-L灌注生物反应器或12-L灌注生物反应器)。在本节描述的任何方法的一些实施方案中，将哺乳动物细胞使用本文描述的任何方法培养在多孔板中，经历与实施较大规模培养相同的时间段(平行培养)。例如，在本文描述的任何方法中用于接种多孔板的接种物也用于在大致相同的时间接种较大规模灌注生物反应器。
在一个实施方案中，用于接种孔的接种物获得自较大规模培养(例如，较大规模灌注生物反应器)。例如，将来自任意时间点的较大规模培养的等分试样(例如，在生长阶段、过渡阶段(例如，当培养物正在过渡至一组不同的生长条件例如不同的液体培养基和/或温度的任选时期)或收获阶段期间取出)用于接种孔(例如，用于起始卫星多孔板培养)。等分试样可在生长阶段期间自较大规模培养取出并用于接种(inoculate)或接种(seed)包含至少一个含有液体培养基的孔的多孔板，随后将所述孔在复制了或类似于较大规模培养中采用的生长阶段条件的条件下培养。可替换地或者此外，等分试样可取自过渡阶段期间的较大规模培养并用于接种(inoculate)或接种(seed)含有至少一个含有液体培养基的孔的多孔板，随后将所述孔在复制了或类似于较大规模培养中采用的过渡阶段条件的条件下培养。可替换地或者此外，等分试样可取自收获阶段期间的较大规模培养并用于接种(inoculate)或接种(seed)含有至少一个含有液体培养基的孔的多孔板，随后将所述孔在复制了或类似于较大规模培养中采用的收获阶段条件的条件下培养。在任何这些方法中，可改变在用于在多孔板中培养哺乳动物细胞的方法中的一种或多种培养参数(相较于在较大规模培养中用于培养所述哺乳动物细胞的培养参数或组分)，测量至少一种培养读数，并将所述至少一种培养读数与针对所述较大规模培养所测定的至少一种培养读数进行比较。正如本领域技术人员能够理解的，这些方法能够用于测试特定培养参数或组分对培养方法中一个或多个具体阶段过程中的至少一种培养读数的作用(例如，一种或多种培养参数和/或培养组分对生长阶段、任选的过渡阶段和/或收获阶段期间至少一种培养读数的作用)。
在某些实施方案中，可实施这些方法以测定污染物是否存在于较大规模生物反应器中，其通过测定或检测多孔板(例如，用较大规模生物反应器培养的等分试样或用于接种较大规模生物反应器的同一冷冻细胞库接种)中的至少一种培养读数，将所述至少一种培养读数与至少一种培养读数的参照水平(例如，来自基本上不含污染的培养物的至少一种培养读数的水平)相比，并且当与所述至少一种培养读数的参照水平相比孔中的至少一种培养读数指示孔中存在污染物时，将较大规模生物反应器鉴定为含有污染物。例如，所述污染物可以是生物污染物，如病毒、真菌、不希望的哺乳动物细胞或细菌，如分枝杆菌。例如，所述污染物可为水疱疹病毒(vesivirus)。
多孔细胞培养板系统
本说明书提供用于培养哺乳动物细胞(例如，使用任何本文所述的方法)的示例性多孔细胞培养板系统。这些系统经设计以允许通过至少一个端口连续或周期去除培养容器中存在的流体(例如，第一液体培养基)和向培养容器添加流体(例如，第二液体培养基)，所述端口经配置以容纳流入和/或流出所述培养容器的流体流。
示例性多孔细胞培养板系统
多孔细胞培养板系统1的非限定性实例的顶视图在图1中提供。多孔细胞培养板系统1包括一体支持板2，一体支持板2包含具有多个孔4的表面3。孔可以以任何形式排列，并且尽管图1显示孔呈线和行的形式，熟练的操作人员会理解可以采用孔的任何构型。
示例性多孔培养板系统11的非限定性实例的侧视图在图2中提供。多孔培养板系统11包括一体支持板2，所述一体支持板2具有包括多个孔4的表面3。所述一体支持板2可由任何生物相容性材料(例如，聚苯乙烯或任何其他本领域已知的生物相容性材料)制成。所述一体支持板2可具有至少2个孔4(例如，4、6、9、10、12、15、18、20、24、36、48、60、72或96个孔4)或者可具有至少3、4、5、6、12、18、24、36、48或96个孔4。图2中所示的多孔培养板系统11具有多个在支持板2之内形成的或设置的并配置用于容纳细胞培养物(例如，本文描述的任何示例性哺乳动物细胞和/或组织培养基)的培养容器5。容器5可经配置以容纳任何体积的细胞培养物，例如，那些具有约0.3mL至约25mL(例如，约0.3mL至约24mL、约0.3mL至约22mL、约0.3mL至约20mL、约0.3mL至约18mL、约0.3mL至约16mL、约0.3mL至约14mL、约0.3mL至约12mL、约0.3mL至约10mL、约0.3mL至约8mL、约0.3mL至约6mL、约0.3mL至约5mL、约0.3mL至约4mL、约0.3mL至约3mL、约0.3mL至约2mL、约0.3mL至约1mL、约0.5mL至约25mL、约0.5mL至约24mL、约0.5mL至约22mL、约0.5mL至约0.5mL至约20mL、约0.5mL至约18mL、约0.5mL至约16mL、约0.5mL至约14mL、约0.5mL至约12mL、约0.5mL至约10mL、约0.5mL至约8mL、约0.5mL至约6mL、约0.5mL至约5mL、约0.5mL至约4mL、约0.5mL至约3mL、约0.5mL至约2mL、约0.5mL至约1mL、约1mL至约25mL、约1mL至约24mL、约1mL至约22mL、约1mL至约20mL、约1mL至约18mL、约1mL至约16mL、约1mL至约14mL、约1mL至约12mL、约1mL至约10mL、约1mL至约8mL、约1mL至约7mL、约1mL至约6mL、约1mL至约5mL、约1mL至约4mL、约1mL至约3.5mL、约1mL至约3mL、约1mL至约2.5mL、约1mL至约2mL、约1mL至约1.5mL、约1.5mL至约25mL、约1.5mL至约24mL、约1.5mL至约22mL、约1.5mL至约20mL、约1.5mL至约18mL、约1.5mL至约16mL、约1.5mL至约14mL、约1.5mL至约12mL、约1.5mL至约10mL、约1.5mL至约8mL、约1.5mL至约6mL、约1.5mL至约5mL、约1.5mL至约4mL、约1.5mL至约3.5mL、约1.5mL至约3mL、约1.5mL至约2.5mL、约1.5mL至约2.0mL、约2mL至约25mL、约2mL至约24mL、约2mL至约22mL、约2mL至约20mL、约2mL至约18mL、约2mL至约16mL、约2mL至约14mL、约2mL至约12mL、约2mL至约10mL、约2mL至约8mL、约2mL至约6mL或约2mL至约5mL)的体积的细胞培养物，其中每个孔3与每个培养容器4配对并限定进入每个培养容器中的开口。
所述培养容器5可具有不同的形状。所述培养容器的形状的非限定性实例可为大致圆柱或圆柱形，其具有与孔4的末端相对的末端，所述末端是例如平的、半球形的、金字塔形的或圆锥形的。孔4的直径可为，例如，约4.0mm至约50mm(例如，约4.0mm至约45mm、约4.0mm至约40mm、约4.0mm至约35mm、约4.0mm至约30mm、约4.0mm至约25mm、约4.0mm至约20mm、约4.0mm至约15mm、约4.0mm至约10mm、约6.0mm至约50mm、约6.0mm至约45mm、约6.0mm至约40mm、约6.0mm至约35mm、约6.0mm至约30mm、约6.0mm至约25mm、约6.0mm至约25mm、约6.0mm至约20mm、约6.0mm至约15mm、约6.0mm至约10mm、约8mm至约50mm、约8mm至约45mm、约8mm至约40mm、约8mm至约35mm、约8mm至约30mm、约8mm至约25mm、约8mm至约20mm、约8mm至约15mm、约10mm至约50mm、约10mm至约45mm、约10mm至约40mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约15mm至约50mm、约15mm至约45mm、约15mm至约40mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm或约15mm至约20mm)。培养容器5可具有约1cm至约12cm(例如，约1cm至约11cm、约1cm至约10cm、约1cm至约9cm、约1cm至约8cm、约1cm至约7cm、约1cm至约6cm、约1cm至约5cm、约1cm至约4cm、约1cm至约3cm、约1.2cm至约12cm、约1.2cm至约11cm、约1.2cm至约10cm、约1.2cm至约9cm、约1.2cm至约8cm、约1.2cm至约7cm、约1.2cm至约6cm、约1.2cm至约5cm、约1.2cm至约4cm、约1.2cm至约3cm、约1.5cm至约11cm、约1.5cm至约10cm、约1.5cm至约9cm、约1.5cm至约8cm、约1.5cm至约7cm、约1.5cm至约6cm、约1.5cm至约5cm、约1.5cm至约4cm、约1.5cm至约3cm、约2cm至约12cm、约2cm至约11cm、约2cm至约10cm、约2cm至约9cm、约2cm至约8cm、约2cm至约7cm、约2cm至约6cm、约2cm至约5cm、约2cm至约4cm、约2cm至约3cm、约2.5cm至约12cm、约2.5cm至约11cm、约2.5cm至约10cm、约2.5cm至约9cm、约2.5cm至约8cm、约2.5cm至约7cm、约2.5cm至约6cm、约2.5cm至约5cm、约2.5cm至约4cm、约3cm至约12cm、约3cm至约11cm、约3cm至约10cm、约3cm至约9cm、约3cm至约8cm、约3cm至约7cm、约3cm至约6cm、约3cm至约5cm、约4cm至约12cm、约4cm至约11cm、约4cm至约10cm、约4cm至约9cm、约4cm至约8cm、约4cm至约7cm、约4cm至约6cm、约5cm至约12cm、约5cm至约11cm、约5cm至约10cm、约5cm至约9cm、约5cm至约8cm或约5cm至约7cm)的高度。
图2中所示的多孔细胞培养板系统11还包括端口6，例如，单向或多向阀，其经配置以容纳流入和流出培养容器5的流体流。所述端口6可以流体连接至培养容器5的任何位置。本文描述的多孔细胞培养板系统可以具有至少一个，例如，两个、三个或至少四个端口6流体连接至每个培养容器5。端口6与培养容器5的连接的示例性位置示于图2和图3中。可配置端口6以使流体以单向(例如，进或出培养容器5)或双向流动(进和出培养容器5)。在一些实施方案中，第一端口6可经配置以容纳单向流入培养容器5的单向流，而第二端口6可经配置以容纳单向流出培养容器5的单向流。
图3显示多孔细胞培养板系统12，其包括经配置用于选择性阻止细胞流入和流出培养容器5的过滤器8。过滤器8可以是任何本领域已知的用于过滤哺乳动物细胞的微米或纳米过滤器。具有两个或多个端口6的多孔细胞培养板系统可以具有配置在每个端口6之上或之内的过滤器8，以选择性地阻止细胞流入或流出所述培养容器5。
分别显示于图2和图3中的多孔细胞培养板系统12和13还包括至少一个置于一体支持板2之内并与端口6流体联通的导管7，其中所述导管7经配置以使流体流至或流自培养容器5。在一些实例中，多孔细胞培养板系统可具有与每个端口6流体联通的导管7(例如，经配置以使流体流至和/或流自每一培养容器5)。
本文提供的多孔细胞培养板系统可进一步包括与端口6可操作连接的至少一个流体流调节器。本文提供的多孔细胞培养板系统可进一步包括与导管7可操作连接的至少一个流体流调节器。流体流调节器的非限定性实例可以通过检测培养容器5内流体体积和/或流体压力的变化来控制流体流动速率和/或流动方向。在一些实例中，可以对流体流调节器进行编程以使流体以特定速率以特定的流动方向(例如，流入和/或流出培养容器5)流动一段特定的时间。
在一些实施方案中，一体支持板2经配置以包括用于容纳液体并向端口6或导管7供应液体的贮液器。在一些实例中，多孔细胞培养板系统包括用于容纳液体并向端口6或导管7供应液体的贮液器，其经配置使得其在一体支持板2的外部并且与端口6或导管7分别流体连接(其中所述端口6或导管7执行使流体流入培养容器5的功能)。在一些实施方案中，配置一体支持板2以包括用于容纳和储存从培养容器5去除的液体的贮液器，其中所述用于容纳和储存去除的液体的贮液器在一体支持板2的外部并且与端口6或导管7流体连接(其中所述端口6或导管7实施使流体流出培养容器5的功能)。
经配置以包括用于容纳液体并将液体供应至端口6的内部贮液器9的示例性一体支持板2示于图4。图4中的一体支持板2进一步包括交换端口10用于去除或向内部贮液器9添加液体。包括内部贮液器9的一体支持板可包括单向和/或双向交换端口10(例如，单向或双向阀)。例如，包括内部贮液器9的一体支持板2可以具有第一交换端口10，其允许液体流入内部贮液器，以及第二交换端口，其允许液体流出内部贮液器。在另一实例中，包括内部贮液器9的一体支持板2可具有单一双向交换端口10，其允许液体流入和流出内部贮液器10。内部贮液器10中存在的流体可以通过一个或多个端口6和/或导管7的使用流入和/或流出容器5。
