KR102479281B1 - 관류 배양 방법 및 이들의 용도 - Google Patents
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Abstract
포유류 세포의 배양 방법 및 이러한 배양 방법을 이용하는 다양한 방법이 본원에 제공된다. 또한, 예로, 관류 배양 방법에서 이용하기 위한, 다중-웰 세포 배양 플레이트가 제공된다.
Description
관련
출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2014년 6월 6일에 출원된 U.S. 특허 가출원 일련 번호 제62/009,058호에 대한 우선권을 청구한다; 그 전체 내용은 본원에 참조로서 포함된다.
기술 분야
본 발명은 분자 생물학, 세포 배양 공정 개발, 및 재조합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 포유류 세포는 종종 치료적으로 또는 상업적으로 중요한 단백질을 생산하기 위해 이용된다. 몇몇 고처리량(HT) 세포 배양 시스템이 수 년 동안 공급-회분식 공정을 위해 생물공학 산업 내에서 이용되어 왔으나, 존재하는 다중-웰 플레이트를 이용한 관류-기반 세포 배양에 대한 HT 모델은 알려져 있지 않다.
본 발명은 적어도 부분적으로 본원에 기재된 특정 방식으로 다중-웰 플레이트에서 포유류 세포를 배양하는 것이 실질적으로 개선된 생활성 세포 밀도 및 재조합 단백질 생산을 일으키며 대규모 관류, 생산 바이오리액터에서 배양 성능의 정확한 모델을 제공한다는 발견에 기반한다. 상기 발견의 측면에서, 포유류 세포의 배양 방법, 재조합 단백질의 생산 방법, 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 제조 공정의 평가 방법이 본원에 제공된다. 또한, 예로, 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위해 이용될 수 있는 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템이 제공된다.
포유류 세포의 배양 방법으로서, 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 제공하는 단계로써, 제1 액체 배양 배지가 웰 부피의 약 5% 내지 약 70%를 점유하는, 단계; 약 31℃ 내지 약 40℃에서 분당 약 320회전(RPM) 내지 약 500 RPM의 회전 진탕으로 일정 시기 동안 다중-웰 플레이트를 인큐베이션하는 단계; 및 연속적으로 또는 주기적으로 일정 시기 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계로써, 제1 및 제2 부피는 대략 동일한, 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 포유류 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 이들 방법의 일부 구현예에서, CHO 세포는 재조합 단백질(예로, 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편, 또는 조작된 단백질)을 인코딩하는 핵산을 함유한다.
또한 재조합 단백질의 생산 방법으로서, 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 제공하는 단계로써, 제1 액체 배양 배지가 웰 부피의 약 5% 내지 약 70%를 점유하고 포유류 세포가 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는, 단계; 약 31℃ 내지 약 40℃에서 분당 약 320회전(RPM) 내지 약 500 RPM의 회전 진탕으로 일정 시기 동안 다중-웰 플레이트를 인큐베이션하는 단계; 연속적으로 또는 주기적으로 일정 시기 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계로써, 제1 및 제2 부피는 대략 동일한, 단계; 및 포유류 세포로부터 또는 제1 또는 제2 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예로, 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편, 또는 조작된 단백질)은 포유류 세포로부터 회수된다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예로, 분비된 면역글로불린, 분비된 효소, 분비된 성장 인자, 분비된 단백질 단편, 또는 분비된 조작된 단백질)은 제1 또는 제2 액체 배양 배지로부터 회수된다.
재조합 단백질을 제조하기 위한 제조 공정의 평가 방법으로서, 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 제공하는 단계로써, 제1 액체 배양 배지가 웰 부피의 약 5% 내지 약 70%를 점유하고 포유류 세포가 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는, 단계; 약 31℃ 내지 약 40℃에서 분당 약 320회전(RPM) 내지 약 500 RPM의 회전 진탕으로 일정 시기 동안 다중-웰 플레이트를 인큐베이션하는 단계; 연속적으로 또는 주기적으로 일정 시기 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계로써, 제1 및 제2 부피는 대략 동일한, 단계; 포유류 세포에서 또는 제1 또는 제2 액체 배양 배지에서 재조합 단백질을 검출하는 단계; 및 포유류 세포에 또는 제1 또는 제2 액체 배양 배지에 존재하는 재조합 단백질의 양을 재조합 단백질의 참조 수준과 비교하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 재조합 단백질의 참조 수준은 상이한 배양 방법을 이용해서 생산된 재조합 단백질의 수준이다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 상이한 배양 방법은 상이한 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 상이한 포유류 세포, 상이한 온도, 상이한 진탕 수준, 또는 상이한 다중-웰 플레이트를 이용한다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 상이한 배양 방법은 상이한 원료, 항-응집제, 또는 화학적으로 정의된 액체 배양 배지를 이용한다. 일부 구현예에서, 이들 방법은, 예로, 실험 설계(DOE) 또는 품질 설계(QDB) 연구를 수행하기 위한 고처리량 세포 배양 실험을 수행하기 위해 이용될 수 있다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예로, 분비된 면역글로불린, 분비된 효소, 분비된 성장 인자, 분비된 단백질 단편, 또는 분비된 조작된 단백질)은 제1 또는 제2 액체 배양 배지에서 검출된다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예로, 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편, 또는 조작된 단백질)은 세포에서 검출된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지에는 실질적으로 포유류 세포가 없다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제1 액체 배양 배지는 웰 부피의 약 10% 내지 약 60%를 점유한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 포유류 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 회전 진탕은 약 320 RPM 내지 약 400 RPM이다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 동시에 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 연속적으로 또는 주기적으로 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 경시적으로 증가된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 7일 초과의 시기 동안, 인큐베이션 1일 내지 3일에 각각 24시간의 기간으로, 인큐베이션되며, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 30% 내지 약 50%이며; 인큐베이션 4일 내지 6일에 각각 24시간의 기간으로, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 40% 내지 약 70%이며; 인큐베이션 7일 및 그 이후 각각 24시간의 기간으로, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 90% 내지 약 150%이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 웰은 약 1 mL 내지 약 18 mL(예로, 약 1 mL 내지 약 7 mL 또는 약 1 mL 내지 약 3.5 mL)의 부피를 갖는다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 6-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 48-웰 플레이트, 또는 96-웰 플레이트이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 깊은-웰 플레이트이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 웰 바닥의 지름은 약 6.0 mm 내지 약 35 mm(예로, 약 12 mm 내지 약 50 mm)이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 웰의 높이는 약 12 mm 내지 약 50 mm이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 포유류 세포는 제1 배양 배지의 약 150 ㎕ 내지 약 15 mL(예로, 약 150㎕ 내지 약 10 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 5 mL, 또는 약 150 ㎕ 내지 약 150㎕) 중에 현탁된다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제1 액체 배양 배지 및/또는 제2 액체 배양 배지는 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 혈청 비함유 액체 배양 배지, 혈청 함유 액체 배양 배지, 동물 유래 성분 비함유 액체 배양 배지, 및 단백질 비함유 배지로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 최초 약 24 내지 48 시간의 시기 후, 각각 24-시간의 기간으로, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 30% 내지 약 150%이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 진탕은 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 전 적어도 30초의 시기 동안 중지된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 기체-투과성 일회용 막 또는 기체-투과성 실리콘 층으로 밀봉된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 웰은 평탄 바닥 또는 둥근형 바닥을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에는 증발로 인한 제1 액체 배양 배지의 부피에서의 임의 감소를 상쇄하기 위해, 복수의 웰 각각으로 추가 부피의 제2 액체 배양 배지를 주기적으로 첨가하는 것이 추가로 포함된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 자동화된 장치를 이용해서 수행된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 본원에 기재된 임의의 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 방법은 웰에서 15 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL의 생활성 세포 밀도를 야기한다.
또한 포유류 세포의 배양 방법으로서, 사각형-바닥 웰이 약 31℃ 내지 약 40℃의 온도에서 인큐베이션되고 분당 약 320 회전(RPM) 내지 약 360 RPM의 빈도로 회전 진탕되는 경우, 약 6.0 mm 내지 약 35 mm의 지름 및 약 40 mm 내지 약 50 mm의 높이를 갖는 사각형-바닥 웰 부피의 약 15% 내지 약 25%를 점유하는 배지에서 달성되는 것과 본질적으로 동일한 유체 전단력 및 용존 산소(O2) 농도를 배지에서 생성하는 조건 하에, 다중-웰 플레이트의 웰 내에 배치된 액체 배양 배지 중에 현탁된 포유류 세포를 구배 관류 공정에서 배양하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 포유류 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(예로, 재조합 단백질(예로, 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편, 또는 조작된 단백질)을 인코딩하는 핵산을 함유하는 CHO 세포)이다.
또한 재조합 단백질의 생산 방법으로서, 사각형-바닥 웰이 약 31℃ 내지 약 40℃의 온도에서 인큐베이션되고 분당 약 320 회전(RPM) 내지 약 360 RPM의 빈도로 회전 진탕되는 경우, 약 6.0 mm 내지 약 35 mm의 지름 및 약 40 mm 내지 약 50 mm의 높이를 갖는 사각형-바닥 웰 부피의 약 15% 내지 약 25%를 점유하는 배지에서 달성되는 것과 본질적으로 동일한 유체 전단력 및 용존 산소(O2) 농도를 배지에서 생성하는 조건 하에, 다중-웰 플레이트의 웰 내에 배치된 액체 배양 배지 중에 현탁된 포유류 세포를 구배 관류 공정에서 배양하는 단계; 및 포유류 세포 또는 액체 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 임의의 이들 방법의 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예로, 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편, 또는 조작된 단백질)은 포유류 세포로부터 회수된다. 임의의 이들 방법의 일부 구현예에서, 재조합 단백질(예로, 분비된 면역글로불린, 분비된 효소, 분비된 성장 인자, 분비된 단백질 단편, 또는 분비된 조작된 단백질)은 액체 배양 배지로부터 회수된다. 이들 방법의 일부 구현예에서, 포유류 세포는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 선택된 6-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 48-웰 플레이트, 또는 96-웰 플레이트이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 깊은-웰 플레이트이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 액체 배양 배지는 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 혈청 비함유 액체 배양 배지, 혈청 함유 액체 배양 배지, 동물 유래 성분 비함유 액체 배양 배지, 및 단백질 비함유 배지로 구성된 군으로부터 선택된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 기체-투과성 일회용 막 또는 기체-투과성 실리콘 층으로 밀봉된다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 평탄 바닥 또는 둥근형 바닥을 갖는 웰을 포함한다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 본원에 기재된 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템 중 하나이다. 본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 배양은 웰에서 15 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL의 생활성 세포 밀도를 야기한다.
또한 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템으로서, 복수의 천공을 포함하는 제1 표면을 포함하는 단일 지지 플레이트; 지지 플레이트 내에 배치되고 부피 약 200 ㎕ 내지 약 18 mL의 부피를 갖는 세포 배양을 수용하도록 구성되는 복수의 배양 용기로써, 각각의 천공은 각각의 배양 용기와 페어링되고 그 내부로의 개구를 정의하며, 각각의 배양 용기에는 배양 용기 안으로 및/또는 밖으로 유체의 흐름을 수용하도록 구성된 적어도 하나의 포트가 추가로 포함되는, 용기를 포함하는 시스템이 제공된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 단일 지지 플레이트는 액체를 수용하고 포트로 공급하기 위한 저장소를 포함하도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 배양 용기에는 적어도 제1 및 제2 포트가 포함되며, 여기서 제1 포트는 배양 용기 안으로 유체의 일방향 흐름을 수용하도록 구성되고, 제2 포트는 배양 용기 밖으로 유체의 일방향 흐름을 수용하도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 포트에는 세포가 배양 용기 안팎으로 흐르는 것을 선택적으로 방지하기 위해 구성된 필터가 포함된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에서, 제1 및 제2 포트는 각각 세포가 배양 용기 안팎으로 흐르는 것을 선택적으로 방지하기 위해 구성된 필터를 포함한다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에는 단일 지지 플레이트 내에 그리고 포트와 유체 접촉하며 배치된 적어도 하나의 유로가 추가로 포함되며, 여기서 유로는 배양 용기로 및/또는 이로부터 유체가 흐르도록 구성된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에는 적어도 하나의 포트에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 유체 흐름 조절장치가 추가로 포함된다. 본원에 기재된 임의의 시스템의 일부 구현예에는 적어도 하나의 유로에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 유체 흐름 계량기가 추가로 포함된다.
본원에서 이용되는 명사 앞의 단수 용어는 특정한 명사의 하나 이상을 나타낸다. 예를 들어, 어구 "포유류 세포"는 "하나 이상의 포유류 세포"를 나타낸다.
용어 "포유류 세포"는 임의의 포유류(예로, 인간, 햄스터, 마우스, 녹색 원숭이, 래트, 돼지, 소, 또는 토끼)로부터의 또는 이로부터 유래된 임의의 세포를 의미한다. 일부 구현예에서, 포유류 세포는 불멸화된 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 포유류 세포는 분화된 세포이다. 일부 구현예에서, 포유류 세포는 미분화 세포이다.
"0일"이라는 용어는 포유류 세포가 제1 액체 배양 배지 내로 씨드접종되는 시점을 의미한다.
"1일"이라는 용어는 0일 내지 포유류 세포의 제1 액체 배양 배지 내 씨드접종 후 약 24시간의 시기를 의미한다.
"2일"이라는 용어는 포유류 세포의 제1 액체 배양 배지 내 씨드접종 후 약 24시간 내지 약 48시간의 시기를 의미한다.
"3일"이라는 용어는 포유류 세포의 제1 액체 배양 배지 내 씨드접종 후 약 48시간 내지 약 72시간의 시기를 의미한다.
"4일"이라는 용어는 포유류 세포의 제1 액체 배양 배지 내 씨드접종 후 약 72시간 내지 약 96시간의 시기를 의미한다. 각각의 추가 일에 대한 용어("5일", "6일", "7일" 등)는 바로 앞 날의 끝에서부터 약 24시간의 추가 기간에 걸친 범위의 시기를 의미한다.
"실질적으로 없는"이라는 용어는 특정 물질(예로, 포유류 세포)이 적어도 또는 약 90% 없는(예로, 적어도 또는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 또는 약 99% 없는, 또는 약 100% 없는) 조성물(예로, 액체 배양 배지)을 의미한다.
용어 "0.5x부피"는 부피의 약 50%를 의미한다. 용어 "0.6x부피"는 부피의 약 60%를 의미한다. 마찬가지로, 0.7x, 0.8x, 0.9x, 및 1.0x는 각각 부피의 약 70%, 80%, 90%, 또는 100%를 의미한다.
"배양" 또는 "세포 배양"이라는 용어는 제어되는 물리적 조건 세트 하의 포유류 세포의 유지 또는 성장을 의미한다.
"액체 배양 배지"라는 용어는 포유류 세포가 시험관내 성장할 수 있도록 하기에 충분한 영양소를 함유하는 유체를 의미한다. 예를 들어, 액체 배양 배지는 아미노산(예로, 20개 아미노산), 퓨린(예로, 하이포잔틴), 피리미딘(예로, 티미딘), 콜린, 이노시톨, 티아민, 엽산, 바이오틴, 칼슘, 니아신아마이드, 피리독신, 리보플라빈, 티미딘, 시아노코발아민, 피루베이트, 리포산, 마그네슘, 글루코오스, 나트륨, 칼륨, 철 설페이트, 구리 설페이트, 아연 설페이트, 및 나트륨 바이카보네이트 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 배양 배지는 포유류로부터의 혈청을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 배양 배지는 포유류로부터의 혈청 또는 다른 추출물을 함유하지 않는다(정의된 액체 배양 배지). 일부 구현예에서, 액체 배양 배지는 미량 금속, 포유류 성장 호르몬, 및/또는 포유류 성장 인자를 함유할 수 있다. 액체 배양 배지의 비제한적 예가 본원에 기재된다. 액체 배양 배지의 추가 예는 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능하다. 액체 배양 배지는 임의 밀도의 포유류 세포를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 이용되는 웰로부터 제거되는 제1 부피의 제1 배양 배지에는 실질적으로 포유류 세포가 없을 수 있다.
"제1 액체 배양 배지"라는 용어는 포유류 세포의 배양에 적합한 일정 부피의 액체 배양 배지를 의미한다.
"제2 액체 배양 배지"라는 용어는 제1 및 제2 액체 배양 배지의 임의의 혼합 전에 일정 부피의 제1 액체 배양 배지와 구별되는, 포유류 세포의 배양에 적합한 일정 부피의 액체 배양 배지를 의미한다.
"동물 유래 성분 비함유 액체 배양 배지"라는 용어는 포유류로부터 유래되는 임의의 성분(예로, 단백질 또는 혈청)을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
"혈청 비함유 액체 배양 배지"라는 용어는 포유류의 혈청을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
"혈청 함유 액체 배양 배지"라는 용어는 포유류 혈청을 함유하는 액체 배양 배지를 의미한다.
"화학적으로 정의된 액체 배양 배지"라는 용어는 모든 화학 성분이 공지된 액체 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 이들 제조물은 전형적으로 알부민 및 지질의 복합체 믹스를 함유하므로, 화학적으로 정의된 액체 배양 배지는 태아 소 혈청, 소 혈청 알부민, 또는 인간 혈청 알부민을 함유하지 않는다.
"단백질 비함유 액체 배양 배지"라는 용어는 임의의 단백질(예로, 임의의 검출 가능한 단백질)을 함유하지 않는 액체 배양 배지를 의미한다.
"진탕"이라는 용어는 액체 배양 배지에서 용존 O2 농도를 증가시키기 위한 액체 배양 배지를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트의 운동을 의미한다. 진탕, 예컨대 회전 진탕은 임의의 당분야에 공지된 방법, 예로, 다중-웰 플레이트를 원형 또는 타원형 운동으로 이동시키는 기기, 예컨대 회전 진탕기를 이용해서 수행될 수 있다. 다중-웰 플레이트를 진탕하기 위해 이용될 수 있는 예시적인 장치가 본원에 기재된다. 이러한 장치의 추가 예는 또한 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용 가능하다.
"면역글로불린"이라는 용어는 면역글로불린 단백질(예로, 가변 도메인 서열, 프레임워크 서열, 또는 불변 도메인 서열)의 적어도 15개 아미노산(예로, 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개 아미노산)의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 의미한다. 면역글로불린에는, 예를 들어 경쇄 면역글로불린의 적어도 15개 아미노산, 예로, 중쇄 면역글로불린의 적어도 15개 아미노산이 포함될 수 있다. 면역글로불린은 단리된 항체(예로, IgG, IgE, IgD, IgA, 또는 IgM)일 수 있다. 면역글로불린은 IgG의 서브클래스(예로, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)일 수 있다. 면역글로불린은 항체 단편, 예로, Fab 단편, F(ab')2 단편, 또는 scFv 단편일 수 있다. 면역글로불린은 또한 이중-특이적 항체 또는 삼중-특이적 항체, 또는 이량체, 삼량체, 또는 다량체 항체, 또는 디아바디, Affibody®, 또는 Nanobody®일 수 있다. 면역글로불린은 또한 적어도 하나의 면역글로불린 도메인을 함유하는 조작된 단백질(예로, 융합 단백질)일 수 있다. 면역글로불린의 비제한적 예가 본원에 기재되며, 면역글로불린의 추가 예는 당분야에 공지되어 있다.
"단백질 단편" 또는 "폴리펩타이드 단편"이라는 용어는 적어도 또는 약 4개 아미노산, 적어도 또는 약 5개 아미노산, 적어도 또는 약 6개 아미노산, 적어도 또는 약 7개 아미노산, 적어도 또는 약 8개 아미노산, 적어도 또는 약 9개 아미노산, 적어도 또는 약 10개 아미노산, 적어도 또는 약 11개 아미노산, 적어도 또는 약 12개 아미노산, 적어도 또는 약 13개 아미노산, 적어도 또는 약 14개 아미노산, 적어도 또는 약 15개 아미노산, 적어도 또는 약 16개 아미노산, 적어도 또는 약 17개 아미노산, 적어도 또는 약 18개 아미노산, 적어도 또는 약 19개 아미노산, 적어도 또는 약 20개 아미노산, 또는 20개 아미노산 초과 길이인 폴리펩타이드 서열의 일부를 의미한다. 재조합 단백질 단편은 본원에 기재된 임의의 방법을 이용해서 생산될 수 있다.
"조작된 단백질"이라는 용어는 유기체(예로, 포유류) 내에 존재하는 내인성 핵산에 의해 천연 인코딩되지 않는 폴리펩타이드를 의미한다. 조작된 단백질의 예에는 효소(예로, 조작된 효소의 안정성 및/또는 촉매 활성의 증가를 야기하는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 삽입, 또는 부가를 포함), 융합 단백질, 항체(예로, 2가 항체, 3가 항체, 또는 디아바디), 및 적어도 하나의 재조합 골격화 서열을 함유하는 항원-결합 단백질이 포함된다.
"유체 전단력"이라는 용어는 대략 표면(예로, 세포 표면 또는 웰 표면)과 평행하게 흐르는 액체에 의해 유도되는 스트레스를 의미한다. 유체 전단력은 일반적으로 적용되는 힘 벡터와 평행한 영역을 갖는 물질의 횡단면적으로 나눈 적용된 힘으로서 정의된다. 유체 전단력의 예시적인 계산 방법이 본원에 기재되며 당분야에 공지되어 있다.
"용존 O2 농도" 또는 "용존 산소 농도"라는 용어는 액체 배양 배지(예로, 본원에 기재된 또는 당분야에 공지된 임의의 액체 배양 배지) 중 용해된 산소 기체의 양을 의미한다. 액체 배양 배지 중 용존 O2 농도의 비제한적 측정 방법이 본원에 기재되며 다른 것들은 당분야에 공지되어 있다.
"회수"라는 용어는 세포 배양 배지에 존재하는 하나 이상의 다른 성분(예로, 포유류 세포 또는 배양 배지 단백질) 또는 포유류 세포 용해물에 존재하는 하나 이상의 다른 성분(예로, DNA, RNA, 또는 다른 단백질)으로부터의 재조합 단백질의 부분 정제 또는 단리(예로, 중량을 기준으로 적어도 또는 약 5%, 예로, 적어도 또는 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 또는 약 95%가 순수함)를 의미한다. 액체 배양 배지로부터 또는 포유류 세포 용해물로부터의 단백질의 비제한적인 회수 방법이 본원에 기재되며 다른 것들은 당분야에 공지되어 있다.
