JP6358999B2 - 真核生物細胞の培養方法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その内容の全体を出典明示により本明細書中に援用する２００９年７月６日出願の米国特許仮出願第６１／２２３３１３号の優先権を主張するものである。

（発明の分野）
本発明は、培養培地へ塩基を直接添加することなく、細胞培養のｐＨを維持することを可能にする重炭酸塩含有培地において真核生物細胞を培養するための装置及び方法に関する。

細胞バンクのため、例えば組換えタンパク質生産等の細胞産物の生産のための細胞の培養は、細胞が増殖するに伴い変化する条件によって妨げられる。ステンレス鋼製バイオリアクタが細胞製造のためにしばしば用いられる一方、ディスポーザブルのものが、生物製剤製造の全ての段階で使用されることが増えている（Rao等, 2009）。上流プロセシングにおいては、ディスポーザブルなバイオリアクタが、そのステンレス鋼製の対応品に勝る多くの利点を提供する（相互汚染のリスク低減からコスト及び時間の節約まで及ぶ）。ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭは、生物製剤産業において組換えタンパク質の生産に使用されるディスポーザブルな上流技術の十分に記述された例である（Cronin等, 2007；Haldankar等, 2006；Ling等, 2003；Ye等, 2009）。

Ｓｉｎｇｈ（Singh, 1999）によって開発されたＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^TMシステムは、予め殺菌された、可撓性でディスポーザブルな培養チャンバ（Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭ）と、ＣＯ_２-及び／又はＯ_２-空気混合コントローラと、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭを揺動し加熱するための空気圧制御式プラットフォームを具備する。このプラットフォームによって発生する揺動動作は、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭにおける混合及びガス移動をもたらす。

ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムは、オンラインでのｐＨ及び溶存酸素（ＤＯ）モニタ及び実時間フィードバック制御を提供するように更に装備せしめることができる（Mikola等, 2007；Tang等, 2007）。しかしながら、必要とされる更なる装置、並びにｐＨ及びＤＯプローブを収容するための特別に設計されたバッグの必要性により、このシステムの稼動コスト及び複雑性が増加する。加えて、ｐＨ制御されたバイオリアクタにおいて、規定の設定値まで培養ｐＨを上げるために必要とされる塩基の添加は、培養オスモル濃度を増加させる。バイオリアクタのオスモル濃度増加の程度に依存して、細胞増殖及び生存の付随する減少（deZengotita等, 2002；Zhu等, 2005）が、ｐＨ制御の利点を相殺する場合がある。更に、ｐＨプローブが故障した場合、生じるｐＨ摂動が細胞代謝を変化させ得、細胞死を促進し得る（Miller等, 1988；Osman等, 2002）。

厳格なｐＨ及びＤＯ制御は、ある種の細胞培養アプリケーション、例えば、細胞維持及び増殖のための、振とうフラスコ及びスピナー等の小規模の培養システムにおける細胞の単調な継代等のためには必要ではないかもしれない。しかしながら、極端なｐＨ及びＤＯは、細胞増殖及び生存に有害であり（Lin等, 1993；Link等, 2004；Miller等, 1988；Osman等, 2001）、製品品質に影響し得る（Restelli等, 2006；Yoon等, 2005）。従って、生物製剤製造の全てのステージにわたって細胞のこのような増殖条件に対してある程度の制御を維持することは極めて重要である。研究者は、６．８−７．３のｐＨ範囲及び空気飽和の１０−１００％のＤＯ範囲でのＣＨＯ細胞の培養における成功を既に証明した（Link等 2004；Restelli等 2006；Trummer等 2006；Yoon等 2005）。

実時間ｐＨモニタ及びＤＯモニタリング制御等の一般的なバイオリアクタの更なる機能は、生物学的製造における細胞培養の費用及び労働集約度を著しく増加させる。更に、これらの機能の故障又は不良は、時間及び資源が大きく犠牲となる、細胞培養の容認できない変動及び潜在的ロスを導き得る。

このように、強塩基の導入を必要とすることなく、またｐＨ及びＤＯの更なるモニタ及び実時間制御をすることのない、真核生物細胞を培養するための改良された方法に対するニーズがある。

本発明は、塩基を添加しないで、細胞培養系のｐＨを維持するための装置及び方法を提供する。重炭酸塩を含有する細胞培養培地において、培地のＣＯ_２量は、炭酸-重炭酸塩バッファー平衡（式１）に基づいて、培地のｐＨに影響する：

このように、本発明は、この関係を利用し、細胞培養系の液相及び気相の動的界面を用いて溶存ＣＯ_２濃度を増減させることによって、強酸又は塩基の追加を必要とすることなく細胞培養培地のｐＨを調節する。本発明は、この調節を達成するための方法及び該方法を実施するための装置を提供する。

一般に、本発明の装置には、細胞培養の溶存酸素を維持するために、空気、酸素又はこれらの気体の組合せが供給される。装置のヘッド空間に（その組成及び導入速度に関して操作され得る）気体混合物を供給することにより、液相及び気相間のＣＯ_２の濃度差に依存して、ＣＯ_２が細胞培養培地に添加され又は培地から除去され得る。ヘッド空間からのＣＯ_２の除去は、培地の溶存ＣＯ_２がヘッド空間に拡散するに従い、培養ｐＨを増加させる。逆に、ＣＯ_２が培地の濃度より高い濃度で装置に加えられる時、ＣＯ_２は培地に溶け、培養ｐＨは減少する。本発明は、塩基を添加することなく、培養ｐＨを維持するために細胞培養への又は培養からのＣＯ_２移動を可能にする方法を提供する。

このように、本発明は、容器内で、重炭酸塩を含有する培養液中に真核生物細胞を含んでなる真核生物細胞を培養する方法を提供するものであって、容器は細胞培養物及び前記細胞培養物上部の気相ヘッド空間を封入する壁部を有する。容器は、また、前記ヘッド空間からのガスの流出入を提供する少なくとも一つのポートを有する。容器は、液相及び気相間の動的界面を提供するために攪拌される。培養物のｐＨは、モニタされ得、ガスは、前記ポートを通りヘッド空間へ供給され、ガスは、細胞培養物によりＣＯ_２が溶解するに従い、ｐＨの低下をもたらすよう、所定量のＣＯ_２を含むか、又は細胞培養物のｐＨの増加をもたらすために、ポートを通して、ヘッド空間から蓄積ＣＯ_２が除去される。このように、ｐＨは所定の範囲に維持される。

一般に、細胞培養培地の溶存ＣＯ_２の分圧は、１〜２００ｍｍＨｇの量に維持される。幾つかの実施態様では、溶存ＣＯ_２の分圧は、１０〜１８０ｍｍＨｇである。幾つかの実施態様では、溶存ＣＯ_２の分圧は、２０〜１５０ｍｍＨｇである。幾つかの実施態様では、溶存ＣＯ_２の分圧は、１００-１８０ｍｍＨｇである。幾つかの実施態様では、溶存ＣＯ_２の分圧は、２０〜８０ｍｍＨｇである。幾つかの実施態様では、溶存ＣＯ_２の分圧は、３０〜６０ｍｍＨｇである。幾つかの実施態様では、溶存ＣＯ_２の分圧は、３５〜５０ｍｍＨｇである。幾つかの実施態様では、溶存ＣＯ_２の分圧は、４０ｍｍＨｇである。

ヘッド空間クリアランスは、連続的に又は断続的に実施され得る。

一般に、ＤＯは、１０％より上に維持される。幾つかの実施態様では、ＤＯは、２０％より上に維持される。幾つかの実施態様では、ＤＯは、３０％より上に維持される。幾つかの実施態様では、ＤＯは、４０％より上に維持される。幾つかの実施態様では、ＤＯは、５０％より上に維持される。幾つかの実施態様では、ＤＯは、６０％より上に維持される。

幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．００１ヘッド空間体積／分（ｈｖｍ）である。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．００５ｈｖｍである。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．０１ｈｖｍである。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．０２ｈｖｍである。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．０５ｈｖｍである。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．１ｈｖｍである。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．２ｈｖｍである。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．５ｈｖｍである。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、０．９ｈｖｍである。幾つかの実施態様では、容器へのガスの流量は、１．０ｈｖｍである。

真核生物細胞は脊椎動物の細胞であり得、限定するものではないが、例えば、カエル、ウサギ、齧歯類、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、非ヒト霊長類、又はヒト等からの細胞である。

方法は、剛性又は柔質の壁部を有する容器において実施され得、例えばプラスチック容器又はディスポーザブル培養バッグ等である。

容器において液相及び気相の間の動的界面を提供する任意の手段によって、容器は、攪拌されうる。このような攪拌は、例えば、揺動、軌道運動、８の字運動、転動運動、振とう等によることができる。

幾つかの実施態様では、撹拌は、揺動によって実施される。揺動速度及び揺動角度は、所望の攪拌を成し遂げるように調節されうる。幾つかの実施態様では、揺動角度は、２０°、１９°、１８°、１７°、１６°、１５°、１４°、１３°、１２°、１１°、１０°、９°、８°、７°、６°、５°、４°、３°、２°又は１°である。ある実施態様では、揺動角度は、６−１６°の間である。他の実施態様では、揺動角度は、７−１６°の間である。他の実施態様では、揺動角度は、８−１２°の間である。

幾つかの実施態様では、揺動速度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１，１ １２、１３、１４ １５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ｒｐｍである。幾つかの実施態様では、揺動速度は、１９−２５ｒｐｍの間である。幾つかの実施態様では、揺動速度は、２０−２４ｒｐｍの間である。幾つかの実施態様では、揺動速度は、２１−２３ｒｐｍの間である。

