CN103946366A - 细胞培养物的预编程非反馈控制的连续供料 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于生物反应器中的底物的质量平衡的用于细胞培养物生长和维持的预编程非反馈连续供料方法。所公开的方法不依赖于仪器、探针或操作人员反馈。所述方法提供一种团式供料的有效且高效的替代方案。

Description

细胞培养物的预编程非反馈控制的连续供料

本申请要求2011年9月16日提交的美国临时专利申请号61/535，809的权益，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文。

发明领域

本发明涉及对细胞培养物供料的方法，所述方法是连续的并且使细胞生长和蛋白质表达增强，但不依赖于反馈控制，从而适于改变细胞培养物的需要。

发明背景

在医药和生物技术行业中广泛使用哺乳动物细胞培养来制造重组治疗蛋白质。由于蛋白质治疗剂的市场不断增长和持续努力提高生产效率及降低制造商品的成本，因此在最近十年来对提高细胞培养产率的需要显著增加。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞常用于生产治疗蛋白质，如单克隆抗体、抗原和其它特殊蛋白质模态。

使用哺乳动物细胞来生产蛋白质通常涉及分批供料方法，在这种方法中，在整个生产过程中向细胞供给支持细胞生长、代谢和所需蛋白质产物的合成的营养补充物。细胞培养物批供料供料方法的当前行业标准是团式供料。在团式供料方法中，在细胞培养物生产的整个过程中的不同时间点以间歇的不连续添加向细胞提供营养物。团式供料方法的方式很简单，因为它受限于手动供料操作的可操作性，这就是它常用的一个原因。

然而，团式供料具有若干缺点，最主要的缺点是不能提供细胞实际上所需要的精确营养物量。换句话说，团式供料不能根据细胞培养物的特殊需要而调整并且因此所提供的一些营养物的量可能比细胞培养物所要求的量高，而所提供的其它营养物的水平可能比细胞所要求的水平低。因此，虽然在方法上非常简单，但是团式供料方法可能导致过度供料，因而导致过度代谢，从而产生不支持细胞生长或生物合成并且可能实际上抑制细胞生长的废弃副产物如乳酸盐的积累。

团式供料方法在制造情形中的另一缺点在于团式供料方法本身是变化的源头，这可能导致细胞培养物性能出现差异。一个这种源头是在所需供料日执行供料操作的时间上的变化。与团式供料相关的变化的另一源头是营养物流施用至生物反应器中的速率。执行供料的时间和对细胞进行供料的速率上的变化可以单独或一起影响指定细胞培养物在不同操作时的特性和生产。与团式供料相关的另一缺点在于它通常是手动操作，这需要由操作人员执行。缺少自动化可消耗人力资源和财力资源，并且成为变化的另一源头，即由于在操作人员之间缺少一致性或者在操作人员保持相同的情况下由操作人员引入的变化不可控，致使在制造过程中引入了微小的差异。

团式供料的缺点可以通过使用连续供料方法来克服。连续供料方法可以被设计成通过随时间向培养物连续供给较小量的营养物而不是进行大量的单次团式添加来更好地满足细胞需要。这样实施时，营养物浓度可以被控制和维持在对于细胞生长来说更佳的水平，由此防止过度供料，使得不必要的废物的产生减至最少，并且维持不间断的准稳态水平。采用连续供料操作还可以消除与团式供料操作相关的供料时间和速率上变化，因为这些变量在连续供料方法中是自动控制的。使用连续供料方案也消除了操作人员的干预。

虽然其他人已经展示了这种方法的不同形式，但是这些方法仍然引入了操作人员失误的可能性。例如，Hu和Europa(美国专利号6，156，570)展示了提高生产力的连续供料策略。然而，这种用于哺乳动物细胞培养物的连续供料策略依赖于设备反馈控制，这可在供料方法中引入变化。

类似地，所有这些方法所共有的缺点在于它们实际上依赖于一些种类的通过仪器获得的反馈以便管理这个过程。因此，所需要的是可以针对指定细胞培养物的具体需要进行调整、可以自动化并且不依赖于仪器介导的反馈来控制递送给细胞培养物的营养物的对细胞培养物供料的方法。

发明概要

提供一种不采用反馈控制的对哺乳动物细胞培养物连续供料的方法。在一个实施方案中，所述方法包括(a)提供包括包含哺乳动物细胞和培养基的哺乳动物细胞培养物的容器；(b)确定营养物的消耗速率(K₁)、细胞培养物的生长速率(K₂₁)和生长速率(K₂₂)的优选值；(c)提供适于向细胞培养物给予连续供料流的装置，其中所述装置包括适于以流速F对培养物连续供料的控制器模块，其中F被定义为K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)；t是从供料流被添加至生物反应器的时间到停止供料流时的时间的持续时间；并且K₁、K₂₁和K₂₂是在(b)中所确定的值；和(d)启动控制器模块以起始对细胞培养物的连续供料。在一个实施方案中，K₁、K₂₁和K₂₂是凭经验确定的。在另一实施方案中，K₁、K₂₁和K₂₂被建模。在另一实施方案中，控制器模块包括计算机。在另一实施方案中，供料流包含多种营养物。在另一实施方案中，细胞培养物的渗透压在所述方法的整个过程中保持恒定。在另一实施方案中，供给培养物的营养物是葡萄糖。在其它实施方案中，哺乳动物细胞培养物是CHO细胞培养物。在另一实施方案中，响应于细胞培养物中预先选定的乳酸盐水平启动控制器模块，而在另一实施方案中，响应于细胞培养物中预先选定的葡萄糖水平启动控制器模块。在另一实施方案中，响应于氨基酸如天冬酰胺或谷氨酰胺的预先选定的水平启动控制器模块。在另一实施方案中，供料流包含两种或更多种营养物。

附图描述

图1是示出供料函数与细胞系1的细胞培养物营养物需求之间的配合紧密度的曲线图。

图2是描绘针对细胞系1测试的葡萄糖连续供料速率和体积积累趋势的曲线图；空心形状是葡萄糖流速并且在左侧的Y轴上示出，并且实心形状是累积供给葡萄糖体积并且在右侧Y轴上示出；空心三角形(△)和实心三角形(▲)分别是K₁=0.0504、K₂₁=-0.00015、K₂₂=-0.0331时的连续葡萄糖流速和体积积累，而空心菱形(◇)和实心菱形(◆)分别是K₁=0.04、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0348时的连续葡萄糖流速和体积，并且空心方形(□)和实心方形(■)分别是K₁=0.062、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0288时的连续葡萄糖流速和体积。

图3是描绘针对细胞系1测试的供料流速和体积积累趋势的曲线图；空心形状是供料流速并且在左侧的Y轴上示出，并且实心形状是累积供给供料体积并且在右侧Y轴上示出；空心菱形(◇)和实心菱形(◆)分别表示K₁=0.59499、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0348时的连续供料流速和体积，而空心三角形(△)和实心三角形(▲)分别表示K₁=0.96678、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0288时的连续供料流速和体积，空心圆形(○)和实心圆形(●)分别表示恒定供料流速2.875ml/hr和其累积体积，并且实心方形(■)表示对照团式供料的累积体积趋势。