在一些实例中，多孔细胞培养板进一步包含盖板，其经配置以覆盖一体支持板2和孔4(例如，一体支持板2中的全部孔4)，防止培养容器5的污染(例如，细菌(例如，分枝杆菌)、病毒或真菌污染)并允许培养容器5和外部环境之间的气体交换。在一些实施方案中，多孔培养板还包括置于盖板和一体支持板2之间的透气性抛弃式膜或透气性硅酮层以防止培养容器5的污染，同时允许培养容器5和外部环境之间的气体交换。
可使用本领域已知的流体压力、气压、重力和机械压力的多种方法中的一种或多种使流体流动通过本文描述的任何系统(例如，流入和/或流出系统，例如，流入和/或流出端口6，流入和/或流出导管7，或流入和/或流出交换端口10)。例如，可以使用泵、重力、离心力或机械压力使流体移动通过本文描述的任何系统。用于使流体流过本文描述的任何系统的其他方法是本领域已知的。
培养哺乳动物细胞的方法
在本文描述示例的方法中，首先提供多孔板。将第一液体培养基添加至孔使得培养基占据约5％至约80％(例如，约5％至约75％、约5％至约70％、约5％至约65％、约5％至约60％、约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约45％、约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约10％至约80％、约10％至约75％，约10％至约70％、约10％至约65％、约10％至约60％、约10％至约55％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约15％至约80％、约15％至约75％、约15％至约70％、约15％至约65％、约15％至约60％、约15％至约55％、约15％至约50％、约15％至约45％、约15％至约40％、约20％至约80％、约20％至约75％、约20％至约70％、约20％至约65％、约20％至约60％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、约25％至约80％、约25％至约75％、约25％至约70％、约25％至约65％、约25％至约60％、约25％至约55％或约25％至约50％)的孔体积。将至少一个哺乳动物细胞添加至第一液体培养基，即，在将培养基添加至孔之前或在此之后。将多孔板在约31℃至约40℃并且以约300RPM至约600RPM(例如，本文描述的任何示例性搅拌范围)搅拌(例如，在旋转振荡器设备上)温育一段时间。例如，细胞可在温育箱中温育，如抛掷(轨道)直径约3mm至约50mm的摇动温育箱。在温育过程中，在所述时间段内连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基(例如，含有任何哺乳动物细胞浓度的，例如，基本上不含哺乳动物细胞或被制成基本上不含哺乳动物细胞的第一体积的第一液体培养基)，并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。通常，所述第一和第二体积大致相等，但是可有小量的不同，例如当比较第一和第二体积时相差约1％至约10％(例如，约1％至约8％、约1％至约5％或约1％至约3％)。在一些实施方案中，添加的第二体积的第二液体培养基少于(例如，最多少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％)去除的第一体积的第一液体培养基。如本领域已知的，术语温育可包括在其间将含有哺乳动物细胞和液体培养基的多孔板从温育箱移出从而去除第一体积的第一液体培养基并添加第二体积的第二液体培养基的短时间段(例如，至多1分钟、至多2分钟、至多3分钟、至多4分钟、至多5分钟、至多10分钟、至多20分钟、至多30分钟、至多40分钟、至多50分钟或至多1小时)。在一些实例中，术语温育不包括在其间将含有哺乳动物细胞和液体培养基的多孔板从温育箱移出从而去除第一体积的第一液体培养基并添加第二体积的第二液体培养基的短时间段(例如，通过使用本文描述的多孔培养板系统)。
这些温育方法的各个方面的多种非限定性实例在下文描述。本文提供的方法的示例性方面可不受限地以任何组合使用。
哺乳动物细胞
本文提供的方法可用于培养多种不同的哺乳动物细胞。例如，所述哺乳动物细胞可为生长在悬浮液中的细胞或者可以是粘附细胞。能够使用本文描述的任何方法培养的哺乳动物细胞的非限定性实例包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Sp2.0、黑素瘤细胞(例如，NS/0)、B-细胞、杂交瘤细胞、T-细胞、人胚胎肾(HEK)细胞(例如，HEK 293E和HEK 293F)，非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)细胞和Madin-Darby犬(可卡犬(Cocker Spaniel))肾上皮细胞(MDCK)细胞。能够使用本文描述的方法培养的其他哺乳动物细胞是本领域已知的。
哺乳动物细胞可含有编码重组蛋白的重组核酸(例如，稳定整合到所述哺乳动物细胞的基因组的核酸)。编码示例性重组蛋白的重组核酸的非限定性实例在下文描述，因为重组蛋白可使用本文描述的方法产生。在一些情况中，置于用于培养的多孔板中的哺乳动物细胞源自较大培养。例如，多孔板中的哺乳动物细胞可源自大规模生物反应器培养，即，可使用所述方法制备卫星培养物。
培养基
液体培养基是本领域已知的。所述第一和/或第二组织培养基可以补充有哺乳动物血清(例如，胎牛血清和牛血清)和/或生长激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子)。可替换地或另外地，第一和/或第二液体培养基可以是化学上限定的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基或无蛋白质液体培养基。化学上限定的液体培养基、无动物来源组分的幼体培养基、无血清液体培养基和含血清液体培养基的非限定性实例是市售的。
液体培养基通常含有能量源(例如，碳水化合物，如葡萄糖)、必需氨基酸(例如，基本组的二十种氨基酸加上半胱氨酸)、维生素和/或其他以低浓度需要的有机化合物、游离脂肪酸和/或痕量元素。如有需要，第一和/或第二液体培养基可以补充有例如哺乳动物激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐和缓冲液(例如钙、镁和磷酸盐)、核苷和碱基(例如，腺苷、胸苷和次黄嘌呤)、蛋白质和组织水解物和/或这些添加剂的任何组合。
在本文描述的方法中特别有用的液体培养基的非限定性实例包括，例如，CD CHO、Opti CHO和Forti CHO(全部可从Life Technologies；Grand Island,NY获得)、Hycell CHO培养基(Thermo Fisher Scientific,Inc.；Waltham,MA)、Ex-cell CD CHO融合培养基(Sigma-Aldrich Co.；St.Louis,MO)和PowerCHO培养基(Lonza Group,Ltd.；Basel,Switzerland)。在本方法中也可能有用的培养基组分包括但不限于化学成分确定(CD)的水解物，例如，CD蛋白胨、CD多肽(两个或多个氨基酸)和CD生长因子。液体组织培养基和培养基组分的其他实例是本领域已知的。
在本文描述的任何方法的一些实施例中，将哺乳动物细胞悬浮在约100μL至约25mL(例如，约100μL至约20mL、约100μL至约15mL、约100μL至约10mL、约100μL至约8mL、约100μL至约6mL、约100μL至约4mL、约100μL至约3mL、约100μL至约2.5mL、约100μL至约2.0mL、约100μL至约1.5mL、约100μL至约1.0mL、约100μL至约800μL、约100μL至约600μL、约100μL至约500μL、约100μL至约400μL、约100μL至约300μL、约100μL至约250μL、约100μL至约200μL、约150μL至约25mL、约150μL至约20mL、约150μL至约15mL、约150μL至约10mL、约150μL至约8mL、约150μL至约6mL、约150μL至约4mL、约150μL至约3mL、约150μL至约2.5mL、约150μL至约2.0mL、约150μL至约1.5mL、约150μL至约1.0mL、约150μL至约800μL、约150μL至约600μL、约150μL至约500μL、约150μL and约400μL、约150μL至约300μL、约150μL至约200μL、约250μL至约25mL、约250μL至约20mL、约250μL至约15mL、约250μL至约10mL、约250μL至约8mL、约250μL至约6mL、约250μL至约5mL、约250μL至约4mL、约250μL至约3mL、约250μL至约2.5mL、约250μL至约2mL、约250μL至约1mL、约500μL至约25mL、约500μL至约20mL、约500μL至约15mL、约500μL至约10mL、约500μL至约8mL、约500μL至约6mL、约500μL至约5mL、约500μL至约4mL、约500μL至约3mL、约500μL至约2.5mL、约500μL至约2mL、约500μL至约1mL、约1mL至约25mL、约1mL至约20mL、约1mL至约15mL、约1mL至约10mL、约1mL至约8mL、约1mL至约6mL、约1mL至约5mL、约1mL至约4mL、约1mL至约3mL、约1mL至约2.5mL或约1mL至约2mL)的第一培养基中。
熟练的操作者会理解本文描述的第一液体培养基和第二液体培养基可为相同类型的培养基或不同的培养基。
微载剂
在哺乳动物细胞是粘附细胞的一些实例中，第一和/或第二液体培养基包括多个微载剂。例如，孔可含有例如，约1.0g/L至约15.0g/L的终浓度(例如，振荡烧瓶中约1.0g/L至约2.5g/L、约1.0g/L至约2.0g/L、约1.0g/L至约1.75g/L、约1.0g/L至约1.5g/L、约1.0g/L至约1.25g/L、约2.5g/L至5.0g/L、约5.0g/L至约7.5g/L、约7.5g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约12.5g/L、约12.5g/L至约15.0g/L、约1.0g/L至约5.0g/L、约5.0g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约15.0g/L、约2.5g/L至约3.5g/L、约3.0g/L至约4.0g/L、约4.0g/L至约5.0g/L、约5.0g/L至约6.0g/L、约6.0g/L至约7.0g/L、约7.0g/L至约8.0g/L、约8.0g/L至约9.0g/L、约9.0g/L至约10.0g/L、约10.0g/L至约11.0g/L、约11.0g/L至约12.0g/L、约12.0g/L至约13.0g/L、约13.0g/L至约14.0g/L或约14.0g/L至约15.0g/L的终浓度)的微载剂。
在一些实施方案中，多个微载剂可具有约20μm至约1mm(例如，约20μm至约250μm、约100μm至约250μm、约150μm至约250μm、约250μm至500μm、约200μm至约300μm、约750μm至1mm、约200μm至约800μm、约200μm至约500μm或约500μm至约800μm)的平均直径，其中所述微载剂具有容许性的表面或促进哺乳动物细胞(例如，本文描述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞)的附着。在一些实例中，微载剂可含有一个或多个孔(例如，具有约10μm至约100μm(例如，约10μm至20μm、约20μm至约30μm、约30μm至约40μm、约50μm至约60μm、约60μm至约70μm、约70μm至约80μm、约80μm至约90μm、约90μm至约100μm、约10μm至约45μm、约45μm至约80μm、约25μM至约35μm、或约30μm)的平均直径的一个或多个孔)。在一些实施方案中，将多个微载剂的表面和/或多个微载剂中一个或多个孔的表面以促进哺乳动物细胞附着至微载剂(例如，附着至微载剂的外表面和/或微载剂中的孔的表面)的试剂涂覆。能够用于促进哺乳动物细胞的附着的这些试剂的实例包括但不限于明胶、胶原蛋白、聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白。
