CN116829696A - 调整细胞培养基pH的方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于调整细胞培养基的pH的方法、用于在经pH调整的细胞培养基中培养细胞的方法，以及用于制备由在经pH调整的细胞培养基中培养的细胞表达的多肽的方法。还描述了用于确定应添加至细胞培养基以获得期望的pH的酸或碱的多少的系统。这些方法包括电荷平衡模型，该模型包括针对细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度、应用于细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度和期望的培养基pH的参数。

Description

调整细胞培养基pH的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月12日提交的美国临时申请号63/149,169的优先权和权益，该申请出于所有目的通过引用并入本文。
发明领域
本文所述的是调整溶液，诸如细胞培养基的pH的方法。还描述了使用经pH调整的细胞培养基的方法，包括培养细胞和从在细胞培养基中培养的细胞表达多肽的方法。进一步描述的是用于确定溶液(诸如细胞培养基)的pH应当如何调整的系统。
背景技术
在过去几十年里，哺乳动物细胞培养物已经用于产生许多有价值的生物制药生物制品。这些是由活细胞制成的复杂药物，包括单克隆抗体、治疗性蛋白质和疫苗。传统上，生物制药药物在成功满足该治疗用途所需的所有产品质量标准后才投放到市场。然而，由于越来越多的复杂生物产品不能通过“最终产品测试”来完全表征，因此更需要对生产过程进行更加全面的验证。在这种背景下，美国食品和药品管理局(FDA)引入了设计质量(Qualityby Design，QbD)，其中基于增加的科学知识基础，将质量标准建立为产品和过程两者，以满足特定目标并降低制造期间的潜在风险。International Conference on Harmonisation,ICH Harmonised Tripartite Guideline:Pharmaceutical Development Q8(R2)(2009年8月)。QbD首先鉴定关键过程参数(CPP)及其对关键质量属性(CQA)和关键绩效指标(KPI)的影响。鉴于复杂生产过程包含相当大的变异性，执行确定CCP与CQA和KPI之间的关系的实验，以定义有效产生所需产品CQA的一系列条件。不同于先前作为固定过程的，这种增强的方法旨在允许在设计空间内进行调整，包括基于利用过程分析技术的反馈，以获得增强的对最终产品质量的控制。这将减少批准后的过程变化，并增加生物制药公司的监管灵活性，同时确保治疗产品的安全性、同一性、纯度和效力。Calcott,How QbD and the FDAProcess Validation Guidance Affect Product Development and Operations,BioProcess International(2011)。
统计实验设计(DOE)已广泛用作将QbD概念应用于哺乳动物细胞培养过程中的重组蛋白质生产的一部分。参见Horvath et al.,Characterization of a MonoclonalAntibody Cell Culture Production Process Using a Quality by Design Approach,Molecular Biotechnology,vol.45,pp.203-206(2010)；Kim et al.,Applying theQuality by Design to Robust Optimization and Design Space Define forErythropoietin Cell Culture Process,Bulletin of the Korean Chemical Society,vol.40,no.10,pp.1002-1012(2019)；Nagashima et al.,Application of a Quality byDesign Approach to the Cell Culture Process of Monoclonal AntibodyProduction,Resulting in the Establishment ofa Design Space,J.PharmaceuticalSciences,vol.102,no.12,pp.4274-4283(2013)；和Rouiller et al.,Application ofQuality by Design to the Characterization of the Cell Culture Process of anFc-Fusion Protein,European J.Pharmaceutics and Biopharmaceutics,vol.81,no.2,pp.426-437(2012)。这些研究报告pH作为最重要的CPP之一，对细胞生长、生产力和产品质量具有显著影响。例如，对于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，在pH7.2下报告比在pH 6.85下高两倍的生长速率。Yoon et al.,Effect on Culture pH on Erythropoietin Production byChinese Hamster Ovary Cells Grown in Suspension at 32.5and 37.0degrees C,Biotechnology and Bioengineering,vol.89,no.3,pp.345-356(2005)。相似地，人PER.C6细胞生长在pH 7.1-7.6范围内不受影响，而在pH 6.8下存在显著滞后和较低的生长速率。Xie et al.,Serum-Free Suspension Cultivation ofCells andRecombinant Adenovirus Production Under Different pH Conditions,Biotechnologyand Bioengineering,vol.80,no.5,pp.569-579(2002)。pH的这些影响延伸到干细胞培养领域，据报道，当输入培养基pH从7.3下降至7.0时，培养祖细胞产率下降超过两倍。Chaudhry et al.,Culture pH and Osmolality Influence Proliferation andEmbryoid Body Yields of Murine Embryonic Stem Cells,Biochemical EngineeringJ.,vol.,45,no.2,p.126-135(2009)；Teo et al.,Influence of Culture pH onProliferation and Cardiac Differentiation of Murine Embryonic Stem Cells,Biochemical Engineering J.,vol.90,pp.8-15(2014)。因此，这些研究强调，在建立被充分理解的设计空间的实验期间，可能看似微小的pH差异如何对许多细胞类型存在显著的影响。特别是，文献中广泛描述pH对重组蛋白产生、细胞代谢和蛋白质糖基化的实质性影响。参见Borys et al.,Culture pH Affects Expression Rates and Glycosylation ofRecombinant Mouse Placental Lactogen Proteins by Chinese Hamster Ovary(CHO)Cells,Biotechnology,vol.11,pp.720-724(1993)；De Jesus et al.,The Influence ofpH on Cell Growth and Specific Productivity of Two CHO Cell Lines ProducingHuman Anti Rh D IgG,in:Lindner-Olsson E.,Chatzissavidou N.,Lüllau E.(eds)Animal Cell Technology:From Target to Market,ESACT Proceedings,vol.1,Springer,Dordrech(2001)；Kurano et al.,Growth Behavior of Chinese HamsterOvary Cells in a Compact Loop Bioreactor:1.Effects of Physical and ChemicalEnvironments,J.Biotechnology,vol.15,pp.101-11(1990)；Link etal.,BioprocessDevelopment for the Production of a Recombinant MUC1 Fusion Protein Expressedby CHO-K1 Cells in Protein-Free Medium,J.Biotechnology,vol.110,no.1,pp.51-62(2004)；Miller et al.,A Kinetic Analysis of Hybridoma Growth and MetabolisminBatch and Continuous Suspension Culture:Effect of Nutrient Concentration,Dilution Rate,and pH,Biotechnology and Bioengineering,vol.32,no.8,pp.947-965(1988)；Trummer et al.,Process Parameter Shifting:Part I.Effect of DOT,pH,andTemperature on the Performance of Epo-Fc Expressing CHO Cells Cultivated inControlled Batch Bioreactors,Biotechnology and Bioengineering,vol.94,no.6,pp.1033-1044(2006)；Zanghi et al.,Bicarbonate Concentration and Osmolality areKey Determinants in the Inhibition of CHO Cell Polysialylation Under ElevatedpCO2 or pH,Biotechnology and Bioengineering,vol.65,no.2,p.182-191(1999)。
缓冲液的添加用于控制细胞培养期间pH的变化，并且这对于最初在过程开发中常用的高通量多孔培养物尤其重要。为此，常规使用二氧化碳(CO2)/碳酸氢盐(HCO3 -)缓冲体系。对于用碳酸氢钠配制的新鲜培养基，HCO3 -和在液相中的溶解CO2达到平衡，后者也与气相中的CO2水平平衡。在产生乳酸和CO2及其他酸性和碱性种类的代谢后，培养物的pH通过向气相或从气相转移CO2来缓冲。除了在某些情况下，CO2在高细胞浓度下积累到高水平(参见Goudar et al.,Decreased pCO2 Accumulation by Eliminating Bicarbonate Additionto High Cell-Density Cultures,Biotechnology and Bioengineering,vol.96,no.6,pp.1107-1117(2006)；Takuma et al.,Dependence on Glucose Limitations of thepCO2 Influences on CHO Cell Growth,Metabolism and IgG Production,Biotechnology and Bioengineering,vol.97,no.6,pp.1479-1488(2007))，碳酸氢钠的使用不会对细胞或其产物的生理产生负面影响，因此其是用于哺乳动物细胞培养的广泛使用的缓冲液。
然而，碳酸氢钠的使用有其缺陷，因为其缓冲作用取决于气相CO2浓度，使得在离线分析pH时需要小心，因为CO2脱气将提高pH。由于低大气CO2浓度导致的CO2脱气的问题也在细胞培养基制备期间造成挑战，因为这通常在大气条件下的开放环境中发生。当需要为DOE调查制备许多不同的培养基，包括许多滴定以匹配所有培养基的pH时，在培养基制备期间产生的持续渐增的pH是一个复合的问题。此外，这种培养基制备通常在室温下发生，而细胞培养过程接近37℃。由于pH也是温度依赖性的，在室温下达到靶标pH需要的碱/酸的量不会在较高温度下产生当量pH。