"분비된 단백질" 또는 "분비된 재조합 단백질"이라는 용어는 포유류 세포 내에서 번역되고 적어도 부분적으로 포유류 세포에서 분비 신호 서열의 효소적 절단을 통해 세포외 공간(예로, 액체 배양 배지) 내로 방출되는 경우, 원래 적어도 하나의 분비 신호 서열을 함유하는 단백질 또는 재조합 단백질을 의미한다.
"구배 관류"라는 어구는 배양 기간(예로, 일별 기준의 배양 배지 재공급 속도) 동안 증분 기간(예로, 약 24시간의 기간, 약 1분 내지 약 24시간의 기간, 또는 24시간 초과의 기간)에 걸쳐 제거되고 첨가되는 배양 배지 부피의 증분 변화(예로, 증가 또는 감소)를 나타낸다. 예를 들어, 구배 관류 공정의 하나의 구현예에는 다음과 같은 재공급 프로토콜이 수반될 수 있다: 약 0.5x 반응기 부피의 배양 배지(RV)/일로 1-3일에 재공급, 약 0.7x RV/일로 4-6일에 재공급, 및 약 1.0x RV/일로 7일 및 그 이후 재공급. 상기 특정한 예는 임의의 특정한 24시간의 기간에 걸친 재공급 속도에 대해 및/또는 특정한 재공급 속도를 갖는 일 수에 대해 변할 수 있다. 각각의 날에 제거되고 대체된 배지의 분율은 배양되는 특정 세포, 초기 씨드접종 밀도, 및 특정한 시간의 세포 밀도에 따라 변할 수 있다. "RV" 또는 "반응기 부피"는 배양 공정의 시작 시 존재하는 배양 배지의 부피(예로, 씨드접종 후 존재하는 배양 배지의 총 부피)를 의미한다.
"공급-회분식 배양"이라는 용어는 세포 배양으로부터 제1 액체 배양 배지의 실질적인 또는 유의미한 제거가 없는 초기 세포 배양에 대한 제2 액체 배양 배지의 증분 또는 연속 첨가를 의미한다. 공급-회분식 배양의 일부 구현예에서, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지와 동일하다. 공급-회분식 배양의 일부 구현예에서, 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지의 농축된 형태이다. 공급-회분식 배양의 일부 구현예에서, 제2 액체 배양 배지는 건조 분말로서 첨가된다.
본원에서 이용되는 "비 생산율" 또는 "SPR"은 일별 포유류 세포별 생산된 재조합 단백질의 질량 또는 효소 활성을 나타낸다. 재조합 항체에 대한 SPR은 보통 질량/세포/일로서 측정된다. 재조합 효소에 대한 SPR은 보통 단위/세포/일 또는 (단위/질량)/세포/일로서 측정된다.
본원에서 이용되는 "부피 생산율" 또는 "VPR"은 일별 배양 부피별(예로, 바이오리액터, 용기, 또는 튜브 부피 L별) 생산되는 재조합 단백질의 질량 또는 효소 활성을 나타낸다. 재조합 항체에 대한 VPR은 보통 질량/L/일로서 측정된다. 재조합 효소에 대한 VPR은 보통 단위/L/일 또는 질량/L/일로서 측정된다.
"마이크로담체" 라는 용어는 포유류 세포(예로, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 포유류 세포)에 투과성이거나 그 부착을 촉진하는 표면을 함유하는 20 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 크기를 갖는 입자(예로, 유기 중합체)를 의미한다. 마이크로담체는 하나 이상의 포어(예로, 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 평균 지름을 갖는 포어)를 함유할 수 있다. 마이크로담체의 비제한적 예가 본원에 기재된다. 마이크로담체의 추가 예는 당분야에 공지되어 있다. 마이크로담체는, 예로, 중합체(예로, 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 폴리-(락트산-코-글리콜산))를 함유할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 이용하기 위한 방법 및 물질이 본원에 기재된다; 당분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 물질이 또한 이용될 수 있다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 제한하려는 것이 아니다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리, 및 다른 참고문헌은 이들의 전문이 참조로 포함된다. 상충 시, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선이 될 것이다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 도면, 그리고 청구범위로부터 자명해질 것이다.
도 1은 예시적인 다중-웰 플레이트 시스템의 상면 시야의 모식도이다.
도 2는 예시적인 다중-웰 플레이트 시스템의 측면 시야의 모식도이다.
도 3은 대안적인 다중-웰 플레이트 시스템의 측면 시야의 모식도이다.
도 4는 대안적인 다중-웰 플레이트 시스템의 측면 시야의 모식도이다.
도 5는 10 mL 배양 배지를 함유하고 160 RPM으로 진탕되는 50 mL 진탕 튜브에서 또는 200 ㎕ 또는 300 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM으로 진탕되는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 관류 배양되고, 상이한 회분식 재-공급 속도 동안 배양된 세포의 2일에 걸친 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 200 ㎕ 또는 300 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM으로 진탕되는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 관류 배양되고 상이한 회분식 재-공급 속도(2x0.5 반응기 부피/일 또는 1 반응기 부피/일) 동안 배양된 세포의 2일 배양의 종결점 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 300 ㎕의 배양 배지를 함유하고 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 또는 10 mL 배양 배지를 함유하고 160 RPM으로 진탕된 진탕 튜브에서 관류 배양된 세포의 11일 배양의 세포 생활성 백분율 그래프이다. 오차 막대는 진탕 튜브 배양에 대해 n = 2 그리고 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양에 대해 n = 8의 표준 편차를 나타낸다.
도 8은 300 ㎕의 배양 배지를 함유하고 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 또는 10 mL 배양 배지를 함유하고 160 RPM으로 진탕된 진탕 튜브에서 관류 배양된 세포의 11일 배양 배양물의 생활성 세포 밀도이다. 오차 막대는 진탕 튜브 배양에 대해 n = 2 그리고 둥근형-바닥 96-깊은-웰 배양에 대해 n = 8의 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 개질된 재공급 속도 프로토콜 및 제어 재공급 속도 프로토콜에서 15일 배양의 각각의 날에 이용된 재공급 속도(반응기 부피(들))의 그래프이다.
도 10은 200 ㎕, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양되고 Applikon 시스템 또는 일회용 막을 이용해서 밀봉된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 11은 200 ㎕, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양되고 Applikon 시스템 또는 일회용 막을 이용해서 밀봉된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 백분율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 12는 200 ㎕, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양되고 Applikon 시스템 또는 일회용 막을 이용해서 밀봉된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 13은 200 ㎕, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양되고 Applikon 시스템 또는 일회용 막을 이용해서 밀봉된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 백분율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 14는 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 330 RPM, 또는 340 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 15는 100 ㎕, 200 ㎕, 또는 300 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 16은 200 ㎕, 400 ㎕, 또는 600 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 17은 100 ㎕, 200 ㎕, 또는 300 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 누적 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 18은 200 ㎕, 400 ㎕, 또는 600 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 누적 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 19는 CD CHO 배양 배지인 경우 100 ㎕, 200 ㎕, 또는 300 ㎕를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 부피 생산율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 20은 200 ㎕, 400 ㎕, 또는 600 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 부피 생산율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 21은 100 ㎕, 200 ㎕, 또는 300 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 비 생산율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 22는 200 ㎕, 400 ㎕, 또는 600 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 비 생산율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 23은 생활성 세포 밀도의 모델 예측에 대한 실시간 데이터의 피팅 그래프이다.
도 24는 부피 생산율의 모델 예측에 대한 실시간 데이터의 피팅 그래프이다.
도 25는 표준 편차를 고려하여 통계 모델 내로의 실험 데이터 입력에 기반하는 최적 작동 조건을 나타내는 12개의 그래프의 세트이다.
도 26은 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에 놓이고 330 RPM의 빈도로 진탕된 다양한 상이한 배양 배지 중 하나의 500 ㎕ 중 재조합 모노클로날 항체를 생산하는 포유류 세포주의 생활성 세포 밀도 프로필의 그래프이다. 대조군 데이터는 CD CHO 배지를 나타낸다.
도 27은 330 RPM의 빈도로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 재조합 효소를 생산하는 포유류 세포주의 생활성 세포 밀도 프로필의 그래프이다. 대조군 데이터는 CD CHO 배지를 나타낸다.
도 28은 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에 놓이고 330 RPM의 빈도로 진탕된 다양한 상이한 배양 배지 중 하나의 500 ㎕ 중 재조합 모노클로날 항체를 생산하는 포유류 세포주 배양의 역가(mg/mL)의 그래프이다. 대조군 데이터는 CD CHO 배지를 나타낸다.
도 29는 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에 놓이고 330 RPM의 빈도로 진탕된 다양한 상이한 배양 배지 중 하나의 500 ㎕ 중 재조합 효소를 생산하는 포유류 세포주 배양의 역가(mg/mL)의 그래프이다. 대조군 데이터는 CD CHO 배지를 나타낸다.
도 2는 예시적인 다중-웰 플레이트 시스템의 측면 시야의 모식도이다.
도 3은 대안적인 다중-웰 플레이트 시스템의 측면 시야의 모식도이다.
도 4는 대안적인 다중-웰 플레이트 시스템의 측면 시야의 모식도이다.
도 5는 10 mL 배양 배지를 함유하고 160 RPM으로 진탕되는 50 mL 진탕 튜브에서 또는 200 ㎕ 또는 300 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM으로 진탕되는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 관류 배양되고, 상이한 회분식 재-공급 속도 동안 배양된 세포의 2일에 걸친 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 6은 200 ㎕ 또는 300 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM으로 진탕되는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 관류 배양되고 상이한 회분식 재-공급 속도(2x0.5 반응기 부피/일 또는 1 반응기 부피/일) 동안 배양된 세포의 2일 배양의 종결점 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 7은 300 ㎕의 배양 배지를 함유하고 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 또는 10 mL 배양 배지를 함유하고 160 RPM으로 진탕된 진탕 튜브에서 관류 배양된 세포의 11일 배양의 세포 생활성 백분율 그래프이다. 오차 막대는 진탕 튜브 배양에 대해 n = 2 그리고 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양에 대해 n = 8의 표준 편차를 나타낸다.
도 8은 300 ㎕의 배양 배지를 함유하고 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 또는 10 mL 배양 배지를 함유하고 160 RPM으로 진탕된 진탕 튜브에서 관류 배양된 세포의 11일 배양 배양물의 생활성 세포 밀도이다. 오차 막대는 진탕 튜브 배양에 대해 n = 2 그리고 둥근형-바닥 96-깊은-웰 배양에 대해 n = 8의 표준 편차를 나타낸다.
도 9는 개질된 재공급 속도 프로토콜 및 제어 재공급 속도 프로토콜에서 15일 배양의 각각의 날에 이용된 재공급 속도(반응기 부피(들))의 그래프이다.
도 10은 200 ㎕, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양되고 Applikon 시스템 또는 일회용 막을 이용해서 밀봉된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 11은 200 ㎕, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양되고 Applikon 시스템 또는 일회용 막을 이용해서 밀봉된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 백분율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 12는 200 ㎕, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양되고 Applikon 시스템 또는 일회용 막을 이용해서 밀봉된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 13은 200 ㎕, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양되고 Applikon 시스템 또는 일회용 막을 이용해서 밀봉된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 백분율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 14는 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 330 RPM, 또는 340 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된; 또는 대조군 진탕 튜브에서 배양된 세포의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 3의 표준 편차를 나타낸다.
도 15는 100 ㎕, 200 ㎕, 또는 300 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 16은 200 ㎕, 400 ㎕, 또는 600 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 경시적인 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 17은 100 ㎕, 200 ㎕, 또는 300 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 누적 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 18은 200 ㎕, 400 ㎕, 또는 600 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 누적 생활성 세포 밀도의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 19는 CD CHO 배양 배지인 경우 100 ㎕, 200 ㎕, 또는 300 ㎕를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 부피 생산율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 20은 200 ㎕, 400 ㎕, 또는 600 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 부피 생산율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 21은 100 ㎕, 200 ㎕, 또는 300 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 비 생산율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 22는 200 ㎕, 400 ㎕, 또는 600 ㎕ CD CHO 배양 배지를 함유하고 320 RPM, 340 RPM, 또는 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 배양된 세포, 또는 진탕 튜브에서 배양된 세포(제어 재공급 속도 또는 개질된 재공급 속도를 이용해서 배지 관류를 수행함)의 비 생산율의 그래프이다. 오차 막대는 n = 2의 표준 편차를 나타낸다.
도 23은 생활성 세포 밀도의 모델 예측에 대한 실시간 데이터의 피팅 그래프이다.
도 24는 부피 생산율의 모델 예측에 대한 실시간 데이터의 피팅 그래프이다.
도 25는 표준 편차를 고려하여 통계 모델 내로의 실험 데이터 입력에 기반하는 최적 작동 조건을 나타내는 12개의 그래프의 세트이다.
도 26은 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에 놓이고 330 RPM의 빈도로 진탕된 다양한 상이한 배양 배지 중 하나의 500 ㎕ 중 재조합 모노클로날 항체를 생산하는 포유류 세포주의 생활성 세포 밀도 프로필의 그래프이다. 대조군 데이터는 CD CHO 배지를 나타낸다.
도 27은 330 RPM의 빈도로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 재조합 효소를 생산하는 포유류 세포주의 생활성 세포 밀도 프로필의 그래프이다. 대조군 데이터는 CD CHO 배지를 나타낸다.
도 28은 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에 놓이고 330 RPM의 빈도로 진탕된 다양한 상이한 배양 배지 중 하나의 500 ㎕ 중 재조합 모노클로날 항체를 생산하는 포유류 세포주 배양의 역가(mg/mL)의 그래프이다. 대조군 데이터는 CD CHO 배지를 나타낸다.
도 29는 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에 놓이고 330 RPM의 빈도로 진탕된 다양한 상이한 배양 배지 중 하나의 500 ㎕ 중 재조합 효소를 생산하는 포유류 세포주 배양의 역가(mg/mL)의 그래프이다. 대조군 데이터는 CD CHO 배지를 나타낸다.
다중-웰 플레이트에서 포유류 세포의 개선된 배양 방법이 본원에 제공된다. 배양 방법은 더 대규모 생산 관류 바이오리액터에 의해 달성되는 것과 유사한 생활성 포유류 세포 농도, 예로, 10 x 106 세포/mL 초과, 15 x 106 세포/mL 초과, 20 x 106 세포/mL 초과, 25 x 106 세포/mL 초과, 30 x 106 세포/mL 초과, 35 x 106 세포/mL 초과, 40 x 106 세포/mL 초과, 45 x 106 세포/mL 초과, 50 x 106 세포/mL 초과, 55 x 106 세포/mL 초과, 또는 60 x 106 세포/mL 초과의 생활성 포유류 세포 밀도를 달성할 수 있다(예로, 액체 배양 배지, 예로, 제1 액체 배양 배지, 또는 제1 및 제2 액체 배양 배지의 조합에서). 예를 들어, 배양 방법은 10 x 106 세포/mL 내지 70 x 106 세포/mL, 10 x 106 세포/mL 내지 65 x 106 세포/mL, 10 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL, 10 x 106 세포/mL 내지 50 x 106 세포/mL, 10 x 106 세포/mL 내지 40 x 106 세포/mL, 10 x 106 세포/mL 내지 30 x 106 세포/mL, 15 x 106 세포/mL 내지 70 x 106 세포/mL, 15 x 106 세포/mL 내지 65 x 106 세포/mL, 15 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL, 15 x 106 세포/mL 내지 55 x 106 세포/mL, 15 x 106 세포/mL 내지 50 x 106 세포/mL, 15 x 106 세포/mL 내지 45 x 106 세포/mL, 15 x 106 세포/mL 내지 40 x 106 세포/mL, 15 x 106 세포/mL 내지 35 x 106 세포/mL, 20 x 106 세포/mL 내지 70 x 106 세포/mL, 20 x 106 세포/mL 내지 65 x 106 세포/mL, 20 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL, 20 x 106 세포/mL 내지 55 x 106 세포/mL, 20 x 106 세포/mL 내지 50 x 106 세포/mL, 20 x 106 세포/mL 내지 45 x 106 세포/mL, 20 x 106 세포/mL 내지 40 x 106 세포/mL, 25 x 106 세포/mL 내지 70 x 106 세포/mL, 25 x 106 세포/mL 내지 65 x 106 세포/mL, 25 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL, 25 x 106 세포/mL 내지 55 x 106 세포/mL, 25 x 106 세포/mL 내지 50 x 106 세포/mL, 25 x 106 세포/mL 내지 45 x 106 세포/mL, 30 x 106 세포/mL 내지 70 x 106 세포/mL, 30 x 106 세포/mL 내지 65 x 106 세포/mL, 30 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL, 30 x 106 세포/mL 내지 55 x 106 세포/mL, 30 x 106 세포/mL 내지 50 x 106 세포/mL, 35 x 106 세포/mL 내지 70 x 106 세포/mL, 35 x 106 세포/mL 내지 65 x 106 세포/mL, 35 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL, 35 x 106 세포/mL 내지 55 x 106 세포/mL, 40 x 106 세포/mL 내지 70 x 106 세포/mL, 40 x 106 세포/mL 내지 65 x 106 세포/mL, 40 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL, 40 x 106 세포/mL 내지 55 x 106 세포/mL, 45 x 106 세포/mL 내지 70 x 106 세포/mL, 또는 45 x 106 세포/mL 내지 65 x 106 세포/mL의 생활성 포유류 세포 농도를 야기할 수 있다. 다양한 상이한 방법을 이용하여 세포 밀도 또는 생활성 세포 밀도를 결정할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 샘플을 생리 완충액 중에 희석하고, 희석된 세포 현탁액을 혈구계에 놓고, 세포를 광학 현미경을 이용해서 계수할 수 있다. 또 다른 방법에서, 생활성 세포 밀도는 유사한 방법을 이용해서, 그러나 비생활성 세포에 의해 선택적으로 흡수되는 생리 완충액 중 염료(예로, 트립판 블루, 예컨대 Beckman Coulter의 Vi-CELL 방법(Beckman Coulter 웹사이트 참고))를 포함하여 결정될 수 있다. 또 다른 예에서, 세포 밀도 또는 생활성 세포 밀도는 형광-보조 유세포 측정(예로, Merck Millipore의 GUAVA(Millipore 웹사이트 참고)) 및 다른 세포 계수 방법을 이용해서 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 배양 방법은 유의미하게 개선된 비 생산율을 야기한다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법에 의해 달성되는 비 생산율은 일정 부피의 제1 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 배양 배지의 첨가 없이 실질적으로 동일한 배양 조건 하에 달성된 비 생산율보다 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 15배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 또는 100배 더 크다. 본 발명의 방법에 의해 달성되는 생산성은 적어도 10,000 단위/L, 적어도 15,000 단위/L, 적어도 약 20,000 단위/L, 적어도 약 25,000 단위/L, 적어도 약 30,000 단위/L, 적어도 약 35,000 단위/L, 또는 적어도 약 40,000 단위/L일 수 있다(제1 및/또는 제2 액체 배양 배지에서). 일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 달성되는 생산성은 적어도 1 g/L, 적어도 1.5 g/L, 적어도 2.0 g/L, 적어도 2.5 g/L, 적어도 3.0 g/L, 적어도 4.0 g/L, 적어도 4.5 g/L, 또는 적어도 5.0 g/L일 수 있다.
재조합 단백질의 생물학적 활성은 당분야에 공지된 다양한 방법을 이용해서 평가될 수 있으며, 특정한 재조합 단백질의 활성에 근거할 것이다. 예를 들어, 면역글로불린(예로, 항체 또는 항체 단편)인 재조합 단백질의 생물학적 활성은 그 특정한 에피토프에 결합하는 항체의 친화도를 측정함으로써(예로, Biocore 또는 경쟁적 효소-연관 면역흡착 검정을 이용하여) 결정될 수 있다. 재조합 단백질은 효소(예로, 재조합 갈락토시다아제, 예로, 재조합 알파-갈락토시다아제)일 수 있고, 생물학적 활성은 효소의 활성을 측정(예로, 검출 가능한 기질의 농도 감소 또는 검출 가능한 산물의 농도 증가를 측정(예로, 분광계측 또는 광 방출을 이용하여)함으로써 효소의 촉매 속도 상수를 결정)함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 재조합 갈락토시다아제의 생물학적 활성은 글로보트리아실세라마이드(GL-3) 또는 갈라바이오실세라마이드의 수준 감소 또는 세라마이드 디헥소사이드 또는 갈락토오스의 수준 증가를 측정함으로써 검출될 수 있다.
또한, 예로, 본원에 기재된 임의의 방법을 수행하기 위해 이용될 수 있는 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템이 제공된다.
제조 공정의 평가 방법
재조합 단백질(예로, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 재조합 단백질)을 제조하기 위한 제조 공정의 평가 방법이 본원에 제공된다. 이들 방법에는 본원에 기재된 재조합 단백질의 제조 방법을 수행하고, 방법 동안 및/또는 이후에 적어도 하나(예로, 2, 3 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개)의 배양 판독치(예로, 세포 또는 제1 및/또는 제2 배양 배지 중 재조합 단백질의 양, 글루코오스 소비, 생활성 세포 농도, 락테이트 생산, 부피 생산율, 비 생산율, 글루코오스로부터의 락테이트 수율, 글루타민 농도, 글루타메이트 농도, 배양 배지의 pH, 용존 CO2의 분압 또는 농도, 용존 O2의 농도 또는 분압, 대사 물질 전달 및 대사 물질 균형)를 검출하거나 측정하는 단계; 및 적어도 하나의 배양 판독치를 적어도 하나(예로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13개)의 배양 판독치의 참조 수준(예로, 세포에서 또는 제1 및/또는 제2 배양 배지에 존재하는(예로, 검출된) 재조합 단백질의 양, 글루코오스 소비, 생활성 세포 농도, 락테이트 생산, 부피 생산율, 비 생산율, 글루코오스로부터의 락테이트 수율, 글루타민 농도, 글루타메이트 농도, 배양 배지의 pH, 용존 CO2의 농도 또는 분압, 용존 O2의 농도 또는 분압, 대사 물질 전달 및 대사 물질 균형의 참조 수준)과 비교하는 단계가 포함된다.
당업자는 본원에 기재된 임의의 다양한 배양 파라미터(예로, 다중-웰 플레이트, 배양 부피의 대체 부피, 속도 또는 빈도, 진탕 빈도, 온도, 배지, CO2 농도, 및 반응기 각도)가 이들 방법을 수행하기 위해 임의 조합으로 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 포유류 세포가 방법에서 이용될 수 있다.