在一些实例中，微载剂具有约0.5m2/g干重至2.0m2/g干重(例如，约0.75m2/g干重至1.25m2/g干重、约1.0m2/g干重至约1.5m2/g干重、约1.25m2/g干重至约1.5m2/g干重、约1.5m2/g干重至约2.0m2/g干重，或约1.1m2/g干重)的平均有效细胞结合表面积。在一些实例中，微载剂具有约10mL/g干重至约70mL/g干重(例如，约10mL/g干重至约20mL/g干重、约20mL/g干重至约30mL/g干重、约30mL/g干重至约40mL/g干重、约40mL/g干重至约50mL/g干重、约50mL/g干重至约60mL/g干重、约60mL/g干重至约70mL/g干重、约10mL/g干重至约40mL/g干重、约30mL/g干重至约40mL/g干重、约40mL/g干重至约70mL/g干重，或约40mL/g干重)的平均体积。在一些实施方案中，微载剂的平均相对密度为0.8g/mL至约1.2g/mL(例如，约0.8g/mL至约0.9g/mL、约0.9g/mL至约1.0g/mL、约1.0g/mL至约1.1g/mL、约1.0g/mL、约1.1g/mL至约1.2g/mL、约0.95g/mL至约1.05g/mL，或约1.03g/mL)。
在一些实施方案中，微载剂大致为球形或椭球形的形状。在其他实例中，微载剂具有经刮擦的或粗糙的表面，其带有增加微载剂的外表面总面积的小突起。在一些实施方案中，微载剂具有网络状结构。在一些实施方案中，微载剂是吸湿性的。在一些实例中，微载剂含有纤维素。
在一些实施方案中，微载剂具有的外表面和/或微载剂孔具有的表面是带正电的(例如，由于N,N-二乙基氨基乙基基团的存在而带正电)。在一些实例中，微载剂具有网络或网状或网样结构。微载剂可具有约0.5me/g至约2.5me/g(例如，约0.5me/g至约1.5meq/g、约0.75meq/g至约1.25meq/g、约1.1meq/g、约1.5meq/g至约2.5meq/g、约1.5meq/g至约2.0meq/g、约1.8meq/g、约0.5meq/g至约1.0meq/g或约1.0meq/g至约1.5meq/g)的平均电荷密度。
在一些情况中，微载剂可含有天然聚合物和/或合成聚合物。合成聚合物的非限定性实例包括聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷、聚乙烯亚胺、二甘醇、三甘醇、聚亚烷基二醇、聚氧化烯、聚乙烯醇、多聚磷酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯基甲基醚、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟丙基噁唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟丙基酯、聚丙烯酸羟乙酯、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、聚甘油、聚天冬酰胺、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆(poloxamer))、羧酸(例如，丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸和马来酸)、聚氧乙烯类、聚环氧乙烷、不饱和烯属单二羧酸、聚乳酸(PLA)、聚环氧丙烷、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(ε-己内酯)、聚(乙基乙烯)、聚丁二烯、聚乙醇酸、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯基丁基醚、聚苯乙烯、聚环戊二烯基甲基降冰片烯、聚乙烯丙烯、聚乙基乙烯、聚异丁烯、聚硅氧烷、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸2-乙酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸酯类(例如，甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯和甲基丙烯酸异丁酯)、丙烯腈类、甲基丙烯腈、乙烯基类(例如，乙酸乙烯酯、叔碳酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、乙烯基甲酰胺、乙烯基乙酰胺、乙烯基吡啶和乙烯基咪唑)、氨基烷类(例如，氨基烷基丙烯酸酯、氨基烷基甲基丙烯酸酯和氨基烷基(甲基)丙烯酰胺)、苯乙烯、聚亚烷基二醇、多碱氧化物和乳酸。天然聚合物的非限定性实例包括纤维素、卵磷脂和玻尿酸。微载剂可以含有不同聚合物以相同或不同比例混合的混合物(例如，本文描述的或本领域已知的一种或多种聚合物的任意组合)。本文描述的任何微载剂可以含有核心和外层，所述核心含有一种或多种聚合物(例如，本文描述的或本领域已知的任何聚合物)，所述外层含有一种或多种不同的聚合物(例如，本文描述的或本领域已知的任何聚合物)。
能够在本文描述的任何方法中使用的非限定性示例性微载剂包括CytoPoreTM 1和CytoPoreTM 2(可从GE Healthcare,Life Sciences,Piscataway,New Jersey获得)。能够在本文描述的任何方法中使用的微载剂的其他实例是公众可以获得的和本领域已知的。
多孔板
多种多孔板是本领域已知的并且可用于本文描述的任何方法。例如，多孔板可为2孔板、4孔板、6孔板、8孔板、9孔板、10孔板、12孔板、15孔板、18孔板、20孔板、24孔板、36孔板、48孔板、60孔板、72孔板，或96孔板。在一些实例中，孔具有约0.3mL至约25mL(例如，约0.3mL至约24mL、约0.3mL至约22mL、约0.3mL至约20mL、约0.3mL至约18mL、约0.3mL至约16mL、约0.3mL至约14mL、约0.3mL至约12mL、约0.3mL至约10mL、约0.3mL至约8mL、约0.3mL至约6mL、约0.3mL至约5mL、约0.3mL至约4mL、约0.3mL至约3mL、约0.3mL至约2mL、约0.3mL至约1mL、约0.5mL至约25mL、约0.5mL至约24mL、约0.5mL至约22mL、约0.5mL至约0.5mL至约20mL、约0.5mL至约18mL、约0.5mL至约16mL、约0.5mL至约14mL、约0.5mL至约12mL、约0.5mL至约10mL、约0.5mL至约8mL、约0.5mL至约6mL、约0.5mL至约5mL、约0.5mL至约4mL、约0.5mL至约3mL、约0.5mL至约2mL、约0.5mL至约1mL、约1mL至约25mL、约1mL至约24mL、约1mL至约22mL、约1mL至约20mL、约1mL至约18mL、约1mL至约16mL、约1mL至约14mL、约1mL至约12mL、约1mL至约10mL、约1mL至约8mL、约1mL至约7mL、约1mL至约6mL、约1mL至约5mL、约1mL至约4mL、约1mL至约3.5mL、约1mL至约3mL、约1mL至约2.5mL、约1mL至约2mL、约1mL至约1.5mL、约1.5mL至约25mL、约1.5mL至约24mL、约1.5mL至约22mL、约1.5mL至约20mL、约1.5mL至约18mL、约1.5mL至约16mL、约1.5mL至约14mL、约1.5mL至约12mL、约1.5mL至约10mL、约1.5mL至约8mL、约1.5mL至约6mL、约1.5mL至约5mL、约1.5mL至约4mL、约1.5mL至约3.5mL、约1.5mL至约3mL、约1.5mL至约2.5mL、约1.5mL至约2.0mL、约2mL至约25mL、约2mL至约24mL、约2mL至约22mL、约2mL至约20mL、约2mL至约18mL、约2mL至约16mL、约2mL至约14mL、约2mL至约12mL、约2mL至约10mL、约2mL至约8mL、约2mL至约6mL或约2mL至约5mL)的体积(内部体积)。
在一些实例中，多孔板是深孔板。例如，深孔板中的孔的内部高度可为1cm至约12cm(例如，约1cm至约11cm、约1cm至约10cm、约1cm至约9cm、约1cm至约8cm、约1cm至约7cm、约1cm至约6cm、约1cm至约5cm、约1cm至约4cm、约1cm至约3cm、约1.2cm至约12cm、约1.2cm至约11cm、约1.2cm至约10cm、约1.2cm至约9cm、约1.2cm至约8cm、约1.2cm至约7cm、约1.2cm至约6cm、约1.2cm至约5cm、约1.2cm至约4cm、约1.2cm至约3cm、约1.5cm至约11cm、约1.5cm至约10cm、约1.5cm至约9cm、约1.5cm至约8cm、约1.5cm至约7cm、约1.5cm至约6cm、约1.5cm至约5cm、约1.5cm至约4cm、约1.5cm至约3cm、约2cm至约12cm、约2cm至约11cm、约2cm至约10cm、约2cm至约9cm、约2cm至约8cm、约2cm至约7cm、约2cm至约6cm、约2cm至约5cm、约2cm至约4cm、约2cm至约3cm、约2.5cm至约12cm、约2.5cm至约11cm、约2.5cm至约10cm、约2.5cm至约9cm、约2.5cm至约8cm、约2.5cm至约7cm、约2.5cm至约6cm、约2.5cm至约5cm、约2.5cm至约4cm、约3cm至约12cm、约3cm至约11cm、约3cm至约10cm、约3cm至约9cm、约3cm至约8cm、约3cm至约7cm、约3cm至约6cm、约3cm至约5cm、约4cm至约12cm、约4cm至约11cm、约4cm至约10cm、约4cm至约9cm、约4cm至约8cm、约4cm至约7cm、约4cm至约6cm、约5cm至约12cm、约5cm至约11cm、约5cm至约10cm、约5cm至约9cm、约5cm至约8cm或约5cm至约7cm)。
在一些实例中，孔(例如，深孔多孔板中的孔)可具有平底(也称为方底)、圆底(也称为半球底)、锥形底或金字塔形底。在一些实施方案中，本文描述的任何孔的直径可为约4.0mm至约50mm(例如，约4.0mm至约45mm、约4.0mm至约40mm、约4.0mm至约35mm、约4.0mm至约30mm、约4.0mm至约25mm、约4.0mm至约20mm、约4.0mm至约15mm、约4.0mm至约10mm、约6.0mm至约50mm、约6.0mm至约45mm、约6.0mm至约40mm、约6.0mm至约35mm、约6.0mm至约30mm、约6.0mm至约25mm、约6.0mm至约25mm、约6.0mm至约20mm、约6.0mm至约15mm、约6.0mm至约10mm、约8mm至约50mm、约8mm至约45mm、约8mm至约40mm、约8mm至约35mm、约8mm至约30mm、约8mm至约25mm、约8mm至约20mm、约8mm至约15mm、约10mm至约50mm、约10mm至约45mm、约10mm至约40mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约15mm至约50mm、约15mm至约45mm、约15mm至约40mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm或约15mm至约20mm)。
在一些实例中，将多孔板密封(例如，用透气性抛弃式膜或透气性硅酮层密封)。用于密封多孔板的材料的非限制性实例在实施例中描述。用于密封多孔板的其他材料是本领域已知的。
孔的内表面可具有至少一种涂层(例如，明胶、胶原蛋白、聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白涂层的至少一种)。多孔板的其他实例(例如，不同形状和尺寸的孔)和孔的内表面涂层的其他实例是本领域已知的并且可用于本发明中。
搅拌
