ES2862576T3

ES2862576T3 - Alimentación continúa controlada sin retroalimentación pre-programada de cultivos celulares

Info

Publication number: ES2862576T3
Application number: ES12766802T
Authority: ES
Inventors: Henry Lin; Jeremy Bezaire
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2021-10-07
Anticipated expiration: 2032-09-14
Also published as: KR20140044396A; ZA201401655B; AU2012308335A1; CN103946366B; EA201490502A1; IL231032A0; WO2013040444A1; JP2020022492A; EP2756069B1; US20140295545A1; SG11201400656SA; CA2846905A1; MX356956B; EP2756069A1; JP2014526265A; TWI583788B; CN103946366A; MX2014003134A; JP2022058710A; TW201326387A

Abstract

Un método de alimentación continua de un cultivo de células de mamíferos que no emplea control de retroalimentación, que comprende: (a) proporcionar un recipiente que comprende un cultivo de células de mamíferos que comprende células de mamífero y medios; (b) determinar los valores preferidos para la tasa de consumo (K1) de un nutriente, tasa de crecimiento (K21) y tasa de crecimiento (K22) del cultivo celular; (c) proporcionar un aparato adaptado para impartir una corriente de alimentación continua al cultivo celular, en donde el aparato comprende un módulo controlador adaptado para alimentar continuamente el cultivo a una tasa de flujo F, en donde F se define como K1exp (K21t2 + K22t); t es la duración del tiempo desde el tiempo que la corriente de alimentación se agrega al bioreactor al tiempo que la corriente de alimentación se detiene; y K1, K21 y K22 son los valores determinados en (b); y (d) activar el módulo controlador para iniciar la alimentación continua del cultivo celular.

Description

DESCRIPCIÓN

Alimentación continúa controlada sin retroalimentación pre-programada de cultivos celulares

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se relaciona a métodos de alimentación de cultivos celulares que son continuos y proporcionan crecimiento celular mejorado y expresión de proteína, pero no se basan en el control de retroalimentación para adaptarse a las necesidades cambiantes del cultivo celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cultivo de células de mamíferos se usa ampliamente en las industrias farmacéuticas y de biotecnología para la fabricación de proteínas terapéuticas recombinantes. La necesidad de mejorar la producción del cultivo celular se ha incrementado tremendamente en la última década debido al mercado en crecimiento para terapéuticos de proteína y un esfuerzo en desarrollo para mejorar la eficiencia de producción y para reducir el costo de bienes fabricados. Las células de Ovario de hámster Chino (CHO) son comúnmente usadas para la producción de proteínas terapéuticas tal como anticuerpos monoclonales, antígenos y otras modalidades de proteína especializadas.

La producción de proteínas usando células de mamífero típicamente implica un proceso de lote alimentado, un proceso en el cual un suplemento de nutrientes se alimenta a la célula a través de la producción que respalda el crecimiento celular, metabolismo y síntesis de un producto de proteína deseado. El estándar de la industria actual para procesos de alimentación de lote alimentado de cultivo celular es la alimentación de bolo. En un proceso de alimentación de bolo, los nutrientes se proporcionan a la célula en adiciones discretas intermitentes en varios puntos de tiempo a través de la producción de cultivo celular. El proceso de alimentación de bolo es simple en su enfoque, en que se limita por la practicidad de operación de alimentación manual, que es una razón por la que comúnmente se emplea.

El documento DE102004007658 se refiere a un proceso para la producción de proteína recombinante en una línea de célula eucariota, en donde el cultivo de células huésped se realiza con alimentación continua de nutrientes, caracterizado por que la tasa de flujo de alimentación aumenta linealmente mientras dura la alimentación.

La alimentación de bolo tiene muchas desventajas, sin embargo, la desventaja más importante es la incapacidad para proporcionar las cantidades precisas de nutrientes que las células de hecho necesitan. Dicho de otra manera, la alimentación de bolo no se fabrica para las necesidades específicas del cultivo celular y consecuentemente algunos nutrientes pueden proporcionarse en cantidades más altas que las que requiere el cultivo celular, mientras que otros nutrientes pueden proporcionarse en niveles menores que aquellos que las células requieren. De este modo, aunque es simple en metodología, el enfoque de la alimentación de bolo puede llevar a la sobrealimentación, que consecuentemente lleva a metabolismo de sobreflujo que resulta en una acumulación de subproductos de desecho, tal como lactato, que no apoyan el crecimiento celular o biosíntesis y pueden de hecho inhibir el crecimiento de las células.

Otra desventaja de un proceso de alimentación de bolo en un escenario de fabricación es que los procesos de alimentación de bolo tienen fuentes inherentes de variabilidad que pueden causar diferencias en el desempeño de cultivo celular. Una tal fuente es la variabilidad en la sincronización del desempeño de la operación de alimentación en una alimentación diaria requerida. Aún otra fuente de variabilidad asociada con la alimentación de bolo es la tasa en la cual se administra una corriente de nutriente en el bioreactor. Por separado o juntas, las variaciones en el tiempo en el cual la alimentación se realiza y la tasa en la cual las células se alimentan pueden afectar las características y producción de un cultivo celular dado de corrida a corrida. Aún otra desventaja asociada con la alimentación de bolo es que es típicamente una operación manual que necesita ser realizada por un operador. La ausencia de automatización puede consumir recursos humanos y financieros y representa aún otra fuente de variabilidad, esto es, diferencias sutiles introducidas en un proceso de fabricación debido a la ausencia de consistencia entre operadores o, si el operador se mantiene igual, variación no controlable introducida por el operador.

Las desventajas de la alimentación de bolo pueden combatirse a través del uso de un proceso de alimentación continua. Los procesos de alimentación continua pueden diseñarse para cumplir mejor las necesidades celulares alimentando continuamente cantidades más pequeñas de nutrientes al cultivo con el tiempo, más que en adiciones grandes de bolo sencillo. Haciéndolo así, las concentraciones de nutriente pueden controlarse y mantenerse en niveles más óptimos para crecimiento celular, de este modo previniendo sobrealimentación, minimizando la generación de productos de desecho innecesarios y manteniendo niveles de estado pseudo-sólidos. El empleo de una operación de alimentación continua también puede eliminar la variabilidad en el sincronizado y la tasa de alimentación asociada con una operación de alimentación de bolo, ya que estas variables son de automatización controlada en un proceso de alimentación continua. La intervención del operador también es eliminada por el uso de un protocolo de alimentación continua.

Aunque otros han demostrado diferentes formas de este enfoque, tales enfoques aún introducen la posibilidad de error del operador. Por ejemplo, Hu and Europa (Patente de E.U.A. No. 6.156.570) demostró una estrategia de alimentación continua que mejoró la productividad. Sin embargo, esta estrategia de alimentación continua cultivos de células de mamíferos se basa en el control de retroalimentación del equipo, que puede introducir variabilidad en un proceso de alimentación.

En resumen, un inconveniente común para todos estos métodos es que todos ellos se basan en algún tipo de retroalimentación obtenida de instrumento para manejar el proceso. Por lo tanto, lo que se necesita es un método de alimentación de un cultivo celular que pueda fabricarse de acuerdo con las necesidades específicas de un cultivo celular dado, que pueda ser automatizado y no se base en retroalimentación mediada de instrumento para controlar los nutrientes entregados al cultivo celular.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Un método de alimentación continua de un cultivo de células de mamíferos que no emplea control de retroalimentación se proporciona. En una modalidad el método comprende (a) proporcionar un recipiente que comprende un cultivo de células de mamíferos que comprende células de mamífero y medios; (b) determinar los valores preferidos para la tasa de consumo (K¹) de un nutriente, tasa de crecimiento (K²¹) y tasa de crecimiento (K²²) del cultivo celular; (c) proporcionar un aparato adaptado para impartir una corriente de alimentación continua al cultivo celular, en donde el aparato comprende un módulo controlador adaptado para continuamente alimentar el cultivo a una tasa de flujo F, en donde F se define como K¹exp(K²¹t2 K²²t); t es la duración del tiempo del tiempo que la corriente de alimentación se agrega al bioreactor al tiempo cuando la corriente de alimentación se detiene; y K¹, K²¹y K²²son los valores determinados en (b); y (d) activar el módulo controlador para iniciar la alimentación continua del cultivo celular. En una modalidad K¹, K²¹y K²²son empíricamente determinados. En otra modalidad K¹, K²¹y K²²se modelan. En una modalidad adicional el módulo controlador comprende una computadora. Aún en otra modalidad la corriente de alimentación comprende múltiples nutrientes. En una modalidad adicional la osmolalidad del cultivo celular se mantiene constante durante todo el método. En otra modalidad el alimento de nutriente al cultivo es glucosa. En otras modalidades el cultivo de células de mamíferos es un cultivo celular CHO. En una modalidad adicional el módulo controlador se activa en respuesta al nivel de lactato preseleccionado en el cultivo celular, mientras en otra modalidad el módulo controlador se activa en respuesta a un nivel de glucosa preseleccionado en el cultivo celular. Aún en otra modalidad el módulo controlador se activa en respuesta a un nivel preseleccionado de un aminoácido, tal como asparaginas o glutamina. En aún otra modalidad la corriente comprende dos o más nutrientes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 es un gráfico que muestra la firmeza de ajuste de una función de alimentación comparada con los requisitos de nutriente de cultivo celular de la Línea Celular 1.