적어도 하나의 배양 판독치(예로, 세포에서 또는 제1 및/또는 제2 배양 배지에서 재조합 단백질의 양, 글루코오스 소비, 생활성 세포 농도, 락테이트 생산, 부피 생산율, 비 생산율, 글루코오스로부터의 락테이트 수율, 글루타민 농도, 글루타메이트 농도, 배양 배지의 pH, 용존 CO2의 농도 또는 분압, 용존 O2의 농도 또는 분압, 대사 물질 전달, 및 대사 물질 균형)의 참조 수준은 상이한 배양 방법, 예로, 적어도 하나의 상이한 배양 파라미터(예로, 상이한 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지, 상이한 포유류 세포, 상이한 진탕 빈도 및/또는 유형, 상이한 다중-웰 플레이트, 상이한 회분식 재공급 또는 관류 속도(예로, 24시간의 시기 또는 다른 증분 시기에 걸친 제1 액체 배양 배지 부피 또는 웰 부피의 10% 내지 200%), 및 본원에 기재된 임의의 다른 배양 파라미터)를 이용하는 배양 방법을 이용하여 생성된 수준일 수 있다. 재조합 단백질의 참조 양은, 예로, 상이한 수준의 용존 O2 및/또는 상이한 수준의 액체 전단 스트레스를 야기하는 배양 파라미터 세트를 이용해서 생산된 재조합 단백질의 수준일 수 있다.
본원에 기재된 방법은 제조 공정의 임의 성분 또는 특징의 효과를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 상이한 원료, 진탕 수준, 다중-웰 플레이트, 항-응집제, 배양 배지(예로, 화학적으로 정의된 배양 배지), 또는 영양소 원소 또는 화합물의 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 재조합 단백질 생산 및/또는 포유류 세포 성장에 대한 효과)에 대한 효과를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 제1 액체 배양 배지에 배치된 포유류 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 제공하는 단계로써, 제1 액체 배양 배지가 웰 부피의 약 5% 내지 약 70%를 점유하는, 단계; 약 320 RPM 내지 약 500 RPM의 회전 진탕으로 약 31℃ 내지 약 40℃에서 일정 시기 동안 다중-웰 플레이트를 인큐베이션하는 단계; 연속적으로 또는 주기적으로 일정 시기 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계로써, 제1 및 제2 부피는 대략 동일한, 단계; 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 세포에서 또는 제1 및/또는 제2 배양 배지에서 재조합 단백질의 양)를 검출하거나 결정하는 단계; 적어도 하나의 배양 판독치를 하나 이상의 상이한 제1 또는 제2 액체 배양 배지를 이용하는 상이한 배양 방법, 또는 상이한 포유류 세포원에 의해 생산되는 적어도 하나의 배양 판독치의 참조 수준(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 세포에서 또는 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지에서 재조합 단백질의 양)과 비교하는 단계; 및 참조 수준에 비해 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 재조합 단백질의 증가된 양)에서 유익한 변화(예로, 증가 또는 감소)와 연관되는 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 제1 또는 제2 액체 배양 배지에 존재하는 원료 성분 또는 보충물, 또는 포유류 세포원을 재조합 단백질의 생산 방법에서 이용하기 위해 유효한 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법에서 이용하기 위한 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 제1 또는 제2 액체 배양 배지에 존재하는 원료 성분 또는 보충물, 또는 포유류 세포원의 유효성 평가 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 참조 수준에 비해 재조합 단백질 수준의 증가, 생활성 세포 농도의 증가, 부피 생산율의 증가, 비 생산율의 증가, 및 글루코오스 소비의 증가는 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 제1 또는 제2 액체 배양 배지에 존재하는 원료 성분 또는 보충물, 또는 포유류 세포원이 재조합 단백질의 생산 방법에서 이용하기 유효함을 시사한다.
본원에 기재된 방법은 또한 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 다양한 세포 배양 파라미터(예로, 웰의 부피, 높이, 지름 또는 바닥 형태, 진탕 빈도 또는 유형, 전단력, 배양 씨드접종 밀도, 제1 또는 제2 액체 배양 배지의 pH, 용존 O2 농도 또는 분압, 웰의 내부 표면 코팅, 액체 배양 배지(예로, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지) 내의 다양한 내용물, 포유류 세포 유형 또는 세포주, CO2 노출 또는 용존 CO2 농도 또는 분압, 온도, 액체 배양 배지의 부피(예로, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지의 부피), 및/또는 제1 부피의 제1 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 배양 배지의 제1 배양 배지로의 첨가 속도 또는 빈도)의 변화 효과를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 방법은 또한 액체 배양 배지(예로, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지)를 제조하기 위해 이용되는 물의 품질 및/또는 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 재조합 단백질 생산 및/또는 포유류 세포 성장에 대한 효과)에 대한 액체 배양 배지 중 상이한 미량 금속의 효과를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 방법은 또한 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 재조합 단백질 생산 및/또는 포유류 세포 성장에 대한 효과)에 대한 성장 인자 또는 성장 호르몬의 효과를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 방법은 또한 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지를 제조하기 위해 이용되는 여과 공정 및 필터를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 방법은 또한 생물학적 기능(예로, 본원에 기재된 적어도 하나의 임의의 배양 판독치, 예로, 재조합 단백질 생산 및/또는 포유류 세포 성장에 대한 효과)에 대한 액체 배양 배지 안정성 및 액체 배양 배지의 효과를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 방법은 또한 원하는 재조합 단백질(예로, 원하는 분비된 치료 단백질)을 생산하는 이들의 능력에 대해 다양한 재조합 세포주 및 세포 은행을 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 주지되는 바와 같이, 방법은 또한 비제한적으로 진탕 유형 및 빈도, 전단력, 관류 속도 및 부피, 배양 씨드접종 밀도 등을 포함하는 임의의 세포 배양 공정 파라미터를 스크리닝하기 위해 이용될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 또한 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 제1 또는 제2 액체 배양 배지를 생성하기 위해 이용되는 원료, 또는 포유류 세포원 중 오염물질의 존재를 평가하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 제1 액체 배양 배지에 현탁된 포유류 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 제공하는 단계로써, 제1 액제 배양 배지가 웰 부피의 약 5% 내지 약 70%를 점유하는, 단계; 분당 약 320 회전(RPM) 내지 약 500 RPM의 진탕으로 약 31℃ 내지 약 40℃에서 일정 시기 동안 다중-웰 플레이트를 인큐베이션하는 단계; 연속적으로 또는 주기적으로 일정 시기 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계로써, 제1 및 제2 부피는 대략 동일한, 단계; 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 세포에서 또는 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지에서 재조합 단백질의 양)를 검출하거나 결정하는 단계; 적어도 하나의 배양 판독치를 하나 이상의 상이한 제1 또는 제2 액체 배양 배지를 이용하는 상이한 배양 방법, 제1 또는 제2 액체 배양 배지를 생성하기 위한 상이한 원료, 또는 상이한 포유류 세포원에 의해 생산되는 적어도 하나의 배양 판독치의 참조 수준(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 세포에 또는 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지에 존재하는 재조합 단백질의 양)과 비교하는 단계; 및 참조 수준에 비해 적어도 하나의 배양 파라미터의 수준이 유해하게 변화된(예로, 증가되거나 감소된) 경우 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 제1 또는 제2 액체 배양 배지를 생성하기 위해 이용되는 원료, 또는 포유류 세포원을 오염물질을 함유하는 것으로 확인하는 단계를 포함하는, 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 제1 또는 제2 액체 배양 배지를 생성하기 위해 이용되는 원료, 또는 포유류 세포원 중 오염물질의 존재의 평가 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 참조 수준에 비해 재조합 단백질 생산의 감소(예로, 세포에서 또는 제1 및/또는 제2 배양 배지에서 재조합 단백질의 감소), 부피 생산율의 감소, 또는 생활성 세포 농도의 감소는 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 제1 또는 제2 액체 배양 배지를 생성하기 위해 이용되는 원료, 또는 포유류 세포원에서 오염물질의 존재를 시사하는 유해한 변화이다. 일부 방법에는 제1 또는 제2 액체 배양 배지, 제1 또는 제2 액체 배양 배지를 생성하기 위해 이용되는 원료, 또는 포유류 세포원에 존재하는 오염물질의 정체를 결정하기 위한 하나 이상의 검정이 추가로 포함된다. 오염물질은 생물학적 오염물질(예로, 미코박테리아, 진균, 박테리아, 바이러스, 또는 원치않는 포유류 세포)일 수 있다. 오염물질은 또한 물리적으로 특성규명되지 않은 물질일 수 있다.
방법은 세포 배양 방법의 실험 설계(DOE) 또는 품질 설계(QBD) 최적화를 수행하기 위한 고처리량 세포 배양 실험을 수행하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 제1 액체 배양 배지에 현탁된 포유류 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 제공하는 단계로써, 제1 액제 배양 배지가 웰 부피의 약 5% 내지 약 70%를 점유하는, 단계; 약 320 RPM 내지 약 500 RPM의 회전 진탕으로 약 31℃ 내지 약 40℃에서 일정 시기 동안 다중-웰 플레이트를 인큐베이션하는 단계; 연속적으로 또는 주기적으로 일정 시기 동안 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계로써, 제1 및 제2 부피는 대략 동일한, 단계; 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 세포에서 또는 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지에서 재조합 단백질의 양)를 검출하는 단계; 적어도 하나의 배양 판독치를 상이한 배양 방법에 의해 생산되는 적어도 하나의 배양 판독치의 참조 수준(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 세포에 또는 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지에 존재하는 재조합 단백질의 양)과 비교하는 단계; 및 적어도 하나의 배양 판독치의 참조 수준(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 생산되는 재조합 단백질)에 비해 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 생산되는 재조합 단백질의 양)에서 유해한 변화(예로, 증가 또는 감소)와 연관되는 임의의 배양 성분 또는 파라미터를 제조 공정에서 확인 및 제거 또는 변경하거나, 적어도 하나의 배양 판독치의 참조 수준(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 생산되는 재조합 단백질)에 비해 적어도 하나의 배양 판독치(예로, 본원에 기재된 임의의 배양 판독치, 예로, 생산되는 재조합 단백질의 양)에서 유익한 변화(예로, 증가 또는 감소)와 연관되는 임의의 배양 성분 또는 파라미터를 제조 공정에서 확인 및 추가하는 단계를 포함하는 재조합 단백질을 생산하는 제조 공정의 최적화 방법이 본원에 제공된다. 예를 들어, 생산되는 재조합 단백질의 양, 부피 생산율, 비 생산율, 또는 생활성 세포 농도의 증가가 배양 판독치에서 유익한 변화이고, 생산되는 재조합 단백질의 양, 부피 생산율, 비 생산율, 또는 생활성 세포 농도의 감소가 배양 판독치에서 유해한 변화이다. 일부 경우에서, 방법은 고처리량 방식으로, 재조합 단백질의 스케일 업된(예로, 바이오리액터) 생산을 위해 이용될 수 있는 최적화된 세포 배양 조건을 확인하기 위해 이용된다.
본 섹션에 기재된 임의의 방법에서, 적어도 하나의 배양 판독치의 참조 수준은 더 대규모 배양(예로, 관류 바이오리액터, 예로, 2000 L 관류 바이오리액터, 40 L 관류 바이오리액터, 또는 12 L 관류 바이오리액터)에서 유래될 수 있다. 본 섹션에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 포유류 세포는 더 대규모 배양이 수행되는(병렬 배양되는) 동일한 시기에 걸쳐 본원에 기재된 임의의 방법을 이용해서 다중-웰 플레이트에서 배양된다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에서 다중-웰 플레이트를 접종하기 위해 이용되는 접종물은 또한 대략 동시에 더 대규모 관류 바이오리액터를 접종하기 위해 이용된다.
하나의 구현예에서, 웰(들)을 씨드접종하기 위해 이용되는 접종물은 더 대규모 배양(예로, 더 대규모 관류 바이오리액터)으로부터 수득된다. 예를 들어, 임의 시점의 더 대규모 배양으로부터의 분취물(예로, 성장 상, 전이 상(예로, 배양이 상이한 성장 조건 세트, 예로, 상이한 액체 배양 배지 및/또는 온도로 전이되고 있을 때의 선택적 기간), 또는 수확 상)이 웰(들)을 접종하기 위해 이용된다(예로, 위성 다중-웰 플레이트 배양을 시작하기 위해 이용된다). 분취물은 성장 상 동안 더 대규모 배양으로부터 제거되고 액체 배양 배지를 함유하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 접종 또는 씨드접종하기 위해 이용될 수 있고, 이어서 웰(들)은 더 대규모 배양에서 채용되는 성장 상 조건을 복제하거나 이와 유사한 조건 하에 인큐베이션된다. 분취물은 대안적으로 또는 추가적으로 전이 상 동안 더 대규모 배양으로부터 제거되고 액체 배양 배지를 함유하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 접종 또는 씨드접종하기 위해 이용될 수 있고, 이어서 웰(들)은 더 대규모 배양에서 채용되는 전이 상 조건을 복제하거나 이와 유사한 조건 하에 인큐베이션된다. 분취물은 대안적으로 또는 추가적으로 수확 상 동안 더 대규모 배양으로부터 제거되고 액체 배양 배지를 함유하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 접종 또는 씨드접종하기 위해 이용될 수 있고, 이어서 웰(들)은 더 대규모 배양에서 채용되는 수확 상 조건을 복제하거나 이와 유사한 조건 하에 인큐베이션된다. 임의의 이들 방법에서, 하나 이상의 배양 파라미터는 (더 대규모 배양에서 포유류 세포를 배양하기 위해 이용되는 배양 파라미터 또는 성분에 비해) 다중-웰 플레이트에서 포유류 세포를 배양하기 위해 이용되는 방법에서 변경될 수 있고, 적어도 하나의 배양 판독치가 측정되며, 적어도 하나의 배양 판독치가 더 대규모 배양을 위해 결정되는 적어도 하나의 배양 판독치와 비교된다. 당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 이들 방법은 배양 공정에서 하나 이상의 특정 상 동안 적어도 하나의 배양 판독치에 대한 특정 배양 파라미터 또는 성분의 효과(예로, 성장 상, 선택적 전이 상, 및/또는 수확 상 동안 적어도 하나의 배양 판독치에 대한 하나 이상의 배양 파라미터 및/또는 배양 성분(들)의 효과)를 평가하기 위해 이용될 수 있다.
특정 구현예에서, 이들 방법은 또한 다중-웰 플레이트(예로, 더 대규모 바이오리액터를 접종하기 위해 이용되는 더 대규모 바이오리액터 배양의 분취물 또는 동일한 냉동 세포 은행이 접종됨)에서 적어도 하나의 배양 판독치를 결정하거나 검출하고, 적어도 하나의 배양 판독치를 적어도 하나의 배양 판독치의 참조 수준(예로, 실질적으로 오염이 없는 배양으로부터의 적어도 하나의 배양 판독치의 수준)과 비교하고, 적어도 하나의 배양 판독치의 참조 수준에 비해 웰에서 적어도 하나의 배양 판독치가 웰에 오염물질이 존재하는 것으로 시사하는 경우 더 대규모 바이오리액터가 오염물질을 함유하는 것으로 확인함으로써 오염물질이 더 대규모 바이오리액터에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 오염물질은, 예를 들어 생물학적 오염물질, 예컨대 바이러스, 진균, 원치않는 포유류 세포, 또는 박테리아, 예컨대 미코박테리아일 수 있다. 오염물질은, 예를 들어 베시바이러스일 수 있다.
다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템
본 명세서는 포유류 세포를 배양하기 위해 유용한(예로, 본원에 기재된 임의의 방법을 이용하는) 예시적인 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템을 제공한다. 이들 시스템은 배양 용기(들)에 존재하는 유체(예로, 제1 액체 배양 배지)를 연속적으로 또는 주기적으로 제거하고, 배양 용기(들) 안으로 및/또는 밖으로 유체 흐름을 수용하도록 구성된 적어도 하나의 포트를 통해 배양 용기(들)에 유체(예로, 제2 액체 배양 배지)를 첨가하는 것을 허용하도록 설계된다.
예시적인 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템
다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템(1)의 비제한적 예의 상면도가 도 1에 제공된다. 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템(1)에는 복수의 천공(4)을 갖는 표면(3)을 포함하는 단일 지지 플레이트(2)가 포함된다. 천공은 임의의 형식으로 배열될 수 있는 반면, 도 1은 선과 줄 형식의 천공을 나타내며, 당업자는 임의의 천공 구성이 채용될 수 있음을 이해할 것이다.
예시적인 다중-웰 배양 플레이트 시스템(11)의 측면도를 도 2에 나타낸다. 다중-웰 배양 플레이트 시스템(11)에는 복수의 천공(4)을 포함하는 표면(3)을 갖는 단일 지지 플레이트(2)가 포함된다. 단일 지지 플레이트(2)는 임의의 생물학적 상용성 물질(예로, 폴리스티렌 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 생물학적 상용성 물질)로 제조될 수 있다. 단일 지지 플레이트(2)는 적어도 2개의 천공(4)(예로, 4, 6, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 24, 36, 48, 60, 72, 또는 96개의 천공(4))을 가질 수도 있고, 또는 적어도 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 또는 96개의 천공(4)을 가질 수도 있다. 도 2에 나타낸 다중-웰 배양 플레이트 시스템(11)은 또한 지지 플레이트(2) 내에 형성되거나 배치되고, 세포 배양(예로, 임의의 예시적인 포유류 세포 및/또는 본원에 기재된 조직 배양 배지)을 수용하도록 구성되는 복수의 배양 용기(5)를 갖는다. 용기(5)는 임의 부피의 세포 배양, 예로, 약 0.3 mL 내지 약 25 mL(예로, 약 0.3 mL 내지 약 24 mL, 약 0.3 mL 내지 약 22 mL, 약 0.3 mL 내지 약 20 mL, 약 0.3 mL 내지 약 18 mL, 약 0.3 mL 내지 약 16 mL, 약 0.3 mL 내지 약 14 mL, 약 0.3 mL 내지 약 12 mL, 약 0.3 mL 내지 약 10 mL, 약 0.3 mL 내지 약 8 mL, 약 0.3 mL 내지 약 6 mL, 약 0.3 mL 내지 약 5 mL, 약 0.3 mL 내지 약 4 mL, 약 0.3 mL 내지 약 3 mL, 약 0.3 mL 내지 약 2 mL, 약 0.3 mL 내지 약 1 mL, 약 0.5 mL 내지 약 25 mL, 약 0.5 mL 내지 약 24 mL, 약 0.5 mL 내지 약 22 mL, 약 0.5 mL 및 약 0.5 mL 내지 약 20 mL, 약 0.5 mL 내지 약 18 mL, 약 0.5 mL 내지 약 16 mL, 약 0.5 mL 내지 약 14 mL, 약 0.5 mL 내지 약 12 mL, 약 0.5 mL 내지 약 10 mL, 약 0.5 mL 내지 약 8 mL, 약 0.5 mL 내지 약 6 mL, 약 0.5 mL 내지 약 5 mL, 약 0.5 mL 내지 약 4 mL, 약 0.5 mL 내지 약 3 mL, 약 0.5 mL 내지 약 2 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1 mL, 약 1 mL 내지 약 25 mL, 약 1 mL 내지 약 24 mL, 약 1 mL 내지 약 22 mL, 약 1 mL 내지 약 20 mL, 약 1 mL 내지 약 18 mL, 약 1 mL 내지 약 16 mL, 약 1 mL 내지 약 14 mL, 약 1 mL 내지 약 12 mL, 약 1 mL 내지 약 10 mL, 약 1 mL 내지 약 8 mL, 약 1 mL 내지 약 7 mL, 약 1 mL 내지 약 6 mL, 약 1 mL 내지 약 5 mL, 약 1 mL 내지 약 4 mL, 약 1 mL 내지 약 3.5 mL, 약 1 mL 내지 약 3 mL, 약 1 mL 내지 약 2.5 mL, 약 1 mL 내지 약 2 mL, 약 1 mL 내지 약 1.5 mL, 약 1.5 mL 내지 약 25 mL, 약 1.5 mL 내지 약 24 mL, 약 1.5 mL 내지 약 22 mL, 약 1.5 mL 내지 약 20 mL, 약 1.5 mL 내지 약 18 mL, 약 1.5 mL 내지 약 16 mL, 약 1.5 mL 내지 약 14 mL, 약 1.5 mL 내지 약 12 mL, 약 1.5 mL 내지 약 10 mL, 약 1.5 mL 내지 약 8 mL, 약 1.5 mL 내지 약 6 mL, 약 1.5 mL 내지 약 5 mL, 약 1.5 mL 내지 약 4 mL, 약 1.5 mL 내지 약 3.5 mL, 약 1.5 mL 내지 약 3 mL, 약 1.5 mL 내지 약 2.5 mL, 약 1.5 mL 내지 약 2.0 mL, 약 2 mL 내지 약 25 mL, 약 2 mL 내지 약 24 mL, 약 2 mL 내지 약 22 mL, 약 2 mL 내지 약 20 mL, 약 2 mL 내지 약 18 mL, 약 2 mL 내지 약 16 mL, 약 2 mL 내지 약 14 mL, 약 2 mL 내지 약 12 mL, 약 2 mL 내지 약 10 mL, 약 2 mL 내지 약 8 mL, 약 2 mL 내지 약 6 mL, 또는 2 mL 내지 약 5 mL)의 부피를 갖는 것들을 수용하도록 구성될 수 있고, 여기서 각각의 천공(3)은 각각의 배양 용기(4)와 페어링되고 그 내부로의 개구를 정의한다.