图4a-4d是一系列与涉及细胞系1的实验相关的曲线图，并且更具体地说，图4a是示出残余葡萄糖的曲线图，图4b是示出渗透压的曲线图，图4c是示出细胞活力的曲线图，并且图4d是示出积分活细胞密度的曲线图；空心圆形(○)表示团式葡萄糖和供料的对照，空心方形(□)表示连续葡萄糖(K₁=0.04、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0348)与团式供料，星形(*)表示连续葡萄糖(K₁=-0.062、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0288)与团式供料，实心三角形(▲)表示连续葡萄糖(K₁=0.0504、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0331)与连续供料(K₁=0.59499、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0348)，实心菱形(◆)表示连续葡萄糖(K₁=-0.0504、K₂₁=-0.00015、K₂₂=-0.0331)与恒定供料(2.875ml/hr)，并且实心圆形(●)表示连续葡萄糖(K₁=0.0504、K₂₁=-0.00015、K₂₂=-0.0331)与连续供料(K₁=0.96678、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0288)。

图5a-5c是一系列与涉及细胞系2的实验相关的曲线图，并且更具体地说，图5a是示出残余葡萄糖的曲线图，图5b是示出积分活细胞密度的曲线图，图5c是示出效价的曲线图；星形(*)表示团式葡萄糖与供料的对照，空心菱形(◇)表示连续葡萄糖(K₁=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)与团式供料，空心三角形(△)表示连续葡萄糖(K₁=0.069、K₂₁=-0.000048、K₂₂=0.018)与团式供料，实心三角形(▲)表示连续葡萄糖(K₁=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)与连续供料(K₁=1.1320、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)，实心菱形(◆)表示连续葡萄糖(K₁=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)与连续供料(K₁=0.8965、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)，实心圆形(●)是连续葡萄糖(K₁=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)与连续供料(K₁=1.9056、K₂₁=-0.00006、K₂₂=0.0092)，并且实心方形(■)是连续葡萄糖(K₁=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)与连续供料(K₁=2.3821、K₂₁=-0.00006、K₂₂=0.0092)。

图6a-6d是一系列与涉及细胞系2的实验相关的曲线图，并且更具体地说，图6a是示出效价的曲线图，图6b是示出体积生产率的曲线图，图6c是示出活力的曲线图，并且图6d是示出积分活细胞密度的曲线图；空心菱形(◇)表示团式葡萄糖和供料(600mL总供料)的对照，空心三角形(△)表示连续葡萄糖(K₁=0.215、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)与团式供料(600mL总供料)，实心三角形(▲)表示连续葡萄糖(K₁=0.215、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)与连续供料(K₁=1.8744、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)(540mL总供料)，并且实心菱形(◆)表示连续葡萄糖(K₁=0.215、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)与连续供料(K₁=2.0827、K₂₁=-0.000003、K₂₂=-0.003)(600mL总供料)。

图7a-7d是一系列与涉及细胞系2的实验相关的曲线图，并且更具体地说，图7a是示出效价的曲线图，图7b是示出体积生产率的曲线图，图7c是示出活力的曲线图，并且图7d是示出积分活细胞密度的曲线图；空心三角形(△)表示团式葡萄糖与供料(600mL总供料)的对照，空心圆形(○)表示团式葡萄糖与连续供料(K₁=2.6503、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)(600mL总供料)，并且空心方形(□)表示团式葡萄糖与连续供料(K₁=2.2910、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)(660mL总供料)。

图8a-8b是一系列与涉及细胞系3的实验相关的曲线图，并且更具体地说，图8a是示出效价的曲线图，并且图8b是示出比生产率的曲线图；空心三角形(△)表示团式葡萄糖与供料的对照，并且空心菱形(◇)表示第4天至第8天与对照供料相同总计300mL体积的团式葡萄糖与连续供料(K₂₁=2.7233、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)。

详细说明

除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本领域的普通技术人员通常所理解的含义。另外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。

一般来说，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传性和蛋白质及核酸化学以及杂交所使用的术语以及细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传性和蛋白质及核酸化学以及杂交技术是本领域中熟知和常用的。本申请的方法和技术一般根据本领域中所熟知的以及如本说明书通篇所引用和论述的各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来实施，除非另外规定。参见例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001)和后续版本，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biolo gy，Greene Publishing Associates(1992)，以及HarloW和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)，所述文献以引用的方式并入本文。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明书、如本领域中通常所实现或如本文所述来实施。结合本文所述的分析化学、合成有机化学和医疗及医药化学使用的术语以及分析化学、合成有机化学和医疗及医药化学的实验室程序及技术为本领域中所熟知和常用者。可使用化学合成、化学分析、医药制备、配制和递送以及治疗患者的标准技术。

应了解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂等并且因此可以变化。本文中所用的术语仅是为了描述特定实施方案的目的，并且不欲限制本发明的范围。

除了在操作实施例中以外，或者在另外规定的情况下，本文所用的表示成分的量或反应条件的所有数值应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。当结合百分比使用时，术语“约”可以意指±5％，例如1％、2％、3％或4％。

为满足不依赖于仪器反馈来控制过程的连续供料方法的需要，提供这种供料方法。一方面，所公开的方法是基于细胞培养物的细胞生长和底物消耗的模型。所公开的方法提供具有三个参数的供料速率函数，所述三个参数表示比底物消耗和比生长速率；所有三个参数都可以针对指定培养物进行优化，并且可以针对所有CHO细胞系进行优化。优化的函数在连续供料算法中用于控制细胞培养物供料以适合所需特征。这种供料策略可以预先编程并且在整个蛋白质生产过程中受到非反馈控制。因此，不需要来自仪器或其它测量形式的输入来控制或调整供料。它可以应用于所有类型的营养物供料，如葡萄糖供料和混合物供料。如本文所示，所公开的连续供料方法可以提高细胞活力、细胞密度和指定细胞培养物的生产率。供料速率函数也可以进行调整以达成有限的碳供应，并因此减少副产物废物，如乳酸盐和铵。所公开的连续供料方法在许多方面优于团式供料，包括细胞培养物性能增强、运转一致性更好、消除供料操作变化以及消除手动供料操作的需要。这种连续供料策略是常规团式供料的改进的有效替代方案，并且减少或消除与常用常规团式供料方法相关的变化。

一方面，本发明提供对细胞培养物如表达所需分子的培养物连续供料的方法。在一个实施方案中，所述方法提供供料函数，所述供料函数控制提供给生长中的细胞培养物的营养物的速率和体积。供料函数可以如本文所示来推导出；供料函数中出现的个别变量都可以针对指定培养物测量出来。

广义来说，针对指定培养物新建一个供料函数要纳入描述营养物消耗和生长参数的三个参数(K₁、K₂₁和K₂₂)，它们经过确定以便匹配和满足指定细胞培养物的生长需求和底物消耗特征。供料函数中另一变量是供料持续时间(t)，它决定要供给的体积的总量并且也可以经过确定以匹配和满足细胞培养物的生长需求和底物消耗特征。通过确定这些参数、将它们纳入供料函数以及使供料函数与适当硬件相关联，达成可完全自动化的连续供料方法，这种方法使得性能相对于团式供料得到提高。

所公开的方法可以应用于基于蛋白质的分子的制造，如任何长度的蛋白质(例如治疗蛋白质)、抗体、肽体、半体、包含一个或多个非天然存在的或编码的氨基酸的分子(如抗体或治疗蛋白质)、肽、Fc融合蛋白、SCFv、单链抗体等。