La Figura 2 es un gráfico que representa las tendencias de tasa de flujo de alimentación y acumulación de volumen probadas para la Línea Celular 1; las formas abiertas son tasas de flujo de glucosa y se muestran a la izquierda del eje Y y las formas sólidas son alimento de volumen de glucosa acumulado y mostrado a la derecha del eje Y; los triángulos abiertos (A) y triángulos sólidos (▲) son la tasa continua de flujo de glucosa y acumulación de volumen, respectivamente, para K¹= 0.0504, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0331, mientras que los diamantes abiertos (◊) y diamantes sólidos (♦) son el volumen y tasa de flujo de glucosa continuos, respectivamente, para K¹= 0.04, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0348, y cuadros abiertos (□) y cuadros sólidos (■) son el volumen y tasa de flujo de glucosa continuos, respectivamente, para K¹= 0.062, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0288.

La Figura 3 es un gráfico que representa las tendencias de tasa de flujo de alimentación y acumulación de volumen probadas para la Línea Celular 1; las formas abiertas son tasas de flujo de alimentación y se muestran en el lado izquierdo del eje Y, y las formas sólidas son alimento de volumen de alimentación acumulado y mostrado a la derecha del eje Y; diamantes abiertos (◊) y diamantes sólidos (♦) representan la tasa y el volumen de flujo de alimentación continua, respectivamente, para K¹= 0.59499, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0348, mientras que los triángulos abiertos (A) y triángulos sólidos (▲) representan la tasa y el volumen de flujo de alimentación continua, respectivamente, para K¹= 0.96678, K²¹= ~0.00015, K²²= 0.0288, los círculos abiertos (o) y los círculos sólidos (•) representan la tasa de flujo de alimentación constante de 2.875 ml/hr y su volumen acumulado, respectivamente, y los cuadros sólidos (■) representan la tendencia de volumen acumulado de la alimentación de bolo de control.

Las Figuras 4a-4d son una serie de gráficos relacionados a experimentos que implican Línea Celular 1, y más particularmente la Figura 4a es un gráfico que muestra glucosa residual, la Figura 4b es un gráfico que muestra osmolalidad, la Figura 4c es un gráfico que muestra la viabilidad celular, y la Figura 4d es un gráfico que muestra densidad integrada de célula viable; los círculos abiertos (o) representan alimentación y glucosa de bolo con control, los cuadros abiertos (□) representan glucosa continua (K¹= 0.04, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0348) con alimentación de bolo, las estrellas (*) representan glucosa continua (Ki = 0.062, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0288) con alimentación de bolo, los triángulos sólidos (▲) representan glucosa continua (K¹= 0.0504, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0331) con alimentación continua (K¹= 0.59499, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0348), los diamantes sólidos(^) representan glucosa continua (K¹= 0.0504, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0331) con alimentación continua (2.875 ml/hr), y los círculos sólidos (•) representan glucosa continua (K¹= 0.0504, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0331) con alimentación continua (K¹= 0.96678, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0288).

Las Figuras 5a-5c son una serie de gráficos relacionados a experimentos que implican la Línea Celular 2, y más particularmente la Figura 5a es un gráfico que muestra glucosa residual la Figura 5b es un gráfico que muestra densidad integrada de célula viable, la Figura 5c es un gráfico que muestra concentración; las estrellas (*) representan control con glucosa y alimentación de bolo, los diamantes abiertos (◊) representan glucosa continua (K¹= 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) con alimentación de bolo, los triángulos abiertos (A) representan glucosa continua (K¹= 0.069, K²¹= -0.000048, K²²= 0.018) con alimentación de bolo, los triángulos sólidos (▲) representan glucosa continua (K¹= 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) con alimentación continua (K¹= 1.1320, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155), los diamantes sólidos (♦) representan glucosa continua (K¹= 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) con alimentación continua (K¹= 0.8965, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155), los círculos sólidos (•) son glucosa continua (K¹= 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) con alimentación continua (K¹= 1.9056, K²¹= -0.00006, K²²= 0.0092), y los cuadrados sólidos (■) son glucosa continua (K¹= 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) con alimentación continua (K¹= 2.3921, K²¹= -0.00006, K²²= 0.0092).

Las Figuras 6a-6d son una serie de gráficos relacionados a experimentos que implican la Línea Celular 2, y más particularmente la Figura 6a es un gráfico que muestra concentración, la Figura 6b es un gráfico que muestra productividad volumétrica, la Figura 6c es un gráfico que muestra viabilidad, y la Figura 6d es un gráfico que muestra densidad integrada de célula viable; los diamantes abiertos (◊) representan control con glucosa y alimento de bolo (600 mL alimentación total), los triángulos abiertos (A) representan glucosa continua (K¹= 0.215, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) con alimentación de bolo (600 mL alimentación total), los triángulos sólidos (▲) representan glucosa continua (K¹= 0.215, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) con alimentación continua (K¹= 1.8744, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) (540 mL alimentación total), y los diamantes sólidos (♦) representan glucosa continua (K¹= 0.215, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) con alimentación continua (K¹= 2.0827, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) (600 mL alimentación total).

Las Figuras 7a-7d son una serie de gráficos relacionados a experimentos implicando la Línea Celular 2, y más particularmente la Figura 7a es un gráfico que muestra concentración, la Figura 7b es un gráfico que muestra productividad volumétrica, la Figura 7c es un gráfico que muestra viabilidad, y la Figura 7d es un gráfico que muestra densidad integrada de célula viable; los triángulos abiertos (A) representan control con glucosa y alimentación de bolo (600 mL alimentación total), los círculos abiertos (o) representan glucosa de bolo con alimentación continua (K¹= 2.6503, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) (600 mL alimentación total), y el cuadro abierto (□) representan glucosa de bolo con alimentación continua (K¹= 2.2910, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) (660 mL alimentación total).

Las Figuras 8a-8b son una serie de gráficos relacionados a experimentos que implican Línea Celular 3, y más particularmente la Figura 8a es un gráfico que muestra concentración, y la Figura 8b es un gráfico que muestra productividad específica; los triángulos abiertos (A) representan control con glucosa y alimentación de bolo, y los diamantes abiertos (◊) representan glucosa de bolo con alimentación continua (K¹= 2.7233, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) del día 4 al día 8 por un total de 300 mL el mismo volumen como la alimentación de control.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A menos que se defina de otro modo en la presente, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente solicitud tendrán los significados que son comúnmente entendidos por aquellas personas expertas en la técnica. Además, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular.

Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y técnicas de, cultivo y tejido celular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y proteína y química de ácido nucleico e hibridación descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente solicitud son generalmente realizados de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten en toda la presente solicitud a menos que se especifique de otro modo. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) y ediciones subsecuentes, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988). Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo a las especificaciones del fabricante, como comúnmente se logra en la técnica o como se describe en la presente. La terminología usada en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química farmacéutica y medicinal descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar pueden usarse para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, y entrega, y tratamiento de pacientes.

Debe de entenderse que la descripción actual no se limita a la metodología particular, protocolos, y reactivos, etc., descritos en la presente y como tal pueden variar. La terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares únicamente, y no se pretende límite el enfoque de la presente descripción.

Aparte de los ejemplos operativos, o donde se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de ingredientes o condiciones de reacción usadas en la presente deben de entenderse ya que se modifican en todos los ejemplos por el término “alrededor de”. El término “alrededor de” cuando se usa en conexión con los porcentajes puede referirse a ±5%, por ejemplo, 1%, 2%, 3%, o 4%.

Para cumplir la necesidad de un método de alimentación continua que no se base en retroalimentación de instrumento para controlar el proceso, se proporciona tal método de alimentación. En un aspecto, el método descrito se basa en un modelo de crecimiento celular y consumo de sustrato de un cultivo celular. El método descrito proporciona una función de tasa de alimentación con tres parámetros representando la tasa específica de consumo de sustrato tasa específica de crecimiento; todos los tres parámetros pueden optimizarse para un cultivo dado, y pueden optimizarse para todas las líneas celulares CHO. La función optimizada se usa en el algoritmo de alimentación continua para la alimentación de control de cultivo celular control para ajustar a un perfil deseado. Tal estrategia de alimentación puede ser pre-programada y controlada sin retroalimentación durante un proceso entero de producción de proteína. De este modo, no se necesitan entradas de instrumentos u otras formas de mediciones para controlar o ajustar la alimentación. Puede aplicarse a todos los tipos de alimentos de nutrientes, tal como alimentaciones de glucosa y alimentaciones de mezcla. Como se demuestra en la presente, el método descrito de alimentación continua puede mejorar la viabilidad celular, densidad celular, y productividad de un cultivo celular dado. La función de la tasa de alimentación también se puede ajustar para alcanzar alimentación de carbono limitada y de este modo reducir el residuo de subproducto, tal como lactato y amonio. El método descrito de alimentación continua es superior a la alimentación de bolo en numerosas maneras, incluyendo desempeño mejorado de cultivo celular, mejor consistencia de corrida, la eliminación de variabilidad de operación de alimentación y la eliminación de la necesidad de operación de alimentación manual. Esta estrategia de alimentación continua es una alternativa mejorada y viable para la alimentación de bolo convencional, y reduce o elimina las variabilidades asociadas con los enfoques convencionales de alimentación de bolo comúnmente empleados.

En un aspecto, la presente descripción proporciona métodos de alimentación continua de un cultivo celular, tal como un cultivo que expresa una molécula deseada. En una modalidad, el método proporciona una función de alimentación, que rige la tasa y volumen de nutrientes proporcionados a un cultivo celular de crecimiento. La función de alimentación puede derivarse como se muestra en la presente; las variables individuales que aparecen en la función de alimentación pueden todas medirse para un cultivo dado.