배양 용기(들)(5)는 상이한 형태를 가질 수 있다. 배양 용기(들)의 형태의 비제한적 예는 천공(4)의 형태와 반대되는 말단, 즉 예로, 평탄, 반구형, 피라미드형, 또는 원뿔형을 가지는 실질적으로 실린더형 또는 실린더형 형태일 수 있다. 천공(4)의 지름은, 예로, 약 4.0 mm 내지 약 50 mm(예로, 4.0 mm 내지 약 45 mm, 약 4.0 mm 내지 약 40 mm, 약 4.0 mm 내지 약 35 mm, 약 4.0 mm 내지 약 30 mm, 약 4.0 mm 내지 약 25 mm, 약 4.0 mm 내지 약 20 mm, 약 4.0 mm 내지 약 15 mm, 약 4.0 mm 내지 약 10 mm, 약 6.0 mm 내지 약 50 mm, 약 6.0 mm 내지 약 45 mm, 약 6.0 mm 내지 약 40 mm, 약 6.0 mm 내지 약 35 mm, 약 6.0 mm 내지 약 30 mm, 약 6.0 mm 내지 약 25 mm, 약 6.0 mm 내지 약 25 mm, 약 6.0 mm 내지 약 20 mm, 약 6.0 mm 내지 약 15 mm, 약 6.0 mm 내지 약 10 mm, 약 8 mm 내지 약 50 mm, 약 8 mm 내지 약 45 mm, 약 8 mm 내지 약 40 mm, 약 8 mm 내지 약 35 mm, 약 8 mm 내지 약 30 mm, 약 8 mm 내지 약 25 mm, 약 8 mm 내지 약 20 mm, 약 8 mm 내지 약 15 mm, 약 10 mm 내지 약 50 mm, 약 10 mm 내지 약 45 mm, 약 10 mm 내지 약 40 mm, 약 10 mm 내지 약 35 mm, 약 10 mm 내지 약 30 mm, 약 10 mm 내지 약 25 mm, 약 10 mm 내지 약 20 mm, 약 15 mm 내지 약 50 mm, 약 15 mm 내지 약 45 mm, 약 15 mm 내지 약 40 mm, 약 15 mm 내지 약 35 mm, 약 15 mm 내지 약 30 mm, 약 15 mm 내지 약 25 mm, 또는 약 15 mm 내지 약 20 mm)일 수 있다. 배양 용기(들)(5)는 1 cm 내지 약 12 cm(예로, 약 1 cm 내지 약 11 cm, 약 1 cm 내지 약 10 cm, 약 1 cm 내지 약 9 cm, 약 1 cm 내지 약 8 cm, 약 1 cm 내지 약 7 cm, 약 1 cm 내지 약 6 cm, 약 1 cm 내지 약 5 cm, 약 1 cm 내지 약 4 cm, 약 1 cm 내지 약 3 cm, 약 1.2 cm 내지 약 12 cm, 약 1.2 cm 내지 약 11 cm, 약 1.2 cm 내지 약 10 cm, 약 1.2 cm 내지 약 9 cm, 약 1.2 cm 내지 약 8 cm, 약 1.2 cm 내지 약 7 cm, 약 1.2 cm 내지 약 6 cm, 약 1.2 cm 내지 약 5 cm, 약 1.2 cm 내지 약 4 cm, 약 1.2 cm 내지 약 3 cm, 약 1.5 cm 내지 약 11 cm, 약 1.5 cm 내지 약 10 cm, 약 1.5 cm 내지 약 9 cm, 약 1.5 cm 내지 약 8 cm, 약 1.5 cm 내지 약 7 cm, 약 1.5 cm 내지 약 6 cm, 약 1.5 cm 내지 약 5 cm, 약 1.5 cm 내지 약 4 cm, 약 1.5 cm 내지 약 3 cm, 약 2 cm 내지 약 12 cm, 약 2 cm 내지 약 11 cm, 약 2 cm 내지 약 10 cm, 약 2 cm 내지 약 9 cm, 약 2 cm 내지 약 8 cm, 약 2 cm 내지 약 7 cm, 약 2 cm 내지 약 6 cm, 약 2 cm 내지 약 5 cm, 약 2 cm 내지 약 4 cm, 약 2 cm 내지 약 3 cm, 약 2.5 cm 내지 약 12 cm, 약 2.5 cm 내지 약 11 cm, 약 2.5 cm 내지 약 10 cm, 약 2.5 cm 내지 약 9 cm, 약 2.5 cm 내지 약 8 cm, 약 2.5 cm 내지 약 7 cm, 약 2.5 cm 내지 약 6 cm, 약 2.5 cm 내지 약 5 cm, 약 2.5 cm 내지 약 4 cm, 약 3 cm 내지 약 12 cm, 약 3 cm 내지 약 11 cm, 약 3 cm 내지 약 10 cm, 약 3 cm 내지 약 9 cm, 약 3 cm 내지 약 8 cm, 약 3 cm 내지 약 7 cm, 약 3 cm 내지 약 6 cm, 약 3 cm 내지 약 5 cm, 약 4 cm 내지 약 12 cm, 약 4 cm 내지 약 11 cm, 약 4 cm 내지 약 10 cm, 약 4 cm 내지 약 9 cm, 약 4 cm 내지 약 8 cm, 약 4 cm 내지 약 7 cm, 약 4 cm 내지 약 6 cm, 약 5 cm 내지 약 12 cm, 약 5 cm 내지 약 11 cm, 약 5 cm 내지 약 10 cm, 약 5 cm 내지 약 9 cm, 약 5 cm 내지 약 8 cm, 또는 약 5 cm 내지 약 7 cm)의 높이를 가질 수 있다.
도 2에 나타낸 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템(11)에는 또한 포트(6), 예로, 배양 용기(5)의 안팎으로 유체 흐름을 수용하도록 구성된 1 또는 2방향 밸브가 포함된다. 포트(6)는 임의의 위치에서 배양 용기(5)에 유체 연결될 수 있다. 본원에 기재된 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템은 각각의 배양 용기(5)에 유체 연결되는 적어도 하나, 예로, 2, 3 또는 적어도 4개의 포트(6)를 가질 수 있다. 배양 용기(5)에 대한 포트(6)의 연결을 위한 예시적 위치를 도 2 및 도 3에 나타낸다. 포트(6)는 한 방향으로(예로, 배양 용기(5)의 안으로 또는 밖으로) 또는 양 방향으로(배양 용기(5)의 안팎으로) 유체가 흐르도록 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 포트(6)는 배양 용기(5)의 안으로 한 방향 흐름을 수용하도록 구성될 수 있고, 제2 포트(6)는 배양 용기(5) 밖으로 한 방향 흐름을 수용하도록 구성된다.
도 3은 세포가 배양 용기(5) 안팎으로 흐르는 것을 선택적으로 방지하도록 구성된 필터(8)를 포함하는 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템(12)을 나타낸다. 필터(8)는 포유류 세포를 여과하기 위해 이용되는 당분야에 공지된 임의의 마이크로- 또는 나노-필터일 수 있다. 2개 이상의 포트(6)를 가지는 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템은 세포가 배양 용기(5) 안팎으로 흐르는 것을 선택적으로 방지하기 위해 각각의 포트(6) 상이나 내에 구성된 필터(8)를 가질 수 있다.
각각 도 2 및 도 3에 나타낸 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템(12) 및 (13)에는 또한 단일 지지 플레이트(2) 내에 배치되고 포트(6)와 유체 소통하는 적어도 하나의 유로(7)가 포함되며, 여기서 유로(7)는 배양 용기(5)로 및 이로부터 유체가 흐르도록 구성된다. 일부 예에서, 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템은 각각의 포트(6)와 유체 소통하는(예로, 각각의 배양 용기(5)로 및/또는 이로부터 유체가 흐르도록 구성된) 유로(7)를 가질 수 있다.
본원에 제공된 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템에는 포트(들)(6)에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 유체 흐름 조절장치가 추가로 포함될 수 있다. 본원에 제공된 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템에는 유로(들)(7)에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 유체 흐름 조절장치가 추가로 포함될 수 있다. 유체 흐름 조절장치의 비제한적 예는 배양 용기(들)(5) 내에서 유체 부피 및/또는 유체 압력의 변화를 검출함으로써 유체 유속 및/또는 흐름 방향을 제어할 수 있다. 일부 구현예에서, 유체 흐름 조절장치는 특정한 흐름 방향으로(예로, 배양 용기(들)(5) 안으로 및/또는 밖으로) 특정한 시기 동안 특정한 속도로 유체가 흐르도록 프로그래밍될 수 있다.
일부 구현예에서, 단일 지지 플레이트(2)는 포트(들)(6) 또는 유로(들)(7)에 액체를 공급하고 수용하기 위한 저장소가 포함되도록 구성된다. 일부 예에서, 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템에는 각각 포트(들)(6) 또는 유로(들)(7)에 유체 연결되고 단일 지지 플레이트(2)에 대해 외부이도록 구성되는 포트(들)(6) 또는 유로(들)(7)에 액체를 공급하고 수용하기 위한 저장소가 포함된다(포트(들)(6) 또는 유로(들)(7)는 반응 용기(들)(5) 내로 유체를 흘리는 기능을 수행한다). 일부 구현예에서, 단일 지지 플레이트(2)는 배양 용기(들)(5)로부터 제거된 액체를 수용하고 저장하기 위한 저장소를 포함하도록 구성되며, 여기서 제거된 액체를 수용하고 저장하기 위한 저장소는 단일 지지 플레이트(2)에 대해 외부이며 포트(들)(6) 또는 유로(들)(7)에 유체 연결된다(포트(들)(6) 또는 유로(들)(7)는 배양 용기(들)(5)의 밖으로 유체를 흘리는 기능을 수행한다).
포트(들)(6)에 액체를 공급하고 수용하기 위한 내부 저장소(9)를 포함하도록 구성된 예시적인 단일 지지 플레이트(2)를 도 4에 나타낸다. 도 4에서 단일 지지 플레이트(2)에는 내부 저장소(9)에서 액체를 제거하거나 여기에 첨가하기 위한 교환 포트(10)가 추가로 포함된다. 내부 저장소(9)를 포함하는 단일 지지 플레이트에는 1- 및/또는 2-방향 교환 포트(10)(예로, 1- 또는 2-방향 밸브)가 포함될 수 있다. 예를 들어, 내부 저장소(9)를 포함하는 단일 지지 플레이트(2)는 내부 저장소 안으로 액체 흐름을 허용하는 제1 교환 포트(10) 및 내부 저장소 밖으로 액체 흐름을 허용하는 제2 교환 포트를 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 내부 저장소(9)를 포함하는 단일 지지 플레이트(2)는 내부 저장소(10) 안팎으로 액체 흐름을 허용하는 단일 2-방향 교환 포트(10)를 가질 수 있다. 내부 저장소(10)에 존재하는 유체는 하나 이상의 포트(6) 및/또는 유로(7)의 이용을 통해 용기(들)(5) 안으로 및/또는 밖으로 흐를 수 있다.
일부 예에서, 다중-웰 세포 배양 플레이트는 단일 지지 플레이트(2) 및 천공(들)(4)(단일 지지 플레이트(2)의 모든 천공(4))을 커버하고, 배양 용기(들)(5)의 오염(예로, 박테리아(예로, 미코박테리아), 바이러스, 또는 진균 오염)을 방지하고, 배양 용기(들)(5) 및 외부 환경 간 기체 교환을 허용하도록 구성된 커버 플레이트를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 다중-웰 배양 플레이트는 배양 용기(들)(5) 및 외부 환경 간 기체 교환을 허용하면서 배양 용기(들)(5)의 오염을 방지하기 위해 커버 플레이트 및 단일 지지 플레이트(2) 간에 배치된 기체-투과성 일회용 막 또는 기체 투과성 실리콘 층을 추가로 포함한다.
유체는, 예로, 유체 압력, 공기 압력, 중력, 및 기계적 압력에 대해 당분야에 공지된 하나 이상의 다양한 방법을 이용하여 본원에 기재된 임의의 시스템(예로, 시스템 안으로 및/또는 밖으로, 예로, 포트(6)의 안으로 및/또는 밖으로, 유로(7)의 안으로 및/또는 밖으로, 또는 교환 포트(10)의 안으로 및/또는 밖으로)을 통해 흐를 수 있다. 예를 들어, 유체는 펌프, 중력, 원심력, 또는 기계적 압력을 이용해서 본원에 기재된 임의의 시스템을 통해 이동될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 시스템을 통해 유체를 흘리기 위한 추가 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다.
포유류 세포의 배양 방법
본원에 기재된 예시적인 방법에서, 다중-웰 플레이트가 먼저 제공된다. 제1 액체 배양 배지는 배지가 웰 부피의 약 5% 내지 약 80%(예로, 약 5% 내지 약 75%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 65%, 약 5% 내지 약 60%, 약 5% 내지 약 55%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5 % 내지 약 45%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 35%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 75%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 65%, 약 10% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 55%, 약 10% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 약 10% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 80%, 약 15% 내지 약 75%, 약 15% 내지 약 70%, 약 15% 내지 약 65%, 약 15% 내지 약 60%, 약 15% 내지 약 55%, 약 15% 내지 약 50%, 약 15% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 75%, 약 20% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 65%, 약 20% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 55%, 약 20% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 45%, 약 25% 내지 약 80%, 약 25% 내지 약 75%, 약 25% 내지 약 70%, 약 25% 내지 약 65%, 약 25% 내지 약 60%, 약 25% 내지 약 55%, 또는 약 25% 내지 약 50%)를 점유하도록 웰(들)에 첨가된다. 적어도 하나의 포유류 세포는 제1 액체 배양 배지에, 즉 배지가 웰에 첨가되기 전에 또는 후에 첨가된다. 다중-웰 플레이트는 일정 시기 동안 약 31℃ 내지 약 40℃에서 인큐베이션되고, 예로, 회전 진탕 장치 상에서 약 300 RPM 내지 약 600 RPM(예로, 본원에 기재된 임의의 예시적 진탕 범위)으로 진탕된다. 세포는, 예를 들어 인큐베이터, 예컨대 약 3 mm 내지 약 50 mm의 편심(궤도) 지름을 갖는 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 동안, 연속적으로 또는 주기적으로, 일정 시기에 걸쳐 제1 부피의 제1 액체 배양 배지(예로, 임의의 포유류 세포 농도를 함유하는, 예로, 실질적으로 포유류 세포가 없는 또는 없도록 제조된 제1 부피의 제1 액체 배양 배지)가 제거되고, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 제1 액체 배양 배지에 첨가된다. 전형적으로, 제1 및 제2 부피는 대략 동일하지만, 예로, 제1 및 제2 부피가 비교되는 경우 소량, 예로, 약 1% 내지 약 10%(예로, 약 1% 내지 약 8%, 약 1% 내지 약 5%, 또는 약 1% 내지 약 3%)씩 다를 수 있다. 일부 구현예에서, 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지보다 적다(예로, 최대 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10% 적다). 당분야에 공지된 바와 같이, 인큐베이션이라는 용어에는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하기 위해 포유류 세포 및 액체 배양 배지를 함유하는 다중-웰 플레이트가 인큐베이터로부터 제거되는 짧은 시기(예로, 최대 1분, 최대 2분, 최대 3분, 최대 4분, 최대 5분, 최대 10분, 최대 20분, 최대 30분, 최대 40분, 최대 50분, 또는 최대 1시간)가 포함될 수 있다. 일부 예에서, 인큐베이션이라는 용어에는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하기 위해(예로, 본원에 기재된 다중-웰 배양 플레이트 시스템의 이용을 통해) 포유류 세포 및 액체 배양 배지를 함유하는 다중-웰 플레이트가 인큐베이터로부터 제거되는 짧은 시기가 포함되지 않는다.
이들 배양 방법의 각 양태의 다양한 비제한적 예가 아래에 기재된다. 본원에 기재된 방법의 예시적인 양태는 비제한적으로 임의 조합으로 이용될 수 있다.
포유류 세포
본원에 제공된 방법은 다양한 상이한 포유류 세포를 배양하기 위해 이용될 수 있다. 포유류 세포는, 예로, 현탁 성장하는 세포일 수도 있고, 또는 부착성 세포일 수도 있다. 본원에 기재된 임의의 방법을 이용해서 배양될 수 있는 포유류 세포의 비제한적 예에는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, Sp2.0, 골수종 세포(예로, NS/0), B-세포, 하이브리도마 세포, T-세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포(예로, HEK 293E 및 HEK 293F), 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 세포(Vero) 세포, 및 Madin-Darby Canine(코커 스파니엘) 신장 상피 세포(MDCK) 세포가 포함된다. 본원에 기재된 방법을 이용해서 배양될 수 있는 추가적인 포유류 세포는 당분야에 공지되어 있다.
포유류 세포는 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산(예로, 포유류 세포의 게놈으로 안정적으로 통합된 핵산)을 함유할 수 있다. 예시적인 재조합 단백질을 인코딩하는 재조합 핵산의 비제한적 예가 본원에 기재된 방법을 이용해서 생산 가능한 재조합 단백질과 마찬가지로 아래에 기재된다. 일부 예에서, 배양을 위한 다중-웰 플레이트에 배치된 포유류 세포는 더 큰 배양으로부터 유래된다. 예를 들어, 다중-웰 플레이트에서의 포유류 세포는 대규모 바이오리액터 배양으로부터 유래될 수 있다, 즉 위성 배양이 방법을 이용해서 제조될 수 있다.
배양 배지
액체 배양 배지는 당분야에 공지되어 있다. 제1 및/또는 제2 조직 배양 배지에는 포유류 혈청(예로, 태아 소 혈청 및 소 혈청), 및/또는 성장 호르몬 또는 성장 인자(예로, 인슐린, 트랜스페린, 및 표피 성장 인자)가 보충될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지는 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 유래 성분 비함유 액체 배양 배지, 혈청 비함유 액체 배양 배지, 혈청 함유 액체 배양 배지, 또는 단백질 비함유 액체 배양 배지일 수 있다. 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 동물 유래 성분 비함유 액체 배양 배지, 혈청 비함유 액체 배양 배지, 및 혈청 함유 액체 배양 배지의 비제한적 예가 상업적으로 이용 가능하다.
액체 배양 배지는 전형적으로 에너지원(예로, 탄수화물, 예컨대 글루코오스), 필수 아미노산(예로, 20개 아미노산의 기본 세트와 시스테인), 저농도로 요구되는 비타민 및/또는 다른 유기 화합물, 자유 아미노산, 및/또는 미량 원소를 함유한다. 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지는, 원하는 경우, 예로, 포유류 호르몬 또는 성장 인자(예로, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염 및 완충제(예로, 칼슘, 마그네슘, 및 포스페이트 염), 뉴클레오사이드 및 염기(예로, 아데노신, 티미딘, 및 하이포잔틴), 단백질 및 조직 가수분해물, 및/또는 이들 첨가제의 임의 조합이 보충될 수 있다.
본원에 기재된 방법에서 특히 유용한 액체 배양 배지의 비제한적 예에는, 예로, CD CHO, Opti CHO, 및 Forti CHO(모두 Life Technologies; Grand Island, NY에서 이용 가능함), Hycell CHO 배지(Thermo Fisher Scientific, Inc.; Waltham, MA), Ex-cell CD CHO Fusion 배지(Sigma-Aldrich Co.; St. Louis, MO), 및 PowerCHO 배지(Lonza Group, Ltd.; Basel, Switzerland)가 포함된다. 또한 본 방법에서 유용할 수 있는 배지 성분에는 비제한적으로 화학적으로 정의된(CD) 가수분해물, 예로, CD 펩톤, CD 폴리펩타이드(2개 이상의 아미노산), 및 CD 성장 인자가 포함된다. 액체 조직 배양 배지 및 배지 성분의 추가 예는 당분야에 공지되어 있다.
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 예에서, 포유류 세포는 약 100 ㎕ 내지 약 25 mL(예로, 약 100 ㎕ 내지 약 20 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 15 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 10 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 8 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 6 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 4 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 3 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 2.5 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 2.0 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 1.5 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 1.0 mL, 약 100 ㎕ 내지 약 800 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 600 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 400 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 300 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 250 ㎕, 약 100 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 150 ㎕ 내지 약 25 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 20 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 15 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 10 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 8 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 6 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 4 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 3 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 2.5 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 2.0 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 1.5 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 1.0 mL, 약 150 ㎕ 내지 약 800 ㎕, 약 150 ㎕ 내지 약 600 ㎕, 약 150 ㎕ 내지 약 500 ㎕, 약 150 ㎕ 내지 약 400 ㎕, 약 150 ㎕ 내지 약 300 ㎕, 약 150 ㎕ 내지 약 200 ㎕, 약 250 ㎕ 내지 약 25 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 20 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 15 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 10 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 8 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 6 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 5 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 4 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 3 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 2.5 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 2 mL, 약 250 ㎕ 내지 약 1 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 25 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 20 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 15 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 10 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 8 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 6 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 5 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 4 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 3 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 2.5 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 2 mL, 약 500 ㎕ 내지 약 1 mL, 약 1 mL 내지 약 25 mL, 약 1 mL 내지 약 20 mL, 약 1 mL 내지 약 15 mL, 약 1 mL 내지 약 10 mL, 약 1 mL 내지 약 8 mL, 약 1 mL 내지 약 6 mL, 약 1 mL 내지 약 5 mL, 약 1 mL 내지 약 4 mL, 약 1 mL 내지 약 3 mL, 약 1 mL 내지 약 2.5 mL, 또는 약 1 mL 내지 약 2 mL)의 제1 배양 배지 중에 현탁된다.
당업자는 본원에 기재된 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지이거나 상이한 배지일 수 있음을 이해할 것이다.