所公开的方法还可以应用于任何所需规模，从实验室规模(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或50升培养物)至小规模制造(例如约100、200、300、400、500、1000、1500或2000升培养物)。在特别合意的形式中，所公开的方法可以以工业规模应用(例如约5000、7500、10000或15,000升)。所公开方法的优点(包括成本节省)在工业规模下将是最显著的，但是不管所述方法所应用的生产规模如何都是明显的。

支持细胞生长的任何培养基都可以用于本发明的细胞培养物和方法中。在一个实施方案中，培养基可以包含血清，而在另一实施方案中，培养基可以不含血清。在各种实施方案中，培养基中可以补充有一种或多种氨基酸。在一个实施方案中，培养基是化学成分明确的培养基。

定义

根据常规，除非另外明确规定，否则“一(a/an)”意谓“一个或多个”。

术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换使用，指包含氨基酸残基的聚合物。术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。所述术语也可以涵盖经过修饰(例如通过添加碳水化合物残基以便形成糖蛋白)或经过磷酸化的氨基酸聚合物。多肽和蛋白质可以由天然存在的和非重组的细胞产生，或者多肽和蛋白质可以由经过遗传工程改造的或重组的细胞产生。多肽和蛋白质可以包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或者具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子，包括以非天然存在的氨基酸取代。

供料函数的推导

所提供的非反馈控制的连续供料方法的一个组成要素是供料函数，所述供料函数适于相关哺乳动物细胞培养物(例如CHO、NS0、BHK21、PER.C6或HEK293细胞培养物)的独特生长需求和性质，例如出于例如表达所关注的蛋白质的目的培养的培养物。供料函数纳入培养物的营养物需求特征，旨在促进生长、生物合成并且减少副产物形成。一方面，供料函数可以视为在细胞培养物生长特征的过程中在任何时间点上培养物的最佳营养需求的表达。有了培养物的营养需求随时间而变化的表达(即供料函数)，可以消除任何反馈控制的需要，因为这些仪器所提供的数据已经知道并且纳入了供料函数中。供料函数还允许细胞培养物生长的完全自动化操作；一旦供料式被设置成控制进入含有细胞培养物的生物反应器的营养物流并且提供起始信号，整个细胞生长过程就受到供料函数控制并且不需要另外的干预。

供料函数考虑多个变量，包括底物的入口流速(F)、生物反应器中的初始营养物浓度(S_i)、营养物物料浓度(S_o)、最大细胞密度对营养物产率比生长速率(μ)、细胞密度(X)和生物反应器的体积(V)。所有这些变量都可以通过测量和计算特定培养物的各参数来容易地确定。底物的入口流速(F)是底物施用至生物反应器中的供料速率。初始生物反应器营养物浓度(S_i)是将要起始连续供料时底物的浓度。这可以使用离线营养物分析仪利用培养基样品来测得。营养物物料浓度(S_o)是用于施用连续供料的液体储器中底物的浓度。最大细胞密度对营养物产率是总细胞密度的峰值点除以在该点消耗的总底物。细胞密度(X)是用细胞计数器测得的培养物中的活细胞密度。比生长速率(μ)描述为在指定时间点的细胞生长速率除以在该时间点的活细胞密度。μ可以使用以下关系式来计算：其中X₂和X₁分别是最终和初始活细胞密度，并且t₂和t₁分别是最终和初始时间。生物反应器的体积(V)由在任何指定时间生物反应器中的总培养物体积组成。在一个实施方案中，供料函数取为以下形式F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)，并且如下所示推导。

生物反应器中指定营养物的质量平衡由方程(1)描述，其中F是营养物的入口流速，S_i是生物反应器中的初始营养物浓度，S_o是营养物物料浓度，是最大细胞密度对营养物产率，μ是比生长速率，X是细胞密度，V是生物反应器的体积。

$\frac{\mathrm{dS}}{\mathrm{dt}}=-\frac{\mathrm{\μXV}}{Y_{x/s}^m}+\frac{F(S_o-S_i)}{V}---\left(1\right)$

采用稳态营养物浓度与连续供料的组合，方程可以简化为方程(2)，

$F=\frac{q_s}{(S_o-S_i)}{X}_i{V}_i{e}^{\mathrm{\μt}}---\left(2\right)$

其中比营养物消耗和细胞生长由XV=X_iV_ie^ut描述，X_i和V_i分别是供料开始时的初始细胞密度和生物反应器体积。方程(2)简化为以下方程(3)，

$F=K_1{e}^{K_{2}t}---\left(3\right)$

其中：

$K_1=\frac{q_s}{(S_o-S_i)}{X}_i{V}_i---\left(4\right)$

K₂=μ                         (5)

然而，方程(3)不适用于指数期以外的细胞培养物生长，因为细胞将进入稳定期并且接着将快速进入死亡期。因此，需要一旦细胞处于死亡期就减少供料的函数。在开发所公开的方法时实施的实验中，观察到当在整个生产过程的跨度上绘制比生长速率(μ)曲线时，CHO细胞的比生长速率μ随时间而降低。发现对于所研究的多种细胞系中的每一种，都始终出现这种情况。将μ随时间的变化拟合为线性趋势时显示拟合良好，并且因此μ可以用线性方程表示

K₂=K₂₁t+K₂₂                      (6)

其中K₂₁始终是负数，K₂₂始终是正数，并且|K₂₂|＞＞|K₂₁|。将方程(6)带入方程(3)得到供料函数

F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)              (7)

方程(7)构成所有连续供料设计和实验的基础。方程(7)使得供料曲线变弯曲，从而趋势不再仅仅是以指数上升。因为项K₂₁始终为负，随时间增加，整个K₂₁t²+K₂₂t项可以变为负并且供料趋势接着将下降。K₁扩大整个供料趋势的量级，因为该值变得较大。

关于方程(4)中的K₁，设定q_s在整个生产过程中为恒定值。q_s是比底物消耗速率，如葡萄糖的比底物消耗速率。它是通过将比生长速率(μ)除以最大细胞密度对底物产率而计算得到的。这些项在上文进行了描述。针对多种细胞系就葡萄糖对恒定的q_s进行了研究，并且观察到在细胞达到峰值细胞密度后，例如在7天后，设定q_s保持恒定的假设显示大体上是正确的。因此，设定q_s保持恒定简化了供料函数，并且鉴于已有三个K变量用于优化，这种假设不会显著影响供料函数。

虽然设定q_s保持恒定的假设是合理的并且简化了供料函数的推导，但是这个假设还去除了在一些情况下可能会有助于得到更精确的供料函数的变量。因此，可以设想可以获得q_s的更精确拟合。q_s的更精确拟合值接着可以替代方程(7)中的K₁以推导出具有甚至更高自由度的供料函数。通过加入这些附加的自由度，有可能获得甚至更高解析度的供料函数。这些更精确拟合的供料函数构成所公开方法的一个方面。

推导体积方程

如本文所示，提供适于指定细胞培养物的独特需要的供料函数。供料函数描述细胞培养物的营养物需要，但是，它不明确提供描述添加到指定培养物中的浓缩营养物物料的总体积的项。这个量可以如下由供料函数自身推导出来。