Ampliamente, el desarrollo de una función de alimentación para un cultivo dado incorpora tres parámetros que describen el consumo de nutriente y parámetros de crecimiento, (K¹, K²¹, y K²²), que se determinan para acoplar y satisfacer los requisitos de crecimiento y características de consumo de sustrato de un cultivo celular dado. Otra variable en la función de alimentación es la duración de la alimentación, (t), que dicta la cantidad total de volumen para ser alimentado y puede también determinarse para acoplar y satisfacer los requisitos de crecimiento y características de consumo de sustrato del cultivo celular. Por la determinación de estos parámetros, incorporándolos en una función de alimentación, y asociando la función de alimentación con hardware apropiado, se alcanzan los métodos de alimentación continua completamente autónomos, que mejoran el desempeño sobre la alimentación de bolo.

Los métodos descritos pueden aplicarse a la fabricación de cualquier molécula basada en proteína, tal como una proteína de cualquier longitud, (porejemplo, una proteína terapéutica), un anticuerpo, un pepticuerpo, un hemicuerpo, una molécula que comprende uno o más aminoácidos codificados o que aparecen de manera natural (tal como un anticuerpo o una proteína terapéutica), un péptido, una proteína de fusión Fc, un SCFv, un anticuerpo de cadena sencilla, etc.

Los métodos descritos pueden también emplearse en cualquier escala deseada, desde la escala de banco (por ejemplo, ~1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 50 cultivos de litro) a pequeña escala de fabricación (por ejemplo, ~100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 o 2000 cultivos de litro). En una forma particularmente deseable, los métodos descritos pueden aplicarse en una escala industrial (porejemplo, ~5000, 7500, 10000 o 15,000 litros). Las ventajas de los métodos descritos, incluyendo ahorros de costo, serán mayormente pronunciadas en la escala industrial, pero son aparentes a pesar de la escala de la producción a la cual los métodos se aplican.

Cualquiera de los medios que apoya el crecimiento celular puede emplearse en los cultivos celulares y los métodos de la invención descrita. En una modalidad, los medios pueden comprender suero, mientras en otra modalidad los medios pueden estar libres de suero. En varias modalidades los medios pueden suplementarse con uno o más aminoácidos. En una modalidad los medios son unos medios químicamente definidos.

Definiciones

La siguiente convención, como se usa en la presente “un” y “uno” se refiere a “uno o más” a menos que específicamente se indique de otro modo.

Los términos “polipéptido” o “proteína” se usan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero que comprende residuos de aminoácido. Los términos también aplican para polímeros de aminoácido en los que uno o más residuos de aminoácido es un análogo o mimético de un aminoácido correspondiente que aparece de manera natural, así como también para polímeros de aminoácido que aparecen de manera natural. Los términos también pueden abarcar polímeros de aminoácido que han sido modificados, por ejemplo, por la adición de residuos de carbohidrato para formar glicoproteínas, o fosforilado. Los polipéptidos y proteínas pueden producirse por una célula recombinante que aparece de manera natural y no recombinante, o polipéptidos y proteínas que pueden producirse por una célula genéticamente ingenierizada o recombinante. Los polipéptidos y proteínas pueden comprender moléculas que tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa, o moléculas que tienen eliminaciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa, incluyendo sustitución con aminoácidos que no aparecen de manera natural.

Derivación de una función de alimentación

Un componente de los métodos de alimentación continúa controlado sin retroalimentación proporcionados es una función de alimentación que se fabrica para las propiedades y requisitos de crecimiento únicos de un cultivo de células de mamíferos (porejemplo, un cultivo celular ^{C h O ,}NS0, BHK21, PER.C6 o HEK 293) de interés, por ejemplo, un cultivo que se hace crecer por ejemplo para el propósito de expresión de una proteína de interés. La función de alimentación incorpora el perfil(es) de requisito de nutriente del cultivo en el objetivo para promover el crecimiento, biosíntesis y reducir la formación de subproducto. En un aspecto, la función de alimentación puede considerarse para ser una expresión del requisito(s) nutricional óptimo del cultivo en cualquier punto en el tiempo sobre el transcurso de un perfil de crecimiento de cultivo celular. Teniendo una expresión del requisito(s) de nutrición de un cultivo como una función de tiempo (esto es, una función de alimentación) la necesidad de cualquier control de retroalimentación se elimina, ya que los datos que tales instrumentos proporcionarían ya son conocidos e incorporados en la función de alimentación. La función de alimentación también permite la operación completamente automatizada de un crecimiento de cultivo celular; una vez que la fórmula de alimentación se posiciona para controlar la corriente(s) de nutriente en un bioreactor que contiene el cultivo celular y una señal de iniciación se proporciona, el proceso entero de crecimiento celular es controlado por la función de alimentación y no se requiere intervención adicional.

La función de alimentación toma en cuenta múltiples variables, incluyendo la tasa de flujo de entrada del sustrato (F), la concentración de nutriente inicial en el bioreactor (Si), la concentración madre de nutriente (So), la densidad celular máxima para producción de nutriente

la tasa de crecimiento específica (p), la densidad celular (X), y el volumen del bioreactor (V). Todas estas variables pueden ser fácilmente determinadas midiendo y calculando cada parámetro para un cultivo particular. La tasa de flujo de entrada del sustrato (F) es la tasa de alimentación en la cual el sustrato está siendo administrado al bioreactor. La concentración inicial de nutriente de bioreactor (Si) es la concentración del sustrato en el tiempo en el que la alimentación continua va a iniciarse. Esto puede medirse con una muestra de medios usando un analizador de nutriente fuera de línea. La concentración madre de nutriente (So) es la concentración del sustrato en el depósito líquido de la que la alimentación Y m

continua se está administrando. La densidad celular máxima para la producción de nutriente ( Lx/ ) es el punto pico de la densidad celular total dividida por el sustrato total consumado en ese punto. La densidad celular (X) es la densidad celular viable en el cultivo medida por un contorno celular. La tasa de crecimiento específica (p) se describe como la tasa de crecimiento celular en un punto de tiempo dado dividida por la densidad celular viable en ese punto de tiempo. La p puede calcularse usando la relación:

In C * 2 )

X ! ,

m = ( t ²— t-i )

donde X²y Xi son las densidades final e inicial viables, respectivamente, y t²y ti son los tiempos final e inicial, respectivamente. El volumen del biorectator (V) consiste del volumen de cultivo total en cualquier tiempo dado en el bioreactor. En una modalidad la función de alimentación toma la forma de F = Kiexp(K²it2+K²²t) y se deriva como se muestra a continuación.

El balance de masa de un nutriente dado en el bioreactor es descrito por la Ecuación (1), donde F es la tasa de flujo de entrada del nutriente, Si es la concentración de nutriente inicial en el bioreactor, So es la concentración madre de nutriente, Y m

Lx/ es la densidad celular máxima para la producción de nutriente, p es la tasa de crecimiento específica, X es la densidad

celular, V es el volumen del bioreactor.

dS = mxv f (So - Sn

dt ~ Y™ + V

/s (1)

La suposición de la concentración de nutriente de estado sólido en combinación con alimentación continua, la ecuación se reduce a la Ecuación (2),

F = — ^ — X M e 0

( So - S i )

(2)

donde el consumo de nutriente específico

y crecimiento celular es descrito por XV = XiVieut. Xi y Vi son la densidad celular inicial y volumen de bioreactor, respectivamente, al comienzo de la alimentación. La ecuación (2) se simplifica a la Ecuación (3) a continuación,

F = K 1eKlt ₍₃₎

donde

K 2 = m (5)

La ecuación (3) no es aplicable para el crecimiento de cultivo celular más allá de la fase exponencial, sin embargo, ya que las células ingresarán a fase estacionaria y luego rápidamente en la fase de muerte. Por lo tanto, se requiere una función para disminuir la alimentación una vez que las células están en fase muerta. En experimentos realizados en el desarrollo del método descrito se observó que cuando la tasa de crecimiento específica (p) se traza sobre el lapso de una producción entera de la tasa de crecimiento específica p disminuye sobre el tiempo para las células CHO. Esto se encontró es consistente para cada una de las líneas celulares múltiples estudiadas. El ajuste de una tendencia lineal a la p contra tiempo muestra buen ajuste, y así la p puede ser representada por la ecuación lineal

K 2 = K 21t K 22 (6)

donde K²¹siempre es negativo, K²²es siempre positivo, y IK²²I >> IK²¹1. Sustituir la ecuación (6) en Ecuación (3) genera la función de alimentación

F = Kiexp(K²it2+K²²t) (7)

La ecuación (7) forma la base para todos los experimentos y diseño de alimentación continua. La ecuación (7) da curvatura al perfil de alimentación de manera que la tendencia no sólo levanta exponencialmente. Ya que el término K²¹es siempre negativo, con incremento de tiempo el término K²¹t2+K²²t entero puede volverse negativo y la tendencia de alimentación entonces disminuirá. K¹amplifica la magnitud de la tendencia de alimentación entera a medida que el valor se mueve más grande.

Con respecto a K¹, en la Ecuación (4), q8 se asume es un valor constante sobre la producción entera, q8 es la tasa específica de consumo de sustrato tal como para glucosa. Se calcula dividiendo la tasa de crecimiento (p) por la densidad

celular máxima para la producción de sustrato ( ) . Estos términos se describen anteriormente. La constante q8 se estudió con respecto a la glucosa para líneas celulares múltiples y se observó que la suposición de que q8 permanece constante prueba es generalmente real después de que las células han alcanzado densidad celular pico, por ejemplo, después del día 7. Así, la suposición de que q8 permanece constante simplifica la función de alimentación, y dado a eso ya hay tres variables K para optimización, esta suposición no impacta en gran medida la función de alimentación.