本发明描述的方法需要旋转搅拌含有哺乳动物细胞和第一和/或第二液体培养基的培养物。旋转搅拌可以约300RPM至约600RPM(例如，约300RPM至约580RPM、约300RPM至约560RPM、约300RPM至约540RPM、约300RPM至约520RPM、约300RPM至约500RPM、约300RPM至约480RPM、约300RPM至约460RPM、约300RPM至约440RPM、约300RPM至约420RPM、约300RPM至约400RPM、约300RPM至约380RPM、约300RPM至约360RPM、约320RPM至约600RPM、约320RPM至约580RPM、约320RPM至约560RPM、约320RPM至约540RPM、约320RPM至约520RPM、约320RPM至约500RPM、约320RPM至约480RPM、约320RPM至约460RPM、约320RPM至约440RPM、约320RPM至约420RPM、约320RPM至约400RPM、约320RPM至约380RPM、约330RPM至约600RPM、约330RPM至约580RPM、约330RPM至约560RPM、约330RPM至约540RPM、约330RPM至约520RPM、约330RPM至约500RPM、约330RPM至约480RPM、约330RPM至约460RPM、约330RPM至约440RPM、约330RPM至约420RPM、约330RPM至约400RPM、约330RPM至约380RPM、约340RPM至约600RPM、约340RPM至约580RPM、约340RPM至约560RPM、约340RPM至约540RPM、约340RPM至约520RPM、约340RPM至约500RPM、约340RPM至约480RPM、约340RPM至约460RPM、约340RPM至约440RPM、约340RPM至约420RPM、约340RPM至约400RPM、约360RPM至约600RPM、约360RPM至约580RPM、约360RPM至约560RPM、约360RPM至约540RPM、约360RPM至约520RPM、约360RPM至约500RPM、约360RPM至约480RPM、约360RPM至约460RPM、约360RPM至约440RPM、约360RPM至约420RPM、约380RPM至约600RPM、约380RPM至约580RPM、约380RPM至约560RPM、约380RPM至约540RPM、约380RPM至约520RPM、约380RPM至约500RPM、约380RPM至约480RPM、约380RPM至约460RPM、约380RPM至约440RPM、约400RPM至约600RPM、约400RPM至约580RPM、约400RPM至约560RPM、约400RPM至约540RPM、约400RPM至约520RPM、约400RPM至约500RPM、约400RPM至约480RPM或约400RPM至约460RPM)的频率发生(例如，在培养箱中，如具有约3mm至约50mm的抛掷(轨道)直径的摇动培养箱)。
如本领域所能够理解的，搅拌的水平(例如，RPM速度)可依赖于孔的大小和形状(例如，孔的直径、形状和高度中的一项或多项)以及用于进行培养的培养箱的抛掷(轨道)的直径而变化。例如，较小的抛掷(轨道)直径可能需要更高水平的搅拌(例如，较高的RPM速度)，而较大的抛掷(轨道)直径可能需要较低水平的搅拌(例如，较低的RPM速度)来达到类似水平的流体剪切力和溶解O2浓度。在另一实例中，具有较大直径的孔可能需要较低的RPM速度，而具有较小直径的孔可能需要较高的RPM速度来达到类似水平的流体剪切力和溶解O2浓度。
在一些实施方案中，使用具有约3mm至约50mm(例如，约3mm至约25mm或约25mm至约50mm)的抛掷(轨道)直径的摇动管型培养箱并以约320RPM至约500RPM(例如，约320RPM至约480RPM、约320RPM至约460RPM、约320RPM至约400RPM、约320RPM至约380RPM、约320RPM至约360RPM、约320RPM至约350RPM、约320RPM至约340RPM、约330RPM至约500RPM、约330RPM至约480RPM、约330RPM至约460RPM、约330RPM至约440RPM、约330RPM至约420RPM、约330RPM至约400RPM、约330RPM至约380RPM、约330RPM至约370RPM、约330RPM至约360RPM、约330RPM至约350RPM、约340RPM至约500RPM、约340RPM至约480RPM,340RPM至约460RPM、约340RPM至约440RPM、约340RPM至约420RPM、约340RPM至约400RPM、约340RPM至约380RPM、约340RPM至约370RPM、约340RPM至约360RPM、约350RPM至约500RPM、约350RPM至约480RPM、约350RPM至约460RPM、约350RPM至约440RPM、约350RPM至约420RPM、约350RPM至约400RPM、约350RPM至约390RPM、约350RPM至约380RPM、约350RPM至约370RPM、约360RPM至约500RPM、约360RPM至约480RPM、约360RPM至约460RPM、约360RPM至约440RPM、约360RPM至约420RPM、约360RPM至约400RPM、约360RPM至约380RPM或约400RPM至约500RPM)的搅拌进行培养。例如，可使用旋转圆形摇动或旋转椭圆形摇动进行旋转搅拌。可连续地或周期性地进行搅拌。
多孔板的旋转搅拌能够产生与含有占据约10％至约40％(例如，约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约10％至约15％，约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约15％至约25％、约15％至约20％、约20％至约40％、约20％至约35％、约20％至约30％、约20％至约25％、约25％至约40％、约25％至约35％、约25％至约30％、约30％至约40％、约30％至约35％或约35％至约40％)孔体积的液体培养基的、具有约6.0mm至约35mm(例如，约6.0mm至约30mm、约6.0mm至约25mm、约6.0mm至约20mm、约6.0mm至约15mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm、约20mm至约35mm、约20mm至约30mm或约25mm至约35mm)的直径和约40mm至约50mm(例如，约40mm至约45mm或约45mm至约50mm)的高度的方底孔中在约31℃至约40℃的温度并以约320RPM至约450RPM(例如，约320RPM至约440RPM、约320RPM至约430RPM、约320RPM至约420RPM、约320RPM至约410RPM、约320RPM至约400RPM、约320RPM至约390RPM、约320RPM至约380RPM、约320RPM至约370RPM、约320RPM至约360RPM、约320RPM至约350RPM、约320RPM至约340RPM、约320RPM至约330RPM、约330RPM至约450RPM、约330RPM至约440RPM、约330RPM至约430RPM、约330RPM至约420RPM、约330RPM至约410RPM、约330RPM至约400RPM、约330RPM至约390RPM、约330RPM至约380RPM、约330RPM至约370RPM、约330RPM至约360RPM、约330RPM至约350RPM、约330RPM至约340RPM、约340RPM至约450RPM、约340RPM至约440RPM、约340RPM至约430RPM、约340RPM至约420RPM、约340RPM至约410RPM、约340RPM至约400RPM、约340RPM至约390RPM、约340RPM至约380RPM、约340RPM至约370RPM、约340RPM至约360RPM、约340RPM至约350RPM、约350RPM至约450RPM、约350RPM至约440RPM、约350RPM至约430RPM、约350RPM至约420RPM、约350RPM至约410RPM、约350RPM至约400RPM、约350RPM至约390RPM、约350RPM至约380RPM、约350RPM至约370RPM、约350RPM至约360RPM、约360RPM至约450RPM、约360RPM至约440RPM、约360RPM至约430RPM、约360RPM至约420RPM、约360RPM至约410RPM、约360RPM至约400RPM、约360RPM至约390RPM、约360RPM至约380RPM、约360RPM至约370RPM、约370RPM至约450RPM、约370RPM至约430RPM、约370RPM至约410RPM、约370RPM至约390RPM、约390RPM至约450RPM、约390RPM至约430RPM、约390RPM至约410RPM、约410RPM至约450RPM、约410RPM至约430RPM或约430RPM至约450RPM)的频率搅拌进行温育所实现的基本上相同的流体剪切力和溶解氧(O2)浓度。
旋转搅拌可使用加湿气氛的受控培养箱(例如，大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的湿度，或100％的湿度)进行，所述培养箱带有为含有哺乳动物细胞和液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)的一个或多个多孔板提供搅拌的机械装置。
温度
本文描述的培养方法可在约31℃至约40℃的温度进行。熟练的操作人员会理解可在培养方法中的特定时间点改变温度，例如，每小时或每天。例如，可在用哺乳动物细胞对孔进行初始接种之后约一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天、十五天、十六天、是七天、十八天、十九天或二十天或更久时改变或变换(例如，提高或降低)温度。例如，可向上变换温度(例如，高至或大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或高至或大约20℃的变化)。例如，可向下变换温度(例如，高至或大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或高至或大约20℃的变化)。
培养基的去除和替换
本文描述的方法包括从孔去除第一体积的第一液体培养基(例如，含有任何浓度的哺乳动物细胞，例如，基本上不含细胞的第一体积的第一液体培养基)，向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。去除和添加可以同时或顺序或以二者的组合进行。另外，去除和添加可连续进行(例如，以在任意给定的时间段内(例如，在24小时期间，在约1小时至约24小时的渐增时间段内，或在大于24小时的渐增时间段内)或周期性地(例如，每三天一次、每隔一天、每天一次、每天两次、每天三次、每天四次或每天五次)或其任意组合去除和替换孔体积或第一液体培养基体积的0.1％至700％(例如，1％至600％、1％至500％、1％至400％、1％至350％、1％至300％、1％至250％、1％至100％、100％至200％、5％至150％、10％至50％、15％至40％、8％至80％或4％至30％)的体积的速率)。在周期性进行的情况下，去除或替换的体积(例如，在约24小时期间，在约1小时至约24小时的渐增时间段内，或在大于24小时的渐增时间段内)可为例如孔体积或第一液体培养基体积的0.1％至700％(例如，1％至700％、1％至600％、1％至500％、1％至400％、1％至300％、1％至200％、1％至100％、100％至200％、5％至150％、10％至50％、15％至40％、8％至80％或4％至30％)的体积。在一些情况下，可在整个或部分培养时期内在每24小时的时期内(或，可替换地，在约1小时至约24小时的渐增时间段内，或在大于24小时的渐增时间段内)使去除的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基保持大致相同。如本领域已知的，去除第一体积的第一液体培养基的速率(体积/单位时间)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可有所变化。去除第一体积的第一液体培养基的速率(体积/单位时间)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可大致相同或可不同。
可替换地，在培养期间在每24小时的时期内(或，可替换地，在约1小时至约24小时的渐增时间段内，或在大于24小时的渐增时间段内)可改变(例如，逐渐增加)去除和添加的体积。包括逐渐增加体积的方法的非限定性实例在本文描述。例如，在培养期间在每24小时的时期内(或，可替换地，在约1小时至24小时以上的渐增时间段内，或在大于24小时的渐增时间段内)去除的第一液体培养基的体积和添加的第二液体培养基的体积可从孔体积或第一液体培养基体积的0.5％至约30％的体积增加(例如，逐渐地或通过交错增量)至孔体积或第一液体培养基体积的约30％至约200％的体积。
在本文描述的任何方法的一些实施方案中，将多孔板培养超过7天的一段时间，并且在温育的第1至3天中的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约50％；在培养的第4至6天中，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约50％或约40％至约70％；并且从培养的第7天起的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约90％至约150％。