該方法は、培養のヘッド空間から、ガスの流出入を可能にする一つのポートを有する容器において実施され得る。あるいは、容器は、複数のポートを有しうる。

培養のｐＨは、連続的に又は断続的にモニタされ、そして、液相のｐＨが所定の値に調節されるように、培養の液相における溶存ＣＯ_２の濃度を増加又は減少するよう、ヘッド空間のガスのＣＯ_２濃度が提供されるように、ヘッド空間にガスが注入される。

他の実施態様では、該方法は、培地ポートを通して、細胞培養に新鮮培養培地を灌流する工程を含み得る。新鮮培地は、細胞培養を所定のｐＨ範囲に一部維持するよう添加する際に、細胞培養の全体のｐＨの調節を提供するｐＨを有する。所定のｐＨを有する新鮮培地を用いたｐＨの調節は、培養方法において有用であるが、ｐＨを完全に制御するには十分でない。

該方法は、いかなるサイズの培養にも適応できる。幾つかの実施形態では、該方法は、市販されるディスポーザブル型バイオリアクタバッグにおいて実施される。この種のバイオリアクタバッグは５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、１０Ｌ、２０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、及び１０００Ｌ等の体積で入手可能である。

培養の様々なパラメータは、モニタされ制御されうる。このようなパラメータは、計算がコンピュータによって実施され、自動化プロセスで制御されうる。単独で又は組合せで制御され得る幾つかのパラメータは、これに限定されるものではないが、ガス流量、ｐＨ、溶存ＣＯ_２濃度、温度、及び攪拌を含む。

本発明は、本発明の方法を実施するための装置も提供する。

図１は、潅流フィルタを有する本発明の装置の例を示す。該装置は、ガスの流入ポート及び流出ポート、培養物に新鮮培地を供給するポート、使用済み培地を除去する潅流フィルタ、揺動デッキ及び基台を有する。揺動動作は、細胞培養培地への及び該培地からのＯ_２及びＣＯ_２の効果的な移動を提供する攪拌を可能にする。 図２は、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおける酸素移動を測定するための、無細胞研究を示す。（パネルＡ）一定の空気流量０．２Ｌ／分での、ｋ_Ｌａに対する揺動速度及び揺動角度の効果；（パネルＢ）ｋ_Ｌａに対する揺動速度、揺動角度及び空気流量の効果；（パネルＣ）異なる揺動角度、揺動速度及び一定の空気流量０．２Ｌ／分（本明細書においてＬＰＭとも称される）での、生のＤＯデータ；（パネルＤ）異なるガス流量での２つの異なる揺動セットポイントに対する生のＤＯ経時データ。 図３は、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおける、ＣＯ_２除去率を評価するための、無細胞研究を示す。（パネルＡ）；一定のガス流量０．２ＬＰＭでの、異なる揺動角度、揺動速度に対する生のｐＨ上昇データ；（パネルＢ）異なるガス流量での、２つの異なる揺動設定点に対する生のｐＨ上昇経時データ。（パネルＣ）パネルＡに示される異なる揺動条件に対する算出されたｐＨ変化の割合；（パネルＤ）パネルＢに示される、異なる揺動条件及び異なるガス流量に対する、算出されたｐＨ変化の割合。ソリッドバーは、最初の５分の間のｐＨの変化の割合であり、オープンバーは次の５５分の間のｐＨの算出変化率である。 図４は、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ回分培養の、（パネルＡ）ＶＣＣ、（パネルＢ）オフラインｐＨ、（パネルＣ）オフラインｐＣＯ_２、及び（パネルＤ）オフラインＤＯプロファイルを示す。プロセス条件は、以下の表２にまとめられる。（ｉ）ＭＡｂＢを生産する細胞株に対しては、接種ステージのみが評価され、（ｉｉ）ＭＡｂＣを生産する細胞株に対しては、接種及びスケールアップステージ（この間、作業体積は６Ｌから２０Ｌまで増加した）双方が評価された。各ステージの間、ヘッド空間にポンプで送られた空気には、１日目の間は８％（ｖ／ｖ）で、２日目の間は５％（ｖ／ｖ）で、そして、その後は、２％（ｖ／ｖ）でＣＯ_２が補充された。 図５は、非最適化条件の下実施された、ＭＡｂＡを生産する細胞株を用いた、２つのＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ潅流培養の、（パネルＡ）ＶＣＣ、（パネルＢ）培養生存率（パネルＣ）オフラインのｐＨ、及び（パネルＤ）ＤＯ濃度を示す。細胞は、最初の６日間はバッチモードで、その後は潅流モードで培養された。回分培養の間、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭの作業体積は、６Ｌの培養物が接種され、３日目に、この培養物体積は、新鮮培地の追加により２５Ｌに増加された。灌流培養の間、培養体積は、一日当たり一体積の灌流率で、２５Ｌに維持された。このセットの実験では、揺動速度は１８ｒｐｍであり、揺動角度は８度であり、ヘッド空間への空気流量は０．２Ｌ／分であった。培養の全期間の間、この空気は５％ＣＯ_２（ｖ／ｖ）で補充された。 図６は、バッチ（０-６日目）／潅流（６-１４日目）プロセスの、細胞培養増殖プロファイル及びｐＨプロファイルを示す。（パネルＡ）％ＰＣＶでの血中血球容積；（パネルＢ）細胞生存率；（パネルＣ）ｐＨプロファイル；（パネルＤ）ＶｉＣｅｌｌ^ＴＭ ＡＳで測定される生細胞数（ＶＣＣ）での細胞増殖。 図７は、異なるヘッド空間クリアランス速度（ｈｖｍ）からの培養実績を示す。（パネルＡ）は気流の単ステップ増加を有する２つの実験を示し、ヘッド空間クリアランス速度の増加に影響する（（-◆-）では０．１ｈｖｍ、（-▲-）では０．０２ｈｖｍ）。他のヘッド空間クリアランス速度ストラテジーは、１０及び１１日目の、多ステップ増加である（０．００７ｈｖｍ〜０．０１３ｈｖｍ〜０．０２ｈｖｍ）（-■-）。（パネルＢ）NOVA BioProfile（登録商標）400によって測定された溶存ＣＯ_２分圧。 図８は、最適化プロセスを使用して、各々が異なるＭＡｂを生産する６つの異なる細胞株の、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭの、（パネルＡ）ＶＣＣ、（パネルＢ）培養生存率（パネルＣ）オフラインのｐＨ、及び（パネルＤ）ＤＯを示す。６Ｌの接種段階の間、培養物は２１ｒｐｍで揺動され、ヘッド空間への空気流量は０．２Ｌ／分であった。この空気は、１日目の間８％（ｖ／ｖ）で、２日目の間５％（ｖ／ｖ）で、その後は２％（ｖ／ｖ）でＣＯ_２が補充された。この気流ストラテジーは、２０Ｌのスケールアップステージで繰り返された（３日目-６日目）。２０Ｌの潅流モードの培養の間（６日目以降）、ヘッド空間への空気流量は、ＣＯ_２補充無しで、０．６Ｌ／分に維持され、流入ガスの空気に対するＯ_２の配合は、８日目に、０％（ｖ／ｖ）から３０％（ｖ／ｖ）まで増加され、そして培養の残りの期間、３０％（ｖ／ｖ）に維持された。２０Ｌのバッチ及び潅流培養は、２３ｒｐｍで揺動された。全培養の揺動角度は１０°で一定だった。 図９は、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ（●）及び攪拌タンクバイオリアクタ（□）において、ＭＡｂＥを生産する細胞株の平行培養の、（パネルＡ）ＶＣＣ、（パネルＢ）生存率、（パネルＣ）オフラインｐＨ及び（パネルＤ）オフラインＤＯを示す。

当業者は、真核生物細胞を培養する多くのプロトコル及び方法に精通しており、また同細胞に対する培養培地もしかりである。この種のプロトコル及び培養培地は、ANIMAL CELL CULTURE, A PRACTICAL APPROACH 2^ND ED., Rickwood, D. and Hames, B.D., eds., Oxford University Press, New York (1992)等の文献及び教参考書に記載されている。一般的な使用方法が、インターネットも入手可能であり、例えばprotocol-online.org/prot/Cell_Biology/Cell_Cultureである。細胞培養培地は、また、商業的に種々の周知のソースから入手可能である。本願明細書において引用される全ての文献は、出典明示によりここに援用される。

（定義）
本願明細書において記載又は参照される一般の細胞培養技術及び手順は、当業者に周知であり、また、一般的な方法論を使用して一般的に採用される。適宜、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、通常、特に明記しない限り、製造業者規定のプロトコル及び／又はパラメータに従って実施される。

本方法の記載の前に、この発明は、記載された特定の方法論、プロトコル、細胞系、動物の種又は属、構造物、及び試薬に、このようなものはもちろん様々なので、限定されないことが理解されるべきである。また、本願明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を記載するためだけのものであり、添付の請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを目的としないことが理解される。

本願明細書において、また添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数系「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から特に明記されない限り、複数形も含むことに注意されなければならない。明細書及び添付の請求項（例えば１〜２００ｍｍＨｇ等）は、「約」なる用語により修飾されることが理解される。

本明細書に記載される全ての刊行物は、該刊行物が引用するものと関連して方法及び／又は材料を開示し記載するために、出典明示により本明細書に援用される。本明細書に引用される刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示に対して引用される。ここにおける何も、本発明の優先日又は先の日に基づいて、発明者が刊行物に先行する権利がないことを自認したと解されるものではない。更に、実際の公開日は、示されるものとは異なり得、個別の検証が必要とされ得る。