Aunque la suposición de que q8 permanece constante es sólida y simplifica la derivación de la función de alimentación, esta suposición también remueve una variable que en algunos casos puede facilitar una función de alimentación más exacta. Por consiguiente, es concebible que un ajuste más exacto para q8 pudiera generarse. El valor más exactamente ajustado de q8 podría entonces ser sustituido por K¹en la Ecuación (7) para derivar una función con incluso más grados de libertad. Agregando estos grados de libertad adicionales, puede ser posible alcanzar una resolución incluso más alta de la función de alimentación. Tales funciones de alimentación más exactamente ajustadas forman un aspecto de los métodos descritos.

Derivación de una ecuación de volumen

Como se muestra en la presente, una función de alimentación adaptada a las necesidades únicas de un cultivo celular dado se proporciona. La función de alimentación describe las necesidades de nutrientes del cultivo celular pero no proporciona explícitamente, sin embargo, un término que describa el volumen total de una reserva concentrada de nutriente que se agregará a un cultivo dado. Esta cantidad puede derivarse de la propia función de alimentación como sigue.

La habilidad para calcular el volumen total de una reserva concentrada de nutriente alimentada desde la función de alimentación es una consideración para el uso de los métodos descritos en una aplicación de desarrollo de proceso. El conocimiento del volumen líquido de una solución que comprende un nutriente particular, por ejemplo, un nutriente descrito por la función de alimentación que será alimento para un cultivo celular, facilita el diseño de un volumen de alimentación deseado, la habilidad para generar valores K del ajuste de datos de volumen, y la habilidad para rastrear el uso de volumen en el controlador. Por lo tanto, el cálculo del alimento de volumen por la función de alimentación es un parámetro valioso para la aplicación de alimentación continua. La ecuación de volumen se deriva integrando la función de alimentación como se muestra en la Ecuación (8).

donde

d V

F =

d t (9)

La serie de Maclaurin se usa para aproximar el término exponencial en la integral para generar una ecuación de volumen usando los primeros cinco términos integrados de la serie para exactitud.

4

X X "

e Zn=0 ^n! (10)

donde

X K 21t + K 22t ₍₁₁₎

La ecuación de volumen final se muestra en la Ecuación (12), y todos los cinco términos de la serie se usan.

y = K1(t K22 1 2 2K21 K22 1 3 6K 21K 22 K 22 1 4 ...)

1 2 6 24 ₍₁₂₎

Método autónomo de alimentación continua

En muchos procesos de producción de proteína se requiere un operador para monitorear los instrumentos de retroalimentación asociados con un bioreactor, que adquieren datos acerca del ambiente local, salud, densidad celular y producción de proteína de un cultivo celular dado. Estos datos se alimentan de vuelta a un operador, que entonces ajusta las condiciones de crecimiento en respuesta a los datos para mantener un conjunto preferido de condiciones en el bioreactor.

Una ventaja de los métodos descritos es la habilidad para correr el método en una tendencia completamente autónoma, así eliminando la necesidad de un operador dedicado y para instrumentos dedicados para adquirir datos acerca del cultivo celular. Esto puede traducirse en eficiencia mejorada, ahorros en el costo en términos de recursos humano y material, y la habilidad para minimizar oportunidades para desviación del operador o error y la eliminación completa de problemas de producción asociados con la falla de un instrumento de retroalimentación (porejemplo, HPLC para aminoácidos, vitaminas y fuentes de carbono; glucosa y analizadores de lactato (Nova Profiler e YSI Instruments); contornos celulares (Cedex y Vi-Cell); sondas in situ de bioreactor (por ejemplo, pH, oxígeno disuelto, turbidez, capacidad, y sondas NIR), osmómetros y otros instrumentos.

Frecuentemente el crecimiento de cultivo celular se trata como un ejercicio empírico de evolución, con un operador continuamente monitoreando y haciendo ajustes a la materia prima y volúmenes siendo proporcionados al cultivo de crecimiento en respuesta a los datos obtenidos acerca del status del cultivo de los instrumentos de retroalimentación. Esto es innecesario cuando se practican los métodos descritos, ya que el método se fabricará para el cultivo celular particular y cuenta para muchas propiedades únicas y requisitos de un cultivo celular dado todos se cuentan en el método descrito.

El método descrito puede también proporcionar producción mejorada de una proteína de interés. Ya que el método comprende una función de alimentación que ha sido optimizada para un cultivo celular particular, el cultivo crece continuamente bajo condiciones que maximizan la salud y productividad del cultivo celular y consecuentemente la producción de proteína de las células. Así, otra ventaja es el ahorro de recursos y costo que le método imparte proporcionando producción máxima de proteína para un cultivo celular dado.

En una modalidad el método se realiza como sigue: Inicialmente se proporciona un recipiente que comprende un cultivo celular que comprende células y medios. Como se observa, los métodos descritos pueden realizarse en cualquier escala deseada, así que el recipiente proporcionado puede así también ser de cualquier escala y debe de estar limpio y estéril. Por ejemplo, cuando se trabaja en una escala pequeña un recipiente puede comprender por ejemplo, un bioreactor 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o 50 litros; cuando se trabaja en una escala grande el recipiente puede comprender un bioreactor 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1500 o 2000 litros o cuando se trabaja en una escala industrial el recipiente puede comprender un bioreactor 5000, 7500, 10,000 o 15,000 litros. Cualquier recipiente empleado en el método puede también comprender un recipiente desechable, tal como una estructura de plástico flexible adaptada para servir como un bioreactor (porejemplo, una bolsa de plástico estéril), o un matraz o tanque de plástico desechable líquido.

El recipiente proporcionado está esterilizado, cargado con un medio apropiado y un cultivo celular que comprende células se introduce. Las células pueden, pero no necesitan adaptarse para expresar una proteína de interés; que es, el método que puede realizarse en cualquier cultivo celular, incluyendo un cultivo celular no adaptado para expresar una proteína de interés particular, o en cultivos siendo probados o estudiados para un propósito que no es la producción de proteína. Las células pueden comprender células de mamífero, tal como células CHO, y pueden prepararse por ingeniería para expresar una proteína de interés, aunque el método puede realizarse para optimizar la producción de una proteína endógena también. En varias modalidades las células pueden ser cualquiera de las células, tal como cualquiera de las células de mamífero; en particular los ejemplos de las células son CHO, NS0, BHK21, PER.C6 o células HEK 293. Las células pueden expresar una proteína heteróloga, tal como una molécula que contiene Fc, incluyendo un anticuerpo o una proteína de fusión Fc. Cundo un anticuerpo se expresa, el anticuerpo puede derivarse de cualquier especie, incluyendo ratón y humano, y puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.

El cultivo celular introducido puede comprender cualquier número de células. En algunas aplicaciones el método puede emplearse para mejorar el crecimiento de células tomadas directamente de un sesgo congelado, mientras en otra aplicación las células pueden expandirse a una cantidad deseada antes de ser introducidas en el recipiente.

Los medios en los cuales las células crecen pueden ser de cualquier composición y preferiblemente se adaptan para apoyar el crecimiento de cualquier cultivo celular que se proporciona. Los ejemplos de los medios que pueden emplearse en el método que incluyen MEM, DMEM, y F12 suplementados con suero o medio completamente químicamente definido tal como MCDB 302. Ver, por ejemplo, Freshney, Culture of Animal Cells, 5a Edición, Wiley-Liss (2005) para las recetas de medios de ejemplares adicionales que pueden empelarse. El método también puede aplicarse a un medio complejo que usa peptonas y extracto de levadura.

Al continuar con el método, los valores preferidos para la tasa de consumo de sustrato del cultivo celular (K¹), tasa de crecimiento (K²¹) y tasa de crecimiento (K²²) entonces se determinan. Para usar la función de alimentación F = K¹exp(K²¹t2+K²²t), los parámetros K¹, K²¹y K²²pueden inicialmente ser determinados usando un cálculo teórico. Esto es, estos valores pueden determinarse basándose en la extrapolación de propiedades conocidas de las células, tal como la tasa de crecimiento específica, densidad máxima de célula a la producción de sustrato, y la tasa específica de consumo de sustrato. Estas propiedades pueden determinarse en experimentos previos de cultivo celular conducidos en la línea celular de interés o conocidos de una revisión de bibliografía relevante. Estos valores pueden servir como un punto de partida para desarrollo empírico adicional de estos parámetros para optimizar el desempeño.

En algunos casos los valores K teóricamente calculados serán satisfactoriamente predictivos y pueden incorporarse directamente en la función de alimentación. En otros casos puede ser deseable refinar los valores K teóricamente calculados usando una o más pruebas de cultivo y los datos empíricos respecto a los tiempos de crecimiento, componentes de medios, requisitos de nutrientes, tiempos de iniciación de alimentación, etc. derivados de los mismos para optimizar los valores calculados.

Para calcular los valores teóricos iniciales para K²¹y K²², la tasa de crecimiento específica (p) de un cultivo celular dado de interés se determina usando un cultivo de prueba o extraído de tasas de crecimiento previamente conocidas y se traza sobre el curso del tiempo de producción. Un ajuste de regresión lineal del trazo entonces se realiza para generar la ecuación lineal p = K²⁴+K²², en donde K²¹es representado por el valor de la pendiente y K²²se representa por el valor de intercepción y del ajuste lineal. Los valores determinados para K²¹y K²²entonces se sustituyen de vuelta a la función de alimentación F = K¹exp(K²¹t2+K²²t), dejando únicamente las variables K¹y t para ser proporcionadas.