마이크로담체
포유류 세포가 부착성 세포인 일부 예에서, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지에는 복수의 마이크로담체가 포함된다. 예를 들어, 웰은, 예로, 약 1.0 g/L 내지 약 15.0 g/L의 최종 농도(예로, 진탕 플라스크에서 약 1.0 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 2.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 1.75 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 1.5 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 1.25 g/L, 약 2.5 g/L 내지 5.0 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 7.5 g/L, 약 7.5 g/L 내지 약 10.0 g/L, 약 10.0 g/L 내지 약 12.5 g/L, 약 12.5 g/L 내지 약 15.0 g/L, 약 1.0 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 10.0 g/L, 약 10.0 g/L 내지 약 15.0 g/L, 약 2.5 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 3.0 g/L 내지 약 4.0 g/L, 약 4.0 g/L 내지 약 5.0 g/L, 약 5.0 g/L 내지 약 6.0 g/L, 약 6.0 g/L 내지 약 7.0 g/L, 약 7.0 g/L 내지 약 8.0 g/L, 약 8.0 g/L 내지 약 9.0 g/L, 약 9.0 g/L 내지 약 10.0 g/L, 약 10.0 g/L 내지 약 11.0 g/L, 약 11.0 g/L 내지 약 12.0 g/L, 약 12.0 g/L 내지 약 13.0 g/L, 약 13.0 g/L 내지 약 14.0 g/L, 또는 약 14.0 g/L 내지 약 15.0 g/L의 최종 농도)의 마이크로담체를 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 복수의 마이크로담체는 약 20 ㎛ 내지 약 1 mm(예로, 약 20 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 100 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 150 ㎛ 내지 약 250 ㎛, 약 250 ㎛ 내지 500 ㎛, 약 200 ㎛ 내지 약 300 ㎛, 약 750 ㎛ 내지 1 mm, 약 200 ㎛ 내지 약 800 ㎛, 약 200 ㎛ 내지 약 500 ㎛, 또는 약 500 ㎛ 내지 약 800 ㎛)의 평균 지름을 가질 수 있으며, 여기서 마이크로담체는 포유류 세포(예로, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 포유류 세포)에 투과성이거나 부착을 촉진하는 표면을 갖는다. 일부 예에서, 마이크로담체는 하나 이상의 포어(예로, 약 10 ㎛ 내지 약 100 ㎛(예로, 약 10 ㎛ 내지 20 ㎛, 약 20 ㎛ 내지 약 30 ㎛, 약 30 ㎛ 내지 약 40 ㎛, 약 50 ㎛ 내지 약 60 ㎛, 약 60 ㎛ 내지 약 70 ㎛, 약 70 ㎛ 내지 약 80 ㎛, 약 80 ㎛ 내지 약 90 ㎛, 약 90 ㎛ 내지 약 100 ㎛, 약 10 ㎛ 내지 약 45 ㎛, 약 45 ㎛ 내지 약 80 ㎛, 약 25 ㎛ 내지 약 35 ㎛, 또는 약 30 ㎛)의 평균 지름을 갖는 하나 이상의 포어)를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 복수의 마이크로담체의 표면 및/또는 복수의 마이크로담체에서 하나 이상의 포어의 표면은 마이크로담체에 대한 포유류 세포의 부착(예로, 마이크로담체의 외부 표면 및/또는 마이크로담체에서 포어의 표면에 대한 부착)을 촉진하는 제제로 코팅된다. 포유류 세포의 부착을 촉진하기 위해 이용될 수 있는 이러한 제제의 예에는 비제한적으로 젤라틴, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리스티렌, 및 라미닌이 포함된다.
일부 예에서, 마이크로담체는 약 0.5 m2/건조물g 내지 2.0 m2/건조물g(예로, 약 0.75 m2/건조물g 내지 1.25 m2/건조물, 약 1.0 m2/건조물g 내지 약 1.5 m2/건조물, 약 1.25 m2/건조물 내지 약 1.5 m2/건조물, 약 1.5 m2/건조물 내지 약 2.0 m2/건조물, 또는 약 1.1 m2/건조물)의 평균 유효 세포 결합 표면적을 갖는다. 일부 예에서, 마이크로담체는 약 10 mL/건조물g 내지 약 70 mL/건조물g(예로, 약 10 mL/건조물g 내지 약 20 mL/건조물g, 약 20 mL/건조물g 내지 약 30 mL/건조물g, 약 30 mL/건조물g 내지 약 40 mL/건조물g, 약 40 mL/건조물g 내지 약 50 mL/건조물g, 약 50 mL/건조물g 내지 약 60 mL/건조물g, 약 60 mL/건조물g 내지 약 70 mL/건조물g, 약 10 mL/건조물g 내지 약 40 mL/건조물g, 약 30 mL/건조물g 내지 약 40 mL/건조물g, 약 40 mL/건조물g 내지 약 70 mL/건조물g, 또는 약 40 mL/건조물g)의 평균 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 마이크로담체의 평균 상대 밀도는 0.8 g/mL 내지 약 1.2 g/mL(예로, 약 0.8 g/mL 내지 약 0.9 g/mL, 약 0.9 g/mL 내지 약 1.0 g/mL, 약 1.0 g/mL 내지 약 1.1 g/mL, 약 1.0 g/mL, 약 1.1 g/mL 내지 약 1.2 g/mL, 약 0.95 g/mL 내지 약 1.05 g/mL, 또는 약 1.03 g/mL)이다.
일부 구현예에서, 마이크로담체는 대략 구형 또는 타원형 형태이다. 다른 예에서, 마이크로담체는 마이크로담체의 전체 외부 표면적을 증가시키는 작은 융기를 갖는 마모된 또는 거친 표면을 갖는다. 일부 구현예에서, 마이크로담체는 네트워크 구조를 갖는다. 일부 예에서, 마이크로담체는 흡습성이다. 일부 예에서, 마이크로담체는 셀룰로오스를 함유한다.
일부 구현예에서, 마이크로담체는 외부 표면을 가지며/갖거나 마이크로담체 포어는 양으로 하전된(예로, N,N,-디에틸아미노에틸기의 존재로 인해 양으로 하전된) 표면을 갖는다. 일부 예에서, 마이크로담체는 네트워크 또는 네트-유사 또는 웹-유사 구조를 갖는다. 마이크로담체는 약 0.5 me/g 내지 약 2.5 me/g(예로, 약 0.5 me/g 내지 약 1.5 meq/g, 약 0.75 meq/g 내지 약 1.25 meq/g, 약 1.1 meq/g, 약 1.5 meq/g 내지 약 2.5 meq/g, 약 1.5 meq/g 내지 약 2.0 meq/g, 약 1.8 meq/g, 약 0.5 meq/g 내지 약 1.0 meq/g, 또는 약 1.0 meq/g 내지 약 1.5 meq/g)의 평균 전하 밀도를 가질 수 있다.
일부 예에서, 마이크로담체는 천연 중합체 및/또는 합성 중합체를 함유할 수 있다. 합성 중합체의 비제한적 예에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌이민, 디에틸렌글리콜, 트리에틸렌글리콜, 폴리알칼렌 글리콜, 폴리알칼린 옥사이드, 폴리비닐 알코올, 나트륨 폴리포스페이트, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리하이드록시프로필옥사졸린, 폴리하이드록시프로필메타크릴아마이드, 폴리메타크릴아마이드, 폴리디메틸아크릴아마이드, 폴리하이드록시프로필메타크릴레이트, 폴리하이드록시에틸아크릴레이트, 하이드록시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리글리세린, 폴리아스파르트아마이드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체(폴록사머), 카복실산(예로, 아크릴산, 메타크릴산, 이타콘산, 및 말레산), 폴리옥시에틸렌, 폴리에틸렌옥사이드, 불포화 에틸렌계 모노디카복실산, 폴리락트산(PLA), 폴리프로필렌 옥사이드, 폴리(락티드-코-글리콜라이드)(PLGA), 폴리(엡실론-카프로락톤), 폴리(에틸에틸렌), 폴리부타디엔, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리비닐부틸에테르, 폴리스티렌, 폴리사이클로펜타디에닐메틸노르보르넨, 폴리에틸렌프로필렌, 폴리에틸에틸렌, 폴리이소부틸렌, 폴리실록산, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 프로필 아크릴레이트, n-부틸 아크릴레이트, 이소부틸 아크릴레이트, 2-에틸 아크릴레이트, t-부틸 아크릴레이트, 메타크릴레이트(예로, 에틸 메타크릴레이트, n-부틸 메타크릴레이트, 및 이소부틸 메타크릴레이트), 아크릴로니트릴, 메타크릴로니트릴, 비닐(예로, 비닐 아세테이트, 비닐베르세테이트, 비닐프로피오네이트, 비닐포름아마이드, 비닐아세트아마이드, 비닐피리딘, 및 비닐이미다졸), 아미노알킬(예로, 아미노알킬아크릴레이트, 아미노알킬스메타크릴레이트, 및 아미노알킬(메트)아크릴아마이드), 스티렌, 폴리알칼렌 글리콜, 폴리알칼린 옥사이드, 및 락트산이 포함된다. 천연 중합체의 비제한적 예에는 셀룰로오스, 레시틴, 및 히알루론산이 포함된다. 마이크로담체는 동일하거나 상이한 비로 상이한 중합체의 혼합물(예로, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 하나 이상의 중합체의 임의 조합)을 함유할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 마이크로담체는 하나 이상의 중합체(예로, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의 중합체)를 함유하는 코어, 및 하나 이상의 상이한 중합체(예로, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의 중합체)를 함유하는 외부 층을 함유할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서 이용될 수 있는 비제한적인 예시적 마이크로담체에는 CytoPoreTM 1 및 CytoPoreTM 2(GE Healthcare, Life Sciences, Piscataway, New Jersey에서 이용 가능함)가 포함된다. 본원에 기재된 임의의 방법에서 이용될 수 있는 마이크로담체의 추가 예는 공개적으로 이용 가능하고 당분야에 공지되어 있다.
다중-웰 플레이트
다양한 다중-플레이트가 당분야에 공지되어 있고, 본원에 기재된 임의의 방법에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 다중-웰 플레이트는 2-웰 플레이트, 4-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 8-웰 플레이트, 9-웰 플레이트, 10-웰 플레이트, 12-웰 플레이트, 15-웰 플레이트, 18-웰 플레이트, 20-웰 플레이트, 24-웰 플레이트, 36-웰 플레이트, 48-웰 플레이트, 60-웰 플레이트, 72-웰 플레이트, 또는 96-웰 플레이트일 수 있다. 일부 예에서, 웰은 약 0.3 mL 내지 약 25 mL(예로, 약 0.3 mL 내지 약 24 mL, 약 0.3 mL 내지 약 22 mL, 약 0.3 mL 내지 약 20 mL, 약 0.3 mL 내지 약 18 mL, 약 0.3 mL 내지 약 16 mL, 약 0.3 mL 내지 약 14 mL, 약 0.3 mL 내지 약 12 mL, 약 0.3 mL 내지 약 10 mL, 약 0.3 mL 내지 약 8 mL, 약 0.3 mL 내지 약 6 mL, 약 0.3 mL 내지 약 5 mL, 약 0.3 mL 내지 약 4 mL, 약 0.3 mL 내지 약 3 mL, 약 0.3 mL 내지 약 2 mL, 약 0.3 mL 내지 약 1 mL, 약 0.5 mL 내지 약 25 mL, 약 0.5 mL 내지 약 24 mL, 약 0.5 mL 내지 약 22 mL, 약 0.5 mL 및 약 0.5 mL 내지 약 20 mL, 약 0.5 mL 내지 약 18 mL, 약 0.5 mL 내지 약 16 mL, 약 0.5 mL 내지 약 14 mL, 약 0.5 mL 내지 약 12 mL, 약 0.5 mL 내지 약 10 mL, 약 0.5 mL 내지 약 8 mL, 약 0.5 mL 내지 약 6 mL, 약 0.5 mL 내지 약 5 mL, 약 0.5 mL 내지 약 4 mL, 약 0.5 mL 내지 약 3 mL, 약 0.5 mL 내지 약 2 mL, 약 0.5 mL 내지 약 1 mL, 약 1 mL 내지 약 25 mL, 약 1 mL 내지 약 24 mL, 약 1 mL 내지 약 22 mL, 약 1 mL 내지 약 20 mL, 약 1 mL 내지 약 18 mL, 약 1 mL 내지 약 16 mL, 약 1 mL 내지 약 14 mL, 약 1 mL 내지 약 12 mL, 약 1 mL 내지 약 10 mL, 약 1 mL 내지 약 8 mL, 약 1 mL 내지 약 7 mL, 약 1 mL 내지 약 6 mL, 약 1 mL 내지 약 5 mL, 약 1 mL 내지 약 4 mL, 약 1 mL 내지 약 3.5 mL, 약 1 mL 내지 약 3 mL, 약 1 mL 내지 약 2.5 mL, 약 1 mL 내지 약 2 mL, 약 1 mL 내지 약 1.5 mL, 약 1.5 mL 내지 약 25 mL, 약 1.5 mL 내지 약 24 mL, 약 1.5 mL 내지 약 22 mL, 약 1.5 mL 내지 약 20 mL, 약 1.5 mL 내지 약 18 mL, 약 1.5 mL 내지 약 16 mL, 약 1.5 mL 내지 약 14 mL, 약 1.5 mL 내지 약 12 mL, 약 1.5 mL 내지 약 10 mL, 약 1.5 mL 내지 약 8 mL, 약 1.5 mL 내지 약 6 mL, 약 1.5 mL 내지 약 5 mL, 약 1.5 mL 내지 약 4 mL, 약 1.5 mL 내지 약 3.5 mL, 약 1.5 mL 내지 약 3 mL, 약 1.5 mL 내지 약 2.5 mL, 약 1.5 mL 내지 약 2.0 mL, 약 2 mL 내지 약 25 mL, 약 2 mL 내지 약 24 mL, 약 2 mL 내지 약 22 mL, 약 2 mL 내지 약 20 mL, 약 2 mL 내지 약 18 mL, 약 2 mL 내지 약 16 mL, 약 2 mL 내지 약 14 mL, 약 2 mL 내지 약 12 mL, 약 2 mL 내지 약 10 mL, 약 2 mL 내지 약 8 mL, 약 2 mL 내지 약 6 mL, 또는 약 2 mL 내지 약 5 mL)의 부피(내부 부피)를 갖는다.
일부 예에서, 다중-웰 플레이트는 깊은-웰 플레이트이다. 예를 들어, 깊은-웰 플레이트에서 웰의 내부 높이는 1 cm 내지 약 12 cm(예로, 약 1 cm 내지 약 11 cm, 약 1 cm 내지 약 10 cm, 약 1 cm 내지 약 9 cm, 약 1 cm 내지 약 8 cm, 약 1 cm 내지 약 7 cm, 약 1 cm 내지 약 6 cm, 약 1 cm 내지 약 5 cm, 약 1 cm 내지 약 4 cm, 약 1 cm 내지 약 3 cm, 약 1.2 cm 내지 약 12 cm, 약 1.2 cm 내지 약 11 cm, 약 1.2 cm 내지 약 10 cm, 약 1.2 cm 내지 약 9 cm, 약 1.2 cm 내지 약 8 cm, 약 1.2 cm 내지 약 7 cm, 약 1.2 cm 내지 약 6 cm, 약 1.2 cm 내지 약 5 cm, 약 1.2 cm 내지 약 4 cm, 약 1.2 cm 내지 약 3 cm, 약 1.5 cm 내지 약 11 cm, 약 1.5 cm 내지 약 10 cm, 약 1.5 cm 내지 약 9 cm, 약 1.5 cm 내지 약 8 cm, 약 1.5 cm 내지 약 7 cm, 약 1.5 cm 내지 약 6 cm, 약 1.5 cm 내지 약 5 cm, 약 1.5 cm 내지 약 4 cm, 약 1.5 cm 내지 약 3 cm, 약 2 cm 내지 약 12 cm, 약 2 cm 내지 약 11 cm, 약 2 cm 내지 약 10 cm, 약 2 cm 내지 약 9 cm, 약 2 cm 내지 약 8 cm, 약 2 cm 내지 약 7 cm, 약 2 cm 내지 약 6 cm, 약 2 cm 내지 약 5 cm, 약 2 cm 내지 약 4 cm, 약 2 cm 내지 약 3 cm, 약 2.5 cm 내지 약 12 cm, 약 2.5 cm 내지 약 11 cm, 약 2.5 cm 내지 약 10 cm, 약 2.5 cm 내지 약 9 cm, 약 2.5 cm 내지 약 8 cm, 약 2.5 cm 내지 약 7 cm, 약 2.5 cm 내지 약 6 cm, 약 2.5 cm 내지 약 5 cm, 약 2.5 cm 내지 약 4 cm, 약 3 cm 내지 약 12 cm, 약 3 cm 내지 약 11 cm, 약 3 cm 내지 약 10 cm, 약 3 cm 내지 약 9 cm, 약 3 cm 내지 약 8 cm, 약 3 cm 내지 약 7 cm, 약 3 cm 내지 약 6 cm, 약 3 cm 내지 약 5 cm, 약 4 cm 내지 약 12 cm, 약 4 cm 내지 약 11 cm, 약 4 cm 내지 약 10 cm, 약 4 cm 내지 약 9 cm, 약 4 cm 내지 약 8 cm, 약 4 cm 내지 약 7 cm, 약 4 cm 내지 약 6 cm, 약 5 cm 내지 약 12 cm, 약 5 cm 내지 약 11 cm, 약 5 cm 내지 약 10 cm, 약 5 cm 내지 약 9 cm, 약 5 cm 내지 약 8 cm, 또는 약 5 cm 내지 약 7 cm)일 수 있다.
일부 예에서, 웰(예로, 깊은 웰 다중-웰 플레이트에서)은 평탄 바닥(사각형 바닥으로도 불림), 둥근형 바닥(반구형 바닥으로도 불림), 원뿔형 바닥, 또는 피라미드형 바닥을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 웰의 지름은 약 4.0 mm 내지 약 50 mm(예로, 4.0 mm 내지 약 45 mm, 약 4.0 mm 내지 약 40 mm, 약 4.0 mm 내지 약 35 mm, 약 4.0 mm 내지 약 30 mm, 약 4.0 mm 내지 약 25 mm, 약 4.0 mm 내지 약 20 mm, 약 4.0 mm 내지 약 15 mm, 약 4.0 mm 내지 약 10 mm, 약 6.0 mm 내지 약 50 mm, 약 6.0 mm 내지 약 45 mm, 약 6.0 mm 내지 약 40 mm, 약 6.0 mm 내지 약 35 mm, 약 6.0 mm 내지 약 30 mm, 약 6.0 mm 내지 약 25 mm, 약 6.0 mm 내지 약 25 mm, 약 6.0 mm 내지 약 20 mm, 약 6.0 mm 내지 약 15 mm, 약 6.0 mm 내지 약 10 mm, 약 8 mm 내지 약 50 mm, 약 8 mm 내지 약 45 mm, 약 8 mm 내지 약 40 mm, 약 8 mm 내지 약 35 mm, 약 8 mm 내지 약 30 mm, 약 8 mm 내지 약 25 mm, 약 8 mm 내지 약 20 mm, 약 8 mm 내지 약 15 mm, 약 10 mm 내지 약 50 mm, 약 10 mm 내지 약 45 mm, 약 10 mm 내지 약 40 mm, 약 10 mm 내지 약 35 mm, 약 10 mm 내지 약 30 mm, 약 10 mm 내지 약 25 mm, 약 10 mm 내지 약 20 mm, 약 15 mm 내지 약 50 mm, 약 15 mm 내지 약 45 mm, 약 15 mm 내지 약 40 mm, 약 15 mm 내지 약 35 mm, 약 15 mm 내지 약 30 mm, 약 15 mm 내지 약 25 mm, 또는 약 15 mm 내지 약 20 mm)일 수 있다.
일부 예에서, 다중-웰 플레이트는 밀봉된다(예로, 기체 투과성 일회용 막 또는 기체 투과성 실리콘 층으로 밀봉된다). 다중-웰 플레이트를 밀봉하기 위해 이용되는 물질의 비제한적 예는 실시예에 기재된다. 다중-웰 플레이트를 밀봉하기 위해 이용되는 추가적 물질은 당분야에 널리 공지되어 있다.
웰(들)의 내부 표면은 적어도 하나의 코팅(예로, 적어도 하나의 젤라틴, 콜라겐, 폴리-L-오르니틴, 폴리스티렌, 및 라미닌 코팅)을 가질 수 있다. 다중-웰 플레이트(예로, 상이한 형태 및 치수의 웰(들)) 및 웰(들)의 내부 표면 코팅의 추가 예는 당분야에 공지되어 있고, 본 발명에서 이용될 수 있다.
진탕
본원에 기재된 방법은 포유류 세포 및 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지를 함유하는 배양의 회전 진탕을 필요로 한다. 회전 진탕은 약 300 RPM 내지 약 600 RPM(예로, 약 300 RPM 내지 약 580 RPM, 약 300 RPM 내지 약 560 RPM, 약 300 RPM 내지 약 540 RPM, 약 300 RPM 내지 약 520 RPM, 약 300 RPM 내지 약 500 RPM, 약 300 RPM 내지 약 480 RPM, 약 300 RPM 내지 약 460 RPM, 약 300 RPM 내지 약 440 RPM, 약 300 RPM 내지 약 420 RPM, 약 300 RPM 내지 약 400 RPM, 약 300 RPM 내지 약 380 RPM, 약 300 RPM 내지 약 360 RPM, 약 320 RPM 내지 약 600 RPM, 약 320 RPM 내지 약 580 RPM, 약 320 RPM 내지 약 560 RPM, 약 320 RPM 내지 약 540 RPM, 약 320 RPM 내지 약 520 RPM, 약 320 RPM 내지 약 500 RPM, 약 320 RPM 내지 약 480 RPM, 약 320 RPM 내지 약 460 RPM, 약 320 RPM 내지 약 440 RPM, 약 320 RPM 내지 약 420 RPM, 약 320 RPM 내지 약 400 RPM, 약 320 RPM 내지 약 380 RPM, 약 330 RPM 내지 약 600 RPM, 약 330 RPM 내지 약 580 RPM, 약 330 RPM 내지 약 560 RPM, 약 330 RPM 내지 약 540 RPM, 약 330 RPM 내지 약 520 RPM, 약 330 RPM 내지 약 500 RPM, 약 330 RPM 내지 약 480 RPM, 약 330 RPM 내지 약 460 RPM, 약 330 RPM 내지 약 440 RPM, 약 330 RPM 내지 약 420 RPM, 약 330 RPM 내지 약 400 RPM, 약 330 RPM 내지 약 380 RPM, 약 340 RPM 내지 약 600 RPM, 약 340 RPM 내지 약 580 RPM, 약 340 RPM 내지 약 560 RPM, 약 340 RPM 내지 약 540 RPM, 약 340 RPM 내지 약 520 RPM, 약 340 RPM 내지 약 500 RPM, 약 340 RPM 내지 약 480 RPM, 약 340 RPM 내지 약 460 RPM, 약 340 RPM 내지 약 440 RPM, 약 340 RPM 내지 약 420 RPM, 약 340 RPM 내지 약 400 RPM, 약 360 RPM 내지 약 600 RPM, 약 360 RPM 내지 약 580 RPM, 약 360 RPM 내지 약 560 RPM, 약 360 RPM 내지 약 540 RPM, 약 360 RPM 내지 약 520 RPM, 약 360 RPM 내지 약 500 RPM, 약 360 RPM 내지 약 480 RPM, 약 360 RPM 내지 약 460 RPM, 약 360 RPM 내지 약 440 RPM, 약 360 RPM 내지 약 420 RPM, 약 380 RPM 내지 약 600 RPM, 약 380 RPM 내지 약 580 RPM, 약 380 RPM 내지 약 560 RPM, 약 380 RPM 내지 약 540 RPM, 약 380 RPM 내지 약 520 RPM, 약 380 RPM 내지 약 500 RPM, 약 380 RPM 내지 약 480 RPM, 약 380 RPM 내지 약 460 RPM, 약 380 RPM 내지 약 440 RPM, 약 400 RPM 내지 약 600 RPM, 약 400 RPM 내지 약 580 RPM, 약 400 RPM 내지 약 560 RPM, 약 400 RPM 내지 약 540 RPM, 약 400 RPM 내지 약 520 RPM, 약 400 RPM 내지 약 500 RPM, 약 400 RPM 내지 약 480 RPM, 또는 약 400 RPM 내지 약 460 RPM)의 빈도로 일어날 수 있다(예로, 인큐베이터, 예컨대 편심(궤도) 지름 약 3 mm 내지 약 50 mm의 진탕 인큐베이터에서).