ここで使用する場合、「約」は、記載される値より１０％多い又は少ない値を意味する。

ここで使用される場合、「攪拌する」は、培養物の液体相が、培養物の上部の気相と動的な相互作用にあるように摂動することを意味する。攪拌は、振とう（shaking）、撹拌（stirring）、揺動（rocking）、軌道振とう（orbital shaking）、転動（rolling）、八の字振とう（figure-eight shaking）、又は液相を非静態にし液相への又は液相からのガスの拡散を増加させる任意の手段をも意味しうる。

ここで使用される場合、「ガス」は、純ガス又は窒素、酸素及び二酸化炭素を含み得るガスの混合物を意味する。典型的には、窒素は全ガス濃度の約６０〜９０％の量で存在し、酸素は全ガス濃度の約１０〜４０％の量で存在し、そして、二酸化炭素は全ガス濃度の約０〜５０％の量で存在する。

ここで使用される場合、「重炭酸塩を含有する細胞培養液」は、その組成の一部として、重炭酸塩バッファ系を含む真核生物細胞を培養するための適切な培養培地を意味する。培地は、また、ＨＥＰＥＳ又はＭＯＰＳ等のような更なる緩衝剤を含みうるが、同様に重炭酸塩ベース系を含まなければならない。

ここで使用される場合、「細胞培養」は、緩衝剤及び生細胞の増殖及び／又は維持に必要な養分を含む液体培地において、真核生物細胞を含んだ液状調製物を意味する。

ここで使用される場合、「溶存ＣＯ_２の濃度」は、ｍｍＨｇでの、ＣＯ_２の相対的測定分圧によって表される。従って、溶存ＣＯ_２の分圧が、溶存ＣＯ_２の濃度の反映として使用される。
「ＤＯ」は、溶存酸素を意味する。

ここで使用される場合、「動的界面」は、細胞培養物の攪拌によって提供される、液相及び気相間の、ガスの強化された活発な交換を意味する。
ここで使用される場合、「真核生物細胞」は、無脊椎動物又は脊椎動物の細胞であり得る動物性細胞を意味する。

ここで使用される場合、「ヘッド空間」は、容器が細胞培養に使用された場合に、細胞培養物の液相上部の気相を意味する。

ここで使用される場合、ｈｖｍは、１分当たりのヘッド空間体積に関連し、ヘッド空間のガスが除去される速度を示す。
ｋ_Ｌａは、体積測定酸素移動係数を意味する。
ｋ_Ｌａ^ＣＯ２は、体積測定二酸化炭素移動係数を意味する。
ＬＰＭは、ガス流の１分当たりのリットルを意味する。

ここで使用される場合、「調節」は、値の増加又は減少をもたらすことに関連する。

ここで使用される場合、「モニタ」は、特定の値を、断続的に又は連続的に決定するために、サンプリング及び分析することによって、追跡することを意味する。
ｐＣＯ_２は、溶存ＣＯ_２濃度の分圧を意味する。

ここで使用される場合、「ポート」は、それ以外は閉鎖されているシステムへのアクセスポイントを意味する。

ここで使用される場合、「予め定められた」は、目的値として使われる、特定のパラメータのために前もって選ばれた値を意味する。。

ここで使用される場合、「ｒｐｍ」は、１分当たりの揺動を意味する。

ＶＣＣは、生細胞濃度を意味する。。

ここで使用される場合、「容器」は、コンテイナを意味する。ここで使用される場合、この種の容器は、例えば、フラスコ、バイオリアクタ、ディスポーザブル・バイオリアクタ・バッグ、培養チャンバ等であってもよい。

ここで使用される場合、「ｖｖｍ」は、１分当たりの容器体積を意味する。

（理論的側面）
（ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ培養におけるＯ_２移動）
ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭのＯ_２移動速度を決定するために、オンラインＤＯプローブに対する十分に速い応答時間、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭにおける理想的な混合、及び液相界面による物質移動抵抗の支配を仮定する。これらの仮定の下で、以下の物質収支式は、気相から液相へのＯ_２移動の速度を概算する：

ここで、Ｏ_２ ^＊は、培地中の飽和ＤＯ濃度であり、またＯ_２は、培地中のＤＯ濃度である。時間ゼロでＯ_２をゼロとすると、式は

となる。
時間の関数として、

をプロットすることにより、最適合線の傾きは、このシステムのｋ_Ｌａを提供する。

ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭのＯ_２移動の速度（式１）を増加するために、システムのｋ_Ｌａを増加、又は濃度勾配（Ｏ_２ ^＊−Ｏ_２）を増加、又は双方を増加することができる。ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔ^ＴＭシステムのｋ_Ｌａを増加するために、揺動速度、揺動角度、又は空気流量を増加することができる（Mikola, 2007; Singh, 1999）。ガスから液相へのＯ_２移動の推進力を提供する、濃度勾配（Ｏ_２ ^＊−Ｏ_２）を増加するために、流入ガスのＯ_２のパーセンテージを増加してＯ_２ ^＊を増加することができる。

（ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ培養におけるＣＯ_２移動）
単純化されたモデルにおいて、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭのガス状ＣＯ_２（ＣＯ_２（ｇ））は、培養培地の溶存ＣＯ_２（ＣＯ_{２（ａｑ）}）と平衡である。

次にＣＯ_{２（ａｑ）}は、炭酸（Ｈ_２ＣＯ_３）と平衡に存在し、それは重炭酸塩（ＨＣＯ_３ ⁻）に解離することができる

炭酸塩（ＣＯ_３ ^２−）へのＨＣＯ_３ ⁻の更なる解離は、ｐＨ４−８の範囲では無視できる(Royce and Thornhill, 1991)。

培養培地からのＣＯ_２発生の律速段階は、気液物質移動であろう（式３）。界面での液体におけるＣＯ_２濃度は、バルクガスの濃度と平衡であると仮定すると、以下の物質収支式が、液相から気相へのＣＯ_２移動の速度を概算する：

ここで、ｋ_Ｌａ^ＣＯ２は、体積測定溶解二酸化炭素移動係数である。

ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおける溶存ＣＯ_２のプローブなしでは、ＣＯ_{２（ａｑ）}移動の速度を直接算出するための、リアルタイムＣＯ_２測定を実施することができなかった。しかしながら、我々の培養培地における、重炭酸塩緩衝システムについての我々の知識に基づくと、式３及び４における平衡が左に移動するため、我々はＣＯ_２除去が培養ｐＨを増加すと考える。オンラインｐＨプローブの十分に速い応答時間を仮定すると、動的ＣＯ_{２（ａｑ）}移動の研究において生成されるｐＨプロファイルは、ＣＯ_{２（ａｑ）}除去の割合の間接的な推定を提供する。

培養ｐＨを増加するために、系のｋ_Ｌａ^ＣＯ２を増加させることによって、又はＣＯ_２移動の推進力（ＣＯ_{２（ａｑ）}−ＣＯ_２（ｇ））を増加させることによって、又は双方を増加させることによって、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおけるＣＯ_２除去の速度を増加させることができる。具体的には、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムのｋ_Ｌａ^ＣＯ２を増加するために、我々は、揺動速度及び揺動角度を増加することができた。推進力（ＣＯ_{２（ａｑ）}−ＣＯ_２（ｇ））を増加させるために、我々は、流入ガスのＣＯ_２のパーセンテージを低下させ、ＣＯ_２（ｇ）を減少させることができた。ヘンリーの法則によれば、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭヘッド空間のＣＯ_２（ｇ）（ｐＣＯ_２（ｇ））の分圧は、培地のＣＯ_{２（ａｑ）}濃度を制限する：

ここで、Ｈは、ＣＯ_２に対するヘンリーの法則の定数である。

逆に、培養ｐＨを低下させるために、我々は、ＣＯ_{２（ａｑ）}を増加するために流入ガスのＣＯ_２（ｇ）濃度を増加することができ、これは式４の平衡を右へ移す。

（本発明の方法）
本発明の方法では、真核細胞が、細胞の生存を可能にする適切な培養培地及び温度で培養される。当業者に周知のように、様々な細胞タイプが様々な培地で増殖され得る。熟練した技術者は、どの培地が、特定の細胞種及び／又は特定の応用のために最適か容易に選択することができる。本発明の方法において、培地は、ＣＯ_２によるｐＨ調節を可能にするために、重炭酸塩緩衝系を含んでいなければならない。培地は、緩衝剤として作用する更なる薬剤を含み得る。

本発明の方法で用いられうる真核生物細胞は動物細胞を含み、無脊椎動物細胞並びに脊椎動物細胞であり得る。無脊椎動物細胞は、昆虫細胞（例えば、ヨトウガ（Spodoptera frugiperda）、カイコ（Bombyx mori）、及びイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）細胞等）を含む。脊椎動物の細胞は、哺乳類及び非哺乳類細胞を含む。脊椎動物細胞は、これに限定されるものではないが、カエル（例えばアフリカツメガエル（Xenopus laevis））、ウサギ目（例えばウサギ及びノウサギ）、齧歯類（例えばラット、ハムスター、スナネズミ（jirds）、アレチネズミ（gerbils）及びマウス）、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ、非ヒト霊長類及びヒトからのものを含む。

本発明の方法で使用される細胞は、組換え又は非組換え細胞であり得る。組換え細胞は、特定のタンパク質（例えば、安定に又は一過性にトランスフェクトされた細胞）を発現するために操作された細胞、又は特定のＲＮＡｓ（例えばｓｉＲＮＡ、リボ酵素等）を生産するために操作された細胞を含みうる。