细胞培养基的配制和补料是细胞培养过程开发中的关键步骤。高通量技术已经能够加速同时筛选具有多种组分的多种配制剂。Brühlmann et al.,Parallel ExperimentalDesign and Multivariate Analysis Provides Efficient Screening ofCell CultureMedia Supplements to Improve Biosimilar Product Quality,Biotechnology andBioengineering,vol.114,no.7,pp.1448-1458(2017)；Lee et al.,Development of aSerum-Free Medium for the Production of Erythropoietin by Suspension Cultureof Recombinant Chinese Hamster ovary Cells Using a Statistical Design,J.Biotechnology,vol.69,pp.85-93(1999)；Jordan etal.,Cell Culture MediumImprovements by Rigorous Shuffling of Components Using Media Blending,Cytotechnology,vol.65,no.1,pp.31-40(2013)；Rouiller et al.,AHigh-ThroughputMedia Design Approach for High Performance Mammalian Fed-Batch Cultures,MAbs,vol.5,no.3,pp.501-511(2013)；Sandadi et al.,Application of FractionalFactorial Designs to Screen Active Factors for Antibody Production by ChineseHamster Ovary Cells,Biotechnology Progress,vol.22,no.2,p.595-600(2006)。尽管这些实验设计良好，但它们没有提及如何制备不同配制剂以最小化平行培养物的pH的任何变化。除了关于CO2脱气的问题外，一些物质的添加会改变这些配制剂的pH。例如，大多数氨基酸在生理pH下不带电，但它们向阳离子和阴离子的不同等解离仍可能导致溶液中种类的总电荷的轻微变化，由此导致pH的轻微差异。对于在生理pH下的带电氨基酸，诸如谷氨酸或天冬氨酸，这种差异更大。滴定过程通常用于匹配所有培养基的pH，但当同时使用多种溶液时，这花费非常多的时间，并且无法解决如上所述使用碳酸氢盐缓冲的培养基用于表达多肽的挑战。
因此，需要基于半经验模型的培养基配制方法，其不依赖于室温下的pH测量，以方便多种培养基配制剂的组装，并在培养环境条件下提供增加的培养基pH的准确度和控制。
此外，需要模型来规定在没有滴定过程帮助的情况下达到期望的pH所需的碱/酸添加的量，以便为产生多肽的细胞生成具有不同氨基酸组合的不同细胞培养基。
此外，需要提供pH模型和方法，以不仅预测盐缓冲培养基的pH，还规定在没有滴定过程帮助的情况下达到期望的pH所需的碱/酸的准确量。
此外，需要用于产生具有不同氨基酸组合的各种不同的细胞培养基的方法或过程，该方法或过程解决在培养基制备和多肽表达过程期间CO2释放及温度差异的挑战。
发明内容
用于调整溶液，诸如细胞培养基的pH的方法，用于在经pH调整的细胞培养基中培养细胞的方法，及用于制备由在经pH调整的细胞培养基中培养的细胞表达的多肽的方法。
调整细胞培养基的pH的方法，其可以包括：对于细胞培养基，获得细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及细胞培养基中的净培养基酸的浓度；向细胞培养基中添加碳酸盐或碳酸氢盐，以获得细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度；和使用电荷平衡模型，确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度，及期望的pH。
此方法可能进一步包括将确定量的强酸或强碱添加到细胞培养基中，从而制备经pH调整的细胞培养基。
在一些实施方式中，碳酸盐或碳酸氢盐是碳酸钠或碳酸氢钠。
在一些实施方式中，该方法进一步包括用一种或多种离子化合物补充细胞培养基，其中电荷平衡模型进一步基于一种或多种离子化合物的浓度。在一些实施方案中，一种或多种离子化合物包括一种或多种氨基酸或氯化铵。在一些实施方案中，一种或多种氨基酸包括谷氨酰胺、天冬酰胺或谷氨酸。
在所描述的方法的一些实施方式中，强碱是氢氧化钠。在所描述的方法的一些实施方式中，强酸是盐酸。
在所描述的方法的一些实施方式中，电荷平衡模型由以下定义：
其中：
[Mk+]是作为金属氢氧化物、碳酸氢盐或碳酸盐添加到细胞培养基中的金属离子的浓度；
k是该金属离子的电荷；
[H+]是获得期望的pH所需的细胞培养基中的质子的浓度；
[OH-]是细胞培养基中的氢氧根离子的浓度；
[NMA-]是细胞培养基中的净培养基酸离子的浓度；
[A-]是添加到细胞培养基中的带负电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何OH-或包含在[NMA-]中的带负电荷的离子；
[B+]是添加到细胞培养基中的带正电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何H+、包含在[Na+]中的钠离子或包含在[NMA-]中的带正电荷的离子。
在所描述的方法的一些实施方式中，电荷平衡模型由以下定义：
其中：
[Na+]是作为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠添加到细胞培养基中的钠离子的浓度；
[H+]是获得期望的pH所需的细胞培养基中的质子的浓度；
[OH-]是细胞培养基中的氢氧根阴离子的浓度；
[NMA-]是细胞培养基中的净培养基酸离子的浓度；
[A-]是添加到细胞培养基中的带负电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何OH-或包含在[NMA-]中的带负电荷的离子；
[B+]是添加到细胞培养基中的带正电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何H+、包含在[Na+]中的钠离子或包含在[NMA-]中的带正电荷的离子。
在该模型的一些实施方式中，
其中：
K0、K1和K2是碳酸氢根和碳酸根阴离子的解离常数；
P是应用于细胞培养基的气压；
yCO2是应用于细胞培养基的CO2气相的摩尔百分比；且
m和KH各自是以经验确定的细胞培养基的参数。
在所描述的方法的一些实施方式中，细胞培养基中的净培养基酸的浓度在电荷平衡模型中建模为细胞培养基的pH的函数。例如，细胞培养基中的净培养基酸的浓度可能与细胞培养基的pH呈线性关系建模。在一些实施方案中，细胞培养基中的净培养基酸的浓度建模为：
[NMA-]＝[C0p+C1p*(pH-7)]
其中：
[NMA-]是细胞培养基中的净培养基酸离子的浓度；且
C0p和C1p各自是以经验确定的细胞培养基的常数。
在所描述的方法的一些实施方式中，细胞培养基中的净培养基酸的浓度在电荷平衡模型中建模为温度的函数。
在所描述的方法的一些实施方式中，细胞培养基中的净培养基酸的浓度在电荷平衡模型中建模为pH和温度的函数。
在所描述的方法的一些实施方式中，获得用于电荷平衡模型的函数关系和净培养基酸的浓度包括以经验确定函数关系和细胞培养基中的净培养基酸的浓度。经验确定函数和细胞培养基中的净培养基酸的浓度可以包括，例如：测量在不同气态二氧化碳水平下平衡并含有不同量的添加的强酸或强碱的细胞培养基的多种条件的pH数据；和使用测量的pH数据拟合电荷平衡模型。在一些实施方案中，该方法包括在测量pH数据之前，在期望的培养温度下平衡多种溶液。在一些实施方案中，期望的培养温度可以是约35℃至约40℃。
在所描述的方法的一些实施方式中，细胞培养基在室温下制备。
在所描述的方法的一些实施方式中，期望的碳酸钠或碳酸氢钠浓度为约1.5g/L至约2g/L。
本文还描述了培养细胞的方法，其包括根据以上方法调整细胞培养基的pH；并在经pH调整的细胞培养基中培养细胞。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞，例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些实施方案中，在约0.1％至约20％摩尔分数的CO2下于细胞培养基中培养该细胞。在一些实施方案中，该细胞包含编码重组多肽的核酸分子。
本文还描述了产生重组多肽的方法，其包括根据以上方法培养细胞，并在经pH调整的细胞培养基中产生重组多肽。在一些实施方案中，该重组多肽是抗体或其片段。
本文还描述了系统，其包括：一个或多个处理器；和存储器，其与一个或多个处理器通信耦合且配置为存储指令，当由一个或多个处理器执行该指令时，使得该系统：在一个或多个处理器处，对于细胞培养基，接收指示细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数的函数关系的一个或多个参数，以及指示细胞培养基中的净培养基酸的浓度的净培养基酸参数；在一个或多个处理器处，接收指示细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度的碳酸盐或碳酸氢盐参数；在一个或多个处理器处，接收指示细胞培养基的期望的pH的pH参数；和使用电荷平衡模型，确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度，及期望的pH。
本文进一步描述了用于在表达多肽的宿主细胞中产生多肽的方法，其包括通过用碳酸氢钠制备细胞培养基以严格控制培养基的pH而在细胞培养基中培养宿主细胞，包括：确定待添加到细胞培养基中的赋形剂和相对量，以定义配方，使用该配方制备溶液并确定该溶液的pH，以定义第一数据集；将该溶液放置在CO2供气并且搅拌的生物反应器中，并使该溶液平衡以确定所得的pH和pCO2值，以定义第二数据集；将该溶液放置在已定义的温度和CO2摩尔百分比的培养箱中，并确定pH和pCO2测量，以定义第三数据集；使用第一、第二和第三数据集及根据以下的pH模型：
以通过最小化以下者来同时求解m、s和净培养基酸的参数值：
∑(k*[Ck])＝0；
定义细胞培养基的靶标pH，并向细胞培养基中添加由该pH模型确定的适当浓度的碱，以达到pH当量，其中该细胞培养基pH受到严格控制；和产生该多肽。
在一些实施方案中，将盐添加到溶液中以维持同渗重摩(osmolality)。
在一些实施方案中，赋形剂选自由谷氨酰胺、谷氨酸/谷氨酸盐、天冬酰胺、氯化铵、氯化钠和氢氧化钠组成的组。
在一些实施方案中，培养基放置在36.5℃和5％ CO2的培养箱中。
在一些实施方案中，细胞培养基在室温下制备。
在一些实施方案中，细胞培养基的pH在预期的pH值的0.005个标准偏差之内。
在一些实施方案中，细胞培养基的pH为7.272+0.005。
在一些实施方案中，方法是自动化的。
在一些实施方案中，方法在分批补料过程中进行。
在一些实施方案中，方法在制造规模上可适用，且确保规模间的鲁棒性。
在一些实施方案中，方法适用于确保在培养基开发或研究期间具有不同氨基酸添加剂的多种溶液的高质量比较。
在一些实施方案中，方法在小规模体系，诸如摇瓶上可适用。
本文进一步描述了用于在表达多肽的宿主细胞中生产所述多肽的方法，其包括在无谷氨酰胺的生产培养基中在培养物的生产阶段中培养宿主细胞，包括：以范围为7.5mM至15mM的浓度添加天冬酰胺到细胞培养基；以范围为1mM至10mM的浓度添加天冬氨酸到细胞培养基；添加盐到细胞培养基；确定待添加到细胞培养基中的赋形剂和相对量以定义配方；使用配方制备溶液并确定溶液的pH，以定义第一数据集；将溶液放置在CO2供气并且搅拌的生物反应器中，并使溶液平衡以确定所得的pH和pCO2值，以定义第二数据集；将溶液放置在已定义的温度和CO2摩尔百分比的培养箱中，并确定pH和pCO2测量，以定义第三数据集；使用第一、第二和第三数据集及根据以下的pH模型：
以通过最小化以下者来同时求解m、s和净培养基酸的参数值：
∑(k*[Ck])＝0；
定义细胞培养基的靶标pH，并向细胞培养基中添加由pH模型确定的适当浓度的碱，以达到pH当量，其中细胞培养基pH受到严格控制；和产生所述多肽。在一些实施方案中，该方法进一步包括分离所述多肽的步骤。在一些实施方案中，生产阶段是分批或补料分批培养阶段。在一些实施方案中，生产培养基是无血清的。
本实施方案提供了用于在表达多肽的宿主细胞中产生多肽的方法，其包括通过用碳酸氢钠制备细胞培养基以严格控制培养基的pH而在细胞培养基中培养宿主细胞，包括确定待添加到细胞培养基中的赋形剂和相对量以定义配方，使用该配方制备溶液1并确定溶液的pH以定义第一数据集；将溶液放置在CO2供气并且搅拌的生物反应器中，并使溶液平衡以确定所得的pH和pCO2值，以定义第二数据集；将溶液放置在已定义的温度和％CO2的培养箱中，并确定pH和pCO2测量，以定义第三数据集；使用第一、第二和第三数据集以及本文所述的pH模型，以通过最小化电荷平衡方程来同时求解m、s和净培养基酸的参数值，该电荷平衡方程定义细胞培养基的靶标pH，并向细胞培养基添加如由结果所确定的适当浓度的碱，以达到pH当量，其中细胞培养基pH受到严格控制；以及生产多肽。
附图说明
技术人员会明白，以下描述的附图只是用于说明目的。附图无意以任何方式限制本教导或权利要求的范围。
图1显示了根据一些实施方案，用于调整细胞培养基的pH的示例性方法。
图2显示了根据一些实施方案，可以用于执行本文所述的方法的示例性系统。
图3A显示了影响溶液pCO2的溶液制备过程期间损失的CO2作为时间的函数(pCO2与时间)。N＝3，误差棒＝标准偏差。
图3B显示了影响溶液pH的溶液制备过程期间损失的CO2作为时间的函数(pH与时间)。N＝3，误差棒＝标准偏差。