K¹puede ser teóricamente calculado usando Ecuación (4):

El parámetro qs, que aparece en el cálculo para K¹, es la tasa específica de consumo de nutriente y se calcula de los datos de cultivo celular basados en la ecuación

El qs se asume es constante, como en el caso de la glucosa. Xi y Vi son la densidad celular inicial y volumen de recipiente inicial, respectivamente. So es la concentración madre del sustrato para ser alimentada, por ejemplo, glucosa. Si es la concentración de nutriente inicial en el recipiente. Con todos estos valores disponibles, K¹puede ser fácilmente calculado y sustituido de vuelta en la función de alimentación.

Después de determinar K¹, todos los tres parámetros K¹, K²¹y K²²de la función F de alimentación tiene valores conocidos. La tasa de alimentación cambiará sobre el transcurso de la producción como una función de tiempo, pero la función de alimentación cuenta para estos cambios transitorios y de este modo proporciona exactamente los nutrientes requeridos por el cultivo en el tiempo exacto que el cultivo los necesite. La función entonces puede introducirse en el módulo de control, que puede usarse para iniciar, controlar y terminar el proceso de alimentación.

Continuando con el método, un aparato adaptado para impartir una corriente de alimento continua al cultivo celular entonces se proporciona, en donde el aparato comprende un módulo controlador adaptado para continuamente alimentar el cultivo a una tasa de flujo F, en donde F se define como Kiexp(K²it2 K²²t),, t es el tiempo de la iniciación del protocolo de alimentación que la corriente de alimentación de lote se agrega al bioreactor al final de la alimentación, y K¹, K²¹y K²²son los valores determinados como se describe anteriormente.

Habiendo determinado K¹, K²¹y K²²como se describe en la presente, entonces se proporciona un aparato adaptado para impartir una corriente de alimentación continua al cultivo celular, en donde el aparato comprende un módulo controlador adaptado para continuamente alimentar el cultivo a una tasa de flujo of F, conforme a la función de alimentación. Tal aparato puede comprender un medio de transferencia de una corriente de alimento de líquido de un depósito al bioreactor en una tasa controlada, y un módulo controlador capaz de iniciar y mantener el flujo de corriente de alimentación de un depósito a un bioreactor de acuerdo al perfil de alimentación. Los ejemplos de tal un aparato pueden comprender un módulo controlador Delta V (Emerson, St Louis, MO), una bomba de controlador controlado (porejemplo, tal como aquellos disponibles de los proveedores tal como Applikon Biotechnology, Foster City, CA; Cole-Parmer, Vernon Hills, IL; Watson-Marlow, Wilmington, MA; y SciLog, Middleton, WI). La bomba está conectada por un tubo que es compatible por un cultivo celular (porejemplo, tal como tubo disponible de Cole-Parmer, Vernon Hills, IL); en un extremo está el recipiente de líquido de alimentación y en el otro extremo el bioreactor.

En una modalidad particular, los tres valores K y el tiempo t de alimentación se introducen en la función de alimentación continua, que ha sido programada en un módulo controlador, tal como un módulo de controlador Delta V (Emerson, St Louis, MO). El módulo controlador controla una bomba (porejemplo, una bomba integrada de bioreactor Applikon; Applikon Biotechnology, Foster City, CA) conectada a un recipiente de alimentación para continuamente entregar la cantidad de alimentación al bioreactor dictado por la función F de alimentación. Dependiendo de los requisitos particulares del cultivo, el volumen y cantidad de corriente de alimentación entregados al bioreactor cambiarán como los cambios de tasa de acuerdo a la función F de alimentación. El módulo controlador controla el volumen de materia prima proporcionada al cultivo en cualquier punto dado en tiempo, como se describe en la fórmula F de alimentación.

Cualquier equipo empleado para facilitar la entrega de alimento (porejemplo, bomba(s) y tubo) puede calibrarse previo al uso de la fórmula de alimentación usando la salida de la bomba y tasa de flujo medida para establecer un valor exacto de calibración de bomba. Este valor puede ser usado por el controlador para convertir las tasas de flujo descritas por la función de alimentación F en una medición del volumen transferido por la bomba. Como se describe en los Ejemplos proporcionados en la presente, este sistema de entrega se usó para bioreactores 2L. Para escalas más grandes tal como 500L, 2000L y 15,000L, el sistema de entrega preferiblemente, pero no necesita, emplear ya sea controlador de flujo de masa o entrada de escala de peso. Ambos se establecen y se prueba el equipo para la alimentación en escalas grandes.

En una etapa subsecuente del método, el módulo controlador se activa para iniciar la alimentación continua del cultivo celular. Cuando el programa se inicia en el módulo controlador la alimentación comienza en un punto de tiempo predeterminado, con la tasa de alimentación (esto es, flujo de nutrientes de un depósito en el recipiente) cambiando continuamente sobre un tiempo de alimentación predeterminado, como lo dicta la función de alimentación, para una duración de tiempo descrita por el parámetro t en la función de alimentación.

El punto de tiempo o condición desencadenante en el que el módulo controlador activa la alimentación continua del cultivo dependerá de la naturaleza y metas del proceso de producción de proteína. En algunos casos se proporcionan nutrientes iniciales a un cultivo en una cantidad establecida y en un punto subsecuente en tiempo cuando los nutrientes residuales de la materia prima inicial alcanzan un cierto nivel de objetivo mínimo la alimentación continua se inicia. En otros casos al cultivo no se proporcionan nutrientes iniciales y los nutrientes se proporcionan bajo la iniciación del método, según lo requerido por la función de alimentación.

Los ejemplos adicionales de condiciones desencadenantes en los que la alimentación continua puede iniciarse incluyen el punto en el que el cultivo alcanza a una densidad celular viable designada (VCD) o el punto en el que el cultivo alcanza un nivel de subproducto residual designado. Una vez que una o más de estas condiciones desencadenantes se establece (que puede identificarse usando un cultivo de prueba antes de iniciar el método), las condiciones desencadenantes observadas pueden convertirse a una base de tiempo para iniciar la alimentación continua. Esto es, a un cultivo de prueba puede proporcionarse una materia prima inicial y estudiarse mientras el cultivo crece para determinar en cual punto de tiempo una condición desencadenante particular se alcanza y el módulo controlador puede establecerse para activar la función de alimentación en ese punto en tiempo.

Un ejemplo específico de un nutriente residual que puede monitorearse es la glucosa; el punto de tiempo en el que los niveles de glucosa inicial caen a un nivel que ya no es suficiente para que el crecimiento celular pueda servir como una condición o punto de tiempo desencadenante para que el módulo controlador inicie la alimentación continua.

En otro ejemplo, la densidad celular viable puede usarse como una condición desencadenante. En un ejemplo particular, un objetivo viable de densidad celular es ~5x106 células/mL, que corresponde al punto en el cual las células justamente están entrando a la fase exponencial.

En aún otro ejemplo, los niveles de acumulación de subproducto pueden usarse como una condición desencadenante. En un ejemplo específico, el nivel de acumulación del lactato de subproducto a mayor que ~0.5 g/L puede servir como una condición desencadenante que, cuando se cumple, inicia la alimentación continua para mantener el lactato bajo previniendo la sobrealimentación.

Optimización de la función de alimentación

Como se señala en la presente, los valores teóricos para K¹, K²¹y K²²pueden calcularse para proporcionar valores iniciales, pero en otro aspecto de los métodos descritos los valores calculados pueden opcionalmente optimizarse. Con la finalidad de optimizar los valores K¹, K²¹y K²², un enfoque de “diseño de experimentos” (DOE) puede aplicarse para evaluar un intervalo dado para cada uno de los tres parámetros K¹, K²¹y K²². Los intervalos se determinan basándose en el desempeño observado en un cultivo inicial en el que los valores teóricos de K¹, K²¹y K²²se usaron en la función de alimentación. Los intervalos probados en el proceso de optimización también son guiados por la cantidad total de volumen de sustrato deseado para ser alimentado (que puede determinarse como se describe anteriormente usando la Ecuación 12).

Un cuarto parámetro que aparece en una función de alimentación que puede optimizarse es el tiempo de alimentación total (t). Una vez que la t en la función de alimentación alcanza el tiempo de corrida total, la alimentación debe de parar. El tiempo de corrida total se usa para balancear el volumen de sustrato total para ser alimentado al cultivo con la duración que un cultivo necesita para ser alimentado. Por ejemplo, si se desea alimentar un cultivo sobre un lapso de tiempo más largo, pero usando menos alimento total, en la función de alimentación t puede incrementarse y el K¹puede disminuirse.

En una modalidad un método empírico puede emplearse para calcular los valores K¹, K²¹y K²². Una ventaja para obtener los valores K¹, K²¹y K²²iniciales empíricamente más que teóricamente es que un enfoque empírico puede generar valores más exactos, que lleva a desempeño mejorado y producción de proteína cuando el método se emplea.

En otro aspecto, para determinar mejor K¹, K²¹y K²², la tasa volumétrica de consumo de sustrato(g/hr) para un cultivo se calcula primero, usando datos basados en datos actuales de producción de alimentación de bolo. La tasa volumétrica de consumo de sustrato se determina corriendo un cultivo de prueba que comprende las células que se usarán en el método y monitoreando el consumo de sustrato usando un analizador de nutriente de cultivo celular estándar (por ejemplo, Nova Profiler o un analizador tal como aquellos fabricados por YSI Instruments incluyendo el modelo de unidades de analizador YSI 7100, YSI 1500, YSI 5300, YSI 2300 y YSI 2700). Un factor de dilución entonces se aplica a la tasa de consumo de sustrato, que se determina basándose en las propiedades conocidas de volumen del recipiente y concentración de almacén de sustrato, para convertirlo en la tasa de alimentación de sustrato esto se requiere para entregar la cantidad de sustrato esto es requerido por el cultivo. La tasa de alimentación calculada de sustrato entonces se grafica sobre el transcurso del tiempo de producción. La función de alimentación, F = K¹exp(K²¹t2+K²²t), entonces se usa para que se ajuste mejor a esta gráfica. Este proceso genera los mejores valores de ajuste K¹, K²¹y K²². Opcionalmente, estos valores pueden entonces usarse como un punto de partida para optimización adicional del desempeño usando un enfoque DOE o un enfoque de factor sencillo simple.