適切な培地中の細胞が、培養容器に入れられ、ガスがヘッド空間に注入される。幾つかの実施態様では、ヘッド空間クリアランス速度は、約０．００２〜０．１ｈｖｍの範囲内である。幾つかの実施態様では、ヘッド空間クリアランス速度は、約０．００７〜０．０８ｈｖｍの範囲内である。幾つかの実施態様では、ヘッド空間クリアランス速度は、約０．００９〜０．０６ｈｖｍの範囲内である。幾つかの実施態様では、ヘッド空間クリアランス速度は、約０．０１〜０．０４ｈｍｖの範囲内である。幾つかの実施態様では、ヘッド空間クリアランス速度は、約０．０２〜０．０３ｈｖｍの範囲内である。さらに他の実施例では、ヘッド空間クリアランス速度は、約０．００９〜０．０２４ｈｍｖの範囲内である。更なる実施例では、ヘッド空間クリアランス速度は、約０．００７〜０．０２ｈｖｍの範囲内である。「ｈｖｍ」は、ヘッド空間体積（Ｌ）に対するガスの体積流量の割合（Ｌ／分）である。

幾つかの実施態様では、例えば、２０Ｌの培養体積及びヘッド空間体積３０Ｌを有する５０ＬのＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭバッグにおいて、容器へのガスの流量は０．１Ｌ／分〜１Ｌ／分である。幾つかの実施態様では、バッグへのガスの流量は０．２Ｌ／分である。幾つかの実施態様では、流量は０．３Ｌ／分である。他の実施態様において、ガスの流量は０．４Ｌ／分である。更に他の実施例において、ガスの流量は０．５Ｌ／分である。他の実施態様において、ガスの流量は０．６Ｌ／分である。他の実施態様において、ガスの流量は０．７Ｌ／分である。更に他の実施例では、流量は０．８Ｌ／分である。他の実施態様では、流量は０．９Ｌ／分である。

一般に、細胞培養は、約６〜８の範囲内に維持されなければならない。幾つかの実施態様では、ｐＨは、約６．６〜７．６の範囲の中で維持される。幾つかの実施態様では、ｐＨは、約６．９〜７．５の範囲の中で維持される。幾つかの実施態様では、ｐＨは、約６．８〜７．２の範囲の中で維持される。幾つかの実施態様では、ｐＨは、約７．０〜７．３の範囲の中で維持される。本発明の方法は、培養における細胞の増殖に貢献するｐＨの維持のための、ｐＨのモニタを必要としないが、本発明の幾つかの実施態様では、培養物のｐＨが（断続的に又は連続的に）モニタされ得る。測定は、ｉｎ ｓｕｔｕ又はオフラインで成され得る。

本発明の幾つかの実施態様では、ＤＯは、１０％より上に維持される。他の実施態様において、ＤＯは、２０％より上に維持される。他の実施態様において、ＤＯは、３０％より上に維持される。他の実施態様において、ＤＯは、４０％より上に維持される。他の実施態様において、ＤＯは、５０％より上に維持される。他の実施態様において、ＤＯは、６０％より上に維持される。他の実施態様において、ＤＯは、７０％より上に維持される。他の実施態様において、ＤＯは、８０％より上に維持される。他の実施態様において、ＤＯは、９０％より上に維持される。

液体培地におけるＣＯ_２濃度のモニタリングは、当技術分野において周知であり、市販の技術を使用して達成されうる。測定は、現場で又はオフラインでなされうる。

本発明の方法の特定の例示的な実施態様では、細胞が段階的に培養される回分法（バッチプロセス）が使用される。この方法では、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムの５０Ｌバッグが、２０Ｌの培養物の作業体積で使用され、ヘッド空間は、１日目の間、８％ＣＯ_２（ｖ／ｖ）ガスで、２日目には５％ＣＯ_２（ｖ／ｖ）ガスで、その後２％ＣＯ_２（ｖ／ｖ）ガスで補充されるガスが注入される。ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭは、０．２Ｌ／分接種のために、２１ｒｐｍ、１０°で、０．２Ｌ／分スケールアップステージのために、２３ｒｐｍ、１０°で揺動される。この構成では、ｐＨは使用されるパラメータによって維持されるため、ｐＨをモニタする必要がない。

本発明の方法の特定の例示的な実施態様では、潅流プロセスが用いられる。この方法では、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭの５０Ｌバッグが、２０Ｌの培養物の作業体積で、使用される。バッグは、潅流の開始の２日後に、３０％Ｏ_２（ｖ／ｖ）で補充されるガスを注入される。ガス流量は、０日目に０．２Ｌ／分から段階的に増加され、３日目に０．４Ｌ／分まで増加され、そして６日目に０．６Ｌ／分まで増加される。この構成では、ｐＨは使用されるパラメータによって維持されるため、ｐＨをモニタする必要がない。

本発明の方法の別の特定の例示的な実施態様では、潅流プロセスが用いられる。この方法では、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭの５０Ｌバッグが、２０Ｌの培養物の作業体積で、使用される。バッグは、潅流の開始の２日後に、３０％Ｏ_２（ｖ／ｖ）で補充されるガスを注入される。ガス流量は、０．６Ｌ／分の一定の流量に保たれる。この構成では、ｐＨは使用されるパラメータによって維持されるため、ｐＨをモニタする必要がない。

本発明の方法の更に別の特定の例示的な実施態様では、潅流プロセスが用いられる。この方法では、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭの５０Ｌバッグが、２０Ｌの培養物の作業体積で、使用される。バッグは、潅流の開始の２日後に、３０％Ｏ_２（ｖ／ｖ）で補充されるガスを注入される。ガス流量は、１．０Ｌ／分の一定の流量に保たれる。この構成では、ｐＨは使用されるパラメータによって維持されるため、ｐＨをモニタする必要がない。

当業者にとって、培養条件のパラメータ（ガス濃度、流量、ｈｍｖ、揺動速度、揺動角度、その他）が、所望の範囲を有するｐＨを達成するために、本願明細書の教示を用いて調節されてもよいことは、明らかであろう。

（装置）
細胞培養培地を収容する容器は、いかなる特定のサイズにも限られない。本発明の容器は、当該技術分野で用いられる一般的に用いられるバイオリアクタ及びディスポーザブル培養バッグのサイズに適合化され得、またより大きな又はより小さな培養に適応させることもできる。

容器は、容器を製作するために使用される材料に制限されない。容器は、例えばガラス又は硬いプラスチックのような硬質材料から製造される得、又は例えばディスポーザブル型バイオリアクタバッグを製造するために使用される柔らかいプラスチック等の柔質な材料で製造され得る。

容器は、攪拌される時に、培地の乱流を増加させるためにバッフルを任意に含んでいてもよい。

容器には、ガス及び液体の添加又は除去を可能にするために、一又は複数のポートを具備せしめることができる。ガスは、一又は複数のポートによって、ヘッド空間に充填され、またヘッド空間から除去されうる。一実施態様では、ガスの流出入双方を可能にする一つのポートが存在する。他の実施態様では、２つのポートがある：一つはガスの流入のためであり、一つはガスの流出のためである。他の実施態様では、複数のポートが、ガスの流出入を可能にするために使用される。

幾つかの実施態様では、装置は、また、連続的に又は断続的に細胞培養培地のｐＨをモニタするｐＨモニタを有しうる。ｐＨモニタは、ＣＯ_２濃度を変更して細胞培養培地のｐＨを調節するために、容器のヘッド空間にガスを供給し又はそこからガスを除去する自動化システムと連結して使用されうる。

幾つかの実施態様では、本発明の装置は、培地のＣＯ_２の濃度の指標として、溶存ＣＯ_２の分圧を連続的に又は断続的にモニタするＣＯ_２のためのモニタを含む。ＣＯ_２モニタは、ＣＯ_２モニタによって測定されたＣＯ_２の実際の濃度を調節して濃度を予め定められた値に調節するように、溶存ＣＯ_２濃度を変更するために、容器のヘッド空間にガスを供給し又はそこからガスを除去する自動化システムと連結されて使用されうる。

幾つかの実施態様では、本発明の装置は、細胞培養培地の温度を、連続的に又は断続的にモニタする温度のためのモニタを含む。温度モニタは、モニタによって測定された実際の温度を予め定められた値に調節するように、温度を増減する自動化システムと連結されて使用されうる。

様々なパラメータモニタは、単独で又は組み合わせで使用され得、またコンピュータによって制御される自動化システムを使用して制御され得る。コンピュータは、細胞培養培地のｐＨを調節するために、ガスと共に注入されるか又はヘッド空間から除去されるＣＯ_２の量を決定するのに必要な演算を実施するようにプログラムされうる。コンピュータはまた温度、攪拌度合い、培地の潅流及び他のパラメータに関する演算を実施し、また自動的にパラメータを調節する手段を制御しうる。

場合によっては、本発明の装置は、細胞培養培地が、静的ではなく、ヘッド空間のガスと動的界面をなすように、容器を攪拌するアジテータを含む。攪拌は、細胞培養培地への又は培地からのガスの拡散を促進する。アジテータは、当該技術分野で知られているいかなる形でもあってもよいが、シェーカ、オービタルシェーカ、ローテータ、８の字シェーカ、揺動プラットフォーム、回転プラットフォーム等の非制限的な例を含む。