당분야에서 이해될 수 있는 바와 같이, 진탕 수준(예로, RPM 속도)은 웰의 크기 및 형태(예로, 웰의 지름, 형태, 및 높이 중 하나 이상) 및 인큐베이션을 수행하기 위해 이용되는 인큐베이터의 편심(궤도) 지름에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 유사한 수준의 유체 전단력 및 용존 O2 농도를 달성하기 위해, 더 작은 편심(궤도) 지름은 더 높은 진탕 수준(예로, 더 높은 RPM 속도)을 필요로 할 수 있는 반면, 더 큰 편심(궤도) 지름은 더 낮은 진탕 수준(예로, 더 낮은 RPM 속도)을 필요로 할 수 있다. 또 다른 예에서, 유사한 수준의 유체 전단력 및 용존 O2 농도를 달성하기 위해, 더 큰 지름을 갖는 웰은 더 낮은 RPM 속도를 필요로 할 수 있는 반면, 더 작은 지름을 갖는 웰은 더 높은 RPM 속도를 필요로 할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 약 3 mm 내지 약 50 mm(예로, 약 3 mm 내지 약 25 mm, 또는 약 25 mm 내지 약 50 mm)의 편심(궤도) 지름을 갖는 진탕 튜브 인큐베이터 및 약 320 RPM 내지 약 500 RPM(예로, 약 320 RPM 내지 약 480 RPM, 약 320 RPM 내지 약 460 RPM, 약 320 RPM 내지 약 400 RPM, 약 320 RPM 내지 약 380 RPM, 약 320 RPM 내지 약 360 RPM, 약 320 RPM 내지 약 350 RPM, 약 320 RPM 내지 약 340 RPM, 약 330 RPM 내지 약 500 RPM, 약 330 RPM 내지 약 480 RPM, 약 330 RPM 내지 약 460 RPM, 약 330 RPM 내지 약 440 RPM, 약 330 RPM 내지 약 420 RPM, 약 330 RPM 내지 약 400 RPM, 약 330 RPM 내지 약 380 RPM, 약 330 RPM 내지 약 370 RPM, 약 330 RPM 내지 약 360 RPM, 약 330 RPM 내지 약 350 RPM, 약 340 RPM 내지 약 500 RPM, 약 340 RPM 내지 약 480 RPM, 340 RPM 내지 약 460 RPM, 약 340 RPM 내지 약 440 RPM, 약 340 RPM 내지 약 420 RPM, 약 340 RPM 내지 약 400 RPM, 약 340 RPM 내지 약 380 RPM, 약 340 RPM 내지 약 370 RPM, 약 340 RPM 내지 약 360 RPM, 약 350 RPM 내지 약 500 RPM, 약 350 RPM 내지 약 480 RPM, 약 350 RPM 내지 약 460 RPM, 약 350 RPM 내지 약 440 RPM, 약 350 RPM 내지 약 420 RPM, 약 350 RPM 내지 약 400 RPM, 약 350 RPM 내지 약 390 RPM, 약 350 RPM 내지 약 380 RPM, 약 350 RPM 내지 약 370 RPM, 약 360 RPM 내지 약 500 RPM, 약 360 RPM 내지 약 480 RPM, 약 360 RPM 내지 약 460 RPM, 약 360 RPM 내지 약 440 RPM, 약 360 RPM 내지 약 420 RPM, 약 360 RPM 내지 약 400 RPM, 약 360 RPM 내지 약 380 RPM, 또는 약 400 RPM 내지 약 500 RPM)의 진탕을 이용해서 수행된다. 회전 진탕은, 예로, 회전 원형 진탕 또는 회전 타원형 진탕을 이용하여 수행될 수 있다. 진탕은 연속적으로 또는 주기적으로 수행될 수 있다.
다중-웰 플레이트의 회전 진탕은 약 31℃ 내지 약 40℃의 온도에서 인큐베이션되고 약 320 RPM 내지 약 450 RPM(예로, 약 320 RPM 내지 약 440 RPM, 약 320 RPM 내지 약 430 RPM, 약 320 RPM 내지 약 420 RPM, 약 320 RPM 내지 약 410 RPM, 약 320 RPM 내지 약 400 RPM, 약 320 RPM 내지 약 390 RPM, 약 320 RPM 내지 약 380 RPM, 약 320 RPM 내지 약 370 RPM, 약 320 RPM 내지 약 360 RPM, 약 320 RPM 내지 약 350 RPM, 약 320 RPM 내지 약 340 RPM, 약 320 RPM 내지 약 330 RPM, 약 330 RPM 내지 약 450 RPM, 약 330 RPM 내지 약 440 RPM, 약 330 RPM 내지 약 430 RPM, 약 330 RPM 내지 약 420 RPM, 약 330 RPM 내지 약 410 RPM, 약 330 RPM 내지 약 400 RPM, 약 330 RPM 내지 약 390 RPM, 약 330 RPM 내지 약 380 RPM, 약 330 RPM 내지 약 370 RPM, 약 330 RPM 내지 약 360 RPM, 약 330 RPM 내지 약 350 RPM, 약 330 RPM 내지 약 340 RPM, 약 340 RPM 내지 약 450 RPM, 약 340 RPM 내지 약 440 RPM, 약 340 RPM 내지 약 430 RPM, 약 340 RPM 내지 약 420 RPM, 약 340 RPM 내지 약 410 RPM, 약 340 RPM 내지 약 400 RPM, 약 340 RPM 내지 약 390 RPM, 약 340 RPM 내지 약 380 RPM, 약 340 RPM 내지 약 370 RPM, 약 340 RPM 내지 약 360 RPM, 약 340 RPM 내지 약 350 RPM, 약 350 RPM 내지 약 450 RPM, 약 350 RPM 내지 약 440 RPM, 약 350 RPM 내지 약 430 RPM, 약 350 RPM 내지 약 420 RPM, 약 350 RPM 내지 약 410 RPM, 약 350 RPM 내지 약 400 RPM, 약 350 RPM 내지 약 390 RPM, 약 350 RPM 내지 약 380 RPM, 약 350 RPM 내지 약 370 RPM, 약 350 RPM 내지 약 360 RPM, 약 360 RPM 내지 약 450 RPM, 약 360 RPM 내지 약 440 RPM, 약 360 RPM 내지 약 430 RPM, 약 360 RPM 내지 약 420 RPM, 약 360 RPM 내지 약 410 RPM, 약 360 RPM 내지 약 400 RPM, 약 360 RPM 내지 약 390 RPM, 약 360 RPM 내지 약 380 RPM, 약 360 RPM 내지 약 370 RPM, 약 370 RPM 내지 약 450 RPM, 약 370 RPM 내지 약 430 RPM, 약 370 RPM 내지 약 410 RPM, 약 370 RPM 내지 약 390 RPM, 약 390 RPM 내지 약 450 RPM, 약 390 RPM 내지 약 430 RPM, 약 390 RPM 내지 약 410 RPM, 약 410 RPM 내지 약 450 RPM, 약 410 RPM 내지 약 430 RPM, 또는 약 430 RPM 내지 약 450 RPM)의 빈도로 진탕되는 웰 부피의 약 10% 내지 약 40%(예로, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 또는 약 35% 내지 약 40%)를 점유하는 액체 배양 배지를 함유하는 약 6.0 mm 내지 약 35 mm(예로, 약 6.0 mm 내지 약 30 mm, 약 6.0 mm 내지 약 25 mm, 약 6.0 mm 내지 약 20 mm, 약 6.0 mm 내지 약 15 mm, 약 10 mm 내지 약 35 mm, 약 10 mm 내지 약 30 mm, 약 10 mm 내지 약 25 mm, 약 10 mm 내지 약 20 mm, 약 15 mm 내지 약 35 mm, 약 15 mm 내지 약 30 mm, 약 15 mm 내지 약 25 mm, 약 20 mm 내지 약 35 mm, 약 20 mm 내지 약 30 mm, 또는 약 25 mm 내지 약 35 mm)의 지름 및 약 40 mm 내지 약 50 mm(예로, 약 40 mm 내지 약 45 mm 또는 약 45 mm 내지 약 50 mm)의 높이를 갖는 사각형-바닥 웰에서 달성되는 것과 본질적으로 동일한 유체 전단력 및 용존 산소(O2) 농도를 생성할 수 있다.
회전 진탕은 포유류 세포 및 액체 배양 배지(예로, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지)를 함유하는 하나 이상의 다중-웰 플레이트의 진탕을 제공하는 기계적 장치와 함께 가습된 대기 제어 인큐베이터를 이용해서(예로, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 초과 습도 또는 100% 습도에서) 수행될 수 있다.
온도
본원에 기재된 배양 방법은 약 31℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 당업자는 온도가 배양 방법에서의 특정 시점(들)에, 예로, 시간별 또는 일별 기준으로 변화될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 온도는 포유류 세포를 이용한 웰의 최초 씨드접종 후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 또는 약 20일 또는 그 초과에 변화되거나 조정될(예로, 증가되거나 감소될) 수 있다. 예를 들어, 온도는 상향 조정될 수 있다(예로, 최대 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 최대 또는 약 20℃의 변화). 예를 들어, 온도는 하향 조정될 수 있다(예로, 최대 또는 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 최대 또는 약 20℃의 변화).
배양 배지 제거 및 대체
본원에 기재된 방법에는 웰(들)로부터 제1 부피의 제1 액체 배양 배지(예로, 임의 농도의 포유류 세포 함유, 예로, 실질적으로 세포가 없는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지)의 제거 및 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가가 포함된다. 제거 및 첨가는 동시에 또는 순차적으로, 또는 둘의 조합으로 수행될 수 있다. 또한, 제거 및 첨가는 연속적으로(예로, 임의의 주어진 시기에 걸쳐(예로, 24 시간의 기간, 약 1시간 내지 약 24시간의 증분 시기에 걸쳐, 또는 24시간 초과의 증분 시기에 걸쳐) 웰의 부피 또는 제1 액체 배양 배지의 부피의 0.1% 내지 700%(예로, 1% 내지 600%, 1% 내지 500%, 1% 내지 400%, 1% 내지 350%, 1% 내지 300%, 1% 내지 250%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 또는 4% 내지 30%)의 부피를 제거하고 대체하는 속도로) 또는 주기적으로(예로, 3일 1회, 2일 1회, 1일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 또는 1일 5회), 또는 이들의 임의 조합으로 수행될 수 있다. 주기적으로 수행되는 경우, 제거되거나 대체되는 부피(예로, 약 24시간의 기간 내에, 약 1시간 내지 약 24시간의 증분 시기 내에, 또는 24시간 초과의 증분 시기 내에)는, 예로, 웰의 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 0.1% 내지 700%(예로, 1% 내지 700%, 1% 내지 600%, 1% 내지 500%, 1% 내지 400%, 1% 내지 300%, 1% 내지 200%, 1% 내지 100%, 100% 내지 200%, 5% 내지 150%, 10% 내지 50%, 15% 내지 40%, 8% 내지 80%, 또는 4% 내지 30%)일 수 있다. 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 일부 경우 배양 기간의 전부 또는 일부에 걸친 각각 24시간의 기간(또는 대안적으로, 약 1시간 내지 약 24시간의 증분 시기, 또는 24시간 초과의 증분 시기)에 걸쳐 대략 동일하게 유지될 수 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지가 제거되는 속도(부피/단위 시간) 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 첨가되는 속도(부피/단위 시간)는 변할 수 있다. 제1 부피의 제1 액체 배양 배지가 제거되는 속도(부피/단위 시간) 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 첨가되는 속도(부피/단위 시간)는 대략 동일할 수도 있고 또는 상이할 수도 있다.
대안적으로, 제거되고 첨가되는 부피는 배양 기간에 걸쳐 각각 24시간의 기간(또는 대안적으로, 약 1시간 내지 약 24시간의 증분 시기, 또는 24시간 초과의 증분 시기)에 걸쳐 변화(예로, 점진적으로 증가)할 수 있다. 부피의 점진적 증가를 포함하는 방법의 비제한적 예가 본원에 기재된다. 예를 들어, 배양 기간에 걸쳐 각각 24시간의 기간(또는 대안적으로, 약 1시간 내지 24시간 초과의 증분 시기, 또는 24시간 초과의 증분 시기) 내에서 제거되는 제1 액체 배양 배지의 부피 및 첨가되는 제2 액체 배양 배지의 부피는 배양 기간에 걸쳐 웰 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 0.5% 내지 약 30%인 부피부터 웰 부피 또는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 30% 내지 약 200%까지 증가될 수 있다(예로, 점진적으로 또는 시차 증분을 통해).
본원에 기재된 임의의 방법의 일부 구현예에서, 다중-웰 플레이트는 7일 초과의 시기 동안, 인큐베이션 1일 내지 3일에 각각 24시간의 기간으로, 인큐베이션되며, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 30% 내지 약 50%이며; 인큐베이션 4일 내지 6일에, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 30% 내지 약 50%이며; 인큐베이션 7일 및 그 이후 각각 24시간의 기간으로, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 90% 내지 약 150%이다.
다른 예에서, 각각 24시간의 기간으로, 최초 약 24 내지 48시간의 시기 후, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지 부피의 약 30% 내지 약 300%(예로, 약 30% 내지 약 280%, 약 30% 내지 약 260%, 약 30% 내지 약 240%, 약 30% 내지 약 220%, 약 30% 내지 약 200%, 약 30% 내지 약 180%, 약 30% 내지 약 160%, 약 30% 내지 약 150%, 약 30% 내지 약 140%, 약 30% 내지 약 120%, 약 30% 내지 약 100%, 약 30% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 300%, 약 40% 내지 약 280%, 약 40% 내지 약 260%, 약 40% 내지 약 240%, 약 40% 내지 약 220%, 약 40% 내지 약 200%, 약 40% 내지 약 180%, 약 40% 내지 약 160%, 약 40% 내지 약 140%, 약 40% 내지 약 120%, 약 40% 내지 약 100%, 약 40% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 300%, 약 50% 내지 약 280%, 약 50% 내지 약 260%, 약 50% 내지 약 240%, 약 50% 내지 약 220%, 약 50% 내지 약 200%, 약 50% 내지 약 180%, 약 50% 내지 약 160%, 약 50% 내지 약 140%, 약 50% 내지 약 120%, 약 50% 내지 약 100%, 또는 약 50% 내지 약 80%이다.
당업자는 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지가 동일한 유형의 배지일 수 있음을 이해할 것이다. 다른 경우, 제1 액체 배양 배지 및 제2 액체 배양 배지는 상이할 수 있다.
제1 부피의 제1 액체 배양 배지는, 예로, 다중-웰 플레이트의 원심분리(예로, 저속 스윙 버킷 원심분리), 및 실질적으로 상청액으로부터의 세포가 없는 제1 부피의 제1 액체 배양을 제거함으로써 제거될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지는 포유류 세포를 배제하는 분자량 컷오프를 갖는 멸균 막을 통한 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 침출 또는 중력 흐름에 의해 제거될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 제1 액체 배양 배지는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 전 적어도 30초(예로, 적어도 1분, 적어도 2분, 적어도 3분, 적어도 4분, 또는 적어도 5분)의 시기 동안 진탕을 중지하여 제거될 수 있다. 제1 부피의 제1 액체 배양 배지는 수동으로(예로, 웰로부터 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 흡입하거나 피펫팅하여) 또는 자동화된 방식으로(예로, 본원에 기재된 임의의 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템 또는 자동화된 장치를 이용하여) 제거될 수 있다.
제2 부피의 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지에, 예로, 관류 펌프에 의해 첨가될 수 있다. 제2 액체 배양 배지는 제1 액체 배양 배지에 수동으로(예로, 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 제1 액체 배양 배지 상에 직접 피펫팅하여) 또는 자동화된 방식으로(예로, 본원에 기재된 임의의 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템 또는 자동화된 장치를 이용하여) 첨가될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 제공된 임의의 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템을 이용해서 제1 부피의 제1 액체 배양 배지가 제거될 수 있고 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 제1 액체 배양 배지에 첨가될 수 있다.
일부 경우에서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지(예로, 실질적으로 포유류 세포가 없는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지)의 제거 및 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가는 포유류 세포를 이용한 웰(들)의 씨드접종의 적어도 1시간 이내(예로, 2 시간 이내, 3 시간 이내, 4 시간 이내, 5 시간 이내, 6 시간 이내, 7 시간 이내, 8 시간 이내, 9 시간 이내, 10 시간 이내, 12 시간 이내, 14 시간 이내, 16 시간 이내, 18 시간 이내, 24 시간 이내, 36 시간 이내, 48 시간 이내, 72 시간 이내, 96 시간 이내, 또는 96 시간 후)에는 일어나지 않는다.
일부 구현예에는 증발로 인한 제1 액체 배양 배지의 부피에서의 임의 감소를 상쇄하기 위해, 복수의 웰 각각으로 추가 부피의 제2 액체 배양 배지의 주기적 첨가가 추가로 포함된다. 예를 들어, 이러한 추가 부피의 제2 액체 배양 배지는 각각의 웰에, 예로, 적어도 24시간 1회, 적어도 48시간 1회, 적어도 72시간 1회, 또는 적어도 96시간 1회 첨가될 수 있다. 상기 추가 부피의 제2 액체 배양 배지는 수동으로 또는 자동화된 방식으로(예로, 자동화된 장치를 이용해서 또는 본원에 기재된 임의의 다중-웰 세포 배양 플레이트 시스템을 이용해서) 첨가될 수 있다.
CO
2
본원에 기재된 방법에는 최대 또는 약 15% CO2(예로, 최대 또는 약 14% CO2, 12% CO2, 10% CO2, 8% CO2, 6% CO2, 5% CO2, 4% CO2, 3% CO2, 2% CO2, 또는 최대 또는 약 1% CO2)를 함유하는 대기에서 다중-웰 플레이트의 인큐베이션이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 임의의 방법에는 가습화된 대기(예로, 적어도 또는 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 85%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 또는 약 95% 습도, 또는 약 100% 습도)에서 다중-웰 플레이트의 인큐베이션이 포함될 수 있다.
예시적 장치
본원에 기재된 배양 방법을 수행하기 위해 이용될 수 있는 장치의 비제한적 예에는 Appropriate Technical Resources(Maryland, USA) 배포 INFORS Multiron 진탕 인큐베이터(INFORS; Basel, Switzerland), 및 Kuhner 진탕 인큐베이터(Kuhner AG; Basel, Switzerland)가 포함된다. 배양 방법을 수행하기 위해 이용될 수 있는 장치의 비제한적 예에는 편심(궤도) 지름 약 3 mm 내지 약 50 mm(예로, 약 1 mm 내지 약 25 mm, 또는 약 25 mm 내지 약 50 mm)의 회전 인큐베이터가 포함된다. 진탕 인큐베이터 및 롤링 배양 인큐베이터의 추가 예는 당분야에 공지되어 있다.
용존 O
2
및 액체 전단력
또한 약 31℃ 내지 약 40의 온도에서 인큐베이션되고 약 320 RPM 내지 약 450 RPM(예로, 약 320 RPM 내지 약 440 RPM, 약 320 RPM 내지 약 430 RPM, 약 320 RPM 내지 약 420 RPM, 약 320 RPM 내지 약 410 RPM, 약 320 RPM 내지 약 400 RPM, 약 320 RPM 내지 약 390 RPM, 약 320 RPM 내지 약 380 RPM, 약 320 RPM 내지 약 370 RPM, 약 320 RPM 내지 약 360 RPM, 약 320 RPM 내지 약 350 RPM, 약 320 RPM 내지 약 340 RPM, 약 320 RPM 내지 약 330 RPM, 약 330 RPM 내지 약 450 RPM, 약 330 RPM 내지 약 440 RPM, 약 330 RPM 내지 약 430 RPM, 약 330 RPM 내지 약 420 RPM, 약 330 RPM 내지 약 410 RPM, 약 330 RPM 내지 약 400 RPM, 약 330 RPM 내지 약 390 RPM, 약 330 RPM 내지 약 380 RPM, 약 330 RPM 내지 약 370 RPM, 약 330 RPM 내지 약 360 RPM, 약 330 RPM 내지 약 350 RPM, 약 330 RPM 내지 약 340 RPM, 약 340 RPM 내지 약 450 RPM, 약 340 RPM 내지 약 440 RPM, 약 340 RPM 내지 약 430 RPM, 약 340 RPM 내지 약 420 RPM, 약 340 RPM 내지 약 410 RPM, 약 340 RPM 내지 약 400 RPM, 약 340 RPM 내지 약 390 RPM, 약 340 RPM 내지 약 380 RPM, 약 340 RPM 내지 약 370 RPM, 약 340 RPM 내지 약 360 RPM, 약 340 RPM 내지 약 350 RPM, 약 350 RPM 내지 약 450 RPM, 약 350 RPM 내지 약 440 RPM, 약 350 RPM 내지 약 430 RPM, 약 350 RPM 내지 약 420 RPM, 약 350 RPM 내지 약 410 RPM, 약 350 RPM 내지 약 400 RPM, 약 350 RPM 내지 약 390 RPM, 약 350 RPM 내지 약 380 RPM, 약 350 RPM 내지 약 370 RPM, 약 350 RPM 내지 약 360 RPM, 약 360 RPM 내지 약 450 RPM, 약 360 RPM 내지 약 440 RPM, 약 360 RPM 내지 약 430 RPM, 약 360 RPM 내지 약 420 RPM, 약 360 RPM 내지 약 410 RPM, 약 360 RPM 내지 약 400 RPM, 약 360 RPM 내지 약 390 RPM, 약 360 RPM 내지 약 380 RPM, 약 360 RPM 내지 약 370 RPM, 약 370 RPM 내지 약 450 RPM, 약 370 RPM 내지 약 430 RPM, 약 370 RPM 내지 약 410 RPM, 약 370 RPM 내지 약 390 RPM, 약 390 RPM 내지 약 450 RPM, 약 390 RPM 내지 약 430 RPM, 약 390 RPM 내지 약 410 RPM, 약 410 RPM 내지 약 450 RPM, 약 410 RPM 내지 약 430 RPM, 또는 약 430 RPM 내지 약 450 RPM)의 빈도로 진탕되는 약 6.0 mm 내지 약 35 mm(예로, 약 6.0 mm 내지 약 30 mm, 약 6.0 mm 내지 약 25 mm, 약 6.0 mm 내지 약 20 mm, 약 6.0 mm 내지 약 15 mm, 약 10 mm 내지 약 35 mm, 약 10 mm 내지 약 30 mm, 약 10 mm 내지 약 25 mm, 약 10 mm 내지 약 20 mm, 약 15 mm 내지 약 35 mm, 약 15 mm 내지 약 30 mm, 약 15 mm 내지 약 25 mm, 약 20 mm 내지 약 35 mm, 약 20 mm 내지 약 30 mm, 또는 약 25 mm 내지 약 35 mm)의 지름 및 약 40 mm 내지 약 50 mm(예로, 약 40 mm 내지 약 45 mm 또는 약 45 mm 내지 약 50 mm)의 높이를 갖는 사각형-바닥 웰 부피의 약 10% 내지 약 40%(예로, 약 10% 내지 약 35%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 40%, 약 15% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 또는 약 35% 내지 약 40%)를 점유하는 배지에서 달성되는 것과 동일한(또는 본질적으로 동일한) 유체 전단력 및 용존 산소(O2) 농도를 배지에서 생성하는 조건 하에 다중-웰 플레이트의 웰 내에 배치된 액체 배양 배지에 현탁된 포유류 세포의 구배 관류 공정에서의 배양을 포함하는 배양 방법이 제공된다.