Enfoques de optimización adicional

La función de alimentación continua puede derivarse basándose en el balance de masa de un nutriente particular dentro del sistema de cultivo celular. En este enfoque un modelo de crecimiento celular se integra en esta derivación para resolver la función de alimentación. En un ejemplo, un modelo de tasa de crecimiento específica lineal puede usarse en tal derivación. Esto proporciona la función de alimentación, F = K¹exp(K²¹t2+K²²t). Esta función de alimentación se usa para realizar alimentación continua de nutrientes en cultivo celular, por ejemplo, glucosa, aminoácidos, etc. En esta ecuación F es la tasa de flujo de nutriente, t es el tiempo transcurrido del cultivo, K¹es un parámetro que describe el consumo de sustrato, y K²¹y K²²ambos describen el perfil de crecimiento del cultivo.

Sin embargo, está no es la única manera en la que una función de alimentación continua puede generarse. En otro enfoque, más que usar un modelo de tasa de crecimiento específica lineal como se describe anteriormente, un modelo sigmoidal puede usarse en lugar de describir la tasa de crecimiento específica del cultivo. El modelo de tasa de crecimiento específica sigmoidal generará una función alimentadora diferente de la generada usando un modelo de tasa de crecimiento específica lineal. Esta función de alimentación sigmoidalmente derivada trabajará igualmente, así como también la función alimentadora linealmente derivada, mientras sus parámetros definidos se optimizan para cada línea celular.

Aún en otro ejemplo para derivar una función de alimentación, más que usar una forma de ecuación sigmoidal o lineal para modelar la tasa de crecimiento específico, la curva de crecimiento celular puede modelarse en lugar de generar una función alimentadora específica que empata al perfil de crecimiento. Tal función alimentadora sería un polinomial del segundo orden o más alto, dependiendo de la bondad del ajuste. Así, una función de alimentación puede optimizarse usando una función lineal o sigmoidal para modelar la tasa de crecimiento específica, o una función de alimentación enteramente nueva puede derivarse basándose en el ajuste polinomial para la curva de crecimiento o nutriente, y la elección de cuya función para uso puede basarse en una consideración de cualquier número de factores, incluyendo la simplicidad de la ecuación para el uso de desarrollo, necesidad de grados mejorados de libertad para manipular el perfil de alimentación o exactitud mejorada con ajuste directo al crecimiento celular actual o perfil de consumo de nutriente.

Función de alimentación para alimentos que contiene múltiples nutrientes

La descripción supra ha sido dirigida en un aspecto, a funciones de alimentación que comprenden un nutriente sencillo, o una materia prima que comprende una mezcla de nutrientes en la que sólo uno de ellos cuenta para la función de alimentación. Los métodos descritos no se limitan a un nutriente sencillo, sin embargo, y pueden aplicarse a corrientes de nutriente múltiples o almacén de alimentación que comprende múltiples nutrientes. Los métodos descritos pueden fácilmente adaptarse para incorporar una función de alimentación que acomode dos o más nutrientes, aunque se toma un enfoque diferente cuando se realiza la alimentación continúa usando un alimento de sustrato mezclado.

Cuando una materia prima que comprende múltiples nutrientes se emplea es difícil de calcular los valores K¹, K²¹y K²²específicos para la mezcla entera. Un enfoque para describir múltiples nutrientes en una materia prima sencilla es seleccionar un sustrato sencillo en el alimento para seguir para generar los datos necesitados para generar los valores K¹, K²¹y K²²iniciales para la materia prima de nutriente mezclada. Por ejemplo, cuando se usa una materia prima que comprende glucosa y otros nutrientes, únicamente el componente de glucosa de una corriente compleja de alimento puede seleccionarse para monitorearse. Los datos obtenidos del metabolismo del componente de glucosa de la corriente (por ejemplo, tasa de consumo según la función del tiempo) pueden usarse para generar K¹, K²¹y K²². Generalmente, es preferible seguir un sustrato esto es altamente utilizado o esencial para el crecimiento celular, viabilidad y producción.

Los valores K iniciales entonces se optimizan para la mezcla entera de alimento. Debido a que el alimento contiene múltiples sustratos en varias concentraciones, la prueba empírica se prefiere para alcanzar el desempeño óptimo. Además de optimizar la función de alimentación para sustratos múltiples, los medios de crecimiento pueden desarrollarse para ajustar las concentraciones de nutriente que mejor ajusten a la tasa de alimentación continua.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y los resultados alcanzados, se proporcionan para propósitos ilustrativos únicamente y no han de construirse como limitantes.

Materiales y Métodos

Líneas celulares

Se estudiaron tres líneas celulares, Línea celular 1, Línea celular 2 y Línea celular 3, cada una que codifica un anticuerpo monoclonal diferente. Las células se pasaron en matraces agitadores (Corning, NY) en un horario de 3-4 días, después se descongelaron y suplementaron con 100 gg/L IGF-1 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) y 500 nM MTX (Bedford Laboratories, Beford, OH). Las condiciones de paso fueron 36°C, 5% CO², y 160 rpm para matraces 125mL y 500mL y 90 rpm para matraces 3L usando una plataforma agitadora de Thermo Electron Corporation, Waltham, MA.

Las células de la línea celular 3 se usaron para inocular el recipiente N-1 a 0.75e6 células/mL. El recipiente de producción N se inaculó a 1.0e6 células/mL para la Línea celular 1 y para el primer experimento de alimentación continua Línea celular 2. Luego los experimentos de la Línea celular 2 y Línea celular 3 subsecuentes se inocularon a 1.4e6 células/mL. La duración de la producción varió para diferentes líneas celulares como se describe en la sección de Resultados y Discusión.

Las estrategias de alimentaciones de bolo variaron entre líneas celulares. El volumen de alimento y días de alimento se describe a detalle en la sección de Resultados y Discusión a continuación. El alimento de glucosa de bolo se alimentó diariamente a 6 g/L comenzando en el segundo día.

Técnicas analíticas

La VCD y viabilidad se midieron en un instrumento CEDEX (Innovatis, Alemania) y metabolitos en el NOVA BioProfile 100+ (NOVA Biomedical, MA). El pH y gases se analizaron en el Bioprofile pHox (NOVA Biomedical, MA) y la osmolalidad en el osmómetro (Advanced Instruments, Norwood, MA).

La concentración se midió por análisis HPLC de fase inversa. El análisis usó cromatografía de afinidad, en donde la Proteína A se inmovilizó en un soporte de columna. A un pH neutro, las moléculas del anticuerpo monoclonal (mAb) se enlazaron a la Proteína A través de la región Fc con proteínas de célula hospedera, los componentes de medios acondicionados y solución amortiguadora se eluyeron de la columna en el canal de flujo. Los mAbs capturados se eluyeron en pH ácido y detectados por absorbancia UV a 280 nm. Una curva de calibración se derivó de un mAb universal estándar y las áreas pico correspondientes usando análisis de regresión lineal. Las concentraciones del mAb en las muestras de prueba entonces se calcularon de la curva de calibración y la relación de los coeficientes de extinción del mAb universal estándar y el mAb probado.

Resultados y Discusión

Comparación del método de alimentación continua al método de alimentación de bolo

La línea celular 1 se usó como el primer modelo de línea celular para probar la función F de alimentación continua = K¹exp(K²¹t2+K²²t) y para estudiar como el desempeño de cultivo celular comparado con el desempeño de cultivo celular usando la alimentación de bolo. Un objetivo fue demostrar la aplicación del modelo de alimentación continua como un sustituto viable para el lote-alimento de cultivo celular. La habilidad para usar la función de alimentación para continuamente alimentar glucosa y mantener la concentración dentro de un intervalo definido fue otro objetivo y una mejoría sobre la alimentación de glucosa de bolo manual.

Un proceso de bolo estudiado para la Línea celular 1 fue un proceso de producción de 13 días. La glucosa de bolo se agregó diariamente hasta 6 g/L. Los alimentos de bolo se agregaron en los días 5, 7 y 9 en el volumen de 138 mL cada uno en total 414 mL de alimento.

Para aplicar la función de alimentación, los valores K necesitan determinarse. Usando un enfoque teórico, el valor K¹puede aproximarse por la Ecuación (4) usando la tasa específica de consumo de glucosa, y la glucosa inicial, densidad celular viable y niveles de volumen de cultivo al comienzo de la alimentación. Los valores K²¹y K²²pueden aproximarse ajustando una línea lineal al curso de tiempo de la tasa de crecimiento específica de la línea celular, donde K²¹es la pendiente y K²²es la intercepción en y.

Aunque el enfoque teórico para determinar K¹, K²¹y K²²fue inicialmente favorecido por su facilidad y simplicidad, finalmente se decidió seguir un enfoque empírico, que proporciona valores K más exactos. Usando el enfoque empírico, los valores K se determinaron ajustando la función F de alimentación para empatar los datos de volumen de consumo de glucosa actual generados de las corridas de alimentación de bolo. La Figura 1 gráficamente ilustra un ejemplo como la ecuación de volumen de función de alimentación ajusta cercanamente la curva de datos de volumen de glucosa empírico. Para este conjunto de datos, la bondad de ajuste de los valores K generados de K¹= 0.04, K²¹= -0.00015, y K²²= 0.0348. Por lo tanto, este conjunto de valores K se usó como una condición para probar. Similarmente, diferentes conjuntos de valores K también se generaron ajustando la ecuación de volumen y función de alimento a otros datos de glucosa de corridas de alimentación de bolo.