自動化されたガス移送及びガスパージシステムは、容器へのガス流の速度を制御するための制御ゲージを備えた無菌フィルタにより加圧ガスを移送するために弁及びポンプシステムを含むことができる。ガスの移送及びガスの除去のための、当該技術分野で知られているいかなる手段も、使用されうる。ガスは、細胞培養培地の溶存ＣＯ_２の濃度が予め定められた値から逸脱したときにコンピュータで算出される信号に応答して導入されうる。ＣＯ_２の測定濃度が予め定められた値から逸脱する場合、自動化システムは、システムに加えられるか又はシステムから除去される必要があるＣＯ_２の量を算出し、内在ガスは流出ポートから除去されるに従って、適切な量のＣＯ_２を含むガスがヘッド空間に導入される。コンピュータは、本明細書で定義される式１、２及び／又は３を含む演算、及び利用できる文献、市販のシステム及び本願明細書における教示に基づいた、当業者に知られているシステムを調節するための他の演算を実施し得る。

別法では、又はモニタされたＣＯ_２濃度を使用する応答システムと連動して、自動化システムは、また、培養培地のｐＨを測定し、測定されたｐＨが細胞を培養するための所定のｐＨから逸脱するときに応答しうる。自動化システムは、ＣＯ_２濃度及び／又はｐＨの逸脱に対して応答し得、培養培地のｐＨを適切に調節するように内在ガスを除去しながら、ガスと共に適切な量のＣＯ_２を導入しうる。

装置及び方法を、図１を参照して、非限定的な例において説明する。培養容器（４０）は、細胞培養培地及び細胞（１１０）及びヘッド空間（１３０）を含んでいる。フィルタ（５０）を有するガス流入ポート（７０）が、ヘッド空間（１３０）へのガスの注入を可能にするために容器（４０）に連結されている。フィルタ（６０）を有するガス流出ポート（８０）が、ヘッド空間（１３０）からのガスの流出を可能にするために容器（４０）に連結されている。容器は、細胞培養培地（１１０）の揺動動作及び攪拌を可能にするために、ロッカー（２０）及び基台（１０）に連結されたプラットフォーム（３０）に置かれる。ヘッド空間（１３０）内の攪拌及びガス流は、細胞培養培地（１１０）に流出入するＯ_２及びＣＯ_２の拡散を可能にする。培養容器に細胞を保持するための任意の潅流フィルタ（９０）は、必要に応じて細胞培養からの使用済み培養培地の除去を可能にするため、管（１００）を介して培地ポート（１２０）に連結されている。
細胞は、容器（４０）中の細胞培養培地（１１０）で培養される。容器（４０）のヘッド空間（１３０）は、ガスで満たされる。ガス流入ポート（７０）及び流出ポート（８０）を通るガス流は、ガスが、ヘッド空間（１３０）内を流れ、培養物が、基台（１０）に取り付けられたロッカー（２０）上のプラットフォーム（３０）の揺動動作によって撹拌されるに伴い、細胞培養培地（１１０）からヘッド空間（１３０）へ拡散するＣＯ_２を排出することを可能にする。細胞培養培地（１１０）の溶存ＣＯ_２の減少は、細胞培養培地（１１０）のｐＨの増加を引き起こす。

細胞培養培地（１１０）には、場合によっては、培地管（１４０）通り培地ポート（１５０）を通って供給される新鮮培地が補充され得、また潅流フィルタ（９０）を通り培地管（１００）を上がってそして培地流出ポート（１２０）を通り抜け除去さる。本発明の方法のこの任意的な特徴では、元の細胞培養培地の栄養が枯渇し、また細胞老廃物が蓄積しｐＨが減少すると、新鮮培地が供給される。新鮮培地は、細胞培養培地を所定の最適ｐＨ範囲にするために混合する際に、全細胞培養培地のｐＨの増加を導くのに十分な予め定められたｐＨで供給される。

（Ａ．原理）
大部分の哺乳類細胞培養系は、重炭酸塩を含有する細胞培養培地を利用するので、哺乳類細胞培養におけるｐＨ制御は、塩基／ＣＯ_２添加によって主に実施される。ｐＨ制御は、炭酸-重炭酸塩緩衝液系を利用する。このようなシステム、例えばディスポーザブル型バイオリアクタバッグ等では、培養のｐＨを、培地の溶存ＣＯ_２の濃度を操作することによって調節でき、これはヘッド空間のＣＯ_２の濃度を調節することによって調節されうることが発見された。双方向ｐＨ調節は、本願明細書の実施例において、ヘッド空間のＣＯ_２濃度を調節することによって可能であることが示される。この方法は、細胞培養バイオリアクタシステムのｐＨを増加するための、塩基の使用を排除する。ディスポーザブル型バイオリアクタの細胞培養のｐＨを減少させる必要がある場合、ヘッド空間のＣＯ_２の濃度を、ＣＯ_２を含む流入ガスを補充することによって増加させることができる。これは、ＣＯ_２を細胞培養に移動せしめることを可能にする。ディスポーザブル型バッグの細胞培養のｐＨが増加される必要がある場合、細胞培養からのＣＯ_２の除去を促進するために、ヘッド空間のＣＯ_２濃度を減少させ又はヘッド空間クリアランス速度を増加させることができる。

ｐＨ維持のこの方法は、バイオリアクタ中のガス移動が、バイオリアクタにおいて作られる大きな表面積によって主に促進されるバイオリアクタシステムに拡張されうる。

（細胞バンクプロセスにおけるＣＯ_２添加／除去に基づくｐＨ維持ストラテジー）
細胞培養の初期段階の間、比較的少ない数の細胞が存在する時に、細胞培養のｐＨは概して上昇する。ｐＨを制御するために、ＣＯ_２を典型的にはバイオリアクタに加えてｐＨを低減させる。通常、この添加は、通常の攪拌タンクバイオリアクタにおいて細胞培養へＣＯ_２ガスを散布することによって達成される。本発明のディスポーザブル型バイオリアクタでは、ヘッド空間中のＣＯ_２濃度は、ＣＯ_２移動の方向が気相から液相へとなるように変更される。細胞濃度が培養の経過に伴って増加するにつれて、細胞培養のＣＯ_２濃度も増加し、これにより典型的にはｐＨが減少する。通常のｐＨフィードバック制御を伴う通常の撹拌タンクバイオリアクタでは、ｐＨを制御するために塩基が加えられる。塩基の添加は、細胞培養のｐＨを増加させる。本発明のディスポーザブル型バイオリアクタでは、ｐＨの増加は、ヘッド空間中のＣＯ_２の濃度を減少させること、並びにヘッド空間のクリアランス速度を増加させることによって、ＣＯ_２移動の方向を逆転させることによって達成することができる。培地中のＣＯ_２濃度を管理することによって細胞培養のｐＨを維持するこの方法は、塩基の使用を排除することを可能にする。要求（ｐＨを増加又は減少させる）に基づいて、ヘッド空間中のＣＯ_２濃度を、それぞれ減少又は増加させることができる。

ディスポーザブル型バイオリアクタシステムは、限定するものではないが、例えばＭａｓｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋｓ（ＭＣＢ）及びＷｏｒｋｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋｓ（ＷＣＢ）等の、高細胞密度細胞バンクを作製するバイオリアクタシステムとして使用されうる。潅流細胞培養プロセスは、ディスポーザブル型バイオリアクタにおいて、高細胞密度細胞バンクの製造を可能にすると考えられる。ＭＣＢｓ及びＷＣＢｓを作製するための細胞培養プロセスを開発しながら、ＣＯ_２の添加／除去アプローチはｐＨ維持のために提案される。ｐＨを維持するためのガス移動アプローチに加えて、細胞培養の潅流は、ｐＨを維持する更なる機会を可能にする。潅流細胞培養プロセスにおいて、新鮮細胞培養培地がバイオリアクタに連続的に加えられ、使用された培養培地が連続的に除去される。潅流は、細胞培養のｐＨに潜在的に影響を及ぼす細胞培養副産物の除去を可能にする。細胞培養副産物の除去に加えて、入ってくる新鮮細胞培養培地のｐＨは、また、細胞培養のｐＨを変えることができる。細胞培養のｐＨが減少することが分かっている場合、流入培地のｐＨは、ｐＨの減少を補うために増加されうる。あるいは、潅流の率は、また、培養ｐＨを管理するために変えられることができる。上記の全方法は、ｐＨに影響を及ぼすが、ｐＨに影響を及ぼす最も重要な要因はＣＯ_２移動方法である。ＣＯ_２移動はまた、ディスポーザブル型バイオリアクタのガス流量及びＣＯ_２補充が、多くの問題無く効果的に制御されうるため、より信頼性が高い方法である。

ｐＨ及びＤＯフィードバック制御なしで、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおいてＣＨＯ細胞を培養する我々の最初の試みの間、我々は、幾つかの課題を特定した（図５）：（１）回分培養段階（０−６日目）の間、およそ０．３日^−１での遅い増殖；（２）潅流培養段階（６日目以降）の間、最初の３日の間のおよそ０．５日^−１からその後の０．３日^−１未満への低下となる、次第により遅くなる増殖；（３）最初の培養ｐＨは、時に７．３を上回り、その後の培養ｐＨはしばしばｐＨ６．８を下回った；そして（４）６日目の潅流開始後、ＤＯレベルは、しばしば空気飽和の２０％を下回った。我々は、他のＭＡｂｓを生成するＣＨＯ細胞株を使用する場合に同じ課題に遭遇した（データは示さない）。回分培養の遅い増殖は高い最初のｐＨに起因し、潅流培養の増殖速度の下降は減少するｐＨ及びＤＯに起因すると考えた。

ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおいてｐＨフィードバック制御がない場合、これらの重炭酸塩緩衝培養物のｐＨは、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭのヘッド空間中のＣＯ_２含有量に依存する。培地中の重炭酸塩及びＨＥＰＥＳバッファの存在に関わらず、培養ｐＨは、乳酸塩蓄積の結果として、最終的に時間と共に低下する。培養ｐＨを我々の所望の６．８−７．２の範囲に維持するための、我々のストラテジーは、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭのＣＯ_２濃度を操作することであった。我々は、回分培養の初期段階の間に、ｐＨを減少させるために、培地へのＣＯ_２移動を増加する。逆に、我々は、バッチ又は潅流培養の後の段階の間、ｐＨを増加するために、ＣＯ_２を培地から除去する。ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおいてＤＯフィードバック制御がない場合、ＤＯレベルは、細胞密度の増加と共に低下する。ＤＯを空気飽和の２０％より大きく維持するために、我々は、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムの体積酸素移動係数（ｋ_Ｌａ）を増加することによって、また流入ガスにＯ_２を補充することによって、培養組織へのＯ_２移動を増加させる。

（Ｂ．材料及び方法）
（１．ＣＨＯ細胞株及び細胞培地）
実施例において使用される全ての細胞株は、無血清浮遊培養において増殖するよう適合されたＣＨＯジヒドロ葉酸還元酵素欠失（ＤＨＦＲ−）宿主に由来した。特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生産する各細胞株は、ＤＨＦＲ、ＭＡｂ軽鎖（ＬＣ）及びＭＡｂ重鎖（ＨＣ）をコードするＤＮＡプラスミドを用いてＤＨＦＲ-宿主をトランスフェクトすることによって生成された。安定にトランスフェクトされた細胞は、メトトレキセートを含む私有の既知組成選択培地において、２−５日毎に継代することによってその後維持された。私有の混合養分に加えて、１．０ｇ／ＬのプルロニックＦ-６８、２．４４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む同じ培地が、バッチ及び潅流モード双方での、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおける細胞培養のために使用された。

（２．ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステム）
バッチ又は潅流モードでＣＨＯ細胞を培養するために使用されるＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステム（GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA）は、揺動プラットフォーム、制御ユニット、及び流出入ガスフィルタ及び複数のサンプリングポートを有する、予め殺菌され、可撓性であり、またディスポーザブルであるバッグから構成された（Singh, 1999; Tang等, 2007）。各システムは、それぞれ、温度制御及び必要とされる流入ガス組成（空気と混合されたＯ_２及び／又はＣＯ_２）を提供するために、加熱パッド及びガス混合ボックスを備えた。全ての細胞培養実験は、６又は２０Ｌの作用体積である５０ＬのＣｅｌｌｂａｇ^ＴＭを使用して、３７℃の温度設定値、１９−２５ｒｐｍの揺動速度、及び８−１２°の揺動角度で実施された。オンラインｐＨ又はＤＯプローブは、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭに設置されなかった；代わりに、異なるガス混合及びガス流量ストラテジーが、培養ｐＨ及びＤＯレベルを目標の範囲内に維持するそれらの能力のために試験された。

（３．ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおける回分培養）
回分培養は、通常の又は潅流Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭを〜７．５×１０^５細胞／ｍＬで接種をすることによって、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおいて６Ｌで始められた。接種の２、３後日、培養組織が充分な細胞集団を蓄積した時に、新鮮培地が、作用体積を２０Ｌに増加するために加えられた。各継代で、培養組織は、回分モードで２−５日保たれた。

（４．ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおける潅流培養）
他に明記しない限り、回分培養が、潅流Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭにおいて２０Ｌの作用体積での充分な細胞集団を蓄積した後、２３ｒｐｍの揺動速度、及び１０°の揺動角度、及び一日当たり１作用体積の潅流流量で開始された。潅流Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭにおける細胞保持機器は、培養プロセスの間、液表層を浮遊するフィルタから成った（Tang等, 2007）。潅流フィルタは、細胞をＣｅｌｌｂａｇ^ＴＭに保持するが、新鮮培地が添加され、また濾過物は連続的に除去された。一日当たりの一作用体積の、新しいメディアの添加と、濾過物除去率とを一致させることによって、一定の体積が、潅流ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおいて維持された。

（５．撹拌タンクバイオリアクタ培養）
ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ及び撹拌タンク・バイオリアクタにおける培養の性能を比較するために、同じシードトレインソース（seed train source）からの細胞が、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭバイオリアクタ及び２０Ｌのステンレス鋼撹拌タンク・バイオリアクタ（Applikon, Foster City, CA, USA）に、〜７．５×１０^５細胞／ｍｌで接種された。細胞は、まず回分モードで培養され、そして、十分な細胞集団の蓄積の上で潅流は開始された。作用体積は、撹拌タンクバイオリアクタにおいて、回分モードで７Ｌであり、潅流モードでは１５Ｌであった。培養温度、ＤＯ及び攪拌は、それぞれ３７℃、空気飽和の３０％及び１２５ｒｐｍに保たれた。培養ｐＨは７．１５に保たれ、不感帯は０．０３であり、ｐＨを増加するために１Ｍの炭酸ナトリウムの添加又はｐＨを減少させるためにＣＯ_２ガスの散布によって維持された。潅流動作の間、Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ遠心分離システム（Centritech AB, Norsborg, Sweden）が、増殖培地から細胞を分離するために使用された；細胞は遠心分離機により保持されバイオリアクタに戻され、上澄みは取り除かれた（Johnson等, 1996）。一日当たりの一作用体積の、新鮮培地の添加の割合と上澄み除去率とを一致させることによって、バイオリアクタにおける一定の体積が保たれた。

（６．オフラインサンプル分析）
培養組織は、生細胞濃度（ＶＣＣ）及び生存率（Vi-Cell AS, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA）、並びにｐＨ、ＤＯ、ｐＣＯ_２、ブドウ糖及び乳酸塩に対して、サンプルが採られ分析された（Bioprofile 400, Nova Biomedical, Waltham, MA, USA）。

（実施例１：無細胞実験：ガス移動の測定）
Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭにおけるガス移動特性は、それらのＤＯ及びｐＨレベルへの影響のため、培養性能に影響を及ぼす。我々の所望の範囲内にｐＨ及びＤＯを維持することに対する第１のステップとして、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭにおける無細胞研究が、Ｏ_２及びＣＯ_２移動を測定するために実施された。

（Ａ．Ｏ_２移動実験）
５０ＬのＣｅｌｌｂａｇ^ＴＭにおけるＯ_２移動が、模擬培養培地を使用して、揺動速度（２０、３０及び４０ｒｐｍ）、揺動角度（８°、１０°及び１２°）及びガス流量（０．１、０．２及び０．３Ｌ／分）の様々な組合せで、体積測定Ｏ_２移動係数（ｋ_Ｌａ）を算出することによって特徴づけられた。古典的な動的ガス放出方法が、ｋ_Ｌａを算出するために用いられた（Dunn and Einsele, 1975）。これらの研究のために使用された試験培地は、専有の細胞培養培地をシミュレーションするように設計された：１．０ｇ／ＬのプルロニックＦ-６８、２．４４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム及び１５ｍＭのＨＥＰＥＳから成った。同じ製造業者（Broadley-James Corporation, Irvine, CA, USA）からの、Ｍｏｄｅｌ４０トランスミッターに連結されたＯｘｙＰｒｏｂｅ（登録商標）ＤＯプローブが、オンラインＤＯ測定を提供するために使用された。

Ｏ_２移動試験に備えて、５０ＬのＣｅｌｌｂａｇ^ＴＭが２５Ｌの模擬培地で満たされた後、窒素（Ｎ_２）がガス流入ポートに通された。バッグは、Ｎ_２の擬培地への移動を促進するために揺動された。ヘッド空間へのＮ_２の流入は、擬培地のＤＯ量が空気飽和の１０％を下回った時に、停止された。この脱酸素化過程の後、バッグは、ヘッド空間から残留Ｎ_２を放出するために押圧された。気液界面へのかく乱を最小化すると共に、バッグのヘッド空間に圧縮ガスが加えられた。バッグが十分に膨らまされると直ぐに、Ｏ_２移動試験が、規定の揺動速度、揺動角度及びガス流量で開始された。ＤＯ濃度において生じた増加が記録され、システムのｋ_Ｌａを決定するために用いられた。更に、オフラインＤＯが、最初の５分の間毎分、その後毎５分で、オンラインＤＯ測定の精度を検証するために測定された。

一定の空気流量では、揺動速度又は揺動角度を増加することは、おそらく酸素移動のための表面積を増加することにより、ｋ_Ｌａを増加した（図２Ａ）。試験された最低の揺動速度（２０ｒｐｍ）で我々が得たｋ_Ｌａ数値は、他の研究者がＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムのために報告したものと同程度である（Mikola等, 2007; Singh, 1999）。これらのｋ_Ｌａ数値は、また、我々の社内撹拌タンク・バイオリアクタで得られたそれらと同等である（データは示さず）。

２０ｒｐｍの一定の揺動速度での、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムのＯ_２移動研究において、２Ｌのスケールでは、空気流量を０．０１ｖｖｍから０．０５ｖｖｍまで増加することは、ｋ_Ｌａを２ｈ^−１から３ｈ^−１まで増加し、また２０Ｌのスケールでは、空気流量を０．０１ｖｖｍから０．１ｖｖｍまで増加することは、ｋ_Ｌａを０．５ｈ^−１から３ｈ^−１まで増加した（Singh, 1999）。対照的に、５０Ｌのスケールでの我々の研究では、揺動速度及び揺動角度の２つの異なる組合せでは、空気流量を０ｖｖｍから０．０２ｖｖｍまで増加することは、ｋ_Ｌａを増加しなかった（図２Ｂ）。我々が使用した最大空気流量は、ｋ_Ｌａに何れかの重要な影響を及ぼすために、気液界面で液可動性に影響を及ぼすには低過ぎたことが考えられる。