당분야에 공지된 바와 같이, 다양한 세포 배양 파라미터가 특정한 용존 O2 농도 및 특정한 유체 전단력을 달성하기 위해 조정될 수 있다. 조정될 수 있는 이러한 파라미터의 비제한적 예에는 웰 부피, 액체 배양 배지의 부피, 웰의 형태(예로, 지름, 높이, 및 웰 바닥의 형태 중 하나 이상), 진탕 유형(예로, 회전 원형 진탕 및/또는 회전 타원형 진탕), 진탕 빈도, 액체 배양 배지의 유형, 웰의 내부 코팅, 및 액체 배양 배지의 온도가 포함된다. 이러한 배양 파라미터의 추가 예는 당분야에 공지되어 있다. 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 배양 파라미터의 임의 조합은 약 31℃ 내지 약 40℃의 온도에서 인큐베이션되고 약 320 RPM 내지 약 450 RPM(예로, 약 320 RPM 내지 약 360 RPM)의 빈도로 진탕되는 지름 약 6.0 mm 내지 약 35 mm 및 높이 약 40 mm 내지 약 50 mm를 갖는 사각형-바닥 웰 부피의 약 10% 내지 약 40%(예로, 약 15% 내지 약 25%)를 점유하는 배지에서 달성되는 것과 동일한(또는 본질적으로 동일한) 유체 전단력 및 용존 산소(O2) 농도를 배양 배지에서 달성하기 위해 임의 방식으로 조합될 수 있다.
액체 배양 배지 중 용존 O2 수준은 다양한 상이한 방법을 이용해서 검출될 수 있다. 예를 들어, 용존 O2는 용존 O2 전극 또는 탐침(예를 들어, Eutech Instruments WD-35201-80 용존 산소 탐침, Rosemount Analytical 499 시리즈 용존 산소/오존 센서, 및 Extech DO705 용존 산소 전극에서 이용 가능한 O2 탐침 및 전극)을 이용해서 측정될 수 있다. O2 탐침 및 전극의 교정 및 이용 방법은 제조업체의 지침을 이용해서 수행될 수 있다.
액체 배양 배지 중 유체 전단력은 당분야에 공지된 방법을 이용해서 계산될 수 있다. 액체 배양 배지 중 액체 전단력의 계산을 기재하는 적합한 텍스트북의 비제한적 예는 문헌[Fluid Mechanics, Robert A. Granger, 1995, Dover Publications, Inc., Mineola, NY, and Fundamentals of Fluid Mechanics, Bruce R. Munson et al., John Wiley & Sons, Inc., 2009]에 기재된다.
재조합 단백질의 생산 방법
또한 본원에 기재된 방법을 이용하여 재조합 단백질을 생산할 수 있는 세포 배양을 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법이 본원에 제공된다. 방법의 수행 후, 재조합 단백질은 포유류 세포로부터 및/또는 제1 또는 제2 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질은 배양 방법 동안 임의의 주어진 시점에 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로부터 회수된다(예로, 배양 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100일 중 하나 이상의 날에 또는 배양 100일 초과의 날 후에 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지로부터 회수된다). 이들 방법의 일부 구현예에는 일정 부피의 제3 배양 배지 또는 일정 부피의 제4 액체 배양 배지의 첨가가 추가로 포함되지만, 각 경우 웰 내 액체 배양 배지의 전체 부피는 대략 제1 액체 배양 배지 부피와 같거나 그보다 적어야 한다.
당업자는 임의의 다양한 배양 파라미터(예로, 본원에 기재된 다중-웰 플레이트, 웰, 부피, 배양 부피의 대체 속도 또는 빈도, 진탕 빈도, 온도, 배지, 및 CO2 농도)가 이들 방법을 수행하기 위해 임의 조합으로 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 임의의 포유류 세포가 재조합 단백질을 생산하기 위해 이용될 수 있다.
재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 분자 생물학 및 분자 유전자에 공지된 매우 다양한 방법을 이용하여 포유류 세포 내로 도입될 수 있다. 비제한적 예에는 전달감염(예로, 리포펙션), 형질감염(예로, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 레트로바이러스 감염), 및 전기천공이 포함된다. 일부 경우에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 포유류 세포의 염색체 내로 안정적으로 통합되지 않는다(일시적 전달감염); 반면, 다른 경우에서, 핵산은 통합된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 플라스미드 및/또는 포유류 인공 염색체(예로, 인간 인공 염색체)에 존재할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 핵산은 바이러스 벡터(예로, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스 벡터)를 이용해서 세포 내로 도입될 수 있다. 핵산은 프로모터 서열(예로, 강력 프로모터, 예컨대 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터, 또는 유도성 프로모터)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 원하는 경우, 핵산을 함유하는 벡터는 선택 가능한 마커(예로, 포유류 세포에 하이그로마이신, 퓨로마이신, 또는 네오마이신 내성을 부여하는 유전자)를 또한 함유할 수 있다.
일부 경우에서, 재조합 단백질은 분비된 단백질이며, 포유류 세포에 의해 세포외 배지(예로, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지) 내로 방출된다. 예를 들어, 가용성 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 재조합 단백질의 N- 또는 C-말단에 분비 신호 펩타이드를 인코딩하는 서열을 함유할 수 있고, 이는 포유류 세포에 존재하는 효소에 의해 절단된 후 세포외 배지(예로, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지) 내로 방출된다. 예를 들어, 이러한 분비된 재조합 단백질은 분비된 면역글로불린, 분비된 효소, 분비된 성장 인자, 분비된 단백질 단편, 또는 분비된 조작된 단백질일 수 있다. 다른 경우에서, 재조합 단백질은 분비되지 않는 가용성 단백질이며, 재조합 단백질은 포유류 세포 내에서부터 회수된다. 예를 들어, 분비되지 않는 재조합 단백질은 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편, 또는 조작된 단백질일 수 있다.
본원에서 제공되는 방법에 의해 생산될 수 있는 재조합 단백질의 비제한적 예에는 면역글로불린(경쇄 및 중쇄 면역글로불린, 항체, 또는 항체 단편(예로, 본원에 기재된 임의의 항체 단편), 효소(예로, 갈락토시다아제(예로, 알파-갈락토시다아제), 미오자임, 또는 세레자임), 단백질(예로, 성장 인자, 인간 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자(TNF), 또는 인터페론 알파 또는 베타), 조작된 단백질, 또는 면역원성 또는 항원성 단백질 또는 단백질 단편(예로, 백신으로 이용하기 위한 단백질)이 포함된다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질은 적어도 하나의 다기능성 재조합 단백질 스캐폴드를 함유하는 조작된 항원-결합 폴리펩타이드이다(예로, 문헌[Gebauer et al., Current Opin . Chem . Biol . 13:245-255, 2009]; 및 U.S. 특허 출원 공개 번호 2012/0164066(본원에 그 전문이 참조로 포함됨)]에 기재된 재조합 항원-결합 단백질 참고). 항체인 재조합 단백질의 비제한적 예에는 파니투무맵, 오말리주맵, 아바고보맵, 애브식시맵, 액톡수맵, 아달리무맵, 아데카투무맵, 아펠리모맵, 아푸투주맵, 알라시주맵, 알라시주맵, 알렘투주맵, 알리로쿠맵, 알투모맵, 아마툭시맵, 아나투모맵, 아폴리주맵, 아티누맵, 토실리주맵, 바실리지맵, 벡투모맵, 벨리무맵, 베바시주맵, 비시로맵, 카나키누맵, 세툭시맵, 다클리주맵, 덴수맵, 에쿨리주맵, 에드레콜로맵, 에팔리주맵, 에펀구맵, 에르투막소맵, 에타라시주맵, 골리무맵, 인플릭시맵, 나탈리주맵, 팔리비주맵, 파니투무맵, 페르투주맵, 라니비주맵, 리툭시맵, 토실리주맵, 및 트라스투주맵이 포함된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생산될 수 있는 치료 항체의 추가 예는 당분야에 공지되어 있다. 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있는 재조합 단백질의 추가적인 비제한적 예에는 알글루코시다아제 알파, 라로니다아제, 아바타셉트, 갈설파아제, 루트로핀 알파, 항-혈우병 인자, 아갈시다아제 베타, 인터페론 베타-1a, 다르베포에틴 알파, 테넥테플라아제, 에타네르셉트, 응고 인자 IX, 여포 자극 호르몬, 인터페론 베타-1a, 이미글루세라아제, 도르나아제 알파, 에포에틴 알파, 및 알테플라아제가 포함된다.
분비된 가용성 재조합 단백질은 포유류 세포로부터 액체 배양 배지를 제거하거나 다르게는 물리적으로 분리하여 액체 배양 배지(예로, 제1 및/또는 제2 액체 배양 배지)로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 피펫팅, 및/또는 흡입을 포함하는 포유류 세포로부터 액체 배양 배지를 제거하기 위한 다양한 상이한 방법은 당분야에 공지되어 있다. 이어서 분비된 재조합 단백질은 다양한 유형의 크로마토그래피(예로, 친화도 크로마토그래피, 분자 체 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피), 및/또는 여과(예로, 분자량 컷오프 여과)를 포함하는 다양한 생화학적 기법을 이용해서 액체 배양 배지로부터 회수되고 추가 정제될 수 있다.
세포내 재조합 단백질을 회수하기 위해, 포유류 세포는 용해될 수 있다. 예를 들어, 초음파 분쇄 및/또는 세제, 효소적, 및/또는 화학적 용해를 포함하는 포유류 세포를 용해하기 위해 광범위한 방법이 당분야에 공지되어 있다. 재조합 단백질은 전형적으로 세포 파편을 제거하기 위한 원심분리 단계를 시작한 후 하나 이상의 추가 단계(예로, 하나 이상의 유형의 크로마토그래피(예로, 친화도 크로마토그래피, 분자 체 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 또는 음이온 교환 크로마토그래피) 및/또는 여과(예로, 분자량 컷오프 여과))의 당분야에 공지된 다양한 생화학적 방법을 이용해서 포유류 세포 용해물로부터 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 회수된 재조합 단백질은 적어도 또는 약 50 중량% 순수하다, 예로, 적어도 또는 약 55 중량% 순수, 적어도 60 중량% 순수, 적어도 65 중량% 순수, 적어도 70 중량% 순수, 적어도 75 중량% 순수, 적어도 80 중량% 순수, 적어도 85 중량% 순수, 적어도 90 중량% 순수, 적어도 95 중량% 순수, 적어도 96 중량% 순수, 적어도 97 중량% 순수, 적어도 98 중량% 순수, 또는 적어도 또는 약 99 중량% 순수, 또는 99 중량% 초과 순수하다.
실시예
본 발명이 하기 실시예에서 추가로 설명되며, 이는 청구범위에 기재된 발명의 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1. 예시적인 배양 방법의 유익한 특성
관류 배양의 소규모 고처리량 모델을 생성하고, 이러한 배양이 생산 관류 배양에서와 유사한 세포 밀도를 달성할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
물질 및 방법
재조합 갈락토시다아제 현탁 세포 배양
재조합 갈락토시다아제를 생산한 동일한 클론의 세포주를 각각의 세포 배양 공정 수행에서 이용하였으며, 각각의 세포 배양 공정 수행에서 이용한 배양 배지를 표 1에 기재한다.
[표 1]
연구에서 이용한 배양 배지.
설비 및 시약
하기 설비 및 시약을 본 실시예에 기재된 세포 배양 공정 수행에서 이용하였다. Multitron 진탕 인큐베이터(Appropriate Technical Resources, Inc.)(모델 번호 AJ125), Cellometer® Auto1000(Nexcelom Bioscience LLC), Beckman Coulter Allegra 원심분리기(모델 번호 Allegra X-14 R), TubeSpin® Bioreactors 50(Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland), 96-웰 MASTERBLOCK® 마이크로플레이트 2-mL(Griener Bio One, Frickenhausen, Germany), 96-웰 MASTERBLOCK® 마이크로플레이트 1-mL(Griener Bio One, Frickenhausen, Germany), Olympus 백색 광 벤치 탑 현미경(모델 번호 BH-s), Olympus 백색 광 벤치 탑 현미경(모델 번호 BX40), Olympus 백색 광 벤치 탑 현미경(모델 번호 BX41), 0.4% 트립판 블루 용액(Sigma), 0.2% 트립판 블루 용액(Sigma), Reichert Bright-Line® 혈구계 챔버, Thermo Scientific 현미경 커버 글래스, Fisher Scientific 실험실 계수기, SAS® JMP 소프트웨어(버전 X), Applikon MicroFlask 마이크로타이터 플레이트 클램핑 장치(Applikon Biotechnology Inc.), AeraSeal, 마이크로포어성 일회용 막 밀봉재(Phenix Research Products), Beckman Coulter Biomek® 3000 실험실 자동화 워크스테이션, RAININ 피펫팅 360° Pipet-Lite™ XLS™ 피펫장치(Mettler Toledo), Ergenomic 고성능 피펫장치(VWR®), 및 시약 저장소(VistaLab Technologies).
방법
진탕(RPM), 웰 형태, 및 작업 부피에 대한 다양한 조건 범위를 평가하기 위해 연구를 수행하였다. 320 RPM 내지 360 RPM의 진탕, 둥근형-바닥(1-mL 정규 부피) 또는 사각형-바닥(2-mL 정규 부피) 웰, 그리고 100 ㎕ 내지 600 ㎕ 작업 부피의 범위를 커버하도록 연구를 설계하였다. 둥근형-바닥 깊은-웰 플레이트(1-mL 정규 부피)에 대한 작동 조건을 위한 기본사항을 결정하기 위해 세포 배양 공정 수행 I을 수행하였다. 고밀도 세포 배양을 지지하는 둥근형-바닥 깊은-웰 플레이트의 능력을 결정하기 위해 세포 배양 공정 수행 II를 수행하였다. Applikon MicroFlask 마이크로타이터 플레이트 클램핑 장치(Applikon Biotechnology, Inc., Foster City, CA)를 멸균, 마이크로다공성 막 밀봉재(AeraSeal, Phenix Research Products, Candler NC)와 비교하기 위해서 뿐만 아니라 설계 최적화를 위한 파라미터 범위를 확립하기 위해 세포 배양 공정 수행 III을 수행하였다. 모델 최적화 목적을 위해 세포 배양 공정 수행 IV 및 V를 설계하였다.
JMP 소프트웨어의 맞춤 설계 도구를 이용해서 세포 배양 공정 수행 V를 설계하였다. 3차 상호작용을 고려하여 2개의 연속 변수(진탕 속도 및 작업 부피) 및 1개의 분류 반응(웰 형태)을 이용해서 I-optimal로 모델을 설계하였다. 하한 및 상한을 표 2에 따라 설정하였다(작업 부피는 전체 용기 부피의 분율로서 기재함). 변수 간 임의의 비선형 상관성을 고려하기 위해 2 제곱을 갖도록 설계를 맞춤화하였다. 마지막으로, 2회씩 수행한 실험 당 총 15개 조건(6개는 둥근형- 및 9개는 사각형-바닥 웰에 대한 것임)을 갖도록 연구를 설계하였다.
[표 2]
JMP에서 이용한 연속 변수 설정.
세포 은행에서 바이알 해동 후, 각각 세포 배양 공정 수행 1-5에 대해 9, 10, 7, 0 및 7 계대에 대해 진탕 플라스크에서 증식된 씨드 배양으로부터의 세포를 이용해서 5 x 106 생활성 세포/mL 로 모든 용기에 접종하였다. 세포 배양을 진탕 인큐베이터에서 5% CO2, 37℃, 및 80% 상대 습도의 제어되는 환경에서 유지하였다. 튜브 당 10 mL의 일정한 작업 부피, 45°의 진탕 각도 및 160 RPM의 진탕으로 각 실험에서 대조군 진탕 튜브 조건을 수행하였다. 모든 실험에 있어서(달리 주지되지 않는 한), 표 3에 따라 증발을 고려하였다.
[표 3]
증발 보충
세포 배양 공정 수행 I에 있어서, 둥근형-바닥 깊은 웰 플레이트에 5 x 105 생활성 세포/mL 및 1 x 106 생활성 세포/mL을 접종하였다. 접종 후 1일에 시작해서, 배양을 2일 동안 매일 샘플링하여(10 ㎕) 수동 계수(트립판 블루 배제)에 의해 생활성 세포 밀도(VCD)를 결정하였다.
세포 배양 공정 수행 II에 있어서, 접종 후 1일부터 시작해서 11일 동안 배양을 매일 샘플링하여(10 ㎕) 수동 계수에 의해 VCD를 결정하였다. 세포 계수 후, 플레이트를 5분 동안 약 233 x g에서 원심분리하고, 소비 배지를 제거하였다. 배양 배지를 표 4에 기재된 비로 교환하였다.
둥근형-바닥(1-mL) 깊은-웰 플레이트 및 사각형-바닥(2-mL) 깊은-웰 플레이트를 세포 배양 공정 수행 III 및 IV를 위해 이용하였다. 접종 후 1일에 시작해서 배양을 매주 월요일, 수요일, 및 금요일에(2-2-3 일정) 샘플링하여(10 ㎕) Cellometer® Auto 1000을 통해 VCD를 결정하였다. 세포 계수 후, 플레이트를 5분 동안 약 233 x g에서 원심분리하고, 소비 배지를 제거하였다. 배양 배지를 표 4에 기재된 비로 교환하였다.
세포 배양 공정 수행 V에 있어서, Biomek 3000 액체 취급장치를 이용하였다. 접종 후 1일에 시작해서 배양을 매주 월요일, 수요일, 및 금요일에 샘플링하여(0.10 x 작업 부피) Cellometer® Auto 1000을 통해 VCD를 결정하였다. 세포 계수 후, 플레이트를 5분 동안 약 233 x g에서 원심분리하고, 제거한 소비 배지를 즉시 이용하거나 산물 역가를 결정하기 위해 재조합 인간 α-갈락토시다아제(rhα-Gal) 활성 검정을 수행하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 배양 배지를 표 5에 기재된 비로 교환하고, rhα-Gal부피 및 비 생산율을 아래의 공식 1 및 2를 이용해서 계산하였다. 추가적으로, 아래의 공식 3을 이용해서 누적 생활성 세포 밀도(IVCD)를 계산하였다.
[표 4]
회분식 재공급 일정
1 접종 시 씨드접종 밀도는 5 x 105 세포/L이다.
[표 5]
개질된 회분식 재공급 일정
1 접종 시 씨드접종 밀도는 5 x 105 세포/mL이다.
VPR = 역가 * PR 공식 1
PR: 관류 속도
VPR: 부피 생산율(U/L/d)
역가: rhα-Gal 활성(U/L)
SPR: 비 생산율(U/E9 세포/d)
Xv: 생활성 세포 수(E6 세포/mL)
IVCD: 누적 생활성 세포 밀도(세포-d/mL)
t: 시간(d)
수동 세포 계수
혈구계 챔버 및 커버 슬립을 이소프로필 알코올(IPA)로 세정하였다. 커버 슬립 모서리를 IPA로 수화시키고 혈구계에 고정하였다. 세포 샘플을 0.4% 트립판 블루와 1:1로 균질하게 혼합하였다. 분취물 10 ㎕을 혈구계 챔버로 옮겼다. 세포를 4개의 더 큰 외부 사각형에서 계수하였다: 각각의 큰 외부 사각형은 16개의 더 작은 사각형 그리드를 함유하였다. 더 큰 사각형의 경계에서 용해된 세포는 4개 측면 중 2개에서만 계수하였다. 염색되지 않은 세포는 생활성으로 계수한 반면, 파란색으로 염색된 세포는 죽은 것으로 간주하였다. 생활성 백분율 및 생활성 세포 밀도를 아래의 공식 4 및 5를 이용해서 계산하였다.
전체 세포: 생활성 세포 및 죽은 세포의 합
Nexcelom Cellometer 세포 계수
세포 샘플을 0.2% 트립판 블루와 1:1로 균질하게 혼합하였다. 혼합물의 20 ㎕ 분취물을 기기-특이적 슬라이드로 옮겼다. 세포를 기기에 포함된 디지털 카메라로 찍은 4개 영상에서 계수하였다. 염색되지 않은 세포는 생활성으로 계수한 반면, 파란색으로 염색된 세포는 죽은 것으로 간주하였다.