在其他实例中，在大约最初的24-48小时的时间段之后，在每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约300％(例如，约30％至约280％、约30％至约260％、约30％至约240％、约30％至约220％、约30％至约200％、约30％至约180％、约30％至约160％、约30％至约150％、约30％至约140％、约30％至约120％、约30％至约100％、约30％至约80％、约30％至约60％、约30％至约50％、约40％至约300％、约40％至约280％、约40％至约260％、约40％至约240％、约40％至约220％、约40％至约200％、约40％至约180％、约40％至约160％、约40％至约140％、约40％至约120％、约40％至约100％、约40％至约80％、约40％至约60％、约50％至约300％、约50％至约280％、约50％至约260％、约50％至约240％、约50％至约220％、约50％至约200％、约50％至约180％、约50％至约160％、约50％至约140％、约50％至约120％、约50％至约100％或50％至约80％)。
熟练的操作人员会理解第一液体培养基和第二液体培养基可使用相同类型的培养基。在其他情况中，第一液体培养基和第二液体培养基可为不同的。
例如，可通过离心(例如，慢速旋翼式离心(swinging bucket centrifugation))多孔板，并将第一体积的基本上不含细胞的第一液体培养基从上清液去除来去除第一体积的第一液体培养基。可替换地或者此外，可通过使第一体积的第一液体培养基渗透或重力流过无菌膜来去除第一体积的第一液体培养基，所述无菌膜具有排除哺乳动物细胞的分子量截留值。可替换地或者此外，第一液体培养基可通过在去除第一体积的第一液体培养基之前停止搅拌至少30秒的时间段(例如，至少一分钟、至少两分钟、至少三分钟、至少四分钟或至少五分钟)来去除。可手动地(例如，通过从孔中抽吸或移液掉第一体积的第一液体培养基)或以自动化的方式(例如，使用自动化设备或使用任何本文描述的多孔细胞培养板系统)去除第一体积的第一液体培养基。
例如，可通过灌注泵向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。可手动地(例如，通过将第二体积的第二液体培养基直接移液到第一液体培养基上)或以自动化的方式(例如，使用自动化设备或使用任何本文描述的多孔细胞培养板系统)将第二液体培养基添加至第一液体培养基。
在一些实例中，使用本文描述的任何多孔细胞培养板系统可去除第一体积的第一液体培养基并且可向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基。
在一些情况中，去除第一体积的第一液体培养基(例如，基本上不含哺乳动物细胞的第一体积的第一液体培养基)和向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基不会发生在用哺乳动物细胞接种孔的至少1小时之内(例如，2小时之内、3小时之内、4小时之内、5小时之内、6小时之内、7小时之内、8小时之内、9小时之内、10小时之内、12小时之内、14小时之内、16小时之内、18小时之内、24小时之内、36小时之内、48小时之内、72小时之内、96小时之内或96小时之后)。
一些实施方案进一步包括向多个孔中的每个周期性地添加额外体积的第二液体培养基，从而抵销因为蒸发所致的第一液体培养基在体积上的任何减少。例如，可向孔添加这样的额外体积的第二液体培养基，例如，至少每24小时一次，至少每48小时一次、至少每72小时一次或至少每96小时一次。可手动地或以自动化的方式(例如，使用自动化设备或使用任何本文描述的多孔细胞培养板系统)添加这种额外体积的第二液体培养基。
CO2
本文描述的方法可以进一步包括在含有至多或约15％CO2(例如，至多或大约14％CO2、12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2或至多或大约1％CO2)的气氛中培养多孔板。另外，本文描述的任何方法可包括在加湿气氛(例如，至少或大约20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或至少或大约95％湿度，或大约100％湿度)中培养多孔板。
示例性设备
能够用于进行本文描述的培养方法的设备的非限制性实例包括：AppropriateTechnical Resources(Maryland,USA)分销的INFORS Multiron摇动培养箱(INFORS；Basel,Switzerland)，和Kuhner摇动培养箱(Kuhner AG；Basel,Switzerland)。能够用于进行培养方法的设备的非限制性实例包括具有约3mm至约50mm(例如，约1mm至约25mm或约25mm至约50mm)的抛掷(轨道)直径的旋转培养箱。摇动培养箱和滚动培养箱的其他实例是本领域已知的。
溶解O2和液体剪切力
还提供包括在梯度灌注方法中在如下条件下培养悬浮在置于多孔板孔内的液体培养基中的哺乳动物细胞的培养方法，所述条件在所述培养基中生成与含有占据具有约6.0mm至约35mm(例如，约6.0mm至约30mm、约6.0mm至约25mm、约6.0mm至约20mm、约6.0mm至约15mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm、约20mm至约35mm、约20mm至约30mm或约25mm至约35mm)的直径和约40mm至约50mm(例如，约40mm至约45mm或约45mm至约50mm)的高度的方底孔体积的约10％至约40％(例如，约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约10％至约15％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约15％至约25％、约15％至约20％、约20％至约40％、约20％至约35％、约20％至约30％、约20％至约25％、约25％至约40％、约25％至约35％、约25％至约30％、约30％至约40％、约30％至约35％或约35％至约40％)的液体培养基中在约31℃至约40℃的温度并以约320RPM至约450RPM(例如，约320RPM至约440RPM、约320RPM至约430RPM、约320RPM至约420RPM、约320RPM至约410RPM、约320RPM至约400RPM、约320RPM至约390RPM、约320RPM至约380RPM、约320RPM至约370RPM、约320RPM至约360RPM、约320RPM至约350RPM、约320RPM至约340RPM、约320RPM至约330RPM、约330RPM至约450RPM、约330RPM至约440RPM、约330RPM至约430RPM、约330RPM至约420RPM、约330RPM至约410RPM、约330RPM至约400RPM、约330RPM至约390RPM、约330RPM至约380RPM、约330RPM至约370RPM、约330RPM至约360RPM、约330RPM至约350RPM、约330RPM至约340RPM、约340RPM至约450RPM、约340RPM至约440RPM、约340RPM至约430RPM、约340RPM至约420RPM、约340RPM至约410RPM、约340RPM至约400RPM、约340RPM至约390RPM、约340RPM至约380RPM、约340RPM至约370RPM、约340RPM至约360RPM、约340RPM至约350RPM、约350RPM至约450RPM、约350RPM至约440RPM、约350RPM至约430RPM、约350RPM至约420RPM、约350RPM至约410RPM、约350RPM至约400RPM、约350RPM至约390RPM、约350RPM至约380RPM、约350RPM至约370RPM、约350RPM至约360RPM、约360RPM至约450RPM、约360RPM至约440RPM、约360RPM至约430RPM、约360RPM至约420RPM、约360RPM至约410RPM、约360RPM至约400RPM、约360RPM至约390RPM、约360RPM至约380RPM、约360RPM至约370RPM、约370RPM至约450RPM、约370RPM至约430RPM、约370RPM至约410RPM、约370RPM至约390RPM、约390RPM至约450RPM、约390RPM至约430RPM、约390RPM至约410RPM、约410RPM至约450RPM、约410RPM至约430RPM或约430RPM至约450RPM)的频率搅拌进行温育所实现的流体剪切力和溶解氧(O2)浓度相同(或基本上相同)的流体剪切力和溶解氧(O2)浓度。
如本领域已知的，可调节多种细胞培养参数以实现特定溶解O2浓度和特定流体剪切力。能够被调节的这些参数的非限定性实例包括：孔体积、液体培养基的体积、孔的形状(例如，直径、高度和孔底部形状中的一项或多项)、搅拌类型(例如，旋转圆形搅拌和/或旋转椭圆形搅拌)、搅拌的频率、培养基类型、孔的内部涂层和液体培养基的温度。这些培养参数的其他实例是本领域已知的。本文描述的或本领域已知的培养参数的任何组合可以任何方式组合以在培养基中实现与占据具有约6.0mm至约35mm的半径和约40mm和约50mm的高度的平底孔体积的约10％至约40％(例如，约15％至约25％)的培养基中在约31℃至约40℃的温度并以约320RPM至约450RPM(例如，约320RPM至约360RPM)的频率搅拌进行培养所实现的流体剪切力和溶解氧(O2)浓度相同(或基本上相同)的流体剪切力和溶解氧(O2)浓度。
液体培养基中的溶解O2水平可使用多种不同的方法检测。例如，溶解O2可使用溶解O2电极或探测器(例如，可从Eutech Instruments WD-35201-80 Dissolved OxygenProbe、Rosemount Analytical 499 Series Dissolved Oxygen/Ozone Sensor、ExtechDO705 Dissolved Oxygen Electrode获得的O2探测器和电极)测量。校准和使用O2探测器和电极的方法可使用制造商的说明书进行。
液体培养基中的流体剪切力可使用本领域已知的方法计算。描述液体培养基中液体剪切力计算的合适教科书的非限定性实例描述在Fluid Mechanics,Robert A.Granger,1995,Dover Publications,Inc.,Mineola,NY，和Fundamentals of Fluid Mechanics,Bruce R.Munson等,John Wiley&Sons,Inc.,2009中。
产生重组蛋白的方法
本文还提供产生重组蛋白的方法，其包括培养使用本文描述的方法能够产生重组蛋白的细胞。在实施所述方法之后，可以从哺乳动物细胞和/或从第一或第二培养基回收所述重组蛋白。在一些实施方案中，在培养方法过程中任何给定的时间点从所述第一和/或第二液体培养基回收所述重组蛋白(例如，在培养的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100天或在超过100天的一天或数天中从第一和/或第二液体培养基回收)。这些方法的一些实施方案进一步包括添加某个体积的第三培养基或某个体积的第四液体培养基，但是在每种情况中，孔中的液体培养基的总体积应该大致等于或小于第一液体培养基体积。
熟练的操作人员会理解可以任何组合使用多种培养参数(例如，本文描述的多孔板、孔、体积、替换培养物体积的速率或频率、搅拌频率、温度、培养基和CO2浓度)中的任何参数来进行这些方法。另外，本文描述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞可用于产生重组蛋白。
可使用分子生物学和分子遗传学中已知的多种多样的方法将编码重组蛋白的核酸引入哺乳动物细胞。非限定性实例包括转染(例如，脂质转染)、转导(例如，慢病毒、腺病毒或逆转录病毒感染)和电穿孔。在一些情况中，编码重组蛋白的核酸不是稳定地整合在哺乳动物细胞的染色体中的(瞬时转染)；而在其他方法中核酸是整合的。可替换地或者此外，编码重组蛋白的核酸可存在于质粒和/或哺乳动物人工染色体(例如，人的人工染色体)中。可替换地或者此外，可使用病毒载体(例如，慢病毒、逆转录病毒或腺病毒载体)将核酸引入细胞中。可将核酸与启动子序列(例如，强启动子，如β-肌动蛋白启动子和CMV启动子或诱导型启动子)可操作地连接。如有需要，含有核酸的载体可还含有选择标记(例如，为哺乳动物细胞赋予潮霉素、嘌呤霉素或新霉素抗性的基因)。