图4显示了pH与温度。N＝6，误差棒＝标准偏差。
图5显示了制备一种溶液所花费的时间的量。N＝5，误差棒＝标准偏差。
图6显示了在36.5℃和5％CO2下达到平衡后每种溶液的pH。N＝5，误差棒＝标准偏差。
图7显示了第一次实验后16种不同溶液的平衡pH和pCO2数据。
图8显示了第二次实验后16种不同溶液的平衡pH和pCO2数据。
图9显示了所有32个数据点的pH和pCO2之间的关系。
图10A显示了根据实施例1收集的经验数据的正态性图。
图10B显示了根据实施例1收集的经验数据的残差图。
图11显示了测量的pH数据和根据示例性实施方案，使用确定的参数从电荷平衡中计算出来的模型拟合的pH数据。
图12显示了测量的pH数据和根据示例性实施方案，在考虑净培养基培养基酸作为pH的函数时，使用确定的参数从电荷平衡中计算出来的模型拟合的pH数据。
图13显示了根据示例性实施方案，基于电荷平衡模型，添加氢氧化钠以获得靶标pH的几个培养基的测量pH和建模pH。
图14显示了根据另一个示例性实施方案，基于电荷平衡模型，添加氢氧化钠以获得靶标pH的几个培养基的测量pH和建模pH。
图15显示了根据一些实施方案，使用第一pH测量装置测量的细胞培养基的冗余条件的测量pH与模型pH。
图16显示了根据一些实施方案，使用第二pH测量装置测量的细胞培养基的冗余条件的测量pH与模型pH。
发明详述
本公开描述了与细胞培养基及制备其的方法有关的实施方案。特别是，描述了用于调整细胞培养基的pH的方法，用于在经pH调整的细胞培养基中培养细胞的方法，以及用于制备由在经pH调整的细胞培养基中培养的细胞表达的多肽的方法。还描述了用于确定应添加多少酸或碱到细胞培养基中以获得期望的pH的系统。
本文所述的方法和系统是就细胞培养基而言描述的。本领域技术人员会认识到，本文所述的方法和系统可以应用于任何含有碳酸盐或碳酸氢盐缓冲液的溶液。
溶液，诸如细胞培养基的pH可以通过确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量来调整。这种确定可以使用电荷平衡模型来进行，该模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐(诸如碳酸钠或碳酸氢钠)浓度以及期望的pH。如本文进一步所述，细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及细胞培养基中的净培养基酸的浓度，可以针对特定的细胞培养基以经验确定。这些参数(即函数关系和净培养基酸的浓度)可以由另一个实体(诸如细胞培养基的制造商)接收，或者可以由终用户以经验确定。该方法可以进一步包括将碳酸盐或碳酸氢盐添加到细胞培养基，以获得细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度。
一旦确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，则可以将确定的强酸或强碱的量添加到细胞培养基中，从而制备经pH调整的细胞培养基。
细胞培养基可以进一步补充有一种或多种离子化合物(例如一种或多种氨基酸和/或一种或多种盐类)。电荷平衡模型可以进一步基于添加到细胞培养基中的一种或多种离子化合物的浓度。
经pH调整的细胞培养基可以用于培养细胞。例如，培养细胞的方法可以包括根据本文所述的方法调整细胞培养基的pH，并在该经pH调整的细胞培养基中培养细胞。该细胞可以包含编码重组多肽的核酸分子。该重组多肽可以由细胞培养基中的细胞表达。例如，产生重组多肽的方法可以包括根据本文所述的方法调整细胞培养基的pH，在经pH调整的细胞培养基中培养包含编码重组多肽的核酸分子的细胞，并在经pH调整的细胞培养基中产生重组多肽。
还描述了系统或电子装置，其包括一个或多个处理器和与一个或多个处理器通信耦合并被配置为存储指令的存储器，当一个或多个处理器执行该指令时，使得该系统或电子装置确定待添加到细胞培养基中以将该细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量。例如，该指令可以使系统或电子装置在一个或多个处理器处接收指示细胞培养基的期望的pH的pH参数；并使用电荷平衡模型，确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度，以及期望的pH。
定义
为了解释本说明书的目的，以下定义将适用。如果下文阐述的任何定义与任何其他文件(包括通过引用而纳入本文的任何文件)中该词的用法相冲突，则为了解释本说明书及其相关权利要求的目的，下文阐述的定义将始终控制，除非明显意指相反含义(例如，在最初使用该术语的文件中)。
在适当的时候，以单数使用的术语也将包括复数，反之亦然。除非另有说明或“一个或多个”的使用明显不合适，否则本文中“一个”的使用是指“一个或多个”。
“或”的使用意指“和/或”，除非另有说明。
“包含”和“包括”的使用是可以互换的并且不是限制性的。此外，术语“诸如”、“例如(for example)”和“例如(e.g.)”并不意指是限制性的。例如，术语“包括”应意指“包括，但不限于"。
如本文所用，术语“约”是指提供的单位值的+/-10％。
如本文所用，术语“基本上”指的是表现出总体的或近似程度的感兴趣的特征或属性的定性条件。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有的话)能达到或避免绝对结果，因为许多影响生物的和化学的组成和材料的测试、生产和储存的变量，并且因为用于测试、生产和储存生物的和化学的组成和材料的仪器和设备中的固有误差。因此，本文使用术语“基本上”来体现许多生物和化学现象中固有的潜在的完整性的缺乏。
术语“抗体”是在最广泛的含义上使用的，特别是，包括个体单克隆抗体(包括激动剂和拮抗剂抗体)和具有多表位特异性的抗体组合物。术语“抗体”特别涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段。
术语“净培养基酸”或“NMA”是指在添加碳酸盐或碳酸氢盐或由本文所述的电荷平衡模型建模的其他培养基补充剂之前，且在调整细胞培养基的pH之前，细胞培养基的净酸性含量。对于酸性种类，NMA定义为正量并且对于碱性种类为负量。因此，NMA的浓度([NMA-])对于整体酸性的培养基是净正的，而对于整体碱性的培养基来说是净负的。
应当理解，本文所述的发明的方面和变化包括“由…组成”和/或“本质上由…组成”方面和变化。
当提供值的范围时，应理解该范围的上限和下限之间的每个中间值，以及该规定范围中的任何其他规定或中间值，都包含在本公开的范围内。在该规定范围包括上限或下限的情况下，排除那些所包括的限中的任一个的范围也包括在本公开中。
本文使用的章节标题仅出于组织目的，不应解释为限制所描述的主题。将该描述呈现以使本领域普通技术人员能够制造和使用该发明，并在专利申请及其要求的上下文中提供。对所描述的实施方案的各种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的，本文的通用的原理可以应用于其他实施方案。因此，本发明并不旨在局限于所示的实施方案，而是被赋予与本文所述的原理和特征相一致的最广泛的范围。
附图阐明了根据各种实施方案的过程。在示例性过程中，任选地组合一些区块、任选地改变一些区块的顺序，并且任选地省略一些区块。在一些实施例中，可以与示例性过程组合执行额外的步骤。相应地，如所示(以及下文更详细描述的)的操作本质上是示例性的，并且因此不应视为限制性的。
本文提及的所有出版物、专利和专利申请的公开各自在此通过引用以其整体并入。
用于确定细胞培养基pH的电荷平衡模型
二氧化碳/碳酸氢盐系统常规用作哺乳动物细胞培养基中的缓冲液。然而，由于二氧化碳的持续脱气及其对温度的依赖性，在环境的温度和不控制溶解二氧化碳的情况下，在制备期间达到靶标pH很难，并且在细胞培养操作条件下更甚。在哺乳动物细胞培养系统的研究和过程开发期间，当准备多种(例如20种)内源性专有培养基的定制化制备时，将放大这些问题。因此，建立数学模型来指定在制备期间待添加的酸或碱的量，以便在过程条件下达到每种培养基的靶标pH，而无需进行滴定。使用修改的亨利定律(Henry’s Law)方程指定气态二氧化碳和含有未知种类的专有培养基中的溶解二氧化碳之间的关系。此外，为了允许不进行滴定的情况下的培养基制备，在模型参数的规定期间，用与专有培养基的“净培养基酸”(或“NMA”)相关的参数拟合该专有培养基的酸/碱特性。除了用于制备培养基，该模型还进一步用于评估定制的培养基配制剂的pH的当量，尽管在温育和取样期间在pCO2中发生变化。
pH模型(在本文中也称为“电荷平衡模型”)允许基于添加到细胞培养基中的酸或碱来预测细胞培养基的pH，或者替代性地，可以基于期望的pH指示应该向该细胞培养基中添加多少酸或碱。如本文进一步解释，对于特定细胞培养基，指示CO2溶解度的系数(例如s或KH)和指示气相CO2和溶解CO2之间的关系的指数项(例如m)对于给定温度是恒定的，无论添加至细胞培养基中的酸或碱的量。该系数和指数可以用来描述细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系。该净培养基酸可以建模为细胞培养基的常数，或可以建模为pH、温度或两者的函数。在一些实施方案中，净培养基酸的浓度在不同的pH或温度范围间保持恒定。在一些实施方案中，净培养基酸的浓度建模为pH的函数。在一些实施方案中，净培养基酸的浓度建模为温度的函数。在一些实施方案中，净培养基酸的浓度被建模为温度和pH的函数。在调整细胞培养基的pH之前，可以例如在期望的操作温度下以经验确定细胞培养基的函数关系。此外，可以使用相同的模型常数在不同的pH下创建若干批次的细胞培养基。
该模型最初假设培养基的电荷平衡由溶液的电中性确定(即净电荷为零)。因此，必须满足以下：
∑(k*[Ck])＝0
其中[C]是每个离子的浓度，且k是每个离子的电荷。该模型进一步假设细胞培养基中的每个种类的质量平衡，这可以通过以下提供：
其中[X]0是化合物X的初始浓度、是所有阳离子种类的浓度之和；是所有阴离子种类的浓度之和；[X]是非解离态的浓度。
由于细胞培养基的净电荷为零，因此可以使用以下示例性电荷平衡模型来针对具有任何添加的碳酸氢盐或碳酸氢盐(例如，碳酸钠或碳酸氢钠)和酸/碱的细胞培养基进行建模：
在示例性电荷平衡模型中，[Na+]是作为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠添加到细胞培养基中的钠离子的浓度；[H+]是获得期望的pH所需的细胞培养基中的质子浓度；[OH-]是细胞培养基中的氢氧根阴离子的浓度；[A-]是添加到细胞培养基中的带负电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何OH-或包含在[NMA-]中的带负电荷的离子；[B+]是添加到细胞培养基中的带正电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何H+、包含在[Na+]中的钠离子或包含在[NMA-]中的带正电荷的离子。在不知道细胞培养基中的具体的组分和数量(或浓度)的情况下，净培养基酸的浓度只能以经验确定。本文所述的模型包括对这些净培养基酸的考虑。这在购买需要由终用户调整pH的专有细胞培养基时特别有用。此外，即使基础培养基的组分是已知的，所描述的模型实质上更容易使用，因为并非培养基中的所有组分均需要建模。细胞培养基中的组分的数量可能相当多(例如，对于细菌和真菌培养物，约10到约30种组分，或者对于哺乳动物细胞培养物，约30到约100种组分)。
尽管碳酸氢钠或碳酸钠系统最常用于细胞培养基中，但该模型适用于任何含有碳酸盐或碳酸氢盐的溶液。因此，对于任何碳酸盐，该模型可以视为：
其中[Mk+]是作为金属氢氧化物、碳酸氢盐或碳酸盐添加到细胞培养基中的金属离子的浓度；k是该金属离子的电荷；[H+]是获得期望的pH所需的细胞培养基中的质子浓度；[OH-]是细胞培养基中的氢氧根阴离子的浓度；[NMA-]是细胞培养基中的净培养基酸离子的浓度；[A-]是添加到细胞培养基中的带负电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何OH-或包含在[NMA-]中的带负电荷的离子；[B+]是添加到细胞培养基中的带正电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何H+、包含在[Na+]中的钠离子，或包含在[NMA-]中的带正电荷的离子。
二氧化碳/碳酸氢盐缓冲系统包括以下平衡反应(参见Millero,Thermodynamicsof the Carbon Dioxide Systemin the Oceans,Geochmica et Cosmochimica Acta,vol.59,no.4,pp.661-677(1995))：
平衡时阴离子和阳离子的浓度可以使用解离常数提供的关系来确定。碳酸的第一和第二解离常数由以下给出：
用另一种方式来框定：
碳酸氢盐解离的解离常数(例如Ka、K0、K1、K2等)在文献中是已知的，或者可以以经验确定。例如，在36.5℃的第一和第二解离常数的pKa值分别为报告为6.303和10.238。Harned et al.,The Ionization Constant of Carbonic Acid in Water and theSolubility of Carbon Dioxide in Water and Aqueous Salt solutions from 0to50°,J.American Chemical Society,vol.65,no.10,pp.2030-2037(1943)。因此，Ka1和Ka2的值分别确定为4.98×10-7mol/L和5.77×10-11mol/L。