通过供料函数计算所供给的浓缩营养物物料的总体积的能力是在方法开发应用中使用所公开的方法的一个考虑因素。对包含特定营养物(例如由供料函数描述的将被供给细胞培养物的营养物)的溶液的液体体积的了解将有助于设计所需供料、体积、由拟合体积数据获得K值的能力以及在控制器上跟踪体积使用的能力。因此，计算由供料函数导出的体积对于应用连续供料来说将是有价值的参数。如方程(8)中所示对供料函数进行积分推导出体积方程。

$\∫\frac{\mathrm{dV}}{\mathrm{dt}}=K_1\∫e^{K_{21}{t}^2+K_{22}t}---\left(8\right)$

其中：

$F=\frac{\mathrm{dV}}{\mathrm{dt}}---\left(9\right)$

使用麦克劳林级数来近似得到积分中的指数项，出于精确度的原因使用级数的前五个积分项获得体积方程。

$e^x=\underset{n=0}{\overset{4}{\mathrm{\Σ}}}\frac{x^n}{n!}---\left(10\right)$

其中：

x=K₂₁t²+K₂₂t              (11)

最终的体积方程在方程(12)中示出，并且使用了级数的全部五个项。

$V=K_1(t+\frac{K_{\text{22}}}{2}{t}^2+\frac{2K_{21}+K_{22}^2}{6}{t}^3+\frac{6K_{21}{K}_{22}+K_{22}^3}{24}{t}^4+...)---\left(12\right)$

自动化连续供料方法

在许多蛋白质生产方法中，需要操作人员监控与生物反应器相关联的反馈仪器，所述仪器获取与指定细胞培养物的局部环境、健康、细胞密度和蛋白质生产相关的数据。这个数据被反馈至操作人员，操作人员接着响应于所述数据调整生长条件，以便维持生物反应器中的一组优选条件。

所公开的方法的一个优点是能够以完全自动化的方式运行所述方法，由此消除对专门操作人员和对专用于获取关于细胞培养物的数据的仪器的需要。这可以转变为效率提高、与人力资源和物质资源相关的成本节省，并且能够使操作人员偏差或误差的机会降至最低，并且完全消除与反馈仪器失效相关的生产问题(例如用于氨基酸、维生素和碳源的HPLC；葡萄糖和乳酸盐分析仪(Nova Profiler和YSIInstruments)；细胞计数器(Cedex和Vi-Cell)；生物反应器原位探针(例如pH、溶解氧、浊度、电容和NIR探针)、渗压计和其它仪器。

通常细胞培养物生长被作为渐进式经验化作业处理，其中操作人员响应于由反馈仪器获得的关于培养物状态的数据对被提供给生长中的培养物的进料量和体积进行监测和调整。当实施所公开的方法时，不必如此，因为所述方法将根据特定细胞培养物进行调整并且在公开的方法中关于指定细胞培养物的许多独特性质和需求的因素都被考虑到。

公开的方法还可以使相关蛋白质的生产得到加强。因为所述方法包括已针对特定细胞培养物优化的供料函数，所以所述培养物将在使得细胞培养物的健康和生产力达到最强并因此使细胞的蛋白质生产达到最强的条件下连续生长。因此，另一优点是所述方法通过使得指定细胞培养物的蛋白质生产达到最强所赋予的成本和资源节省。

在一个实施方案中，所述方法是如下实施：最初提供包含含有细胞和培养基的细胞培养物的容器。如所述，公开的方法可以任何所需规模实施，因此所提供的容器也可以具有任何规模并且应该是清洁和无菌的。举例来说，当在小规模下工作时，容器可以包括例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或50升生物反应器；当在较大规模下工作时，容器可以包括100、200、300、400、500、1000、1500或2000升生物反应器，或者当在工业规模下工作时，容器可以包括5000、7500、10,000或15,000升生物反应器。所述方法中所用的任何容器也可以包括一次性容器，如适于用作生物反应器的柔性塑料结构(例如无菌塑料袋)或刚性一次性塑料瓶或罐。

所提供的容器经过灭菌，装入适当培养基并且引入包含细胞的细胞培养物。细胞可以但是无需适于表达所关注的蛋白质；即，所述方法可以对任何细胞培养物(包括不适于表达特定所关注的蛋白质的细胞培养物)或者对针对除蛋白质生产之外的目的而测试或研究的培养物来实施。细胞可以包括哺乳动物细胞如CHO细胞，并且可以进行工程改造以表达所关注的蛋白质，不过也可以实施所述方法以便优化内源蛋白质的生产。在各种实施方案中，细胞可以是任何真核细胞，如任何哺乳动物细胞；在特定实例中，细胞是CHO、NS0、BHK21、PER.C6或HEK293细胞。细胞可以表达异源蛋白质，如含有Fc的分子，包括抗体或Fc融合蛋白。当表达抗体时，抗体可以来源于任何物种，包括小鼠和人，并且可以是人抗体或人源化抗体。

所引入的细胞培养物可以包含任何数量的细胞。在一些应用中，所述方法可以用于加强直接取自冷冻琼脂斜面的细胞的生长，而在其它应用中，细胞可以在引入容器中之前扩增至所需量。

用于细胞生长的培养基可以具有任何组成并且优选适于支持所提供的任何细胞培养物的生长。可以用于方法中的培养基的实例包括MEM、DMEM和补充有血清的F12或者化学成分完全明确的培养基，如MCDB302。关于可以采用的其它示例性培养基配方，参见例如Freshney，Culture of Animal Cells，第5版，Wiley-Liss(2005)。所述方法也可以用于使用蛋白胨和酵母提取物的复杂培养基。

继续本方法，接着确定细胞培养物的底物消耗速率(K₁)、生长速率(K₂₁)和生长速率(K₂₂)的优选值。为使用供料函数F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)，最初可以通过使用理论计算来确定参数K₁、K₂₁和K₂₂。即，这些值可以基于细胞的已知性质的外推来确定，所述性质如比生长速率、最大细胞密度对底物产率和比底物消耗速率。这些性质可以在对相关细胞系进行的预先培养物实验中确定或者可以通过对相关文献的回顾而知晓。这些值可以用作用于进一步凭经验展开这些参数以便优化性能的起始点。

在一些情况下，理论计算出来的K值将具有足够预测性并且可以直接并入供料函数中。在其它情况下，可能需要使用一种或多种测试培养物以及由其得到的有关生长时间、培养基组分、营养物需求、供料起始时间等的经验数据对理论计算的K值进行改进以便优化所计算的值。

为计算K₂₁和K₂₂的初始理论值，使用测试培养物确定出或从先前已知的生长速率中提炼出所关注的指定细胞培养物的比生长速率(μ)并且随生产时间的过程绘制成曲线。接着对该曲线进行线性回归拟合以建立线性方程μ=K₂₁t+K₂₂，其中K₂₁由斜率值表示并且K₂₂由线性拟合的y截距值表示。随后将所确定的K₂₁和K₂₂的值再带入供料函数F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)中，仅留下变量K₁和t待定。