在一些情况中，重组蛋白是分泌蛋白并且由哺乳动物细胞释放至胞外培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)中。例如，编码可溶性重组蛋白的核酸序列可含有编码在重组蛋白的N或C末端的分泌信号肽的序列，其通过哺乳动物细胞中存在的酶被切割，并且随后释放至胞外培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)中。例如，这样的分泌的重组蛋白可为分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。在其他情况中，所述重组蛋白是不被分泌的可溶性蛋白，并且所述重组蛋白从哺乳动物细胞内回收。例如，不被分泌的重组蛋白可为免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。
能够通过本文提供的方法产生的重组蛋白的非限定性实例包括免疫球蛋白(包括轻链和重链免疫球蛋白、抗体或抗体片段(例如，本文描述的任何抗体片段)、酶(例如，半乳糖苷酶(α-半乳糖苷酶)、Myozyme或Cerezyme)、蛋白质(例如，生长因子、人促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)或干扰素α或β)、工程化蛋白或免疫原性或抗原性蛋白或蛋白片段(例如用于在疫苗中使用的蛋白质))。在一些实施方案中，重组蛋白是工程化抗原结合多肽，其含有至少一个多功能重组蛋白支架(参见，例如，在Gebauer等，CurrentOpin.Chem.Biol.13:245-255,2009；和美国专利申请公开号2012/0164066(通过提述以其整体并入本文)中描述的重组抗原结合蛋白)。作为抗体的重组蛋白的非限定性实例包括：帕尼单抗(panitumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿托续单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿珠单抗(alacizumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、alirocumab、阿妥莫单抗(altumomab)、阿麦妥昔单抗(amatuximab)、马安莫单抗(anatumomab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、巴利昔单抗(basilizimab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比西单抗(biciromab)、卡那单抗(canakinumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达珠单抗(daclizumab)、迪诺赛单抗(densumab)、艾库组单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法利珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、达珠单抗(etaracizumab)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、他珠单抗(natalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)和曲妥单抗(trastuzumab)。能够通过本领域描述的方法产生的治疗性抗体的其他实例是本领域已知的。能够通过本发明的方法产生的重组蛋白的其他非限定性实例包括：阿葡糖苷酶阿尔法(alglucosidase alfa)、拉罗尼酶(laronidase)、阿贝西普(abatacept)、加硫酶(galsulfase)、促黄体素α(lutropin alfa)、抗血友病因子(antihemophilic factor)、阿加糖酶-β(agalsidase beta)、干扰素β-1a(interferonbeta-1a)、阿法达贝泊汀(darbepoetin alfa)、替奈普酶(tenecteplase)、伊纳西普(etanercept)、凝血因子IX(coagulation factor IX)、卵泡雌激素(folliclestimulating hormone)、干扰素β-1a(interferon beta-1a)、伊米苷酶(imiglucerase)、阿法链道酶(dornase alfa)、阿法依泊汀(epoetin alfa)和阿替普酶(alteplase)。
分泌的可溶性重组蛋白可通过将液体培养基从哺乳动物细胞去除或以其他方式在物理上分开而从液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)回收。用于从哺乳动物细胞去除液体培养基的多种不同的方法是本领域已知的，包括，例如，离心、过滤、移液和/或抽吸。然后可使用多种生物化学技术从液体培养基回收并进一步纯化分泌的重组蛋白，所述技术包括多种类型的层析(例如，亲和层析、分子筛层析、阳离子交换层析或阴离子交换层析)和/或过滤(例如，分子量截留过滤)。
为了回收胞内重组蛋白，可裂解哺乳动物细胞。用于裂解哺乳动物细胞的多种多样的方法是本领域已知的，包括，例如，超声处理和/或洗涤剂、酶和/或化学裂解。可使用多种本领域已知的生物化学方法从哺乳动物细胞裂解液纯化重组蛋白，所述方法通常以离心去除细胞碎片的步骤开始，然后是一个或多个额外步骤(例如，一种或多种类型的层析(例如，亲和层析、分子筛层析、阳离子交换层析或阴离子交换层析)和/或过滤(例如，分子量截留过滤))。
在一些实施方案中，回收的重组蛋白是按重量计至少或约50％纯的，例如，按重量计至少或约55％纯的，按重量计至少60％纯的，按重量计至少65％纯的，按重量计至少70％纯的，按重量计至少75％纯的，按重量计至少80％纯的，按重量计至少85％纯的，按重量计至少90％纯的，按重量计至少95％纯的，按重量计至少96％纯的，按重量计至少97％纯的，按重量计至少98％纯的，或按重量计至少或大约99％纯的或按重量计大于99％纯的。
实施例
在下列实施例中进一步描述本发明，所述实施例不对权利要求中记载的本发明的范围进行限制。
实施例1.示例性培养方法的有益特性
进行实验以生成灌注培养的小规模高通量模型并测定这些培养是否能够实现与生产灌注培养类似的细胞密度。
材料和方法
重组半乳糖苷酶悬浮细胞培养
在每个细胞培养方法运行中使用了产生重组半乳糖苷酶的同一选殖细胞系，并且将用于每个细胞培养方法运行的培养基列于表1中。
表1.研究中使用的培养基
仪器和试剂
在本实施例描述的细胞培养方法运行中使用了以下仪器和试剂：Multitron摇动培养箱(Appropriate Technical Resources,Inc.)(型号AJ125)、Auto1000(Nexcelom Bioscience LLC)、Beckman Coulter Allegra离心机(型号Allegra X-14 R)、Bioreactors 50(Techno Plastic Products AG,Trasadingen,Switzerland)、96-孔微板2-mL(Griener Bio One,Frickenhausen,Germany)、96-孔微板1-mL(Griener Bio One,Frickenhausen,Germany)、Olympus白光桌面型显微镜(型号BH-s)、Olympus白光桌面型显微镜(型号BX40)、Olympus白光桌面型显微镜(型号BX41)、0.4％锥虫蓝溶液(Sigma)、0.2％锥虫蓝溶液(Sigma)、Reichert Bright-血细胞计数仪腔室、Thermo Scientific显微镜盖玻片、Fisher Scientific Laboratory Counter、JMP Software(版本X)、ApplikonMicroFlask微量滴定板夹持装置(Applikon Biotechnology Inc.)、AeraSeal、微孔抛弃式膜密封(Phenix Research Products)、Beckman Coulter3000 LaboratoryAutomation Workstation、RAININ Pipetting 360°Pipet-Lite TM XLS TM Pipettor(Mettler Toledo)、Ergenomic High-Performance Pipettor和试剂贮液器(VistaLab Technologies)。
方法
实施研究以测试搅拌(RPM)、孔形状和工作体积的一系列变化条件。设计研究以覆盖320RPM至360RPM的搅拌范围、圆底(1-mL标称容积)或方底(2-mL标称容积)孔和100μL至600μL工作体积。实施细胞培养方法运行I以测定用于圆底深孔板(1-mL标称容积)的操作条件的基础。实施细胞培养方法运行II以测定圆底深孔板支持高密度细胞培养的能力。实施细胞培养方法运行III以建立用于设计优化的参数范围，以及比较Applikon MicroFlask微量滴定板夹持装置(Applikon Biotechnology,Inc.,Foster City,CA)与无菌的、微孔膜密封(AeraSeal,Phenix Research Products,Candler NC)。设计实施细胞培养方法运行IV和V用于模型优化目的。
使用JMP软件的定制设计工具设计细胞培养方法运行V。考虑到三阶相互作用(third-order interaction)，将模型设计为对于两个连续的变量(摇动速度和工作体积)和一个分类响应(孔形状)的I最佳。根据表2(其中工作体积作为总容器体积的分数列出)设定下限和上限。定制设计以具有2次幂来考虑变量之间的任何非线性关系。最后，设计研究以使一式两份重复运行的每个实验具有总共15个条件(圆底孔6个和方底孔9个)。
表2.JMP中使用的连续变量设置
变量 下限 上限
摇动速度(RPM) 320 360
工作体积 0.1 0.3
工作体积(mL) 2 30
将全部容器使用来自种子培养物的细胞以5x106活细胞/mL接种，所述种子培养物在细胞库的小瓶解冻后对于细胞培养方法运行1-5分别在振荡烧瓶中扩大9、10、7、0和7次传代。将细胞培养物保持在摇动培养箱中5％CO2、37℃和80％相对湿度的受控环境中。对照摇管条件与每个实验一起运行，其具有10mL每管的恒定工作体积、45°的摇动角度和160RPM的搅拌。对于全部实验(除非另行注明)，根据表3考虑了蒸发。
表3.蒸发补充
变量 圆形DWP 方形DWP
Applikon 20μL 20μL
抛弃式膜 20μL 40μL
对于细胞培养方法运行I，将圆底深孔板以5x105活细胞/mL和1x106活细胞/mL接种。在接种后的第一天开始，每天采样(10μL)培养物以通过手动计数(排除锥虫蓝)测定活细胞密度(VCD)，进行两日。
对于细胞培养方法运行II，在接种后的第一天开始，每日采样(10μL)培养物以通过手动计数测定VCD达11日。在细胞计数之后，将板以～233x g离心5分钟，并去除用过的培养基。以表4中描述的比例交换培养基。
使用圆底(1-mL)深孔板和方底(2-mL)深孔板用于细胞培养方法运行III和IV。在接种后的第一天开始，在每个周一、周三和周五采样培养物(2-2-3时间表)(10μL)以通过Auto 1000测定VCD。在细胞计数之后，将板以～233x g离心5分钟，并去除用过的培养基。以表4中描述的比例交换培养基。
对于细胞培养方法运行V，使用了Biomek 3000液体处理器。在接种后的第一天开始，在每个周一、周三和周五采样培养物(0.10x工作体积)以通过Auto 1000确定VCD。在细胞计数之后，将板以～233x g离心5分钟，并立即使用去除的用过的培养基或将其储存在-80℃直到进行重组人α-半乳糖苷酶(rhα-Gal)活性测定法以测定产物滴度/效价。以表5中描述的比例交换培养基，并使用下文的等式1和2计算rhα-Gal体积生产率和比生产率。此外，使用下文的等式3计算整体/积分的(integrated)活细胞密度(IVCD)。
表4.批次再补料时间表
接种后的培养日1 再补料速率(生物反应器体积每天)
第1–3天 0.5RV/d
第4–6天 0.7RV/d
第7天起 1.0RV/d
1接种时的接种密度为5x105细胞/mL.