在平衡时并且对于稀释系统，溶解CO2的浓度与气相中的CO2的摩尔分数成正比，如由这个版本的亨利定律所表示：
其中s(mM/％)是将(百分比分压)转换到液相中的CO2的mM的溶解度因子。然而，已经显示，对于细胞培养基，这种关系是非线性的，因此细胞培养基表现得与水和碳酸氢盐的溶液不同。因此，发展了亨利定律的修改形式：
参见Gramer et al.,A Semi-Empirical Mathematical Model Useful forDescribing the Relationship Between Carbon Dioxide,pH,Lactate and Base in aBicarbonate-Buffered Cell Culture Process,Biotechnology and AppliedBiochemistry,vol.47,no.4,pp.197-204(2007)。因此，值“s”是指示CO2溶解度的示例性系数，并且值“m”是指示CO2溶解度的示例性指数。实际上，指示CO2的系数和指数可以以替代表达表示，以适应具体的模型。例如，当就总压力(P)和亨利定律常数(kH)而言表示时：
因此，[HCO3 -]和[CO3 2-]可以表示如下：
该模型可以进一步解释水的解离：
其中Kw是水的解离常数。
相应地，细胞培养基的总电荷平衡模型可以写为：：
[Na+]是作为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠添加到细胞培养基中的钠离子的浓度；[H+]是获得期望的pH所需的细胞培养基中的质子浓度；[OH-]是细胞培养基中的氢氧根离子的浓度；[A-]是添加到细胞培养基中的带负电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何OH-或包含在[NMA-]中的带负电荷的离子；[B+]是添加到细胞培养基中的带正电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何H+、包含在[Na+]中的钠离子或包含在[NMA-]中的带正电荷的离子；K0、K1和K2是碳酸氢根和碳酸根阴离子的解离常数；P是应用于细胞培养基的气体压力；yCO2是应用于细胞培养基的CO2气相的摩尔百分比；并且m和KH各自是以经验确定的细胞培养基的参数。
如上所讨论，无论添加到细胞培养基的碳酸氢钠(或碳酸钠)或酸或碱的量，对于细胞培养基，KH、m和[NMA-]的值在特定温度下是恒定的(尽管[NMA-]可以任选地以更细化的模型建模为pH的函数)，并且可以以经验确定。此外，水和碳酸盐/碳酸氢盐的解离常数是已知的。因此，这种模型函数用于基于添加到细胞培养基的碳酸氢盐或碳酸盐以及强酸或强碱的量来预测该细胞培养基的pH。替代性地，且更常见的用法是，在给定的待添加的预定碳酸氢钠或碳酸钠的量和期望的pH的情况下，应添加到细胞培养基中的强酸或强碱的量可以使用该模型确定。
细胞培养基中的净培养基酸可以包括弱酸和/或弱碱，并且这些组分的平衡本身可以受细胞培养基的pH和/或温度影响。相应地，在一些实施方案中，，净培养基酸的浓度在电荷平衡模型中建模为细胞培养基的pH的函数。净培养基酸的浓度与pH之间的关系可以是多项式关系，例如线性关系。在一些实施方案中，细胞培养基中的净培养基酸的浓度建模为：
[NMA-]＝[C0p+C1p*(pH-7)]
其中[NMA-]是细胞培养基中的净培养基酸离子的浓度；并且C0p和C1p分别是以经验确定的细胞培养基的常数。因此，完全扩展后，在一些实施方案中，电荷平衡模型可以写为：
或，在一些实施方案中：
在一些情况下，培养基参数(即KH、m和[NMA-])受用于测量细胞培养基的pH的具体的方法影响，例如由于pH探头之间的差异。因此，对于基础培养基与用于测量制备期间pH的特定方法的每个组合，可以完成参数确定。
模型参数的经验确定
模型参数(即KH、m和[NMA-])可以在用户指定的过程温度下进行的实验中确定。为了以经验确定这些参数，可以在不同的气态二氧化碳水平和不同的添加强酸或强碱的量下确定基础培养基。在这些条件中的每一个下，测量pH的系统维持在气相CO2与液体培养基中的溶解CO2的平衡。例如，在36.5℃的温度下，使用生物反应器系统的质量流量控制器，对于用[HCl]＝0和[HCl]＝5mM创建的培养基制剂，培养基用设置在4％、6％、8％、10％、15％和20％的yCO2％平衡。参数m、KH和[NMA-]用最小二乘极小化法求解。
在一些实施方式中，仅一种酸/碱水平连同两种或更多种的yCO2％水平一起使用，使得仅m可以首先确定。然后，分别地，在测试不同水平的酸/碱的情况下，并从第一次估计中给出m，然后确定KH和[NMA-]。
在考虑碳酸氢盐缓冲的细胞培养基的pH和pCO2之间的半经验关系的另一种方式，可以使用Henderson-Hasselbach方程：
其中pKa在36.5℃下为6.303。Sandadi et al.,Application of FractionalFactorial Designs to Screen Active Factors for Antibody Production by ChineseHamster Ovary Cells,Biotechnology Progress,vol.22,no.2,p.595-600(2006)。对于标准的碳酸盐pH方程，[B]是浓度(例如，可以以mM表示)。对于具有许多未知种类的专有培养基，[B]可以定义为在培养基制备期间添加的除碳酸氢盐和碳酸盐之外的所有酸性或碱性种类以及净培养基酸的浓度之和。例如。这些可以包括作为正值的[Na+]、[Gln+]、[Asn+]、[Glu+]，和作为负值的[净培养基酸]以及[Gln-]、[Asn-]、[Glu-]和[Glu(2-)]。由于该术语对细胞培养基中使用的pH的范围内的pH变化不敏感，其在与气相CO2平衡之前和之后是相同的。
为了完成专有培养基的描述，净培养基酸的浓度可以认为是对其制备中使用的氢氧化钠的平衡。净培养基酸可以在具有不同初始组成的不同基础培养基之间变化。然而，在使用相同基础培养基的细胞培养基间，净培养基酸是恒定的。
描述细胞培养基的三个经验参数(例如m、s(或KH)和净培养基酸)可以使用在以下三个条件下测量的培养基的未补充的制剂的电荷平衡模型方程找到：(1)在室温下的制备期间，(2)在靶标温度下的各种气相CO2分压下的平衡期间，以及(3)在靶标气相CO2浓度和温度下的平衡期间。例如，Henderson-Hasselbach方程可以重新表述为：
该表达使用常数“m”和“s”作为半经验参数，提供和细胞培养基的pH之间的示例性关系。/>与(pH-pKa-log[B])的图表提供与斜率(-m)和log(1/s)的截距的线性关系。
在提供所有种类的浓度和三个参数的值后，可以使用软件(诸如MicrosoftTMExcel求解器)来找到该电荷平衡方程中使其最小化为零的pH值。
在另一个实例中，对于电荷平衡模型，细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数(例如，KH(或s)和m的参数)之间的函数关系，以及净培养基酸的浓度包括使用从在不同气态二氧化碳水平和不同的添加强酸或强碱的量下平衡的细胞培养基的多种条件中测量的pH数据。在一些实施方案中，该函数关系和净培养基酸的浓度同时确定。在一些实施方案中，该函数关系和净培养基酸的浓度序贯确定。平衡条件的pH可以测量并用于使电荷平衡模型参数化。可以最小化多种条件的电荷平衡，从而为该函数关系和[NMA-]提供参数。
对细胞培养基的额外补充剂
细胞培养基可以进一步补充有一种或多种额外的添加剂，诸如一种或多种盐、酸或碱。例如，细胞培养基可以补充有一种或多种氨基酸和/或氯化铵。在一些实施方案中，细胞培养基补充有一种或多种氨基酸。在一些实施方案中，细胞培养基补充有谷氨酰胺、天冬酰胺和/或谷氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基补充有氯化铵。有利地，净培养基酸的浓度以及细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系(例如，模型的参数m、KH和[NMA-])可以基于添加额外的带电种类之前的细胞培养基，并且因此在调整添加剂的浓度时通常不需要调整(除非该添加剂改变溶解CO2和气态CO2之间的函数关系)。
添加到细胞培养基中的带电种类(例如，弱酸或弱碱)可以使用电荷平衡模型通过将带电种类[A-]和[B+]的浓度掺入电荷平衡模型中来解释。例如，如果细胞培养基补充有谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸和氯化铵，电荷平衡模型可以写为：
当溶液的pH低于其各自的pKa值时，水性培养基中的氨基酸的胺(-NH2)、羧基(-COOH)和官能团大部分被质子化。平衡时所有阴离子和阳离子的浓度可以使用pKa值来确定。例如，在具有3个pKa值的谷氨酸的情况中，可以使用以下的解离/缔合(association)平衡：
两性离子与阳离子之间(Ka1)、两性离子与阴离子(Ka2)以及阴离子和双电荷的阴离子(Ka3)的解离/缔合平衡可以描述为：
对于一元酸的氨基酸，诸如谷氨酰胺和天冬酰胺，不需要考虑第三Ka值。
氯化铵是将铵离子释放到溶液中的可溶性盐，其当转化为氨时释放另一个氢离子。
氨的解离平衡描述为：
在表1中列出谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸和氨在36.5℃下的解离常数的值。
表1 36.5℃下的解离常数
参见Kochergina et al.,Influence of Temperature on the Heats of Acid-Base Reactions in L-Glutamine Aqueous Solution,Russian J.of InorganicChemistry,vol.58,pp.744-748(2013)；Kochergina et al.,Thermochemical Study ofAcid-Base Interactions in L-Asparagine Aqueous Solutions,Russian J.InorganicChemistry,vol.56,no.1481(2011)；Nagai et al.,Temperature Dependence of theDissociation Constant of Several Amino Acids,J.Chemical&Engineering Data,vol.53,no.3,pp.619-627(2008)；Bates et al.,Dissociation Constant of AqueousAmmonia at 0to 50°from E.m.f.Studies of the Ammonium Salt of a Weak Acid,J.American Chemical Society,vol.70,no.3pp.1393-1395(1950)。
相应地，补充有一种或多种离子化合物的细胞培养基可以使用电荷平衡模型进行建模。在一些实施方案中，一种或多种离子化合物包括氯化铵。在一些实施方案中，一种或多种离子化合物包括氨基酸，诸如L-氨基酸。在一些实施方案中，一种或多种离子化合物包括谷氨酰胺、天冬酰胺和谷氨酸中的一种或多种。可以添加到细胞培养基中的其他补充组分在本领域中是已知的，并且可以根据本文所述的方法建模。其他补充组分可以包括，消泡剂、泊洛沙姆(poloxamer)、盐、生长因子、血清等。
用于调整细胞培养基的pH的方法
细胞培养基的pH可以通过确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量来调整。如本文所讨论的，这种确定可以使用电荷平衡模型进行，该电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐(诸如碳酸钠或碳酸氢钠)浓度以及期望的pH。该方法可以进一步包括将确定量的碳酸盐或碳酸氢盐添加到细胞培养基中，以获得细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度。该方法可以进一步包括向细胞培养基中添加确定量的强酸或强碱，从而制备经pH调整的细胞培养基。
经验模型参数(例如，细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及细胞培养基中的净培养基酸的浓度)可以通过经验测定获得。替代性地，经验模型参数可以由另一个实体接收。
因此，在该方法的一些实施方式中，调整细胞培养基的pH的方法包括，对于细胞培养基，获得细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及细胞培养基中的净培养基酸的浓度；向细胞培养基中添加碳酸盐或碳酸氢盐，以获得细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度；以及使用电荷平衡模型，确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度以及期望的pH。该方法可以进一步包括将确定量的强酸或强碱添加到细胞培养基中，从而制备经pH调整的细胞培养基。