통계 분석
통계 분석을 JMP 소프트웨어를 이용해서 수행하였다. 이용한 반응은 피크 생활성 세포 밀도(VCD 또는 XV) 및 최대 선호도를 갖는 부피 생산율(VPR)이었다. 통계 모델을 효과 스크리닝 보고서와 함께 '피팅 모델' 함수를 통해 평가하였다. '정렬 파라미터 추정'은 t-테스트를 통해 통계적으로 결정되는 반응 변수에 유의미하게 효과를 나타낸 인자를 보고하였다. 마지막으로 '예측 프로파일러'는 반응 변수에 대한 파라미터 효과의 독립적 경향성을 도시하고, 선호도 함수의 최대화를 통해 최적 조건을 예측하기 위한 모델을 이용한다.
결과
세포 배양 공정 수행 I
상기 실험에서, 바이알 해동 후 27일째에 rhα-Gal CHO 세포주(CD CHO 배지)를 이용하여 3개의 상이한 조건 하에 용기를 접종하였다(표 6). 세포 배양 증식 프로필을 11일에 걸쳐 추적하였다.
[표 6]
세포 배양 공정 I 평가 조건
11일 동안 CD CHO 배지에서 유지된 배양의 생활성 세포 밀도 프로필을 도 5에 나타낸다. 모든 실험 배양에서 성장이 관찰되었다. 5 x 105 세포/mL로 씨드접종된 세포에 있어서, VCD 1 x 106 세포/mL에 도달한 두 작업 부피(200 ㎕ 및 300 ㎕) 모두에 최소 성장이 존재하였다. 이는 세포가 둥근형-바닥 깊은-웰 플레이트에서 낮은 씨드접종 밀도에서 성장할 수 있음을 제시한다. 1 x 106 세포/mL로 씨드접종된 배양도 2일까지 성장을 나타내었고, 배양에 0.5 RV로 하루 2회 재공급하여 더 우수한 성장을 가졌다(도 6). 하루 2회 재공급된 배양은 2일째에 2 x 106 세포/mL 초과의 VCD에 도달하였다: 200 ㎕로는 2.7 x 106 세포/mL 및 300 ㎕로는 2.3 x 106 세포/mL. 대략 1.0 RV/일로 재공급된 배양은 2일째에 훨씬 더 낮은 VCD를 가졌고, 이는 또한 소비 배지 제거 동안 의도치않은 세포 손실을 야기할 수 있었다. 이들 데이터는 2 x 0.5 RV/일의 관류 속도가 1.0 RV/일의 관류 속도보다 더 우수한 세포 성장을 허용함을 시사한다. 이들 데이터는 둥근형-바닥 1-mL 96-깊은-웰 플레이트가 세포 성장을 지지할 수 있음을 제시한다. 실험 전체에 걸쳐서, 배양은 진탕 인큐베이터에서 제거되자마자 아마도 불충분한 진탕으로 인해 작은 세포 펠렛을 갖는 것이 관찰되었다. 상기 관찰은 둥근형-바닥 1-mL 깊은-웰 플레이트에 대해 더 높은 진탕 속도를 이용해야 함을 제시한다.
세포 배양 공정 수행 II
둥근형-바닥(1-mL) 96-깊은-웰 플레이트에서 세포를 배양하기 위해 이용되는 관류 속도를 최적화하기 위해 한 세트의 실험을 수행하였다. 이들 실험에서, CD CHO 배지 중 rhα-Gal 세포(바이알 해동 후 30일째)를 이용하여 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트의 웰 및 진탕 튜브를 접종하였다(표 7에 기재됨). 세포 배양 성능을 11일 회분식 재공급 공정에서 평가하였다.
[표 7]
세포 배양 공정 수행 평가 조건
모든 배양은 85% 초과의 세포 생활성 백분율을 유지하였다(도 7). CD CHO 배지에서 유지된 세포의 11일 배양의 생활성 세포 밀도 프로필을 도 8에 나타낸다. 실험 대조군(진탕 튜브 배양) 세포 성장이 25 x 106 세포/mL의 피크 밀도에서 안정기가 되었을 때인 9일까지 모든 배양에 대해 성장이 관찰되었다. 둥근형-바닥 96-깊은 웰 플레이트에서의 배양은 8 x 106 세포/mL에서 피크 VCD에 도달하며, 실험 대조군보다 느린 성장 속도를 나타내었다. 8일째에, 배지의 볼루스(50 ㎕)를 증발 손실을 고려하여 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양에 첨가하였다.
둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에 대한 이들 데이터는 재공급 일정이 조정되어야 함을 제시한다. 개질된 재공급 일정을 도 9 및 표 3에 나타낸다.
세포 배양 공정 수행 III
둥근형-바닥 96-깊은 웰 플레이트에서 세포를 배양하기 위해 이용되는 재공급 속도를 최적화하기 위한 실험 세트를 수행하였다. 이들 실험을 1-mL 둥근형-바닥 및 2-mL 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 둘 다, 및 도 9에 나타낸 개질된 재공급 속도 프로토콜을 이용해서 수행하였다. 바이알 해동 후 8일째에, CD CHO 배양 배지에서 rhα-Gal 세포를 이용하여 깊은-웰 플레이트 및 진탕 튜브 두 유형을 모두 접종하였다(표 8 참고). 사각형-바닥 96-깊은-웰 배양은 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 부피를 함유한 반면, 둥근형-바닥 96-깊은-웰 배양은 200 ㎕ 또는 300 ㎕(1 mL 정규 부피)의 배양 부피를 함유하였다. Applikon 시스템을 이용해서 또는 AeraSeal 막을 이용해서 웰을 밀봉하였다. 96-깊은-웰 플레이트 배양을 모두 330 RPM 또는 360 RPM으로 진탕하였다. 세포 배양 성장을 9일에 걸쳐 측정하였다. 96-깊은-웰 플레이트 배양에 대한 모든 생활성 세포 수를 3개씩의 웰에서 계수하고 평균내었다.
15일 세포 배양의 생활성 세포 밀도 프로필을 도 10에 나타낸다. Applikon 시스템을 이용해서 커버된 또는 일회용 막 밀봉재를 이용해서 커버된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양에 대해 유사한 성장 프로필이 나타났다(서로 1 표준 편차(1 SD) 내에 놓임). 96-웰 플레이트 형식에서 가장 높은 생활성 세포 밀도는 35 x 106 세포/mL의 생활성 세포 밀도였고, 이는 15일째에 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 달성되었다. 대조군 진탕 튜브 배양에서 달성된 가장 높은 생활성 세포 밀도는 10일째의 21 x 106 세포/mL이었다. 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양은 또한 13일까지 대조군 진탕 튜브 배양의 성장 프로필과 매우 유사하였다. 그러나, 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양은 전체 15일 공정에 있어서 과거(historic) 진탕 튜브 대조군(n = 11)과 유사하였다. 과거 진탕 튜브 대조군 배양과 가장 가깝게 유사한 2개의 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양은 일회용 막 커버를 이용하였고, 330 RPM으로 진탕되었으며, 300 ㎕ 또는 500 ㎕의 배양 부피를 가졌다.
상기 실험에서 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양은 대조군 진탕 튜브 배양과 필적하는 성장을 나타내지 않았다. 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양에서 관찰된 가장 높은 생활성 세포 밀도는 15일째의 14 x 106 세포/mL이었다. 모든 배양은 감소 상에 들어가기 전까지 85% 초과의 세포 생활성 백분율을 유지하였다(도 11). 진탕 튜브 대조군과는 달리, 두 웰 형태의 배양은 모두 14일 이후 증식을 계속하여, 20일째에 50 x 106 세포/mL(사각형-바닥) 및 17 x 106 세포/mL(둥근형-바닥)의 생활성 세포 밀도에 도달하였다(도 12 및 13). 이들 데이터는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트가 높은 세포 밀도를 지지할 수 있음을 시사한다.
[표 8]
세포 배양 공정 수행 III 평가 조건
세포 배양 공정 수행 IV
사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트(2-mL 정규 부피)에서 세포 성장을 최적화하기 위해 추가 실험 세트를 수행하였다. 이들 실험에서, 바이알 해동 후 1일째에 CD CHO 배양 배지 중 세포를 이용해서 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 및 진탕 튜브를 접종하였다(n=3)(표 9 참고). 이들 실험에서 이용된 배양 부피는 300 ㎕ 또는 500 ㎕였고, 배양은 320 RPM, 330 RPM, 또는 340 RPM으로 진탕하였다. 배양에서의 세포 성장을 14일에 걸쳐 평가하였다. 배양에 대한 전체 생활성 세포 수를 3개씩의 웰로부터 계수하고, 평균내었다.
[표 9]
세포 배양 공정 수행 IV 평가 조건
14일에 걸친 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양의 생활성 세포 밀도 프로필을 도 14에 나타낸다. 7일까지 모든 평가 조건에 대해 유사한 성장 프로필이 나타났다. 7일 후, 500 ㎕의 배양 부피를 갖고 320 RPM 또는 330 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양은 더 우수한 세포 성장을 나타내었다. 모든 평가된 배양 조건이 13일 이후 게속 증식하여 30 x 106 세포/mL 내지 35 x 106 세포/mL의 생활성 세포 밀도에 도달하였지만, 더 우수한 성장 성능을 가진 2개의 배양 조건은 40 x 106 세포/mL을 초과하는 생활성 세포 밀도에 도달하였다. 500 ㎕의 배양 부피 및 320 RPM 또는 330 RPM의 진탕 속도를 갖는 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양에서 달성된 생활성 세포 밀도는 12일 후 진탕 튜브에서 동일한 세포주의 배양에서 역사적으로 관찰된 생활성 세포 밀도를 능가하였다(1 표준 편차 이내에 속함). 배양 12일까지, 500 ㎕의 배양 부피 및 320 RPM 또는 330 RPM의 진탕 속도를 갖는 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양 및 진탕 튜브 배양에서 유사한 성장 패턴이 관찰되었다.
세포 배양 공정 수행 V
세포 배양 작동 조건(상기 실험 방법 설계의 설명 참고)을 최적화하기 위해 추가 실험 세트를 수행하였다. 이들 실험에서 바이알 해동 후 21일째에 CD CHO 중 세포를 이용해서 사각형-바닥 또는 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트, 또는 진탕 튜브를 접종하였다. 각각의 평가 배양에 대한 작동 조건을 표 10에 나타낸다. 각각의 평가된 96-깊은-웰 플레이트를 AeraSeal 일회용 막으로 커버하였다. 진탕 튜브 배양이 대조군으로 작용하였다(n=4): 한 세트의 두 진탕 튜브 배양은 대조군 재공급 일정을 따랐고, 또 다른 세트의 두 진탕 튜브 배양은 96-깊은-웰 플레이트에서 이용된 개질된 재공급 속도를 따랐다(도 9에 도시됨). 모든 조건은 2개씩 평가하였다. 세포 성장을 9일 회분식 재공급 공정에서 평가하였다.
[표 10]
세포 배양 공정 수행 V 평가 조건
표 10에 기재된 CD CHO 배지에서 유지된 세포의 15일 배양의 생활성 세포 밀도 프로필을 도 15 및 16에 나타낸다. 여기서 평가된 조건 하에 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양뿐만 아니라 사각형-바닥 배양은 잘 기능하지 않았다(각각 도 15 및 도 16) 둥근형-바닥 96-깊은 웰 플레이트에서 도달한 가장 높은 생활성 세포 밀도는 360 RPM으로 진탕된 100 ㎕ 배양에 대한 20 x 106 세포/mL이었다. 사각형-바닥 96-깊은 웰 플레이트 배양은 40 x 106 세포/mL에 가까운 피크 생활성 세포 밀도를 가지는 대조군 진탕 튜브 배양에 필적하는 생활성 세포 밀도를 가졌다(1 표준 편차 내)(상술된 개질된 재공급 속도가 이용된 경우). 최고의 사각형-바닥 96-깊은 웰 세포 배양 성능은 배양 부피 400 ㎕ 및 320 RPM 또는 340 RPM의 진탕을 이용해서 달성되어 15일째에 대략 50 x 106 세포/mL의 피크 생활성 세포 밀도에 도달하였다. 또한, 배양 부피 600 ㎕ 및 340 RPM의 진탕을 갖는 사각형-바닥 96-깊은 웰은 13일째에 최대 27 x 106 세포/mL의 세포 성장을 일으켰고 31 x 106 세포/mL의 피크 생활성 세포 밀도에 도달한 진탕 튜브 대조군 배양(대조군 재공급 속도)과 필적하는 결과를 일으켰다. 모든 평가된 배양은 85% 초과의 생활성 세포 백분율을 유지하였다. 진탕 튜브 대조군 배양 및 96-깊은-웰 배양에 대한 누적 생활성 세포 밀도 간 비교를 도 17 및 18에 나타낸다.
CD CHO에서 배양된 세포의 15일 배양의 부피 생산율 프로필을 도 19 및 20에 나타낸다. 생활성 세포 성장에 근거하여 예상된 바와 같이, 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 성장시킨 배양은 더 적은 생산성을 가졌다(도 19). 22,000 단위/L/일의 최적 부피 생산율이 100 ㎕ 배양 배지 중 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에서 320 RPM의 진탕으로 성장시킨 배양에서 15일째에 관찰되었다(도 19). 그러나, 동일한 배양 부피 및 진탕을 가진 둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양은 이전 날들에 있어서 낮은 부피 생산율(<5000 단위/L/일)을 가졌다. 성장 프로필을 가까이 따른 사각형-바닥 96-깊은-웰 배양(도 20)에서 개선된 부피 생산율이 관찰되었다. 그 성장 패턴이 진탕 튜브 배양(600 ㎕ 부피를 가지며 340 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 배양)과 매우 유사한 배양에 대해 필적하는 활성(15일째에 40000 단위/L/일)이 관찰되었다. 초기 성장 지연을 갖지만 궁극적으로는 대조군 진탕 튜브 배양과 유사한 피크 생활성 세포 밀도를 갖는 몇몇 배양(400 ㎕ 부피 및 340 RPM 진탕, 또는 400 ㎕ 또는 600 ㎕ 부피 및 360 RPM 진탕을 갖는 사각형-바닥 96-깊은-웰 배양)은 13일까지 유사한 부피 생산율을 나타내었다(대략 40,000 단위/L/일의 부피 생산율에 도달함). 13일 이후, 15일째에 60,000 단위/L/일의 부피 생산율에 도달한 400 ㎕ 부피로 360 RPM으로 진탕되어 성장시킨 배양을 제외하고, 부피 생산율은 감소하였다. 15일째에 67,000 단위/L/일의 부피 생산율에 도달한 400 ㎕ 부피를 가지고 320 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 배양에서 최적 생산성이 관찰되었다.
둥근형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양에 대한 대부분의 조건은 100 ㎕ 부피로 320 RPM으로 진탕되어, 또는 300 ㎕ 부피로 360 RPM으로 진탕되어 성장시킨 배양을 제외하고, 대조군 진탕 튜브 배양에 비해 필적하거나 더 낮은 비 생산율(SPR)을 나타내었다(도 21). 이들 배양은 15일째에 증가된 비 생산율을 가졌다. 필적하거나 더 높은 부피 생산율을 갖는 5개의 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트 배양은 또한 대조군 진탕 튜브 배양(1600 단위/1 x 109 세포/일)에 비해 필적하거나 더 높은 비 생산율을 나타내었다(도 22).
수집된 데이터를 JMP 실험 설계 내로 투입하여 통계 분석에 근거하여 최적 작동 조건을 예측하였다. 최적 작동 조건을 3개 반응을 이용하여 예측하였다: 피크 생활성 세포 밀도, 피크 부피 생산율, 및 피크 비 생산율. 모든 반응 한계는 결과를 최대화하도록 설정하였다. 먼저, 데이터를 도 23 및 24에 나타낸 바와 같이 모델에 피팅시켰다. 생활성 세포 밀도(도 23) 및 부피 생산율(도 24)에 대해 수집된 데이터는 모델에 잘 피팅된다. 통계 분석(t-테스트)은 웰 형태 및 작업 부피가 생활성 세포 밀도 및 생산성 모두에 유의미하게 영향을 미친 반면, 진탕 속도는 생산성에만 유의미하게 영향을 미침을 드러내었다.
최적 작동 조건을 JMP 프로파일러를 이용해서 예측하였다(도 25). 분석에 근거하여, 440 ㎕의 작업 부피를 가지며 360 RPM으로 진탕된 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트를 이용하는 경우, 최적 세포 성능이 수득되어야 한다. 표준 편차를 고려하고 동일한 선호도를 유지하면, 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트에 대한 최적 작동 범위는 작업 부피는 약 350 ㎕ 내지 약 550 ㎕이고, 진탕 속도는 약 320 RPM 내지 약 360 RPM이다.
종합하면, 데이터는 본원에 제공된 방법이 더 대규모 관류 바이오리액터 세포 배양 모델로서 이용될 수 있음을 나타낸다(예로, 유사한 시간 프레임에 걸쳐 유사한 세포 밀도를 달성하여). 본원에 제공된 방법은 조직 배양 배지(및 조직 배양 배지 내의 성분)의 고처리량 스크리닝을 위해 이용될 수 있다.
실시예 2. 배양 배지를 스크리닝하기 위한 96-깊은-웰 배양 방법의 용도
본원에 기재된 96-깊은-웰 배양 방법을 이용하여 다양한 상이한 조직 배양 배지를 평가하기 위해 추가 실험 세트를 수행하였다. 이들 실험에서, 모노클로날 항체를 생산하는 재조합 포유류 세포주(mAb-생산 세포) 또는 효소를 생산하는 재조합 포유류 세포주(효소-생산 세포)를 이용하여 사각형-바닥 96-깊은-웰 플레이트를 접종하고, 세포를 1주 동안 330 RPM으로 진탕하는 적어도 102개의 상이한 조직 배양 배지 중 하나의 500 ㎕에서 배양하였다. 이들 실험에서의 대조군은 동일한 96-깊은-웰 플레이트, 동일한 배양 배지, 샘플 세포주, 및 CD CHO 배지를 이용하여 달성된 생활성 세포 밀도였다. 생활성 세포 밀도 및 배양의 역가를 모두 7일에 걸쳐 측정하였다.
도 26 내지 29에서의 데이터는 본원에 기재된 96-깊은-웰 배양 방법이 생활성 세포 밀도 및 배양된 세포의 생산성에 대한 상이한 조직 배양 배지의 효과를 스크리닝할 수 있음을 나타낸다.
기타 구현예
본 발명이 이들의 상세한 설명과 함께 기재되었으나, 상기 설명은 첨부되는 청구범위의 범위에 의해 정의되는 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위한 것임이 이해되어야 한다. 다른 양태, 장점, 및 개질은 하기 청구범위의 범위 내이다.
Claims (76)
- 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 관류 배양 방법으로서,
제1 액체 배양 배지에 배치된 CHO 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 제공하는 단계이며, 제1 액체 배양 배지가 웰 부피의 5% 내지 70%를 점유하는 것인 단계,
31℃ 내지 40℃에서 320 분당 회전수(RPM) 내지 360 RPM의 회전 진탕으로 일정 시기 동안 다중-웰 플레이트를 인큐베이션하는 단계, 및
상기 일정 시기 동안 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계이며, 제1 및 제2 부피는 동일하거나 1% 내지 10% 다른 것인 단계
를 포함하고, 웰에서 15 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL의 생활성(viable) 세포 밀도를 야기하는 것인 방법. - 재조합 단백질의 생산 방법으로서,
제1 액체 배양 배지에 배치된 CHO 세포를 포함하는 적어도 하나의 웰을 포함하는 다중-웰 플레이트를 제공하는 단계이며, 제1 액체 배양 배지가 웰 부피의 5% 내지 70%를 점유하고 CHO 세포가 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 함유하는 것인 단계,
31℃ 내지 40℃에서 320 분당 회전수(RPM) 내지 360 RPM의 회전 진탕으로 일정 시기 동안 다중-웰 플레이트를 인큐베이션하는 단계,
상기 일정 시기 동안 연속적으로 또는 주기적으로 제1 부피의 제1 액체 배양 배지를 제거하고 제1 액체 배양 배지에 제2 부피의 제2 액체 배양 배지를 첨가하는 단계이며, 제1 및 제2 부피는 동일하거나 1% 내지 10% 다른 것인 단계, 및
CHO 세포로부터 또는 제1 또는 제2 액체 배양 배지로부터 재조합 단백질을 회수하는 단계
를 포함하고, 웰에서 15 x 106 세포/mL 내지 60 x 106 세포/mL의 생활성(viable) 세포 밀도를 야기하는 것인 방법. - 제2항에 있어서, 재조합 단백질이 CHO 세포로부터 회수되는 것인 방법.
- 제3항에 있어서, 재조합 단백질이 면역글로불린, 효소, 성장 인자, 단백질 단편, 또는 조작된(engineered) 단백질인 방법.
- 제2항에 있어서, 재조합 단백질이 제1 또는 제2 액체 배양 배지로부터 회수되는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 재조합 단백질이 분비된 면역글로불린, 분비된 효소, 분비된 성장 인자, 분비된 단백질 단편, 또는 분비된 조작된 단백질인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지에 실질적으로 CHO 세포가 없는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 액체 배양 배지가 웰 부피의 10% 내지 60%를 점유하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가가 동시에 수행되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가가 연속적으로 수행되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 부피의 제1 액체 배양 배지의 제거 및 제2 부피의 제2 액체 배양 배지의 첨가가 주기적으로 수행되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 경시적으로 증가되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
다중-웰 플레이트가 7일 초과의 시기 동안 인큐베이션되며,
인큐베이션 1일 내지 3일에는 각각 24시간의 기간으로, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 제1 액체 배양 배지 부피의 30% 내지 50%이고,
인큐베이션 4일 내지 6일에는 각각 24시간의 기간으로, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 제1 액체 배양 배지 부피의 40% 내지 70%이고,
인큐베이션 7일 및 그 이후에는 각각 24시간의 기간으로, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 제1 액체 배양 배지 부피의 90% 내지 150%인
방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 다중-웰 플레이트가 깊은-웰 플레이트인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, CHO 세포가 제1 액체 배양 배지의 150 μL 내지 1 mL 중에 현탁되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 액체 배양 배지 및/또는 제2 액체 배양 배지가 화학적으로 정의된 액체 배양 배지, 혈청 비함유 액체 배양 배지, 혈청 함유 액체 배양 배지, 동물 유래 성분 비함유 액체 배양 배지, 및 단백질 비함유 배지로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 최초 24 내지 48 시간의 시기 후, 각각 24-시간의 기간으로, 제거되는 제1 부피의 제1 액체 배양 배지 및 첨가되는 제2 부피의 제2 액체 배양 배지가 제1 액체 배양 배지 부피의 30% 내지 150%인 방법.
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