K₁可以使用方程(4)进行理论计算：

$K_1=\frac{q_s}{(S_o-S_i)}{X}_i{V}_i---\left(4\right)$

在计算K₁时出现的参数q_s是比营养物消耗速率并且是基于方程由细胞培养物数据计算而来。假定q_s为恒定的，与在葡萄糖中情况一样。X_i和V_i分别是初始细胞密度和初始容器体积。S_o是要供给的底物(例如葡萄糖)的物料浓度。S_i是容器中的初始营养物浓度。在所有这些值可用的情况下，可以容易地计算出K₁并且再带入供料函数中。

在确定了K₁之后，供料函数F的所有三个参数K₁、K₂₁和K₂₂具有了已知值。供料速率在生产过程中将作为时间的函数而变化，但是供料函数考虑这些瞬时变化并且因此准确地在培养物恰恰需要营养物的时间提供培养物所需要的营养物。所述函数接着可以被输入到控制器模块中，所述控制器模块可以用于起始、控制和终止供料过程。

继续所述方法，接着提供适于将连续供料流供应至细胞培养物的装置，其中所述装置包括适于以流速F连续向培养物供料的控制器模块，其中F定义为K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)；t为起始将批式供料流添加至生物反应器的供料方案到供料结束的时间，并且K₁、K₂₁和K₂₂是如上所述确定的值。

如本文所述确定了K₁、K₂₁和K₂₂以后，接着提供适于将连续供料流供应至细胞培养物的装置，其中所述装置包括适于根据供料函数以流速F向培养物连续供料的控制器模块。这种装置可以包括用于以受控速率将液体供料流从储器转移至生物反应器的构件以及能够根据供料曲线起始和维持供料流从储器至生物反应器的流动的控制器模块。这种装置的实例可以包括Delta V控制器模块(Emerson，St Louis，MO)、控制器控制的泵(例如像可以从供应商Applikon Biotechnology，Foster City，CA；Cole-Parmer，Vernon Hills，IL；Watson-Marlow，Wihnington，MA；和SciLog，Middleton，WI购得的那些泵)。泵通过与细胞培养物相容的管线连接(例如像可从Cole-Parmer，Vernon Hills，IL获得的管线)；在一端是供料液体容器并且在另一端是生物反应器。

在一个特定实施方案中，三个K值和供料时间t被输进连续供料函数，所述供料函数被编程到控制器模块中，如Delta V控制器模块(Emerson，St Louis，MO)。控制器模块控制连接至供料容器的泵(例如Applikon生物反应器一体式泵；Applikon Biotechnology，Foster City，CA)以便将由供料函数F规定的量的供料连续递送至生物反应器。取决于培养物的特别需求，递送至生物反应器的供料流的体积和量将根据供料函数F随着速率变化而变化。控制器模块控制在任何指定时间点提供至培养物的进料的体积，如供料式F中所述。

任何用于促进供料递送的设备(例如泵和管线)都可以在使用供料式之前通过使用泵输出和实测流速进行校正以建立准确泵校正值。这个值可以由控制器使用以将由供料函数F描述的流速转换成由泵转移的体积的量度。如本文提供的实施例中所述，这个递送系统是用于2L生物反应器。对于更大的规模，如500L、2000L和15,000L，递送系统优选但不必采用质量流控制器或重量比例输入。这两者都是用于以大规模供料的可靠的既定设备。

在所述方法的后续步骤中，启动控制器模块来起始对细胞培养物的连续供料。当控制器模块上的程序起始时，供料在预定时间点开始，其中供料(即，营养物从储器流入容器)的速率在预定供料时间内受供料函数控制连续变化，持续由在供料函数中的参数t描述的时间长度。

控制器模块启动对培养物的连续供料的触发时间点或条件将取决于蛋白质生产方法的性质和目标。在一些情况下，以一个设定量向培养物提供初始营养物并且在来自初始进料的残余营养物达到某一最小目标水平时的一个后续时间点起始连续供料。在其它情况下，不向培养物提供初始营养物并且根据供料函数的要求在起始所述方法时提供营养物。

可以起始连续供料的触发条件的其它实例包括培养物达到指定活细胞密度(VCD)的点或者培养物达到指定残余副产物水平的点。一旦一个或多个这些触发条件建立(这可以通过在起始方法前使用测试培养物来确认)，那么就可以将观察到的触发条件转换为用于起始连续供料的时间基础。即，可以对测试培养物提供初始进料并且随着培养物生长而进行研究以确定在哪个时间点达到特定触发条件，并且可以将控制器模块设定为在那个时间点启动供料函数。

可以监测的残余营养物的一个具体实例是葡萄糖；初始葡萄糖水平下降至不再足够细胞生长所需的水平的时间点可以用作控制器模块起始连续供料的触发条件或时间点。

在另一实例中，可以使用活细胞密度作为触发条件。在一个特定实例中，活细胞密度目标是～5x10⁶个细胞/mL，这对应于细胞刚刚进入指数期的点。

在另一实例中，可以使用副产物累积水平作为触发条件。在一个具体实例中，副产物乳酸盐的累积水平大于～0.5g/L可以用作触发条件，这个条件当满足时起始连续供料以便通过防止过度供料来维持低乳酸盐。

优化供料函数

如本文所述，可以计算K₁、K₂₁和K₂₂的理论值以提供初始值，但在所公开方法的另一方面，可以任选地对计算值进行优化。为优化K₁、K₂₁和K₂₂值，可以应用“实验设计(DOE)”方法来估计三个K₁、K₂₁和K₂₂参数各自的指定范围。基于在供料函数中使用K₁、K₂₁和K₂₂的理论值的初始培养物中观察到的性能来确定范围。在优化过程中测试的范围也受所需供给的底物体积的总量(这可以如上文所述使用方程12来确定)影响。

在供料函数中出现的可以优化的第四个参数是总供料时间(t)。一旦供料函数中的t达到总运行时间，那么供料就应停止。总运行时间被用来平衡要供给到培养物中的总底物体积与培养物需要供料的持续时间。例如，如果需要持续较长的时间跨度但使用较少的总供料来对培养物进行供料，那么在供料函数中，可以增加t并且可以减少K₁。

在一个实施方案中，可以采用经验方法来计算K₁、K₂₁和K₂₂值。根据经验而不是根据理论来获得初始K₁、K₂₁和K₂₂值的一个优点在于经验方法可以得到更准确的值，这可以使得在采用所述方法时性能和蛋白质生产得到增强。

另一方面，为了更好地确定K₁、K₂₁和K₂₂，首先使用基于实际团式供料生产数据的数据来计算培养物的体积底物消耗速率(g/hr)。通过运行包含将在方法中使用的细胞的测试培养物并且使用标准细胞培养物营养物分析仪(例如Nova Profiler或如由YSI Instruments制造的分析仪，包括YSI7100、YSI1500、YSI5300、YSI2300和YSI2700型分析仪单元)监测底物消耗来确定体积底物消耗速率。接着将基于容器体积的已知性质和底物物料浓度确定的稀释因子应用于底物消耗速率以将其转换为递送培养物所需要的量的底物而需要的底物供料速率。接着针对生产时间的整个过程将计算的底物供料速率绘制成曲线。接着使用供料函数F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)来最佳拟合这个曲线。这个过程得到K₁、K₂₁和K₂₂的最佳拟合值。任选地，这些值接着可以用作使用DOE方法或简单单因子方法进一步优化性能的起始点。