在一些实施方式中，调整细胞培养基的pH的方法包括，对于细胞培养基，接收指示细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系的一个或多个参数，以及指示细胞培养基中的净培养基酸的浓度的参数；向细胞培养基中添加碳酸盐或碳酸氢盐，以获得细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度；以及使用电荷平衡模型，确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度以及期望的pH。该方法可以进一步包括将确定量的强酸或强碱添加到细胞培养基中，从而制备经pH调整的细胞培养基。
在一些实施方案中，调整细胞培养基的pH的方法包括，对于细胞培养基，以经验确定细胞培养基中溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及细胞培养基中的净培养基酸的浓度；向细胞培养基中添加碳酸盐或碳酸氢盐，以获得细胞培养基中的期望的的碳酸盐或碳酸氢盐浓度；以及使用电荷平衡模型，确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度以及期望的pH。该方法可以进一步包括将确定量的强酸或强碱添加到细胞培养基中，从而制备经pH调整的细胞培养基。
碳酸盐或碳酸氢盐通常是碳酸氢钠或碳酸钠，尽管在一些实施方案中可以使用不同的碳酸盐或碳酸氢盐。例如，在一些实施方案中，碳酸盐或碳酸氢盐是碳酸镁、碳酸钙、碳酸钙镁、碳酸钾、碳酸锌、碳酸铁，或其他合适的碳酸盐或碳酸氢盐。细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度可取决于细胞培养基的规格和/或制造商推荐。在一些实施方案中，期望的碳酸钠或碳酸氢钠浓度为约1.5g/L至约2g/L，诸如约1.8g/L。
该方法可以进一步包括用一种或多种离子化合物补充细胞培养基。如本文进一步所述，电荷平衡模型可以进一步基于用于补充细胞培养基的一种或多种离子化合物的浓度。例如，细胞培养基可以补充有一种或多种氨基酸和/或氯化铵。在一些实施方案中，细胞培养基补充有一种或多种氨基酸。在一些实施方案中，细胞培养基补充有谷氨酰胺、天冬酰胺和/或谷氨酸。在一些实施方案中，细胞培养基补充有氯化铵。
用于调整细胞培养基的pH的强酸或强碱可以是任何合适的强酸或强碱。示例性强酸包括氯酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、硝酸、高氯酸、磷酸和硫酸。在一些实施方案中，该强酸是盐酸。示例性强碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铷、氢氧化铯、氢氧化钙、氢氧化钡和氢氧化锶。在一些实施方案中，该强碱是氢氧化钠。
对于电荷平衡模型的函数关系和净培养基酸的浓度可以包括以经验确定细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及细胞培养基中的净培养基酸的浓度。例如，细胞培养基的多个样品可以在不同的气态二氧化碳水平下平衡，并且含有不同的强酸或强碱的量。一旦平衡，可以测量样品的pH，然后pH数据拟合至电荷平衡模型，以确定函数关系和净培养基酸的浓度。多个样品可以包括，例如，含有第一量的添加的酸或碱且在不同气态二氧化碳水平下平衡的第一组样品，以及含有第二量(不同于第一量)的添加的酸或碱且在不同气态二氧化碳水平下平衡的第二组样品。在测量多个样品的pH之前，可以将多个样品在期望的操作温度(即培养温度)下平衡。因为函数关系和净培养基酸可能是温度依赖性参数，所以优选在操作温度下确定它们。然而，培养基可以在不同的温度下制备(例如，室温，或约25℃)。
在一些实施方案中，期望的培养温度为约35℃至约40℃，诸如约36℃至约37℃，或约36.5℃。在一些实施方案中，优化培养温度以增强哺乳动物细胞生长。在一些实施方案中，期望的培养温度是约25℃至约35℃，诸如约27℃至约32℃，或约27℃至约30℃。在一些实施方案中，优化培养温度以增强昆虫细胞生长。在一些实施方案中，优化培养温度以增强细菌细胞生长。在一些实施方案中，优化培养温度以增强病毒复制。
在一些实施方方案中，细胞培养基是无血清培养基。
图1显示了调整细胞培养基的pH的示例性方法。在102，获得了细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及细胞培养基中的净培养基酸的浓度。这些参数可以通过例如以经验确定参数或从另一个实体接收参数来获得。在104，向细胞培养基中添加碳酸盐或碳酸氢盐(例如碳酸钠或碳酸氢钠)，以获得细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度。在106，使用电荷平衡模型来确定待添加到细胞培养基中以获得细胞培养基的理想pH的强酸或强碱的量。该电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度以及期望的pH。在108，通过向细胞培养基中添加确定量的强酸或强碱以调整细胞培养基的pH。用于培养细胞和产生多肽的方法
培养细胞的方法可以包括根据本文所述的方法调整细胞培养基的pH，并在经pH调整的细胞培养基中培养细胞。例如，培养细胞的方法可以包括：对于细胞培养基，获得细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及细胞培养基中净培养基酸的浓度；向细胞培养基中添加碳酸盐或碳酸氢盐，以获得细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度；使用电荷平衡模型，确定添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度以及期望的pH；向细胞培养基中添加确定量的强酸或强碱，从而制备经pH调整的细胞培养基；并在该经pH调整的细胞培养基中培养细胞。
在细胞培养基中培养的细胞可以是任何合适的细胞类型。在一些实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞，诸如人类细胞。示例性哺乳动物细胞可以包括HEK 293、3T6、A49、A9、AtT-20、BALB/3T3、BHK-21、BHL-100、BT、Caco-2、Chang、CHO(例如、CHO-K1)、COS-1、COS-3、COS-7、CRFK、CV-1、D-17、Dauidi、GH1、GH3、H9、HaK、HCT-15、HeLa、HEp-2、HL-60、HT-1080、HT-29、HUVEC、I-10、IM-9、JEG-2、Jensen、Jurkat、K-562、KG-1、L2、LLC-WRC 256、McCoy、MCF7、WI-38、WISH、XC、和Y-1细胞。在一些实施方案中，该细胞是CHO细胞。在一些实施方案中，该细胞是昆虫细胞，诸如Sf9、Sf21或Schneider 2(S2)细胞。在一些实施方案中，该细胞是细菌细胞，例如大肠杆菌细胞。在一些实施方案中，该细胞是植物细胞。在一些实施方案中，细胞是酵母细胞，诸如酿酒酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是干细胞，诸如人干细胞，或分化的细胞类型。
细胞可以在任何合适的温度下培养，并且可以例如，基于所培养的细胞的类型来选择。在一些实施方案中，培养温度为约35℃至约40℃，诸如约36℃至约37℃，或约36.5℃。在一些实施方案中，优化培养温度以增强哺乳动物细胞生长。在一些实施方案中，培养温度为约25℃至约35℃，如约27℃至约32℃，或约27℃至约30℃。在一些实施方案中，优化培养温度以增强昆虫细胞生长。在一些实施方案中，优化培养温度以增强细菌细胞生长。在一些实施方案中，优化培养温度以增强病毒复制。
本文所述的方法的一个特别的优点是，电荷平衡模型的经验参数是，细胞培养基的参数可以用于应用于细胞培养的CO2的不同摩尔分数。因此，可以根据期望改变CO2的选定摩尔分数而不需要再确定模型参数。因此，例如，如果不同的细胞系在相同的细胞培养基组分中但在不同的CO2的摩尔分数下培养，该模型可以应用于每种培养物。在该方法的一些实施方式中，细胞在约0.1％至约20％摩尔分数的CO2，例如约0.1％至约0.5％摩尔分数的CO2、约0.5％至约1％摩尔分数的CO2、约1％至约2％摩尔分数的CO2、约2％至约5％摩尔分数的CO2、约5％至约10％摩尔分数的CO2、约10％至约15％摩尔分数的CO2或约15％至约20％摩尔分数的CO2下于细胞培养基中培养。
在经pH调整的细胞培养基中培养的细胞可以包含编码多肽的核酸分子。例如，该细胞可以是包含编码多肽的表达载体的宿主细胞。
本文所述的经pH调整的细胞培养基可以用于培养细胞以产生多肽，诸如抗体或抗体片段的方法。由在经pH调整的细胞培养基中培养的细胞产生的多肽可以是与宿主细胞同源的，或者优选是外源性的，意指与被利用的宿主细胞是异源的，即外来的，诸如由中国仓鼠卵巢细胞产生的人类蛋白质，或由哺乳动物细胞产生的酵母多肽。在一个变化中，该多肽是由宿主细胞直接分泌到培养基中的哺乳动物多肽。在另一个变化中，该多肽通过包含编码多肽的核酸的细胞的裂解释放到培养基中。
可在宿主细胞中表达的任何多肽可以根据本公开产生，并且可以存在于提供的组分中。该多肽可以由与宿主细胞内源的基因表达，或由通过基因工程引入宿主细胞的基因表达。该多肽可以是自然界中存在的多肽，或替代性地，可以具有经工程化或选择的序列。工程化多肽可以由自然界中单独存在的其他多肽区段组装，或可以包括非天然存在的一个或多个区段。
可以根据本发明期望地表达的多肽，可以根据感兴趣的生物或化学活性来选择。例如，本发明可以用于来表达任何药学上或商业上相关的酶、受体、抗体、激素、调节因子、抗原、结合剂等。
用于在细胞培养物中产生多肽(诸如抗体)的方法在本领域是众所周知的。本文提供了用于在细胞培养物中产生抗体(例如全长抗体、抗体片段和多特异性抗体)的非限制性示例性方法。本领域技术人员可以调整本文的方法用于产生其他蛋白质，诸如基于蛋白质的抑制剂。
通常，在促进细胞生长、维持和/或多肽生产中的任一者的一种或多种条件下，细胞与任何细胞培养基组合(接触)。培养细胞和产生多肽的方法采用培养容器(生物反应器)来容纳细胞和细胞培养基。该培养容器可以由任何适合培养细胞的材料构成，包括玻璃、塑料或金属。典型地，该培养容器将是至少1升，且可以是10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10000升或更多。然而，可以使用其他大小的容器，例如试管、微芯片、多孔板或其他尺寸，诸如250mL、100mL、50mL、25mL、15mL、10mL或更小的烧瓶。培养条件，诸如温度、pH等等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并将对普通的技术人员来说是显而易见的。在培养过程期间可以调整的培养条件包括但不限于pH和温度。
细胞培养物通常在有助于细胞培养物的生存、生长和存活力(维持)的条件下维持在初始生长阶段。准确的条件将依赖于细胞类型、细胞所衍生自生物体以及表达的多肽的性质和特征而变化。
在初始生长阶段中的细胞培养物的温度将主要基于在细胞培养物保持活力的温度的范围来选择。例如，在初始生长阶段期间，CHO细胞在37℃下生长良好。一般来说，大多数哺乳动物细胞在约25℃至42℃的范围内生长良好。优选地，哺乳动物细胞在约35℃至40℃的范围内生长良好。本领域普通技术人员将能够选择适当的温度或多个温度以在其中培养细胞，取决于细胞的需要和生产要求。
在初始培养阶段期间，可以搅动或摇动细胞培养物，以增加氧合和营养物向细胞的分散。根据本发明，本领域普通技术人员将理解，在初始生长阶段期间控制或调节生物反应器的特定的内部条件(包括但不限于温度、氧合作用等)是有益的。
最初的培养步骤是生长阶段，其中修改分批细胞培养条件以增强重组细胞的生长，以产生种子培养物(train)。该生长阶段通常指的是指数生长期，其中细胞通常快速地分裂，例如生长。在这个阶段期间，将细胞培养一段时间，通常但不限于1至4天，例如1、2、3或4天，并在细胞生长最佳的此类条件下。宿主细胞的生长周期的确定可以通过本领域技术人员已知的方法针对特定的宿主细胞确定。
在生长阶段中，可以将本文提供的基础培养基和细胞分批供应至培养容器。在一个方面，该培养基含有少于约5％或少于1％或少于0.1％的血清和其他动物衍生的蛋白质。然而，如果期望，可以使用血清和动物衍生的蛋白质。在其生长中的特定点，细胞可以形成接种物以在生产阶段中培养的开始时接种培养基。任选地，生产阶段可以与生长阶段连续。细胞生长阶段之后通常是多肽生产阶段。
在多肽生产阶段，可以将细胞培养物维持在第二组培养条件(与生长阶段相比)下，该条件有利于细胞培养物的生存和存活力并适合于期望的多肽的表达。例如，在随后的生产阶段期间，CHO细胞在25℃至38℃的范围内良好地表达重组多肽和蛋白质。可以采用多个不连续的温度转变来增加细胞密度或活力，或增加重组多肽或蛋白质的表达。在一个方面，与当在不同的培养基中产生多肽时获得的污染物相比，当用于增加多肽产量的方法中时，本文提供的培养基减少了代谢副产物的存在。在一个变化中，污染物是活性氧种类。在一个方面，与当在不同培养基中产生多肽产物时获得的颜色强度相比，当用于增加多肽产量的方法中时，本文提供的培养基减少了多肽产物的颜色强度。在一个变化中，增加多肽产量的方法包括在多肽生产阶段期间的温度转变步骤。在进一步变化中，温度转变步骤包括温度从31℃到38℃、从32℃到38℃、从33℃到38℃、从34℃到38℃、从35℃到38℃、从36℃到38℃、从31℃到32℃、从31℃到33℃、从31℃到34℃、从31℃到35℃或从31℃到36℃的转变。