５０Ｌのディスポーザブル型バッグの酸素移動容量が、物質移動係数、ｋ_Ｌａを決定することによって評価された。図２Ｃは一定のガス流量での経時のＤＯ濃度を示し、また、図２Ｄは溶存酸素へのガス流量の効果を示す。積極的な揺動条件（より高い揺動速度及び揺動角度）では、物質移動係数は高い。驚くべきことに、ヘッド空間クリアランス速度は、しかしながら、酸素移動に関しては、ｋ_Ｌａに影響を及ぼさない。模擬培地は、実験の開始前に脱酸素化された。ガスの酸素濃度は、模擬培地の酸素濃度より高かった。それ故、酸素は、気相から液相に移動された。積極的な揺動条件では、より多くの波形成により、気液体界面が増加する（これは、本明細書において、動的界面を有すると称される）。表面積におけるこの増加は、高い割合の酸素移動を生じると考えられる。ガス流量が増減される時、ヘッド空間クリアランス速度がそれに応じて変わる。ヘッド空間クリアランスにおける変化は、気液相間の酸素の濃度差を変えない。従って、ガス流量は、酸素の物質移動係数に影響を及ぼさないと考えられる。模擬培地の酸素の濃度がヘッド空間のそれに等しい時に、酸素移動は止まる。

（Ｂ．ＣＯ_２移動研究）
Ｏ_２移動研究で使用された方法によって、模擬培地が脱酸素化された後、Ｎ_２を供給するために使用された同じ流入ポートを通してＣＯ_２がＣｅｌｌｂａｇ^ＴＭに供給された。オンラインｐＨプローブが７．０を読んだ時に、ＣＯ_２の供給が止められ、ヘッド空間はＯ_２移動研究に記載されている同じ方法を使用して除去された。バッグが十分に膨らまされた時に、ＣＯ_２移動試験が、揺動速度、揺動角度及びガス流量の規定された条件で開始された。ｐＨに生じた増加は、同じ製造業者（E Healthcare, Piscataway, NJ, USA）によって提供されるｐＨ２０トランスミッターに連結されたディスポーザブルのオンラインｐＨプローブを用いて記録された。ＣＯ_２が重炭酸塩塩基の模擬培地から除去されたので、ｐＨは増加した。オンラインｐＨ計測の精度を検証するために、模擬培地のオフラインのｐＨが、最初の５分の間毎分、その後、５分毎に測定された。時間に対するオンラインｐＨ測定をプロットすることにより、ベストフィットラインの傾きは、ｐＨ変化の割合を提供し、またこれにより、模擬培地からＣｅｌｌｂａｇ^ＴＭのヘッド空間へのＣＯ_２移動の割合を示した。

他の研究者が、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおけるＯ_２移動を特徴付けたが（Mikola等, 2007; Singh, 1999）、我々は、波誘導の攪拌を有する細胞培養系における、ＣＯ_２移動に関する報告を見出してはいない。ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおけるＣＯ_２移動を特徴づけるために、我々は、我々の細胞培養培地と同じ濃度（２．４４ｇ／Ｌ）で重炭酸ナトリウムを含んでいる模擬培地を使用した。この重炭酸塩緩衝無細胞システムにおいて、液相からのＣＯ_２除去は、活発なｐＨ制御無しで、システムのｐＨを増加する。模擬培地の直接のＣＯ_２測定のためのＣＯ_２プローブに依存する代わりに、我々は、ＣＯ_２除去の相対的な割合を評価するために、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭのオンラインｐＨプローブからのｐＨプロファイルを使用した。

この研究において、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭのｐＨプロファイルは、２相に分けられた（図３Ａ及び３Ｂ）。第一相では、ｐＨは、０〜５分の間、毎時〜１−４ｐＨ単位で急増された。第二相では、ｐＨは、毎時＜０．５ｐＨ単位で、５から６０分まで徐々に増加された。この第二相の間（５-６０分）、異なる揺動速度及び揺動角度は、ｐＨ増加の割合に、無視できる程の影響を及ぼした：０．２Ｌ／分の一定の気流量で、揺動条件に関わりなく、ｐＨは毎時０．２の単位で増加した（図３Ａ）。対照的に、より高い空気流量は、この第二相の間（５−６０分）、ｐＨ変化の割合を増加した：気流量が０Ｌ／分から０．６Ｌ／分まで増加する時に、ｐＨ変化の割合は毎時０−０．１の単位から毎時０．４の単位まで増加した（図３Ｂ）。気流がない場合（０Ｌ／分）、第二相の間（５−６０分）に観察された、最小のｐＨ増加（毎時０．１単位以下）は、模擬培地及びＣｅｌｌｂａｇ^ＴＭのヘッド空間間のＣＯ_２交換が、およそ５分での平衡に近づいたことを示唆する。最初の５分を越えて更なるｐＨの増加を得るために、ＣＯ_２除去のための推進力が、空気流量を上げて、ヘッド空間・クリアランスの割合を増加して、これによりヘッド空間のＣＯ_２濃度を最小化することによって、増強されうる。

図３Ｃは、図３Ａからのデータの、算出されたｐＨの変化の割合を示す。図３Ｄは、図３Ｂからのデータの、算出されたｐＨの変化の割合を示す。二相性の挙動は、波の高い表面積及び流入ガスによるヘッド空間の連続的なスイーピング双方による、高いガス移動率によって説明され得る。高い表面積は、液相から気相への速いＣＯ_２移動を容易にする。速い移動は、気液相間のＣＯ_２の濃度差の結果である。この濃度における差は、実験の開始時に、最も高く、この差は、よりＣＯ_２が液相から気相に移動されるに従い連続的に減少された。気液相間のＣＯ_２の濃度差が減少するにつれ、ｐＨの変化の割合もまた、減少した。図３Ａにおいて、ｐＨの変化の割合は、第二相（５−６０分）と比較して、第一相（０−５分）で非常に高かった。ガス流量は、図３Ａに示される場合では同じに保たれた。最初のＣＯ_２の移動の後、ＣＯ_２移動の割合は、ヘッド空間のＣＯ_２濃度に依存する。同じヘッド空間クリアランス速度では、最初の５分の後のｐＨの変化の割合は、揺動条件に関係関わらず同じであった。ｐＨの変化率の算出された値は図３Ｃに示される。

ガス流量が変化した場合、ヘッド空間のクリアランス速度もまた変化した。異なるガス流量に対するｐＨの上昇のデータが、図３Ｂに示される。二相性の挙動が、これらのケースについても観察された。しかしながら、同じガス流量を有する場合とガス流量が異なる場合との間で、違いは、同じガス流量でのケースの場合に類似であることと比較して、第二相（５−６０分）のｐＨ変更率はガス流量に依存して変化することである。ガス流量の変化が、ヘッド空間クリアランスの割合を変化させるため、ヘッド空間のＣＯ_２は異なる割合で除去された。
最初の速いガス移動は、ディスポーザブル型バッグの大きい表面積を作る特性の結果である。この最初のガス移動は、主に揺動条件（揺動速度及び揺動角度）に依存する。しかしながら、培地からのＣＯ_２の継続した除去は、ヘッド空間ＣＯ_２濃度に依存する。ヘッド空間クリアランスの速度は、ガス流量に依存する。

（実施例２：細胞増殖特徴研究）
（Ａ．回分培養）
（１．初期実験）
（細胞培養培地）
無血清細胞培養培地が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を増殖するために使用された。細胞培養培地は、ＤＭＥＭ及びハムＦ-１２の１：１混成に基づく培地を、幾つかの構成要素、例えばアミノ酸、塩類、糖及びビタミンを変更することによって得られた。この培地は、グリシン、ヒポキサンチン及びチミジンを欠く。この培地は、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ（４（２-ヒドロキシエチル）-１-ピペラジンエタンスルホン酸）及び２．４４ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウムから成った。これらの塩類の濃度は、変更されうる。培地は、微量元素、組換えヒトインスリン及び細胞保護剤、Lutrol F-68 Prill（同等のものが使用されうる）で補充された。

（哺乳類細胞培養）
トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、液体窒素に貯蔵された１ｍＬ又は１０ｍＬのバイアルバンクから増殖された。選択された冷凍バイアルは、スピナーフラスコ、振とうフラスコ、又は撹拌タンクバイオリアクタの、重炭酸ナトリウムを含有する培養培地に解凍された。細胞は、２−７日毎に継代された。この培養は、「シードトレイン」と呼ばれる。シードトレインからの細胞は、ディスポーザブル型バッグにおいて細胞培養を開始するために、ディスポーザブル型バッグへ移された。

（分析：）
血液ガス分析定装置（NOVA BioProfileR 400）が、オフライン分析のために用いられた。細胞培養物ｐＨ、溶存酸素及びＣＯ_２の分圧、ブドウ糖、乳酸塩及びアンモニアの濃度が、このオフライン分析定装置を使用して測定された。細胞生存率及び生細胞濃度（ＶＣＣ）測定は、Beckman-Coulter’s ViCellTM AS又はViCellTM XRを使用して成された。細胞濃度測定に加えて、バイオマスの量が、また、血中血球容積（％ＰＣＶ）を記録することによって測定された。