其它优化方法

连续供料函数可以基于细胞培养系统内特定营养物的质量平衡推导出来。在这种方法中，将细胞生长模型整合到这种推导中来解答供料函数。在一个实例中，在这种推导中可以使用线性比生长速率模型。此举提供供料函数F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)。这个供料函数用于执行细胞培养物中营养物(例如葡萄糖、氨基酸等)的连续供料。在这个方程中，F是营养物流速，t是培养物经过的时间，K₁是描述底物消耗的参数，并且K₂₁和K₂₂都描述培养物的生长曲线。

然而，这并不是可以得到连续供料函数的仅有的方式。在另一种方法中，不使用如上所述的线性比生长速率模型，而是可以改为使用S形模型来描述培养物的比生长速率。S形比生长速率模型得到的供料函数将不同于使用线性比生长速率模型得到的供料函数。这个通过S形模型得到供料函数的性能将同以线性模型得到函数同样好，只要它的定义参数针对每一种细胞系进行了优化。

在另一个用于推导供料函数的实例中，不使用线性或S形方程形式来模拟比生长速率，而是可以改为模拟细胞生长曲线来得到匹配生长曲线的经验供料函数。取决于拟合优度，这种供料函数将是二次或更高次多项式。因此，供料函数可以使用线性或S形函数来优化以模拟比生长速率，或者可以基于与生长或营养物曲线的多项式拟合来推导全新的供料函数，并且要使用哪个函数的选择可以基于多种因素的考虑，包括用于开发用途的方程的简单性、对操纵供料曲线的自由度增强或者与实际细胞生长或营养物消耗曲线的直接拟合的准确度提高的需要。

用于含有多种营养物的供料的供料函数

一方面，以上本发明涉及包括单一营养物、包含营养物混合物的进料流(其中仅一种在供料函数中被提及)的供料函数。然而，公开的方法不限于单一营养物，并且可以应用于多个营养物流或者包含多种营养物的进料。公开的方法可以容易地修改以纳入适应两种或更多种营养物的供料函数，不过在使用混合底物供料实施连续供料时采用不同方法。

当采用包含多种营养物的供料流时，难以计算整个混合物的具体K₁、K₂₁和K₂₂值。一种描述单一供料流中多种营养物的方法是选择供料中的单一底物进行跟踪，以得到获得混合营养物供料流的初始K₁、K₂₁和K₂₂值所需要的数据。例如，当使用包含葡萄糖和其它营养物的供料流时，可以仅选择复杂供料流的葡萄糖组分来监测。可以使用由该流的葡萄糖组分的代谢所获得的数据(作为时间的函数的消耗速率)来得到K₁、K₂₁和K₂₂。一般来说，优选跟踪利用度高的或者对于细胞生长、活力和生产来说必需的底物。

接着针对整体供料混合物对初始K值进行优化。因为供料含有不同浓度的多种底物，所以对于达成最佳性能来说，经验测试是优选的。除针对多种底物优化供料函数外，还可以完善生长培养基以调整最佳拟合连续供料速率的营养物浓度。

实施例

仅出于说明的目的提供以下实施例(包括进行的实验和达成的结果)并且不欲解释为具有限制性。

材料和方法

细胞系

研究了各自编码不同的单克隆抗体的三种细胞系，细胞系1、细胞系2和细胞系3。细胞在解冻后按3-4日时程在摇瓶(Corning NY)中进行传代并且补充100μg/L IGF-1(SAFC Biosciences，Lenexa，KS)和500nM MTX(Bedford Laboratories，Beford，OH)。传代条件是36℃、5％CO₂和160rpm(对于125mL和500mL烧瓶)以及90rpm(对于3L烧瓶)，使用来自Thermo Electron Corporation，Waltham，MA的振动平台。

使用细胞系3细胞以0.75e⁶个细胞/mL接种N-1容器。对于细胞系1和首次细胞系2实验测试连续供料，以1.0e⁶个细胞/mL接种第N个生产容器。后续细胞系2和细胞系3实验接着以1.4e⁶个细胞/mL接种。不同细胞系的生产持续时间如结果和讨论章节中所述进行变化。

团式供料策略在细胞系之间不同。供料体积和供料天数在以下结果和讨论章节中详细描述。在第二天开始供给团式葡萄糖供料至6g/L。

分析技术

VCD和活力用CEDEX仪器(Innovatis，Germany)测量并且代谢物用NOVA BioProfile100+(NOVA Biomedical，MA)测量。pH和气体用Bioprofile pHox(NOVA Biomedical，MA)进行分析并且渗透压用渗压计(Advanced Instruments，Norwood，MA)进行分析。

效价通过逆相HPLC分析进行测量。该分析利用亲和色谱，其中将蛋白质A固定在管柱支撑物上。在中性pH下，使单克隆抗体(mAb)分子通过Fc区结合于蛋白质A，而宿主细胞蛋白质、条件培养基组分和缓冲液在穿流时从管柱中洗脱。捕捉的mAb在酸性pH下洗脱并且利用UV吸光度在280nh下检测。由通用mAb标准物和相应峰面积使用线性回归分析得出校正曲线。接着由校正曲线和通用mAb标准物与所测试mAb的消光系数的比率计算出测试样品中mAb的浓度。

结果和讨论

连续供料方法与团式供料方法的比较

使用细胞系1作为第一模型细胞系来测试连续供料函数F=K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)以及研究与使用团式供料的细胞培养物性能相比，细胞培养物性能如何。一个目的在于示范连续供料模型作为细胞培养物批式供料的有效替代的应用。能够使用供料函数来连续供给葡萄糖并且使浓度维持在规定范围内是另一目的和优于手动团式葡萄糖供料的改进。

利用细胞系1研究的团式方法是一个13天生产方法。每天添加至多6g/L团式葡萄糖。在第5、7和9天添加各138mL体积的团式供料，总共414mL供料。

为应用供料函数，需要确定K值。使用理论方法，可以通过方程(4)使用比葡萄糖消耗速率和供料开始时的初始葡萄糖、活细胞密度和培养物体积水平近似得到K₁值。可以通过将线性线拟合至细胞系的比生长速率时间过程来近似得到K₂₁和K₂₂值，其中K₂₁是斜率并且K₂₂是y截距。

尽管确定K₁、K₂₁和K₂₂的理论方法由于其容易并且简单而在最初是有利的，但是最终决定采用经验方法，它提供更精确的K值。使用经验方法，通过拟合供料函数F以匹配由团式供料操作得到的实际葡萄糖消耗体积数据，确定了K值。图1图示供料函数体积方程如何紧密拟合经验葡萄糖体积消耗数据曲线的一个实例。对于这个数据集来说，拟合优度得到的K值为K₁=0.04，K₂₁=-0.00015并且K₂₂=0.0348。因此使用这一组K值作为一个测试条件。类似地，也通过将供料函数体积方程拟合于其它团式供料操作的葡萄糖数据得到了不同组的K值。

选择最佳拟合葡萄糖消耗体积曲线的若干组K值用于评估。图2示出针对细胞系1测试的三个连续葡萄糖供料函数。各供料函数的K值在图例中描述。各供料函数得到不同的流速曲线和不同总添加葡萄糖体积。对它们进行经验测试以了解哪一个在整个生产过程中使葡萄糖浓度总是最好地维持在一定范围内。