细胞可以在随后的生产阶段中维持，直到达到期望的细胞密度或生产效价。在一个实施方案中，细胞在后续生产阶段中维持，直到对重组多肽的滴度达到最大值。在其他实施方案中，培养物可以在这点之前收获。例如，细胞可以维持足以达到最大活细胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99的活细胞密度的时间段。在一些情况下，让活细胞密度达到最大，并然后让活细胞密度在收获培养物之前下降到某个水平，可能是可取的。
感兴趣的多肽优选可以作为分泌的多肽从培养基中回收，或者可以在没有分泌信号的情况下直接表达时从宿主细胞裂解物中回收。在一个方面，产生的多肽是抗体，诸如单克隆抗体。
培养基或裂解物可以离心以除去颗粒状细胞碎片。此后，多肽可以从污染物可溶性蛋白质和多肽中纯化，其中以下规程是具有合适的纯化规程的示例：在免疫亲和柱或离子交换柱上分馏；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或阳离子交换树脂诸如DEAE上进行层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75凝胶过滤；和蛋白ASepharose柱以除去诸如IgG的污染物。蛋白酶抑制剂诸如苯基甲基磺酰氟(PMSF)也可能对抑制纯化期间中的蛋白水解降解有用。本领域技术人员会理解，适用于感兴趣的多肽的纯化方法可能需要修改，以解释多肽的特性中的在重组细胞培养物中的表达上的变化。多肽一般能使用层析技术进行纯化(例如，蛋白质A、具有低pH洗脱步骤的亲和层析和离子交换层析以除去过程杂质)。对于抗体来说，蛋白A作为亲和配体的适用性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。
用于表达和分离多肽(包括重组多肽)的其他方法，在本领域中是已知的。
计算机系统和电子装置
本文所述的方法可以包括为使用电子装置或系统用于执行该方法。例如，为确定应添加到细胞培养基中的酸或碱的量，电子装置或系统可以用于确定或拟合电荷平衡模型的一个或多个模型参数。
举例来说，系统或电子装置可以包括一个或多个处理器；以及与该一个或多个处理器通信耦合并被配置为存储指令的存储器，当由该一个或多个处理器执行该指令时，使得该系统：在一个或多个处理器处，对于细胞培养基，接收指示细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系的一个或多个参数，以及指示细胞培养基中的净培养基酸的浓度的净培养基酸参数；在一个或多个处理器处，接收指示细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度的碳酸盐或碳酸氢盐参数；在一个或多个处理器处接收指示细胞培养基的期望的pH的pH参数；并使用电荷平衡模型，确定待添加到细胞培养基中以将细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中电荷平衡模型至少基于细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度和应用于细胞培养基中的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、细胞培养基中的净培养基酸的浓度、细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度以及期望的pH。
用户可以使用诸如系统或电子装置，例如，以确定应向细胞培养基中添加多少酸或碱，以获得在期望的操作温度下的期望的pH。
图2阐明了根据一个实施方案的计算装置或系统的实例。装置200可以是连接到网络的主计算机。装置200可以是客户端计算机或服务器。如图2所示，装置200可以是任何合适的基于微处理器的装置的类型，诸如个人计算机、工作站、服务器或手持式计算装置(便携式电子装置)，诸如电话或平板电脑。该装置可以包括，例如，一个或多个处理器210，输入装置220，输出装置230，存储器或存储装置240，和通信装置260。驻留在存储器或存储装置240中的软件250可以包括，例如，用于执行本文所述方法的操作系统以及软件。输入装置220和输出装置230通常可以对应于本文所述的那些，并且可以与计算机或是可连接或是集成。
输入装置220可以是提供输入的任何合适的装置，诸如触摸屏、键盘或小键盘、鼠标或语音识别装置。输出装置230可以是提供输出的任何合适的装置，诸如触摸屏、触觉装置或扬声器。输入装置220和输出装置230可以是相同的装置或不同的装置。
存储240可以是提供存储的任何合适的装置(例如，电、磁或光学存储器，包括RAM(易失性的和非易失性的)、缓存、硬盘或可移动存储盘)。通信装置260可以包括任何能够在网络上发送和接收信号的合适的装置，诸如网络接口芯片或装置。计算机的组件能以任何合适的方式连接，诸如通过有线的介质(例如，物理系统总线280，以太网连接，或任何其他有线传输技术)或无线地(例如，或任何其他无线技术)。
软件模块250，其可以作为可执行指令存储在存储240中并且由处理器210执行，可以包括例如操作系统和/或体现本公开的方法的功能的程序(例如，如本文所述的装置中体现的)。
软件模块250还可以存储和/或传送在任何非暂时性计算机可读的存储介质内，用于由指令执行系统、仪器或装置或与之结合使用，诸如本文所述的那些，其可以从指令执行系统、仪器或装置中获取与该软件相关联的指令并执行该指令。在本公开的上下文中，计算机可读存储介质可以是任何介质，诸如存储240，其可以含有或存储用于由指令执行系统、仪器或装置或与之结合使用的过程。计算机可读存储介质的实例可以包括如硬盘、闪存驱动器的存储器单元和作为单一功能单元运行的分发模块。另外，本文所述的各种过程可以体现为配置为按照上述实施方案和技术进行操作的模块。此外，虽然过程可以单独地显示和/或描述，但本领域技术人员将理解，上述过程可以是其他过程内的惯例或模块。
软件模块250还可以在任何传输介质内传播，用于由指令执行系统、仪器或装置或与之结合使用，诸如上文所述的那些，其可以从指令执行系统、仪器或装置中获取与该软件相关联的指令并执行该指令。在本公开的上下文中，传输介质可以的任何介质，其可以通信、传播或传输用于由指令执行系统、仪器或装置使用或与之结合使用的编程。传输可读介质可以包括但不限于电子的、磁的、光学的、电磁的或红外有线的或无线的传播介质。
装置200可以连接到网络，该网络可以是任何合适的类型的互连通信系统。该网络可以执行任何合适的通信协议，并且可以由任何合适的安全协议来保障。网络可以包括可以实施网络信号的发送和接收的任何合适的布置的网络，诸如无线网络连接、T1或T3线路、有线网络、DSL或电话线路。
装置200可以使用任何操作系统，例如，适合于网络上操作的操作系统来实施。软件模块250可以用任何合适的编程语言，诸如C、C++、Java或Python来编写。在各种实施方案中，体现本公开的功能的应用软件可以部署在不同的配置中，诸如在客户端/服务器布置中，或例如通过Web浏览器作为基于Web的应用或网络服务。在一些实施方案中，操作系统由一个或多个处理器，例如处理器210执行。
实施例
实施例1
本研究中使用的基础培养基是来自Cytiva(美国马萨诸塞州)的化学定义的专有培养基。它是ActiCHOP培养基的定制订单，其中除去谷氨酰胺、谷氨酸和天冬酰胺。将这三种氨基酸连同氯化铵单独或组合添加到定制的培养基中。按照制造商的配方，这种定制的ActiCHOP培养基还具有1.8g/L的碳酸氢钠。为了获得在36.5℃及在330mOsm/kg的同渗重摩下在7.27的pH的的所有16种溶液，添加不同量的5N氢氧化钠和5M氯化钠，如由以下呈现的pH模型所确定的。然后将所有16种溶液放置在36.5℃，5％ CO2及125rpm下的加湿培养箱内的摇瓶中。在达到平衡后(1-2天)，取样并测量其pH和pCO2水平。
除非另有说明，pH和pCO2测量使用Siemens RapidLab 248血气分析仪执行。pCO2是气相CO2的平衡分压，并用mm Hg表示来报告。使用100％/760mm Hg的因子将CO2转换为
pCO2随着时间的推移而减少，指示在培养基制备过程期间中发生的CO2的脱气。为了证明在培养基制备过程期间的CO2脱气，在制备以上培养基溶液之一期间进行了实验。该溶液在100ml烧瓶中制备，并且在Cimarec Basic搅拌板(Thermo Scientific，Massachusetts，USA)上以5档速度混合。烧瓶未加盖，并在50分钟内取样，这是为制备单一溶液的典型时间的量。记录每个样品的pH和pCO2。图3A显示了pCO2随时间以-0.48mm Hg/min的速率线性下降；同时，溶液的pH随时间以每分钟0.0058个pH单位的速率线性上升。参见图3B。50分钟后，pCO2下降了24mm Hg，而pH增加了0.29个单位。这个结果证实了在含有碳酸氢盐缓冲液的溶液的制备期间的预期的挑战。由于CO2持续地脱气，溶液的pH不断增加，并因此，滴定过程需要的碱/酸的量可能取决于实验间的准确定时和脱气的程度。
为了证明培养基溶液的pH和温度之间的关系，使用填充有定制ActiCHOP培养基的AMBR250生物反应器(Sartorius，Aubagne，法国)进行实验。气体流量设置为达到10％ CO2和90％空气(干燥基)的浓度。温度设置值随后从36.5℃更改为25℃，然后为15℃。每个系统达到稳定状态后取样。使用Orion VersaStar Pro台式测量仪(Thermo Scientific)分析样品的pH。如下图4所示，当气相CO2保持在总气体流量的10％浓度时，对于温度每升高10度，pH增加0.1单位。
pH和温度之间的这种关系并不如所预期的。之前已经显示，在含有碳酸氢盐的水的情况下，随着温度升高，pH降低。Green,Effect of Temperature on pH of AlkalineWaters–Waters Containing Carbonate,Bicarbonate,and Hydroxide Alkalinity,vol.41,no.8,pp.1795-797(1949)。这一发现再次支持了如下理论：细胞培养基可能不同于仅水和碳酸氢盐的溶液，可能是因为细胞培养基可能已经含有潜在影响其物理特性的其他缓冲液和组分。
16种溶液的m、s和净培养基酸被认为是相同的，因为这些不同的溶液是基于相同的基础培养基建立的。首先，如根据制造商的方案所指示的，从粉末制备仅ActiCHOP的溶液(溶液1)。记录该溶液的pH。然后将溶液1放置到4x 2升的生物反应器中。总气体流量设置在200ccm(空气、氮气和CO2)，在200转/分钟下搅拌，且温度在36.5℃。进口中的CO2的组成设置在总气体流量的大约4％-20％的范围内的值。在每个％CO2水平下达到稳定状态后，为pH和pCO2测量取样。最后，将溶液1放置在36.5℃和5％ CO2的培养箱中。在溶液达到平衡后，再次记录pH和pCO2测量。利用这3组数据和2.4节中开发的pH模型，通过最小化方程(20)同时找到m、s和净培养基酸的值。对于该ActiCHOP溶液，发现参数m为0.827±0.021，s为0.540±0.026mM/％CO2；且净培养基酸为0.033M。
开发pH模型的动机来自于使用滴定法在相同pH下制备16种不同溶液所需的预期更长的时间和可预见的挑战。进行了涉及制备溶液1的实验，使用滴定法和使用pH模型的配方法两者以预测需要的碱的准确量。下面的图5显示了每种方法制备这个溶液所消耗的时间。
使用配方法制备溶液1所消耗的时间的平均量比使用滴定法所需要的平均时间少8分钟。滴定法在所需的时间量方面也具有较大差异，这是由于用碱/酸的添加达到正确pH需要的额外的时间。此外，与用滴定法的2个半小时的总时间相比，对于配方法，制备该溶液5次的总时间仅1个半小时。另外，配方法允许由单个人平行地制备多种溶液，而滴定法在滴定步骤期间需要更多的手动操作。
用这两种方法制成溶液后，将其放置到两个不同的生物反应器中并设置在36.5℃，具有5％ CO2的气相组分。pH数据显示在图6中。
在36.5℃和5％ CO2下，预期的pH为7.27。由配方法制成的溶液的pH为7.274±0.005；而由滴定法制成的溶液的pH为7.282±0.009。确实，两种方法都在0.012个单位内达到了期望的靶标pH，这是相当引人注目的。看来，在室温下进行滴定并具有额外的时间来脱气CO2的挑战在这里不明显。这也许是在同一天连续地已经制备具有极好混合的小体积，并且在称量试剂和滴定中极其小心并密切监视pH的结果。尽管如此，滴定法的标准偏差虽然在数值上仍然相对小，但几乎比配方法的大两倍。相比之下，在制造中使用滴定制备培养基的经验证明0.10个单位的标准偏差，高出10倍。因此，总而言之，使用配方法来进行培养基溶液制备将仍然是有益的。
采用使用溶液1确定的m、s和净培养基酸，使用在平衡时具有36.5℃和5％ CO2的温度和pH靶标的pH模型来确定添加以达到所有16种培养基间的当量pH的碱的准确量。该靶标pH为7.27。氯化钠也被分别添加到每种溶液中，以确保当量同渗重摩。下文表2详细说明了添加以制成每种溶液的每种组分的量。
制成后，将所描述的溶液转移到具有通气盖的250mL Erlenmeyer烧瓶(Corning，纽约，美国)中，并放置于在36.5摄氏度和5％ CO2(38mm Hg pCO2)下的培养箱中。将每个烧瓶从培养箱中取出进行pH和pCO2测量，以烧瓶1开始，每次一个。图7代表了在第一次实验时所有16种溶液的平衡pH和pCO2。