表5.修饰的批次再补料时间表
接种后的培养日1 再补料速率(生物反应器体积每天)
第1–3天 0.4RV/d
第4–6天 0.5RV/d
第7–10天 0.7RV/d
第11天起 2x0.5RV/d
1接种时的接种密度为5x105细胞/mL。
VPR＝滴度*PR 等式1
PR：灌注速率
VPR：体积生产率(U/L/d)
Titer：rhα-Gal活性(U/L)
SPR：比生产率(U/E9细胞/d)
Xv：活细胞计数(E6细胞/mL)
IVCD：整体/积分的活细胞密度(细胞-d/mL)
t：时间(d)
手动细胞计数
用异丙醇(IPA)清洁血细胞计数器腔室和盖片。将盖片的角落用IPA沾湿，并固定至血细胞计数器。将细胞样品均匀地按照1:1与0.4％锥虫蓝混合。将10μL等分试样转移至血细胞计数器腔室。在四个较大的外正方形中计数细胞：每个大的外正方形含有16个较小的正方形网格。将位于较大正方形的边界上的细胞仅对四边中的两边进行计数。将未染色的细胞计算为活细胞，同时将那些染为蓝色的细胞认为是死细胞。百分比活力和活细胞密度使用下文的等式4和5计算。
总细胞：活细胞和死细胞之和
Nexcelom细胞计数器细胞计数
将细胞样品均匀地按照1:1与0.2％锥虫蓝混合。将混合物的20μL等分试样转移至仪器专用载片。在通过仪器中整合的数码相机取得的四幅图像中计数细胞。将未染色的细胞计算为活细胞，同时将那些染为蓝色的细胞认为是死细胞。
统计学分析
使用JMP软件进行统计学分析。使用的应答为使用最大化期望值(maximizeddesirability)的峰值活细胞密度(VCD或X V)和体积生产率(VPR)。通过带有效果筛选报告的“拟合模型”功能评价统计学模型。‘分选参数估计’报告了显著影响应答变量的因素，其是通过t检验在统计学上确定的。最后，‘预测分析器(Prediction Profiler)’绘制了参数对应答变量的效果的独立趋势，并使用模型通过最大化期望值功能来预测最佳条件。
结果
细胞培养方法运行I
在本实验中，在小瓶解冻之后第27天，将rhα-Gal CHO细胞系(于CD CHO培养基中)用于在三种不同条件(表6)下接种容器。追踪细胞培养增殖概貌11天。
表6.细胞培养方法I测试的条件
容器类型 总体积 工作体积 摇晃速度
摇管 50mL 10mL 160RPM
96DWP(圆形) 1mL 200μL 330RPM
96DWP(圆形) 1mL 300μL 330RPM
保持在CD CHO培养基中的培养物十一天的活细胞密度概貌示于图5。观察了全部实验培养物中的生长。对于以5x105细胞/mL接种的细胞，在两种工作体积下(200μL和300μL)存在达到1x106细胞/mL的VCD的最小生长。这表明细胞能够以低接种密度在圆底深孔板中生长。以1x106细胞/mL接种的培养物也在第2天展现出生长，其中以0.5RV每天再补料两次的培养物具有更好的生长(图6)。再补料两次的培养物在第2天达到了2x106细胞/mL以上的VCD：以200μL为2.7x106细胞/mL，而以300μL为2.3x106细胞/mL。以大约1.0RV/天再补料的培养物在第2天具有低得多的VCD，这可能也是因为在去除用过的培养物的过程中无意的细胞损失。这些数据指示2x0.5RV/天的灌注速率允许比1.0RV/天的灌注速率更好的细胞生长。这些数据提示圆底1-mL 96深孔板能够支持细胞生长。在整个实验过程中，当从摇动培养箱中立即取出时，观察到了培养物具有小细胞团块，可能是因为不充分的搅拌。这一观察结果提示对于圆底1-mL深孔板应该使用更高的搅拌速度。
细胞培养方法运行II
进行了一组实验来优化用于在圆底(1-mL)96深孔板中培养细胞的灌注速率。在这些实验中，使用CD CHO培养基中的rhα-Gal细胞(小瓶解冻之后的第30天)来接种圆底96深孔板中的孔和摇管(如表7中所述)。在11天的分批再补料过程中评估了细胞培养表现。
表7.细胞培养方法运行测试的条件
容器类型 总体积 工作体积 振荡速度
摇管 50mL 10mL 160RPM
96DWP(圆形) 1mL 300μL 360RPM
全部培养物保持了85％以上的百分比细胞活力(图7)。保持在CD CHO培养基中的细胞的11天培养的活细胞密度概貌示于图8。对于全部培养观察到了生长直到第9天，此时实验对照(摇管培养)细胞生长达到了25x106细胞/mL的峰值密度的平台期。圆底96深孔板中的培养物展现了比实验对照慢的生长速率，达到8x106细胞/mL的峰值VCD。在第8天，考虑到蒸发损失，向圆底96深孔板培养物添加了培养基的推注(50μL)。
圆底96深孔板的这些数据提示应该调整再补料时间表。修改的再补料时间表示于图9和表3。
细胞培养方法运行III
进行了一组实验来优化用于在圆底96深孔板中培养细胞的再补料速率。这些实验使用1-mL圆底和2-mL方底两种96深孔板和图9中所示的修改的再补料速率方案进行。在小瓶解冻之后的第8天，将CD CHO培养基中的rhα-Gal细胞用于接种两种类型的深孔板和摇管(参见，表8)。方底96深孔培养含有300μL或500μL的培养体积，而圆底96深孔培养含有200μL或300μL的培养体积(1mL标称容积)。这些孔使用Applikon系统或使用AeraSeal膜之一来密封。将全部96深孔板培养以330RPM或360RPM搅拌。在9天期间测量了细胞培养物生长。对96深孔板培养的全部活细胞计数均在一式三份重复的孔中进行计数并进行平均。
15天细胞培养的活细胞密度概貌示于图10。使用Applikon系统覆盖的或使用抛弃式膜密封覆盖的方底96深孔板培养展现了相似的生长曲线(彼此处在一个标准偏差(1SD)之内)。96孔板形式中最高的活细胞密度是35x106细胞/mL的活细胞密度，其是在方底96深孔板中在第15天时实现的。在对照摇管培养中实现的最高活细胞密度是第10天时的21x106细胞/mL。直到第13天，方底96深孔板培养还非常接近地模仿了对照摇管培养的生长曲线。然而，方底96深孔板培养在整个15天的过程中模仿了历史摇管对照(n＝11)。最接近地模仿了历史摇管对照培养的两种方底96深孔板培养使用了抛弃式膜覆盖并且以330RPM搅拌并且具有300μL或500μL的培养体积。
在本实验中的圆底96深孔板培养没有展现出与对照摇管培养相当的生长。在圆底96深孔板培养中观察到的最高活细胞密度是第15天时的14x106细胞/mL。全部培养保持了85％以上的百分比细胞活力(图11)，直到进入下降期。与摇管对照不同，两种孔形状中的培养持续地增殖超过第14天，到第20天达到了50x106细胞/mL(方底)和17x106细胞/mL(圆底)的活细胞密度(图12和13)。这些数据指示圆底96深孔板能够支援高细胞密度。
表8.细胞培养方法运行III测试的条件
容器类型 总体积 工作体积 摇晃速度 无菌覆盖
摇管 50mL 10mL 160RPM 排气盖
96DWP(圆形) 1mL 200μL 330RPM Applikon
96DWP(圆形) 1mL 300μL 330RPM Applikon
96DWP(圆形) 1mL 200μL 330RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 1mL 300μL 330RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 1mL 200μL 360RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 1mL 300μL 360RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 300μL 330RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 500μL 330RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 300μL 330RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 500μL 330RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 300μL 360RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 500μL 360RPM 抛弃式膜
细胞培养方法运行IV
进行了另外一组实验来优化方底96深孔板(2-mL标称容积)中的细胞生长。在这些实验中，在小瓶解冻之后的第1天，使用CD CHO培养基中的细胞来接种方底96深孔板和摇管(n＝3)(参见，表9)。在这些实验中使用的培养体积是300μL或500μL，并且以320RPM、330RPM或340RPM搅拌培养物。在14天期间评估了培养物中的细胞生长。对于培养物的全部活细胞计数均从一式三份重复的孔中计数并进行平均。
表9.细胞培养方法运行IV测试的条件
容器类型 总体积 工作体积 摇晃速度 无菌覆盖
摇管 50mL 10mL 160RPM 排气盖
96DWP(圆形) 2mL 300μL 320RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 2mL 500μL 320RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 2mL 300μL 330RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 2mL 500μL 330RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 2mL 300μL 340RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 2mL 500μL 340RPM 抛弃式膜
在14天期间的方底96深孔板培养的活细胞密度概貌示于图14中。直到第7天，所有测试的条件展现出了相似的生长概貌。在第7天之后，具有500μL的培养体积并以320RPM或330RPM搅拌的方底96深孔板展现了更好的细胞生长。尽管全部测试的培养条件均持续增殖到过了第13天之后，达到30x106细胞/mL至35x106细胞/mL的活细胞密度，具有更好的生长表现的两种培养条件达到了40x106细胞/mL以上的活细胞密度。在第12天之后，在具有500μL的培养体积和320RPM或330RPM的搅拌速率的方底96深孔板培养中实现的活细胞密度超过了摇管中相同细胞系的培养物在历史上观察到的活细胞密度(落入1标准偏差之内)。直到培养的第12天，在具有500μL的培养体积和320RPM或330RPM的搅拌速率的方底96深孔板培养中和摇管培养中观察到了相似的生长模式。
细胞培养方法运行V
进行了另外一组实验来优化细胞培养操作条件(参见，上文对实验方法设计的描述)。在这些实验中，在小瓶解冻之后第21天，使用CD CHO中的细胞来接种方底或圆底96深孔板或摇管。每种测试的培养的操作条件示于表10。将测试的每种96深孔板用AeraSeal抛弃式膜覆盖。摇管培养充当对照(n＝4)：一组两个摇管培养按照对照再补料时间表，而另一组两个摇管培养按照用于96深孔板中的修改的再补料速率(图9中所示)。全部条件以一式两份重复测试。在9天的分批再补料方法中评估了细胞生长。
表10.细胞培养方法允许V测试的条件
容器类型 总体积 工作体积 摇晃速度 无菌覆盖
摇管 50mL 10mL 160RPM 排气盖
96DWP(圆形) 1mL 100μL 320RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 1mL 300μL 320RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 1mL 200μL 340RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 1mL 100μL 360RPM 抛弃式膜
96DWP(圆形) 1mL 300μL 360RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 200μL 320RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 400μL 320RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 600μL 320RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 200μL 340RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 400μL 340RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 600μL 340RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 200μL 360RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 400μL 360RPM 抛弃式膜
96DWP(方形) 2mL 600μL 360RPM 抛弃式膜
列于表10中维持在CD CHO培养基中的细胞的15天培养的活细胞密度概貌示于图15和16。在当前测试的条件下，圆底96深孔板培养不像方底培养一样表现良好(分别为图15和图16)。对于在360RPM搅拌的100μL培养，圆底96深孔板中达到的最高活细胞密度是20x106细胞/mL。与具有接近40x106细胞/mL的峰值活细胞密度的对照摇管培养相比，方底96深孔板培养具有相当的活细胞密度(在1标准偏差之内)(当使用上文所述的修改的再补料速率时)。使用400μL的培养体积和320RPM或340RPM的搅拌实现了最好的方底96深孔细胞培养，在第15天达到了大约50x106细胞/mL的峰值活细胞密度。另外，具有600μL培养体积和340RPM的搅拌的方底96深孔在第13天产生了高达27x106细胞/mL的细胞生长，并且产生了与达到31x106细胞/mL的峰值活细胞密度的摇管对照培养(对照再补料速率)相当的结果。全部测试的培养保持了大于85％的活细胞百分比。在摇管对照培养和96深孔培养的整体/积分的活细胞密度之间进行的比较示于图17和18。
在CD CHO中培养的细胞的15天培养的体积生产率概貌示于图19和20。正如基于活细胞生长所预测的，在圆底96深孔板中生长的培养物具有较低的生产力(图19)。22,000单位/L/天的最佳体积生产率是在第15天在圆底96深孔板内100μL培养基中并以320RPM的搅拌生长的培养物中观察到的(图19)。然而，具有相同培养体积和搅拌的圆底96深孔板培养在之前数天具有低的体积生产率(<5000单位/L/天)。在方底96深孔培养中观察到了改进的体积生产率(图20)，其紧密地遵循了生长概貌。对于生长模式紧密地模仿了摇管培养的培养(具有600μL体积并以340RPM搅拌的方底培养)观察到了相当的活性(到第15天为40000单位/L/天)。具有初始生长延迟但最终与对照摇管培养具有类似的峰值活细胞密度的数种培养(方底96深孔培养，其具有400μL的体积和340RPM的搅拌，或400μL或600μL的体积或360RPM的搅拌)直到第13天展现了类似的体积生产率(达到约40,000单位/L/天的体积生产率)。在第13天之后，体积生产率减少，除了以400μL的体积和360RPM的搅拌生长的培养，其在第15天达到了60,000单位/L/天的体积生产率。在具有400μL的体积并以320RPM搅拌的方底96深孔培养中观察到了最佳生产力，其在第15天达到了67,000单位/L/天的体积生产率。
用于圆底96深孔板培养的大多数条件展现了与对照摇管培养相比相当的或更低的比生产率(SPR)，除了在100μL的体积中生长并以320RPM搅拌的培养，或在300μL的体积中生长并以360RPM搅拌的培养(图21)。这些培养在第15天具有增加的比生产率。具有相当的或更大的体积生产率的五种方底96深孔板培养也展现了与对照摇管培养(1600单位/1x109细胞/天)相当的或更大的比生产率(图22)。
将收集的数据传入JMP实验设计，以基于统计学分析预测最佳操作条件。使用三种响应预测最佳操作条件：峰值活细胞密度、峰值体积生产率和峰值比生产率。设定全部响应限以最大化输出。首先，将数据拟合至模型，如图23和24所示。对于活细胞密度(图23)和体积生产率(图24)收集的数据与模型匹配良好。统计学分析(t检验)揭示了孔形状和工作体积显著影响活细胞密度和生产力二者，而摇动速度仅显著影响生产力。