还与上文所述的一个连续葡萄糖供料(K₁=0.0504，K₂₁=-0.00015，K₂₂=0.0331)组合测试了三个不同连续营养物混合物供料曲线。一个是恒定连续供料速率2.875mL/hr，从而针对细胞培养物性能评估线性体积递送曲线。另两个连续供料利用了具有指数性质的供料函数(图3)。通过使用图1中描述的另两个连续葡萄糖供料操作的相同K₂₁和K₂₂值并且再计算K₁以匹配在第5天至第9天的跨度内所需供给的414mL的总体积来简单地得到这两个连续供料操作的K常量。所测试的这些K常量仅用作评估供料函数中的K值的起始点。将这些连续供料操作与标准批式供料操作进行比较，如图3中所示。团式供料施用三次，每次138mL。所有四种供料策略设计成在生产结束时递送414mL的相同总体积。因此，细胞培养物性能的任何差异将仅归因于不同供料策略而不会归因于所供给的体积。类似地，存在使用两个连续供料流的操作，一个是葡萄糖并且另一个是营养物混合物。一个条件是与使用供料函数的连续葡萄糖供料配对的营养物混合物的恒定流速连续供料。另两个是与同以上所述的恒定流相同的连续葡萄糖供料配对的两个不同连续营养物混合物供料。第四个是标准团式葡萄糖和团式营养物混合物供料操作。

图4示出应用于细胞系2的连续供料模型的结果。图4a中的数据表明连续葡萄糖供料可以始终成功地将残余葡萄糖浓度维持在规定葡萄糖浓度范围内。由实心圆形(●)表示的操作是具有双重连续葡萄糖(K₁=0.0504、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0331)和供料(K₁=0.96678、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0288)的操作。这个操作的葡萄糖浓度维持在2-4g/L之间。由空心圆形(○)表示的团式葡萄糖显示由于每天手动供料供料至6g/L造成的典型实测的预期振荡型态。其它连续葡萄糖操作随时间积累较高葡萄糖或者结束于较低葡萄糖。图4a中所示的结果表明供料函数可以凭经验优化以在整个生产中达成所需要的一致葡萄糖水平。总而言之，观察到连续葡萄糖供料时培养物中的葡萄糖浓度以自动化方式维持在设定范围内，而团式葡萄糖产生振荡行为，而不是所需的稳定一致曲线。

图4b表明连续供料操作维持比团式供料操作低的渗透压。这可能是由于连续葡萄糖供料实际上被设计成对培养物供给细胞所需要的量，而不是团式供料每天简单地供给固定量。连续供料还可以通过使营养物水平更好地匹配细胞的吸收而降低渗透压；细胞的营养物代谢更有效并且不经历环境的剧烈变化，而在团式供料的情况下通常观察到这种剧烈变化。

图4c示出连续对供料的细胞的细胞活力与使用团式供料方法对供料的细胞相当。尽管细胞的活力在两种方法之间相当，但是图4d表明当应用连续供料与连续葡萄糖时，细胞密度(IVCD)显著提高。这种作用在使用两组不同连续供料K常量(K₁=0.96678、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0288)和(K₁=0.59499、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0348)与相同连续葡萄糖(K₁=0.0504、K₂₁=-0.00015、K₂₂=0.0331)的组合的两个操作实心三角形(▲)和实心圆形(●)中都观察到。由实心菱形(◆)表示的使用恒定供料速率和与另两个操作相同的连续葡萄糖的连续供料操作仅产生与团式供料操作(空心圆形(○))相同的IVCD。这个观测结果提示供料函数的指数曲线在用于改进细胞生长的营养物递送方面优于恒定供料和团式供料两者。这些操作(实心三角形(▲)和实心圆形(●))的效价在所有操作中也是最高的并且比对照团式供料操作(空心圆形(○))高约7％。有可能在进一步优化供料函数的K常数的情况下，连续供料的效价可以高于团式供料。应注意，这些操作的乳酸盐和铵曲线极其类似。

应用于细胞系2的连续供料方法

也使用连续供料函数测试了细胞系2。如同在细胞系1的研究中所进行，通过拟合供料函数以匹配由团式供料操作获得的实际葡萄糖消耗数据确定了连续葡萄糖供料的K值。还基于连续葡萄糖的K₂₁和K₂₂的变化推导出连续供料的K值并且使用设定时间内要递送的总体积重新计算出K₁。对照方法是16天。每天添加至多6g/L团式葡萄糖。在第5、7、9、11和13天添加各108mL的团式供料，总共540mL供料。换句话说，在双重连续供料操作中，连续葡萄糖供料K值保持相同并且仅有连续营养物混合物供料K值发生变化。

图5示出应用于细胞系2的连续供料方法的结果。所测试的连续葡萄糖的两个变化是(K₁=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)和(K₁=0.069、K₂₁=-0.000048、K₂₂=0.018)。(K_i=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)用于所有双重连续葡萄糖和供料操作。图5a表明经过经验展开，有可能使葡萄糖浓度始终维持在3-6g/L的特定范围内。达成这个范围的操作是使用连续葡萄糖(K₁=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)与连续供料(K₁=2.3821、K₂₁=-0.00006、K₂₂=0.0092)的实心方形(■)。

图5b表明连续葡萄糖和批式供料操作(空心菱形(◇))以及双重连续葡萄糖和连续供料操作(实心方形(■))的细胞密度(IVCD)显著高于团式供料对照操作(*)。

图5c显示不同连续供料函数可以使效价产生广泛变化，其中一些效价较低并且其它较高，即使供给相同量的540mL供料体积。显示效价比团式供料高的操作是连续葡萄糖供料(K₁=0.105、K₂₁=-0.000051、K₂₂=0.0155)与团式供料(空心菱形(◇))；这个操作的效价是6g/L，相比之下对照批式供料的效价是5.5g/L。细胞活力也发生改变，其中一些连续供料曲线匹配批式供料并且一些较低。这个数据显示具有不同连续供料K值的反应的范围并且说明用K值范围进行优化的潜力。

使用细胞系2在连续供料方法中测试较高体积

在另一实验中，将团式供料方法改为在4和5天84mL，并且在第7、9、11和13天108mL，总共供料600mL。这一改变相比于先前的条件增加一天额外供料和多供料60mL。进一步针对连续葡萄糖和连续供料方程基于图5中所示的数据对K值进行改进。将葡萄糖的K值改变为(K₁=0.215，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)，这将更好地拟合细胞系2的修订的葡萄糖消耗数据。在这个研究中，存在四个条件，如图6中所示。第一个条件(空心菱形(◇))是对照团式葡萄糖和供料。第二个条件(空心三角形(△))是使用连续葡萄糖(K₁=0.215、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)与团式供料的结合。第三个条件(实心三角形(▲))使用相同连续葡萄糖K值与连续供料(K₁=1.8744、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003)的结合。第四个条件(实心菱形(◆))使用相同连续葡萄糖K值与连续供料(K₁=2.0827、K₂₁=-0.000003、K₂₂=0.003))的结合。团式供料条件与第四个条件连续供料都递送相同量的600mL总供料。第三个条件连续供料设定为递送先前的总共540mL用于比较。尽管在第三个与第四个条件中存在容量差异，但是预期连续供料趋势曲线是相同的，因为两个函数都共享相同的K₂₁和K₂₂值。虽然K₂₁和K₂₂值保持相同，但是K₁值较高，这要求较高数量级的供料速率。在这种情况下，整个供料曲线相比于较低K₁供料曲线迁移到高处。所有操作都在第4天到第13天的相同时间段内递送供料。