溶液1的pH为7.33，比预期高0.06个单位，其中其pCO2为34.4mm Hg，比预期低3.6mm Hg。这种差异可能是由于恰好取样前培养箱内的CO2水平的波动。与溶液1的值相比，所有后续溶液的pH都较高，而它们的pCO2较低。如图8所示，在重复第二次实验后，再次观察到这种趋势。
对这些观测的可能的解释是每次打开培养箱门以取样烧瓶，培养箱内的CO2水平不再相同。这些观察结果使得难以得出如下结论：这16种不同的溶液使用配方法达到了相同的pH。然而，正如2.3节所提及，这些溶液的pH和pCO2之间存在关系。因此，在两次实验中的所有16种溶液的pH和pCO2数据用公式18进行了拟合，如图9所示。
发现斜率(-m)为-0.815±0.054，而发现log(1/s)的截距为0.284±0.032，参数s计算为0.052±0.032mM/％(报告的误差基于95％置信区间)。这两个值与3.3节中计算的pH模型参数没有显著差异(P>0.05)。该数据显示在下表3中。
表2从平衡数据与模型获得的参数的比较。
参数 平衡数据 模型
m 0.815±0.054 0.827±0.021
s 0.520±0.032 0.540±0.026
来自平衡数据的参数值与来自模型的参数一致。该模型规定了真正的平衡，而鉴于存在干扰(培养箱CO2循环，培养箱门在取样之间打开，等等)，实验数据可能并未真正达到平衡。尽管如此，开发的pH模型提供了16种不同的溶液，从原始数据中观察到这些溶液具有不同的pH和pCO2，但事实上仍与模型相关。这意指在完全相同的气相CO2的浓度下，每种溶液的pH将相似。
发现图9的线的R2值为0.969，调整后的R2值为0.968。使用R Studio程序绘制了正态概率和残差图。图10A中的正态概率图显示，发现所有数据都在一条直线上。图10B中的残差图没有明显的模式，并且所有学生化外残差值都在±2区域内。因此，可以得出结论：该数据集已经满足正态性和恒定方差假设，并且对于该模型的拟合是良好拟合。
细胞培养基在细胞生长、代谢和生产力中发挥着重要作用。pH是CPP，因此严格地控制培养基的pH是至关重要的。碳酸氢钠是用在细胞培养基中普遍的缓冲液，但含有碳酸氢钠的细胞培养基的制备具有许多挑战；这些挑战使用本文所述的方法得以解决。使用pH模型来为16种不同的培养基配制剂的每一种的提供配方，从而能够在室温下制备这些培养基而无需滴定并在36.5℃下与5％气相CO2平衡时满足7.27的pH靶标。然而，由于来自从培养箱中取出的烧瓶的样品的pH/pCO2测量的困难，这16种溶液的pH和pCO2不一样。然而，通过修改后的Henderson-Hasselbach方程，证明了它们的pH和pCO2是相关的。本文所述的pH模型也将帮助实现溶液制备过程的自动化，特别是在需要多种溶液的情况下。尽管这些方法在小规模下最有用，但它们在生产规模下也可适用，并有助于确保规模间的过程稳健性。
实施例2
这个实施例展示了电荷平衡模型的参数确定。
根据制造商的方案，制备了专有培养基(“培养基A”)。培养基A作为粉末提供，其溶解于水中形成基础液体培养基。向基础液体培养基中添加6.5mL的NaOH，然后是1.8g/L的碳酸氢钠，接着是最终量的水。最后，使用pH探针和额外量的NaOH或HCl将在室温(15-25℃)下的培养基的pH滴定到6.90至7.55范围内。
两个3L的Applikon生物反应器中的每一个填充有两升制备的培养基(生物反应器1和生物反应器2)。将30mL的5N盐酸添加至第二生物反应器(生物反应器2)中的培养基。
生物反应器的温度设置至36.5℃，并且培养基在200rpm下搅动。将含有空气和CO2的气流供应至生物反应器。使用了八种组成的进口气：进口气流中的二氧化碳为1、2、4、6、8、10、15和20％。对于气体的每种组成，在针对pH进行取样之前，操作生物反应器以达到稳定状态，使用Siemens 血气分析仪测量pH。
在16个稳定状态的每一个下的测量的pH报告于表4中。
表4
样品 生物反应器 yCO2％ 测量的pH 建模pH 差异
1 1 1 7.22 7.23 0.01
2 1 2 7.63 7.75 0.12
3 1 4 7.59 7.55 -0.04
4 1 6 7.41 7.35 -0.06
5 1 8 7.19 7.15 -0.04
6 1 10 7.06 7.08 0.02
7 1 15 6.92 6.96 0.05
8 1 20 6.87 6.88 0.07
9 2 1 6.63 6.23 -0.13
10 2 2 6.93 7.10 0.17
11 2 4 6.85 6.90 0.05
12 2 6 6.73 6.70 -0.04
13 2 8 6.65 6.58 -0.07
14 2 10 6.58 6.49 -0.09
15 2 15 6.52 6.43 -0.09
16 2 20 6.41 6.31 -0.10
对于表1中的16个样品的每一个实施电荷平衡模型。该方程的一般形式如下：
由于没有向细胞培养基中添加额外的补充剂，所以从电荷平衡方程中删除[A-]和[B+]项。添加[Cl-]项以解释添加到生物反应器2中的HCl。
所有电荷平衡使用了K0＝1.70x 10-3；K1＝4.98x 10-7；K2＝5.77x 10-11；和P＝1。
样品1-8的电荷平衡使用了[Na+]＝5.22x 10-2和[Cl-]＝0。样品9-16的电荷平衡使用了[Na+]＝5.14x 10-2和[Cl-]＝1.49x 10-2。样品9-16的方程中的参数[NMA-]由0.985的系数修改，以解释其由盐酸的添加引起的稀释。
16个方程中的每一个具有：[H+]＝10-pH，其中pH是针对数据点测量的pH；和如由每个数据点的生物反应器进口气流量指定的yCO2％。
然后通过最小化所有电荷平衡的每个平方乘以1012的总和来确定参数m、KH和[NMA-]。发现参数为m＝0.671；KH＝14.5atm/(mol/L)；[NMA-]＝0.0327mol/L。每个电荷平衡并不完全等于零，因为在这个最小二乘最小化期间，方程组是超定的。因此，参数拟合的平方之和为5.84x 1019。
图11显示了测量的pH数据和模型拟合的pH数据(也显示在表4中)，这些数据是使用确定的参数从电荷平衡计算。
数据和模型拟合的值之间的偏差的平方之和为0.108。当除以15个自由度时，模型的估计:数据标准偏差为0.085。
在对相同数据的第二次分析中考虑了[NMA-]的替代定义，以考虑[NMA-]与pH之间的关系。在此，[NMA-]定义为：
[NMA-]＝[COp+C1p*(pH-7)]
其中C0p和C1p是常数。通过最小二乘法确定的参数为m＝1.254；KH＝85.75atm/(mol/L)；C0p＝3.89x 10-2；以及C1p＝1.37x 10-2。参数拟合的平方之和为1.69x 1019。
表5和图12显示了pH的模型拟合值以及与这些新值的偏差(考虑[NMA-]作为pH的函数)。数据和模型拟合值之间的偏差的平方之和为0.0448。当除以15个自由度时，模型的估计:数据标准偏差为0.054。
表5
样品 生物反应器 yCO2％ 测量的pH 建模pH 差异
1 1 1 7.22 7.25 0.03
2 1 2 7.63 7.74 0.11
3 1 4 7.59 7.58 0.00
4 1 6 7.41 7.39 -0.02
5 1 8 7.19 7.15 -0.04
6 1 10 7.06 7.07 0.01
7 1 15 6.92 6.92 0.00
8 1 20 6.87 6.81 -0.01
9 2 1 6.63 6.38 0.02
10 2 2 6.93 6.80 -0.13
11 2 4 6.85 6.77 -0.08
12 2 6 6.73 6.70 -0.03
13 2 8 6.65 6.65 0.00
14 2 10 6.58 6.60 0.02
15 2 15 6.52 6.55 0.03
16 2 20 6.41 6.46 0.05
实施例3
该实施例展示了如何使用电荷平衡模型来确定氢氧化钠的体积，以制备具有额外的已知种类的16种组合的细胞培养基。
对于总共16种不同的培养基制备，用模型参数m＝0.8412，KH＝20.10atm/(mol/L)，[NMA-]＝2.89x 10-2mol/L指定，以及在制备普通基础培养基C期间使用的5.3mL NaOH的初始体积，使用电荷平衡模型来估计当以各种组合添加4种额外的已知组分时待添加到培养基C中的所要求氢氧化钠的体积。
4种额外的已知组分是谷氨酸/谷氨酸盐、谷氨酰胺、天冬酰胺和氯化铵。使用pKa值确定平衡时所有阴离子和阳离子的浓度。在具有三个pKa值的谷氨酸的情况中，考虑了以下解离/缔合平衡
其中[Glu0]是添加的谷氨酸/谷氨酸盐及其离子的浓度之和。37℃下Ka1、Ka2、Ka3的值分别为6.48x 10-3mol/L、5.62x 10-5mol/L和2.14x 10-10mol/L。
在谷氨酰胺的情况中，考虑了以下解离/缔合平衡
其中[Gln0]是添加的谷氨酰胺及其离子的浓度之和。37℃下Ka1和Ka2的值分别为6.76x 10-3mol/L和6.76x 10-10mol/L。
在天冬酰胺的情况中，考虑了以下解离/缔合平衡
其中[Asn0]是添加的天冬酰胺及其离子的浓度之和。37℃下Ka1和Ka2的值分别为9.55x 10-3mol/L和1.58x10-9mol/L。
在氨的情况中，氨来自于氯化铵盐
[NH4Cl]＝[NH3,0]+[Cl-]
其中[NH3,0]是添加的氨及其离子的浓度之和。37℃下KaA的值为5.75x 10-10mol/L。
现在，电荷平衡模型写成：：
其中[Na+]T是来自配方碳酸氢钠、配方氢氧化钠和达到期望pH所需的额外量的NaOH的总量。而[Cl-]是添加的项，以解释其在铵试剂中的存在。
使用这些方程，对于16种不同的培养基的每一种，计算指定yCO2％＝5％、T＝37℃和pH＝7.30的靶标过程条件后所需的NaOH的量。表6A和6B(所有浓度以mol/L为单位)显示了细胞培养基中的组分的浓度，包括待添加的所需NaOH的量。
表6A
表6B
来自配方碳酸氢钠和来自配方NaOH的Na+的浓度对所有培养基来说是恒定的，并且它们分别等于2.10E-02M和2.60E-02。
每种培养基都是4种组分的所有16种可能的组合的独特组合：谷氨酸/谷氨酸盐、谷氨酰胺、天冬酰胺和氨。谷氨酰胺、天冬酰胺、谷氨酸/谷氨酸盐和氨的起始浓度分别为3.00E-03M、6.00E-03M、5.00E-03M和2.00E-03M。来自所用的氯化铵试剂的Cl-的浓度为2.00E-03M。
CO2的浓度计算为1.93E-03M，并且其对于所有的培养基都相同，因为在1个大气压下，指定的CO2水平为5％。
所用的KH的值为20.10atm/(mol/L)，并且所用的m的值为0.8412。对于所有培养基，净培养基酸(NMA)浓度相同，并且等于2.89E-02mol/L。
根据期望的7.30的pH计算出H+的预期的浓度为5.01E-08M，但由于舍入误差，每种培养基的pH都不完全是7.30。从H+的浓度计算出OH-离子的浓度，并预期为4.59E-07，但同样，由于舍入误差，它接近但不完全相等。在计算中使用的水的Kw是2.30E-14M(因为过程条件温度设置在37℃)。
使用电荷平衡方程在表6B的最后一栏中计算了每种培养基所需的NaOH的量。
如上所述，通过待添加到每种细胞培养基中以获得期望的pH的NaOH的量，通过制备培养基和测量pH来测试该模型的准确度。16种不同的培养基在制备后放置到T＝37℃和5％的CO2设置的培养箱中的250mL的摇瓶中，。培养其过夜以达到平衡。然后，每个烧瓶一次从培养箱中移出一个，取样，并使用RapidLab BGA测量。
由于在烧瓶操作、取样和测量期间发生的CO2脱气，溶解CO2浓度与在培养箱中的与5％平衡的不同。因此，每个烧瓶的pH都高于期望的靶标。然而，RapidLab pCO2数据也是为每个样品收集的，其提供了测量的pCO2来评估模型(参见表7)。使用测量的pCO2值来估计每个烧瓶的新yCO2％值。在稳定状态平衡时，yCO2％＝6.59x pCO2(mmHg)+4.65，这是针对RapidLab BGA的以经验确定的方程。由于基于最接近微升的体积的舍入，每种培养基的靶标pH并不完全是7.030。建模pH和测量的pH显示在表7和图13中。
表7
估计的sigma值是0.006。这在单个BGA pH读数的准确性内，其为0.01-0.02。因此，即使有CO2脱气的测量困难，一旦将实际的yCO2％(如从测量的pCO2所估计的)输入到模型计算中，溶液的pH则是从模型所预期的pH。
在不同天制备了第二组的16种溶液，并重复了准确性评估。参见表8和图14。由于CO2的脱气，pH再次高于靶标，但在测量的pCO2下，测量的pH和模型计算的pH非常相似，在这种情况下具有sigma＝0.009。
表8
实施例4
本实施例通过比较制备的溶液的pH与RapidLab(pH＝7.04)和NOVA Flex II(pH＝7.15)的模型值，证明了电荷平衡模型在实现培养基B的靶标pH中的准确性。
根据制造商的规程制备培养基B，然后以无菌方式将其泵入到生物反应器。然后将生物反应器设置在37℃下，并将设置气流为达到10％CO2水平。在在线pH稳定至少15分钟后，允许达到稳定状态。然后取样以在RapidLab和NOVA Flex II装置两者上测量。在相同或不同天使用相同或不同的生物反应器，并使用相同或不同批次的培养基B，重复该实验16次。
培养基B的NMA浓度计算为3.40E-02mol/L。基于RapidLab装置的pH模型的m和KH值分别为0.8412和20.85atm/(mol/L)。基于NOVA Flex II装置的pH模型的m和KH值分别为0.9128和31.78atm/(mol/L)。