使用JMP分析仪预测了最佳操作条件(图25)。基于该分析，最佳细胞表现应该在使用具有440μL工作体积并以360RPM搅拌的方底96深孔板时获得。将标准偏差考虑在内并维持相同的合意性，对于方底96深孔板的最佳操作范围是工作体积为约350μL至约550μL，而摇动速度为约320RPM至约360RPM。
综上，数据显示本文提供的方法能够用作较大规模灌注生物反应器细胞培养的模型(例如，通过在相似的时间框架内实现相似的细胞密度)。本文提供的方法能够用于高通量筛选组织培养基(和组织培养基内的组分)。
实施例2. 96深孔培养方法用于筛选培养基的用途
进一步进行了一组实验以使用本文描述的96深孔培养方法测试多种不同的组织培养基。在这些实验中，将产生单株株抗体的重组哺乳动物细胞系(产mAb细胞)或产生酶的重组哺乳动物细胞系(产酶细胞)用于接种方底96深孔板，并将细胞在500μL的至少102种不同的组织培养基之一中伴随330RPM的搅拌培养一周。这些实验中的对照是使用相同的96深孔板、相同的培养基、相同的样品细胞系和CD CHO培养基实现的活细胞密度。在历时七天中测量了培养物的活细胞密度和滴度/效价二者。
图26-29中的数据显示本文描述的96深孔培养方法能够筛选不同组织培养基对培养的细胞的生产力和活细胞密度的作用。
其他实施方案
应理解的是，尽管已经结合本发明的详述对本发明进行了描述，但是前文的描述旨在阐释而不在限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围来限定。其他方面、优势和修饰在所附权利要求的范围内。

Claims (76)

1.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：
提供包含至少一个孔的多孔板，所述孔包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积；
在约31℃至约40℃并以约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌，将所述多孔板温育一段时间；和
在所述时间段过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基，并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等。
2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
3.权利要求2的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。
4.权利要求3的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。
5.一种产生重组蛋白的方法，该方法包括：
提供包含至少一个孔的多孔板，所述孔包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积，并且所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸；
在约31℃至约40℃并以约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌，将所述多孔板温育一段时间；
在所述时间段过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；和
从所述哺乳动物细胞或从所述第一或第二培养基回收所述重组蛋白。
6.权利要求5的方法，其中所述重组蛋白回收自所述哺乳动物细胞。
7.权利要求6的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。
8.权利要求5的方法，其中所述重组蛋白回收自所述第一或第二液体培养基。
9.权利要求8的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。
10.一种用于测试用于制备重组蛋白的制造工艺的方法，所述方法包括：
提供包含至少一个孔的多孔板，所述孔包含置于第一液体培养基中的哺乳动物细胞，其中所述第一液体培养基占据约5％至约70％的孔体积，并且所述哺乳动物细胞含有编码重组蛋白的核酸；
在约31℃至约40℃并伴随约320转每分钟(RPM)至约500RPM旋转搅拌，将所述多孔板温育一段时间；
在所述时间段过程中，连续地或周期性地去除第一体积的第一液体培养基并向所述第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基，其中所述第一和第二体积大致相等；
检测所述哺乳动物细胞中或所述第一或第二液体培养基中的重组蛋白；和
将所述哺乳动物细胞中或所述第一或第二液体培养基中存在的重组蛋白的量与重组蛋白的参考水平进行比较。
11.权利要求10的方法，其中所述重组蛋白的参考水平是使用不同的培养方法产生的重组蛋白的水平。
12.权利要求11的方法，其中所述不同的培养方法利用不同的第一或第二液体培养基、不同的哺乳动物细胞、不同的温度、不同的搅拌水平或不同的多孔板。
13.权利要求11的方法，其中所述不同的培养方法利用不同的原材料、抗结块剂或化学上限定的液体培养基。
14.权利要求10的方法，其中所述方法用于实施高通量细胞培养实验来执行实验设计(design-of-experiment；DOE)或质量源于设计(quality-by-design；QBD)研究。
15.权利要求10的方法，其中在所述第一或第二液体培养基中检测所述重组蛋白。
16.权利要求15的方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。
17.权利要求10的方法，其中在所述细胞中检测所述重组蛋白。
18.权利要求17的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。
19.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述第一体积的第一液体培养基基本上不含哺乳动物细胞。
20.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述第一液体培养基占据约10％至约60％的孔体积。
21.权利要求5或10的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
22.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述旋转搅拌为约320RPM至约400RPM。
23.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基同时实施。
24.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基连续实施。
25.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和添加第二体积的第二液体培养基周期性实施。
26.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积随时间增加。
27.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中：
将所述多孔板温育超过7天的时间段，并且在温育的第1至3天中的每24小时时段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约50％；
在培养的第4至6天中的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约40％至约70％；
并且从培养的第7天起的每24小时的时间段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约90％至约150％。
28.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔具有约1mL至约18mL的体积。
29.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔具有约1mL至约7mL的体积。
30.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔具有约1mL至约3.5mL的体积。
31.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述多孔板是6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。
32.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述多孔板是深孔板。
33.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔的底部直径为约6.0mm至约35mm。
34.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔的高度为约12mm至约50mm。
35.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述哺乳动物细胞悬浮在约150μL至约15mL的第一培养基中。
36.权利要求35的方法，其中所述哺乳动物细胞悬浮在约150μL至约10mL的第一培养基中。
37.权利要求36的方法，其中该哺乳动物细胞悬浮在约150μL至约5mL的第一培养基中。
38.权利要求37的方法，其中该哺乳动物细胞悬浮在约150μL至约1mL的第一培养基中。
39.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述第一液体培养基和/或第二液体培养基选自下组：化学上限定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质培养基。
40.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中在约最初的24至48小时时段之后，在每24小时时段内，去除的第一液体培养基的第一体积和添加的第二培养基的第二体积是第一液体培养基的体积的约30％至约150％。
41.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中在去除所述第一体积的第一液体培养基之前，使搅拌中止至少30秒的一段时间。
42.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述多孔板用透气性抛弃式膜密封。
43.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述多孔板用透气性硅酮层(gas-permeable silicone layer)密封。
44.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔具有平底。
45.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述孔具有圆底。
46.权利要求1、5和10中任一项的方法，进一步包括周期性地添加额外体积的第二液体培养基至多个孔中的每个孔，从而抵消因蒸发所致的第一液体培养基体积的任何减少。
47.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中去除第一体积的第一液体培养基和向第一液体培养基添加第二体积的第二液体培养基使用自动化设备实施。
48.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述多孔板是权利要求69的多孔细胞培养板系统。
49.权利要求1、5和10中任一项的方法，其中所述方法在孔中产生15x106细胞/mL至60x106细胞/mL的活细胞密度。
50.一种培养哺乳动物细胞的方法，所述方法包括：
在梯度灌注工艺(gradient perfusion process)中培养悬浮在置于多孔板孔中的液体培养基中的哺乳动物细胞，所述培养条件为在所述培养基中产生的流体剪切力(fluidsheer force)和溶解氧(O2)浓度与占有约6.0mm至约35mm直径和约40mm至约50mm高度的方底孔约15％至约25％体积的培养基中当所述方底孔在约31℃至约40℃的温度温育并且以约320转每分钟(RPM)至约360RPM的频率旋转搅拌时所实现的基本上相同。
51.权利要求50的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
52.权利要求51的方法，其中所述CHO细胞含有编码重组蛋白的核酸。
53.权利要求52的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。
54.一种产生重组蛋白的方法，所述方法包括：
在梯度灌注方法中培养悬浮在置于多孔板孔中的液体培养基中的哺乳动物细胞，所述培养条件为在所述培养基中产生的流体剪切力和溶解氧(O2)浓度与占有约6.0mm至约35mm直径和约40mm至约50mm高度的方底孔约15％至约25％体积的培养基中当所述方底孔在约31℃至约40℃的温度温育并且以约320转每分钟(RPM)至约360RPM的频率旋转搅拌时所实现的基本上相同；和
从所述哺乳动物细胞或所述液体培养基回收所述重组蛋白。
55.权利要求54的方法，其中所述重组蛋白回收自所述哺乳动物细胞。
56.权利要求55的方法，其中所述重组蛋白是免疫球蛋白、酶、生长因子、蛋白片段或工程化蛋白。
57.权利要求54的方法，其中所述重组蛋白回收自所述液体培养基。
58.权利要求57方法，其中所述重组蛋白是分泌的免疫球蛋白、分泌的酶、分泌的生长因子、分泌的蛋白片段或分泌的工程化蛋白。
59.权利要求54的方法，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
60.权利要求50或54的方法，其中所述多孔板是经选择的6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板。
61.权利要求50或54的方法，其中所述多孔板是深孔板。
62.权利要求50或54的方法，其中所述液体培养基选自下组：化学上限定的液体培养基、无血清液体培养基、含血清液体培养基、无动物来源组分的液体培养基和无蛋白质培养基。
63.权利要求50或54的方法，其中所述多孔板用透气性抛弃式膜密封。
64.权利要求50或54的方法，其中所述多孔板用透气性硅酮层密封。
65.权利要求50或54的方法，其中所述多孔板包含具有平底的孔。
66.权利要求50或54的方法，其中所述多孔板包含具有圆底的孔。
67.权利要求50或54的方法，其中所述多孔板是权利要求69的多孔细胞培养板系统。
68.权利要求50或54的方法，其中所述培养在所述孔中产生15x106细胞/mL至60x106细胞/mL的活细胞密度。
69.一种多孔细胞培养板系统，包含：
一体支持板，其包含含有多个孔的第一表面；
置于所述支持板内并配置以放置在体积方面具有约200μL至约18mL体积的细胞培养物的多个培养容器，其中每个孔与每个培养容器配对并且限定进入每个培养容器中的开口，且其中每个培养容器进一步包含至少一个配置用于容纳流入和/或流出所述培养容器的流体流的端口。
70.权利要求69的多孔细胞培养板系统，其中配置所述一体支持板以包含用于放置液体和向所述端口供应液体的贮液器。
71.权利要求69的多孔细胞培养板系统，其中所述培养容器包含至少第一和第二端口，其中配置所述第一端口以容纳流体的单向流流入所述培养容器，并且配置所述第二端口以容纳流体的单向流流出所述培养容器。
72.权利要求69的多孔细胞培养板系统，其中所述端口包含经配置以选择性防止细胞流入和流出所述培养容器的过滤器。
73.权利要求71的多孔细胞培养板系统，其中所述第一和第二端口各自包含经配置以选择性防止细胞流入和流出所述培养容器的过滤器。
74.权利要求69的多孔细胞培养板系统，进一步包含至少一个置于所述一体支持板内并且与所述端口流体连接的导管，其中配置所述导管以使流体流至和/或流自所述培养容器。
75.权利要求69的多孔细胞培养板系统，进一步包含至少一个与至少一个端口可操作地连接的流体流调节器。
76.权利要求74的多孔细胞培养板系统，进一步包含至少一个与至少一个导管可操作地连接的流体流量计。
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