Muchos conjuntos de valores K que ajustan mejor a la curva de volumen de consumo de glucosa se seleccionaron para evaluación. La Figura 2 muestra tres funciones de alimentación de glucosa continúa probadas para la Línea celular 1. Los valores K para cada función de alimentación se describen en la leyenda. Cada una de las tres funciones genera un perfil de tasa de flujo diferente y un volumen total de glucosa diferente agregado. Estos se probaron empíricamente para ver cuales mantiene mejor la concentración de glucosa consistentemente dentro de un intervalo largo de la producción.

Tres diferentes perfiles de alimentación de mezcla de nutrientes continua también se probaron en combinación con una alimentación continua de glucosa (K¹= 0.0504, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0331) descrita anteriormente. Una fue una tasa de alimentación continua constante 2.875 mL/hr evaluando un perfil de entrega de volumen lineal en un desempeño de cultivo celular. Las otras dos alimentaciones continuas utilizaron las funciones de alimentación que son exponenciales por naturaleza (Figura 3). Las constantes K para estas dos corridas de alimento continuo se derivaron simplemente usando los mismos valores K²¹y K²²de las otras dos corridas de alimentación continua de glucosa descritas en la Figura 1, y de vuelta calculando K¹para empatar el volumen total de 414 mL para ser alimentado en el lapso de 5 a 9 días. Estas constantes K probadas sirvieron únicamente como un punto de partida para evaluar los valores K en la función de alimentación. Estas corridas de alimentación continua se compararon a la corrida estándar de alimentación de bolo como se muestra en la Figura 3. Los alimentos de bolo se administraron tres veces a 138 mL cada uno. Todas las cuatro estrategias de alimentación se designaron para entregar el mismo volumen total de 414 mL al final de la producción. Por lo tanto, cualquiera de las diferencias en el desempeño de cultivo celular sólo se atribuiría a las diferentes tendencias de estrategia de alimentación y no el volumen de alimento. En resumen, hubo corridas usando dos corrientes de alimentación continua, una de la glucosa y la otra de la mezcla de nutriente. Una condición fue una tasa de flujo constante de alimentación continua de la mezcla de nutriente emparejada con una alimentación continua de glucosa continúa usando la función de alimentación. Las otras dos fueron dos diferentes alimentaciones de mezcla de nutriente continúas emparejadas con la misma alimentación continua de glucosa como el flujo constante anterior. La cuarta fue la glucosa de bolo estándar y la corrida de alimentación de mezcla de nutriente de bolo.

La Figura 4 muestra los resultados para el modelo de alimentación continúa aplicado a la Línea celular 2. Los datos en la Figura 4a demuestran que la alimentación continua de glucosa podría exitosamente mantener la concentración de glucosa residual consistentemente dentro de un intervalo definido de concentraciones de glucosa. La corrida representada por círculos sólidos (•), es una corrida con glucosa continua dual (K¹= 0.0504, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0331) y alimento (K¹= 0.96678, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0288). El intervalo de concentración de glucosa de esta corrida se mantuvo entre 2 - 4 g/L. La glucosa de bolo, representada por círculos abiertos (o), mostró el patrón oscilatorio esperado y típicamente observado como un resultado de la alimentación manual a 6 g/L cada día. Otras corridas de glucosa continua acumularon glucosa más alta con el tiempo o terminaron con glucosa más baja. Los resultados mostrados en la Figura 4a demuestran que la función de alimentación puede ser empíricamente optimizada para alcanzar el nivel de glucosa consistente deseable durante la producción. En resumen, se observó que la alimentación continua de glucosa mantuvo la concentración de glucosa en el cultivo dentro de un intervalo establecido de una manera automatizada, mientras que la glucosa de bolo creó comportamiento oscilatorio, y no el perfil consistente estable.

La Figura 4b demuestra que las corridas de alimentación continua mantuvieron osmolalidad más baja que las corridas de alimentación de bolo. Esto es probablemente debido al hecho de que la alimentación de glucosa continua se designó para alimentar el cultivo por la cantidad requerida por las células, más que simplemente la alimentación del bolo a una cantidad fija cada día. La alimentación continua puede tener también disminuida la osmolalidad permitiendo que los niveles de nutriente empaten mejor la ingesta de células; las células metabolizan nutrientes más eficientemente y no experimentan cambios drásticos en el ambiente, como se observa típicamente en el caso de la alimentación de bolo.

La Figura 4c muestra que la viabilidad celular de las células de alimento continuo es comparable con el alimento de células usando un enfoque de alimentación de bolo. Aunque la viabilidad de las células es comparable entre los dos enfoques, la Figura 4d demuestra que la densidad celular (IVCD) mejora significativamente cuando se aplica la alimentación continua con la glucosa continua. Este efecto se observó para ambas corridas, los triángulos sólidos (▲) y círculos sólidos (•), usando dos diferentes conjuntos de constantes K de alimentación continua (K¹= 0.96678, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0288) y (K¹= 0.59499, K²¹= -0.0015, K²²= 0.0348) combinada con la misma glucosa continua (K¹= 0.0504, K²¹= -0.00015, K²²= 0.0331). La corrida de alimentación continúa representada por diamantes sólidos (♦), que usó la tasa de alimentación constante y la misma glucosa continua ya que las otras dos corridas únicamente produjeron el mismo IVCD como la corrida de alimentación de bolo (círculos abiertos(o)). Esta observación implica que el perfil exponencial de la función de alimentación es mejor en la entrega de nutriente para mejorar el crecimiento celular que tanto la alimentación constante como la alimentación de bolo. Las concentraciones para estas corridas, triángulo sólido (▲) y círculo sólido (•), también fueron las más altas entre las corridas y aproximadamente 7% más alta que la corrida de alimentación de bolo de control (círculos abiertos (o)). Es posible que, con optimización adicional de las constantes K de la función de alimentación, la concentración de la alimentación continua pueda mejorarse sobre la alimentación de bolo. Se observa que tanto los perfiles de lactato como de amonio de estos perfiles fueron muy similares.

El método de alimentación continua como se aplica a la Línea celular 2

La línea celular 2 también se probó usando la función de alimentación continua. Como se hizo en el estudio de la Línea celular 1, los valores K para la alimentación continua de glucosa se determinaron ajustando la función de alimentación para empatar los datos actuales de consumo de glucosa generados de las corridas de alimentación de bolo. Los valores K para la alimentación continua también se derivaron basándose en las variaciones de K²¹y K²²de la glucosa continua y K¹se calculó de vuelta usando el volumen total para ser entregado dentro de un tiempo establecido. El proceso de control es 16 días. La glucosa de bolo se agregó diariamente hasta 6 g/L. Las alimentaciones de bolo se agregaron en los días 5, 7, 9, 11 y 13 a 108 mL cada una en un total de 540 mL de alimentación. Dicho de otro modo, en las corridas duales de alimentación continua, los valores K de alimentación continua de glucosa se mantuvieron igual y únicamente los valores K de alimentación de mezcla de nutriente continua.

La Figura 5 muestra los resultados del método de alimentación continúa aplicados a la Línea celular 2. Las dos variaciones de glucosa continúan probadas fueron (K¹= 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) y (K¹= 0.069, K²¹= -0.000048, K²²= 0.018). (K¹= 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) se usó para todas las corridas de alimentación y glucosa continua duales. La Figura 5a demuestra que, con desarrollo empírico, es posible mantener la concentración de glucosa consistentemente dentro de un intervalo específico de 3 - 6 g/L. La corrida alcanzando este intervalo es el cuadro sólido (■) usando glucosa continua (Ki = 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) con alimentación continua (Ki = 2.3821, K²¹= -0.00006, K²²= 0.0092).

La Figura 5b demuestra que la densidad celular (IVCD) de la glucosa continua y corrida de alimentación continua (diamantes abiertos (◊)), y la glucosa continua dual y corrida de alimentación continua, (cuadrados sólidos (■)), se mejoran significativamente sobre la corrida de control de alimentación de bolo (*).

La Figura 5c muestra que funciones diferentes de alimentación continua pueden producir una variación amplia de concentraciones, con algunas concentraciones que son disminuidas y otras más altas, aunque la misma cantidad de volumen de alimentación de 540 mL se alimente. La corrida que demostró concentración mejorada sobre la alimentación de bolo fue alimentación continua de glucosa (K¹= 0.105, K²¹= -0.000051, K²²= 0.0155) con alimentación de bolo (diamantes abiertos (◊)); la concentración de esta corrida fue 6 g/L contra la alimentación de bolo de control de 5.5 g/L. La viabilidad celular también varió, con algunos perfiles de alimentación continúa empatando la alimentación de bolo y algunos más bajos. Estos datos muestran el intervalo de respuesta con diferentes valores K de alimentación continua e ilustran el potencial para optimización con un intervalo de valores K.