在这个研究中，对于空心三角形(△)操作来说，连续葡萄糖的残余葡萄糖浓度被控制在3-5g/L的紧密范围内。双重连续葡萄糖和供料的残余葡萄糖的变化更大，但是仍可接受，因此它的变化仍小于团式葡萄糖供料(团式葡萄糖供料的范围为1-6g/L)。

图6a表明使用连续葡萄糖与连续供料的结合使效价得到提高。两个连续供料条件都达到约8.4g/L的效价，这是在任何细胞系2方法中所观察到最高效价。团式供料操作的效价趋势早在第11天就落后于连续供料操作。容量生产率在连续供料操作中也较高。

图6e表明连续供料操作的细胞活力高于团式供料操作。在这个研究中，对于细胞活力，600mL的较高连续供料体积优于540mL供料体积。对于细胞活力，它在生产结束时也比团式供料高9％。使用连续供料递送600mL供料时IVCD也观察到了相同种类的提高，如图6d中所示。在生产结束时，这种连续供料达到214x10⁶个细胞天/mL，相比之下，540mL连续供料为187x10⁶个细胞天/mL，并且团式供料对照为170x10⁶个细胞天/mL。这相当于最好的连续供料的IVCD比团式供料提高大约26％。

在关于连续供料体积的后续实验中，平行测试了连续供料与600mL对照团式供料的两个附加变化。第一个条件(空心圆形(○))利用了在第5天开始并且持续至第13天的连续供料(K₁=2.6503，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)。由于连续供料开始于先前的第4天之后的日子，所以总供料仍为600mL，即使K₁比先前连续供料的2.0827高。K₂₁和K₂₂值仍与先前的连续供料相同。这个条件测试稍后开始的连续供料，同时维持相同的总体积。在第二个条件中，测试连续供料(K₁=2.2910，K₂₁=-0.000003，K₂₂=0.003)，所述连续供料从第4天应用至第13天。这个开始和结束时间与对照团式供料相同。然而K₁由2.0827增加至2.2910，以便测试660mL的较高总体积。对于这两个连续供料条件，都与团式葡萄糖相结合。目的是理解没有连续葡萄糖的情况下仅仅连续供料的作用。

图7a和7b表明连续供料条件的效价和体积生产率都稍有提高。图7c表明在连续供料条件下，活力显著提高。这先前在图6的条件下观察到。图7d表明相比于在图5中所见的较大提高，在连续供料条件下IVCD仅稍有提高。

在细胞系3中测试连续供料方法

使用连续供料函数测试了细胞系3。对照团式供料方法在第4天供给84mL，在第6天供给108mL并且在第8天供给108mL，总共300mL。整个过程为12天。测试了一个连续供料条件与团式葡萄糖的结合。在没有任何展开的情况下，使用与先前使用细胞系2的研究相同的K₂₁(-0.000003)和K₂₂(0.003)。K₁计算为2.7233以便从第4天开始至第8天供给总共300mL。

细胞系3的数据显示相比于团式供料的4.2g/L，连续供料使效价提高至4.5g/L(图8a)。在连续供料的情况下，第8天至第12天的比生产率q_p也较高(图8b)。在细胞活力、IVCD、乳酸盐和铵曲线方面不存在显著差异。结果表明可以显著提高细胞系3的效价。

结论

细胞系1、2和3的研究表明可以成功替代团式供料应用于细胞培养物的有效新颖预编程非反馈连续供料模型。测试了三种不同的细胞系并且与团式供料相比，观察到各种益处。对于细胞系1，显示渗透压曲线较低并且IVCD较高。对于细胞系2，显示在连续供料的情况下，效价、体积生产率、细胞活力和IVCD都可以得到提高。关于细胞系3，显示在连续供料的情况下，效价和比生产率可以得到提高。

除了细胞培养物性能提高以外，还显示连续供料方法还可以用于使葡萄糖在生产过程中始终维持在合意范围内。这是合乎需要并且有益的，因为这消除了对手动团式供料的需要，并且因而消除了对人工干预和节约资源的需要。因为连续供料方法在操作之前预编程并且消除了操作人员的干预，所以该方法在良好展开的稳定K值的情况下在不同操作之间是一致的。成功的双重连续葡萄糖和供料操作的实例表明细胞培养物供料的完全自动化是有效的。

这些研究的结果表明，所公开的连续供料方法增强了细胞培养物生长和蛋白质生产的性能，并且所述方法可以替代常规的团式供料策略。

本文引用的各参考文献出于其所教导的所有方面和出于所有目的以引用的方式整体并入本文。

本发明的范围不受本文所述的具体实施方案限制，所述具体实施方案意欲作为本发明的个别方面的说明，并且功能上等同的方法和组分构成本发明的方面。实际上，除了本文所示和所述的以外，对本发明的各种修改对于本领域的技术人员来说根据前述描述和随附图式也是显而易见的。此类修改也意图落在所附权利要求书的范畴内。

Claims (14)

1. 一种不采用反馈控制的对哺乳动物细胞培养物连续供料的方法，所述方法包括：

(a)提供包括包含哺乳动物细胞和培养基的哺乳动物细胞培养物的容器；

(b)确定营养物的消耗速率(K₁)、所述细胞培养物的生长速率(K₂₁)和生长速率(K₂₂)的优选值；

(c)提供适于将连续供料流供给所述细胞培养物的装置，其中所述装置包括适于以流速F对所述培养物连续供料的控制器模块，其中

F定义为K₁exp(K₂₁t²+K₂₂t)；

t是从将所述供料流添加至生物反应器的时间到所述供料流停止时的时间的持续时间；并且

K₁、K₂₁和K₂₂是在(b)中确定的值；以及

(d)启动所述控制器模块以起始对所述细胞培养物的连续供料。

2. 如权利要求1所述的方法，其中K₁、K₂₁和K₂₂是凭经验确定的。

3. 如权利要求1所述的方法，其中K₁、K₂₁和K₂₂被建模。

4. 如权利要求1所述的方法，其中所述控制器模块包括计算机。

5. 如权利要求1所述的方法，其中所述供料流包含多种营养物。

6. 如权利要求1所述的方法，其中所述细胞培养物的渗透压在所述方法的整个过程中保持恒定。

7. 如权利要求1所述的方法，其中所述营养物是葡萄糖。

8. 如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物细胞培养物是CHO细胞培养物。

9. 如权利要求1所述的方法，其中响应于所述细胞培养物中的预先选定的乳酸盐水平启动所述控制器模块。

10. 如权利要求1所述的方法，其中响应于所述细胞培养物中的预先选定的葡萄糖水平启动所述控制器模块。

11. 如权利要求1所述的方法，其中响应于预先选定的氨基酸水平启动所述控制器模块。

12. 如权利要求11所述的方法，其中所述氨基酸是天冬酰胺。

13. 如权利要求11所述的方法，其中所述氨基酸是谷氨酰胺。

14. 如权利要求1所述的方法，其中所述供料流包含两种或更多种营养物。