在图15中绘制了所有16次测试的使用RapidLab装置的测量pH。测量的数据是有噪音的，并且该装置的预期的模型pH(pH＝7.04)的偏差可能是由于每次测量的来自单一读数的噪音。另外，控制每个生物反应器的气体流量的每个质量流量控制器(MFC)均具有与之相关的噪声，没有提供正好在10％的CO2摩尔分数。最后，由于测量噪音，每批培养基略有不同地制备，也可能有助于观察到的不同的pH。然而，发现由RapidLab(n＝16)测量的平均pH为7.051，具有0.020的标准偏差。95％的置信限计算为0.011。平均pH与7.04的pH靶标间的差异不是统计学显著的。因此，培养基B的pH模型和RapidLab装置准确地预测了如使用RapidLab装置所测量的制备的培养基B的pH。
在图16中绘制了所有16次测试的使用Nova flex II装置的测量pH。测量的数据再次是有噪音的，并且该装置的预期的模型pH(pH＝7.15)的偏差可能是由于上述类似的原因。发现由Nova flex II(n＝16)测量的平均pH为7.145，具有0.040的标准偏差。95％的置信限计算为0.013。平均pH与7.15的pH靶标间的差异不是统计学显著的。因此，培养基B的pH模型和Nova flex II装置准确地预测了如使用Nova flex II装置所测量的制备的培养基B的pH。
从前述内容应该理解，虽然已经阐明和描述了所公开的方法和系统的特定的实施方式，但可以对其进行各种修改，并在本文中考虑到。这也并不意指本发明限于在说明书内提供的特定的实例。虽然本发明已经参照上述说明书进行描述，但本文可优选的实施方案的描述和说明并不意指解释为限制性意义。此外，应当理解的是，本发明的所有方面并不限于本文阐述的特定的描述、配置或相对比例，它们依赖于各种条件和变量。对本领域的技术人员来说，本发明的实施方案在形式和细节上的各种修改是显而易见的。因此，可以设想本发明也应覆盖任何此类修改、变化和等同物。

Claims (46)

1.调整细胞培养基的pH的方法，其包括：
对于所述细胞培养基，获得所述细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于所述细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系，以及所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度；
向所述细胞培养基中添加碳酸盐或碳酸氢盐，以获得所述细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度；和
使用电荷平衡模型，确定待添加到所述细胞培养基中以将所述细胞培养基的pH调整到期望的pH的强酸或强碱的量，其中所述电荷平衡模型至少基于所述细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于所述细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度、所述细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度，及所述期望的pH。
2.权利要求1的方法，其进一步包括将所述确定量的强酸或强碱添加到所述细胞培养基中，从而制备经pH调整的细胞培养基。
3.权利要求1或2的方法，其中所述碳酸盐或碳酸氢盐为碳酸钠或碳酸氢钠。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其进一步包括用一种或多种离子化合物补充所述细胞培养基，其中所述电荷平衡模型进一步基于所述一种或多种离子化合物的浓度。
5.权利要求4的方法，其中所述一种或多种离子化合物包括一种或多种氨基酸或氯化铵。
6.权利要求5的方法，其中所述一种或多种氨基酸包括谷氨酰胺、天冬酰胺或谷氨酸。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述强碱是氢氧化钠。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述强酸是盐酸。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述电荷平衡模型定义为：
其中：
[Na+]是作为氢氧化钠、碳酸氢钠或碳酸钠添加到所述细胞培养基中的钠离子的浓度；
[H+]是获得所述期望的pH所需的所述细胞培养基中的质子的浓度；
[OH-]是所述细胞培养基中的氢氧根阴离子的浓度；
[NMA-]是所述细胞培养基中的净培养基酸离子的浓度；
[A-]是添加到所述细胞培养基中的带负电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何OH-或包含在[NMA-]中的带负电荷的离子；且
[B+]是添加到所述细胞培养基中的带正电荷的离子的浓度，乘以其电荷的绝对值，不包括任何H+、包含在[Na+]中的钠离子或包含在[NMA-]中的带正电荷的离子。
10.权利要求9的方法，其中：
其中：
K0、K1和K2是碳酸氢根和碳酸根阴离子的解离常数；
P是应用于所述细胞培养基的气压；
yCO2是应用于所述细胞培养基的CO2气相的摩尔百分比；且
m和KH各自是以经验确定的所述细胞培养基的参数。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度在所述电荷平衡模型中建模为所述细胞培养基的pH的函数。
12.权利要求11的方法，其中所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度与所述细胞培养基的pH呈线性关系建模。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度建模为：
[NMA-]＝[C0p+C1p*(pH-7)]
其中：
[NMA-]是所述细胞培养基中的净培养基酸离子的浓度；且
C0p和C1p各自是以经验确定的所述细胞培养基的常数。
14.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度在所述电荷平衡模型中建模为温度的函数。
15.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度在所述电荷平衡模型中建模为pH和温度的函数。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中获得用于所述电荷平衡模型的所述函数关系和所述净培养基酸的浓度包括以经验确定所述函数关系和所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度。
17.权利要求16的方法，其中以经验确定所述函数关系和所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度包括：
测量在不同气态二氧化碳水平下平衡并含有不同量的添加的强酸或强碱的所述细胞培养基的多种条件的pH数据；和
使用所述测量的pH数据拟合所述电荷平衡模型。
18.权利要求17的方法，其包括在测量所述pH数据之前，在期望的培养温度下在所述多种条件下平衡所述细胞培养基。
19.权利要求18的方法，其中所述期望的培养温度为约35℃至约40℃。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中所述细胞培养基在室温下制备。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述期望的碳酸钠或碳酸氢钠浓度为约1.5g/L至约2g/L。
22.培养细胞的方法，其包括：
根据权利要求1-21中任一项的方法调整细胞培养基的pH；和
在所述经pH调整的细胞培养基中培养细胞。
23.权利要求22的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
24.权利要求22或23的方法，其中细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
25.权利要求22-24中任一项的方法，其中所述细胞在约35℃至约40℃下在所述细胞培养基中培养。
26.权利要求22-25中任一项的方法，其中在约0.1％至约20％摩尔分数的CO2下于所述细胞培养基中培养所述细胞。
27.权利要求22-26中任一项的方法，其中所述细胞包含编码重组多肽的核酸分子。
28.产生重组多肽的方法，其包括：
根据权利要求27的方法培养细胞；和
在所述经pH调整的细胞培养基中产生所述重组多肽。
29.权利要求27或28的方法，其中所述重组多肽为抗体或其片段。
30.系统，其包括：
一个或多个处理器；和
存储器，其与所述一个或多个处理器通信耦合且配置为存储指令，当由所述一个或多个处理器执行所述指令时，使得所述系统：
在所述一个或多个处理器处，对于细胞培养基，接收指示所述细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于所述细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数的函数关系的一个或多个参数，以及指示所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度的净培养基酸参数；
在所述一个或多个处理器处，接收指示所述细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度的碳酸盐或碳酸氢盐参数；
在所述一个或多个处理器处，接收指示所述细胞培养基的期望的pH的pH参数；和
使用电荷平衡模型，确定待添加到所述细胞培养基中以将所述细胞培养基的pH调整到所述期望的pH的强酸或强碱的量，其中所述电荷平衡模型至少基于所述细胞培养基中的溶解二氧化碳的浓度与应用于所述细胞培养基的气态二氧化碳的摩尔分数之间的函数关系、所述细胞培养基中的净培养基酸的浓度、所述细胞培养基中的期望的碳酸盐或碳酸氢盐浓度，及所述期望的pH。
31.用于在表达多肽的宿主细胞中产生所述多肽的方法，其包括通过用碳酸氢钠制备细胞培养基以严格控制所述培养基的pH而在细胞培养基中培养所述宿主细胞，包括：
确定待添加到细胞培养基中的赋形剂和相对量，以定义配方；
使用所述配方制备溶液并确定所述溶液的pH，以定义第一数据集；
将所述溶液放置在CO2供气并且搅拌的生物反应器中，并使所述溶液平衡以确定所得的pH和pCO2值，以定义第二数据集；
将所述溶液放置在已定义的温度和CO2摩尔百分比的培养箱中，并确定所述pH和pCO2测量，以定义第三数据集；
使用所述第一、第二和第三数据集及根据以下的pH模型：
以通过最小化以下者来同时求解m、s和净培养基酸的参数值：
∑(k*[Ck])＝0；
定义所述细胞培养基的靶标pH，并向所述细胞培养基中添加由所述pH模型确定的适当浓度的碱，以达到pH当量，其中所述细胞培养基pH受到严格控制；和
产生所述多肽。
32.权利要求31的方法，其中将盐添加到所述溶液中以维持同渗重摩。
33.权利要求31的方法，其中所述赋形剂选自由谷氨酰胺、谷氨酸/谷氨酸盐、天冬酰胺、氯化铵、氯化钠和氢氧化钠组成的组。
34.权利要求33的方法，其中所述培养基放置在36.5℃和5％CO2的培养箱中。
35.权利要求34的方法，其中所述细胞培养基在室温下制备。
36.权利要求31的方法，其中所述细胞培养基的pH在预期的pH值的0.005个标准偏差之内。
37.权利要求36的方法，其中所述细胞培养基的pH为7.272±0.005。
38.权利要求31的方法，其中所述方法是自动化的。
39.权利要求31的方法，其中所述方法在分批补料过程中进行。
40.权利要求31的方法，其中所述方法在制造规模上可适用，且确保规模间的鲁棒性。
41.权利要求31的方法，其中所述方法适用于确保在培养基开发或研究期间具有不同氨基酸添加剂的多种溶液的高质量比较。
42.权利要求31的方法，其中所述方法在小规模体系，诸如摇瓶上可适用。
43.用于在表达多肽的宿主细胞中产生所述多肽的方法，其包括在无谷氨酰胺的生产培养基中在培养物的生产阶段中培养所述宿主细胞，包括：
以范围为7.5mM至15mM的浓度添加天冬酰胺到细胞培养基；
以范围为1mM至10mM的浓度添加天冬氨酸到细胞培养基；
添加盐到细胞培养基；
确定待添加到细胞培养基中的赋形剂及相对量，以定义配方；
使用所述配方制备溶液并确定所述溶液的pH，以定义第一数据集；
将所述溶液放置在CO2供气并且搅拌的生物反应器中，并使所述溶液平衡以确定所得的pH和pCO2值，以定义第二数据集；
将所述溶液放置在已定义的温度和CO2摩尔百分比的培养箱中，并确定所述pH和pCO2测量，以定义第三数据集；
使用所述第一、第二和第三数据集及根据以下的pH模型：
以通过最小化以下者来同时求解m、s和净培养基酸的参数值：
∑(k*[Ck])＝0；
定义所述细胞培养基的靶标pH，并向所述细胞培养基中添加由所述pH模型确定的适当浓度的碱，以达到pH当量，其中所述细胞培养基pH受到严格控制；和
产生所述多肽。
44.权利要求43的方法，其进一步包括分离所述多肽的步骤。
45.权利要求43的方法，其中所述生产阶段是分批或补料分批培养阶段。
46.权利要求43的方法，其中所述生产培养基是无血清的。
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