Prueba de volúmenes más altos en el método de alimentación continúa usando la Línea celular 2

En otro experimento, el proceso de alimentación de bolo se cambió a 84 mL en los días 4 y 5, y 108 mL en los días 7, 9, 11 y 13 en total 600 mL de alimentación. Esta modificación agrega un día de alimentación adicional y 60 mL más de alimentación que la condición previa. Los valores K además se refinaron para las ecuaciones de glucosa continua y alimentación continúa basándose en los datos mostrados en la Figura 5. Los valores K para glucosa se cambiaron a (K¹= 0.215, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003), que ajustaron mejore revisados de los datos de consumo de glucosa para la Línea celular 2. En este estudio, hubo cuatro condiciones, como se muestra en la Figura 6. La primera condición (diamantes abiertos (◊)), es la glucosa y alimentación de bolo de control. La segunda condición (triángulos abiertos (A)), es el uso de glucosa continua (K¹= 0.215, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) acoplada con alimentación de bolo. La tercera condición (triángulo sólido (▲)), usa los mismos valores K de glucosa continua K acoplados con alimentación continua (K¹= 1.8744, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003). La cuarta condición (diamante sólido (♦)), usa los mismos valores K de glucosa continua con alimentación continua (K¹= 2.0827, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003). Las condiciones de alimentación de bolo y la cuarta condición de alimentación continua todos entregan la misma cantidad de alimentación total de 600 mL. La tercera condición de alimentación continua se estableció para entregar el total previo de 540 mL para comparación. A pesar de la diferencia de volumen en la tercera y cuarta condiciones, las curvas de tendencia de alimentación continua se esperan sean las mismas ya que ambas funciones comparten los mismos valores K²¹y K²². Mientras que los valores K²¹y K²²se mantuvieron igual, el valor K¹es más alto, que dirige una magnitud más alta de tasa de alimentación. En este caso, la curva entera de alimentación se desplaza más alto que la curva de alimentación K¹más baja. Todas las corridas tienen alimento entregado dentro del mismo marco de tiempo del día 4 al día 13.

En este estudio, la concentración de glucosa residual de la glucosa continua se controló dentro de un intervalo estrecho de 3 - 5 g/L para la corrida de triángulos abiertos (A). La glucosa residual de la glucosa continua dual y alimentación tuvieron más variación, pero aún era perceptible, ya que su variación aún era más pequeña que la alimentación de glucosa de bolo (que tuvo un intervalo de 1 - 6 g/L).

La Figura 6a demuestra que la concentración se mejora usando la glucosa continúa acoplada con la alimentación continua. Ambas condiciones de alimentación continua alcanzaron aproximadamente concentración 8.4 g/L, que fue la concentración más alto observado para cualquier proceso de Línea celular 2. Las tendencias de concentración de las corridas de alimentación de bolo se quedarán atrás de las corridas de alimentación continua tan pronto como el día 11. La productividad volumétrica fue también más alta en las corridas de alimentación continua.

La Figura 6c muestra que la viabilidad celular es más alta con las corridas de alimentación continua contra las corridas de alimentación de bolo. En este estudio el volumen de alimentación continua más alto de 600 mL fue mejor que el volumen de alimentación 540 mL con respecto a la viabilidad celular. También fue 9% más alto con respecto a la viabilidad celular que la alimentación de bolo al final de la producción. El mismo tipo de mejoría también se observó para el IVCD usando a la entrega de alimentación continua 600 mL de alimento, como se muestra en la Figura 6d. Al final de la producción, esta alimentación continua alcanzó 214x106 célula días/mL contra 187x106 célula días/mL para la alimentación continua 540 mL, y 170x106 célula días/mL para el control de alimentación de bolo. Este es aproximadamente 26% mejoría en IVCD sobre la alimentación de bolo con la mejor alimentación continua.

En experimentos continuos en el volumen de alimentación continua, dos variaciones adicionales de la alimentación continua se probaron en paralelo con la alimentación de bolo de control de 600 mL. La primera condición (círculos abiertos (o)) utilizó una alimentación continua de (K¹= 2.6503, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) comenzando el día 5 y continuando hasta el día 13. Ya que la alimentación continua comenzó un día después que el día previo 4, la alimentación total fue 600 mL, aunque el Ki fue más alto que la alimentación continua previa 2.0827. Los valores K²¹y K²²fueron los mismos como la alimentación continua previa. Esta condición prueba un comienzo tardío de alimentación continua mientras mantiene el mismo volumen total. En la segunda condición, la alimentación continua de (K¹= 2.2910, K²¹= -0.000003, K²²= 0.003) se probó, que se aplicó del día 4 al día 13. Este es el mismo tiempo de comienzo y termino como la alimentación de bolo de control. El K¹se incrementó de 2.0827 a 2.2910, sin embargo, para probar el volumen total más alto de 660 mL. Para estas dos condiciones de alimentación continua, ambos se acoplaron con glucosa de bolo. El objetivo fue entender el efecto de la alimentación continua sola sin la glucosa continua.

Las Figuras 7a y 7b demuestran que el concentración y productividad volumétrica se mejoraron ligeramente con ambas condiciones de alimentación continua. La Figura 7c demuestra que la viabilidad fue significativamente mejorada con las condiciones de alimentación continua. Esto se observó previamente en las condiciones de la Figura 6. La Figura 7d demuestra que el IVCD fue únicamente marginalmente mejorado con las condiciones de alimentación continua, en contraste a la mejoría mayor vista en la Figura 5.

Prueba del método de alimentación continua en la Línea celular 3

La línea celular 3 se probó usando la función de alimentación continua. El proceso de alimentación de bolo de control alimenta 84 mL en el día 4, 108 mL en el día 6, y 108 mL en el día 8 para un total de 300 mL. El proceso entero fue de 12 días. Una condición de alimentación continúa acoplada con glucosa de bolo se probó. Sin algún desarrollo, el mismo K²¹de -0.000003 y K²²de 0.003 de los estudios previos usando Línea celular 2 se usaron. El K¹se calculó es de 2.7233 para alimentar 300 mL total comenzando el día 4 al día 8.

Los datos para la Línea celular 3 mostraron que la alimentación continua mejoró la concentración sobre la alimentación de bolo de 4.2 g/L a 4.5 g/L (Figura 8a). La productividad específica, qp, también fue más alta del día 8 al día 12 con la alimentación continua (Figura 8b). No hubo diferencia importante en los perfiles de viabilidad celular, IVCD, lactato y amonio. Los resultados demuestran que la concentración para la Línea celular 3 pueden mejorarse significativamente.

Conclusiones

Los estudios con las líneas celulares 1, 2 y 3 demuestran un modelo de alimentación continuo sin retroalimentación pre-programada efectiva y novedosa para el cultivo celular que pueda aplicarse exitosamente en el lugar de la alimentación de bolo. Tres diferentes líneas celulares se probaron y se observaron varios beneficios comparados a la alimentación de bolo. Para la Línea celular 1, se demostró que el perfil de osmolalidad fue más bajo y el IVCD fue más alto. Para la Línea celular 2, se demostró que la concentración, productividad volumétrica, viabilidad celular y IVCD podrían todos mejorarse con alimentación continua. Con respecto a la Línea celular 3, se demostró que el concentración y productividad específica podrían mejorarse con alimentación continua.

Además de la mejoría del desempeño del cultivo celular, se demostró que el método de alimentación continua también puede usarse para mantener glucosa consistentemente dentro de un intervalo deseable durante la producción. Esto es deseable y benéfico ya que elimina la necesidad de alimentación de bolo manual, y consecuentemente elimina la necesidad de intervención humana y recursos conservadores. Ya que el método de alimentación continua preprograma por adelantado una corrida y se elimina la intervención del operador, el proceso es consistente de la corrida a corrida con valores K fuertes bien desarrollados. Los ejemplos corridos dobles exitosas de glucosa continua y de alimentación muestran que la automatización completa de la alimentación de cultivo celular es efectiva.

Los resultados de estos estudios demuestran que el método descrito de alimentación continua mejora el desempeño del crecimiento de cultivo celular y producción de proteína, y que el método puede remplazar estrategias de alimentación de bolo convencional.

Cada referencia citada en la presente se incorpora como referencia en su totalidad para todo lo que enseña y para todos los propósitos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de alimentación continua de un cultivo de células de mamíferos que no emplea control de retroalimentación, que comprende:

(a) proporcionar un recipiente que comprende un cultivo de células de mamíferos que comprende células de mamífero y medios;

(b) determinar los valores preferidos para la tasa de consumo (K¹) de un nutriente, tasa de crecimiento (K²¹) y tasa de crecimiento (K²²) del cultivo celular;

(c) proporcionar un aparato adaptado para impartir una corriente de alimentación continua al cultivo celular, en donde el aparato comprende un módulo controlador adaptado para alimentar continuamente el cultivo a una tasa de flujo F, en donde

F se define como K¹exp (K²¹t2 K²²t);

t es la duración del tiempo desde el tiempo que la corriente de alimentación se agrega al bioreactor al tiempo que la corriente de alimentación se detiene; y

K¹, K²¹y K²²son los valores determinados en (b); y

(d) activar el módulo controlador para iniciar la alimentación continua del cultivo celular.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque K¹, K²¹y K²²son empíricamente determinados.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque K¹, K²¹y K²²se modelan.

4. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el módulo controlador comprende una computadora.

5. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la corriente de alimentación comprende múltiples nutrientes.

6. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la osmolalidad del cultivo celular se mantiene constante durante todo el método.

7. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el nutriente es glucosa.

8. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el cultivo de células de mamíferos es un cultivo celular CHO.

9. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el módulo controlador se activa en respuesta al nivel de lactato preseleccionado en el cultivo celular.

10. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el módulo controlador se activa en respuesta a un nivel de glucosa preseleccionado en el cultivo celular.

11. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el módulo controlador se activa en respuesta a un nivel preseleccionado de un aminoácido.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el aminoácido es asparagina.

13. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el aminoácido es glutamina.

14. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque la corriente comprende dos o más nutrientes.