（実施例３：幾つかのＣＨＯ細胞株を用いた詳細な分析）
（Ａ．バッチ・プロセス）
回分培養の過程において、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭに供給されるガスにおけるＣＯ_２濃度を減少させることによって、我々は、最初の高いｐＨ（＞７．３）を低下させ、そして、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムのその後のｐＨ低下少を最小化することが可能となる。幾つかのＣＨＯ細胞株を用いた、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ回分培養において、異なるＣＯ_２ガスストラテジーを試験した後（データは示さない）、我々は、接種及びスケールアップステージ双方に対する、「８-５-２」段階的ストラテジーを規定した：Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭにポンプで送りこまれる空気は、１日目の間８％（ｖ／ｖ）で、２日目の間の５％（ｖ／ｖ）で、その後２％（ｖ／ｖ）でＣＯ_２ガスが補充された。

無細胞研究からの結果に基づいて、以下の揺動速度、揺動角度及び空気流量を、我々のＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ回分培養に対するプロセス設定値として選択した：接種については２１ｒｐｍ、１０°の揺動角度及び０．２Ｌ／分；スケールアップステージについては、２３ｒｐｍ、１０°の揺動角度及び０．２Ｌ／分であった。これらのプロセス設定値の信頼性を試験するために、我々は要因実験（表１）を設計した。プロセス条件が中央点から逸脱する時、試験された両細胞株に対して、我々は細胞増殖及びｐＣＯ_２プロファイルに対するごくわずかな影響を観察し、また、ｐＨは６．８−７．２及びＤＯ＞５０％を維持した（図４）。

（Ｂ．潅流培養）
ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭでの、潅流培養の我々の最初の試みにおいて、６日目の潅流開始後、培養ｐＨは概して６．８を下回り、ＤＯはしばしば空気飽和の３０％を下回った（図５）。潅流流量を上げることなくｐＨ低下を最小化するために、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭへの空気流量の増加の実施可能性を調査し、これは無細胞研究が、増加空気流量はｐＨを増加することを示したからである（図３）。ＤＯ低下を克服するために、我々は、潅流の開始の２日後に、３０％Ｏ_２（ｖ／ｖ）で、Ｃｅｌｌｂａｇ^ＴＭへの気流を補充した。観察されたＤＯ低下（図５）と一致したため、我々はこのタイミングを選択した。

（実施例４：バッチ潅流プロセス）
この潅流プロセスは、２つのバッチステップとその後の潅流ステップから成った。５０Ｌのディスポーザブル型バッグは、接種ステップで、５から７．５×１０^５細胞／ｍＬの標的細胞密度で、６Ｌの作用体積で接種をされた。接種３日後に、スケールアップステップのため、新鮮培地が、ディスポーザブル型バッグの体積を２０Ｌに増加するために加えられた。接種ステップ及びスケールアップステップがバッチステップを構成した。バッチステップでのＣＯ_２段階的低減ストラテジーが、バッチプロセスにて説明したように、使用された。３日のスケールアップステップの終りに、潅流が開始された。新鮮培地がディスポーザブル型バッグに連続的に加えられ、そして、細胞を保持すると共に、使用された培養培地はディスポーザブル型バッグから連続的に除去された。細胞培養培地は、１日当たり２０リットル（１日当たり１体積）の割合で潅流された。潅流培地ｐＨ設定値は７．２単位であった。潅流の開始で、流入ガスのＣＯ_２濃度は、ゼロに設定された。ヘッド空間クリアランス速度は、ＣＯ_２除去を促進するために増加された。図７に示すように、ヘッド空間クリアランス速度の増加は、単ステップ増加もしくはマルチステップ増加が続いた。揺動速度範囲は、１９〜２５ｒｐｍの間であった。揺動角度範囲は、８及び１２度の間であった。温度は３７℃に維持された。細胞の酸素要求量を満たすために、酸素が、潅流開始の４８時間後に補充された。流入ガスにおける酸素濃度は、潅流開始の４８時間後で、３０％に設定された。

図６は、バッチ-潅流プロセス（バッチ工程（０−６日目）及び潅流工程（６−１４日目））の細胞培養実績である（図６Ａ）。図６Ｂは、％細胞生存率を示す。図７Ａは、３つの異なる実験での、ヘッド空間クリアランス速度設定点を示す。潅流ステップのヘッド空間クリアランス速度セットポイントは、異なるプロファイルを見せた（６-１４日目）：（１）２つの一定のヘッド空間クリアランス速度：０．０２ｈｖｍ（-▲-）及び０．１ｈｖｍ（◆）；及び（２）ヘッド空間クリアランス速度の段階的増加：０．００７ｈｖｍ〜０．０１３ｈｖｍ〜０．０２ｈｖｍ（-■-）。単ステップ増加並びにマルチステップ増加双方が実験された。図７Ｂは、オフライン溶存ＣＯ_２濃度を示す。図６Ｄは、生細胞数（ＶＣＣ）の細胞成長である。図６及び７の説明：◆、■、▲は、３つの異なる実施を示す。図６Ｃに示すように、ｐＨは、ヘッド空間のクリアランスによりＣＯ_２を調節することによって、所望の範囲内に維持することができた。

（実施例５：「８-５-２」条件下での６ＣＨＯ細胞株の挙動）
細胞増殖の支持、及び所望の範囲にｐＨ及びＤＯを維持することにおける、このＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭプロセスの信頼性を試験するために、我々のインハウスＣＨＯ細胞株で典型的に観察される細胞増殖及び代謝挙動の範囲を包含する、６つのＣＨＯ細胞株を選択した。

最適化されたプロセス条件では、全ての６細胞株は、バッチ及び潅流培養ステージを通して高い生存率で増殖した（図８）。全ての場合において、ｐＨは所望の６．８−７．２の範囲内を保ち、またＤＯは空気飽和の２０％を超えた。

（実施例６：「８-５-２」ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ方法と一般的な撹拌タンク・バイオリアクタ培養との比較）
ｐＨ及びＤＯ制御を用いた、発明者のＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭプロセスと撹拌タンク・バイオリアクタプロセスとの培養性能を比較するため、我々は両システムにおいて、平行培養を実施した（図９）。増殖長及び生存率プロファイルは、２つのバイオリアクタ・システムの間で類似だった：ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭ及び撹拌タンク・バイオリアクタにおける増殖率は、〜０．５日^−１で同程度であった。ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムのｐＨ及びＤＯのオンライン・フィードバック制御の欠如にもかかわらず、ｐＨ及びＤＯプロファイルは、２つのバイオリアクタ培養間で有意に異ならなかった。

本発明は、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭにおいて、培養ｐＨを６．８-７．２の範囲に、またＤＯを空気飽和の２０％より大きく維持するためのプロセス制御方法を提供し、バッチ及び潅流モード双方で作動され、ｐＨ及びＤＯフィードバック制御に依存しない。ｐＨ及びＤＯ制御無しで、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムにおいてＣＨＯ細胞を培養することの課題を特定した後、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムにおける、揺動速度、揺動角度、及びガス流量の、Ｏ_２及びＣＯ_２移動への影響を決定するために無細胞研究を実施した。流入ガスにおけるＯ_２及びＣＯ_２の濃度と共に、これらのプロセスパラメータを調節することによって、我々は、６つの組換えＣＨＯ細胞株のバッチ及び潅流培養について、ｐＨ及びＤＯを我々の所望の範囲に維持した。ｐＨ及びＤＯのプローブの必要性を除くことにより、この方法は、ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ^ＴＭシステムで細胞を培養することの、より単純でより費用効果的な方法を提供する。これは、また、それらのプローブを備えたＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ^ＴＭにおける、ｐＨ又はＤＯプローブの故障の際に、細胞を培養するための代替の方法を提供する。

また、本願明細書において記載される具体的な例は、例証のためだけであり、本発明の範囲を制限するものではないことが理解される。本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。

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Claims (33)

1. 真核生物細胞を回分培養するための方法において、
   重炭酸塩含有培養液中に真核生物細胞を含んでなる細胞培養物を、容器に供給する工程であって、
   前記容器は、前記細胞培養物及び前記細胞培養物上部の気相ヘッド空間を封入する壁部を有し、かつ前記容器は、前記ヘッド空間に対するガスの流出入を提供する少なくとも一のポートを有する工程；
   前記容器を攪拌する工程；及び
   前記ポートを通して前記ヘッド空間にガスを供給する工程であって、前記ガスはある量のＣＯ_２を含み、前記ガス中のＣＯ_２の前記量は、前記細胞培養物の所定のｐＨを維持するために、前記細胞培養物のｐＨを調整するように経時的に調節される工程
   を含み、前記ＣＯ_２が、１日目に前記ガスの８％（ｖ／ｖ）の量で、２日目に前記ガスの５％（ｖ／ｖ）の量で、その後は、前記ガスの２％（ｖ／ｖ）の量で供給される方法。
2. 前記攪拌が、前記容器を、１５から３０ｒｐｍの揺動速度及び５°から１５°の揺動角度で揺動することによる請求項１に記載の方法。
3. 揺動速度が１９及び２５ｒｐｍの間であり、揺動角度が８°から１２°の間である請求項２に記載の方法。
4. 前記ガスの流量が、０．００１から１．０ｈｖｍの間である請求項１に記載の方法。
5. 前記ガスの流量が、０．００１及び０．００２ｈｖｍの間である請求項４に記載の方法。
6. 前記ガスの流量が、０．００７ｈｖｍである請求項４に記載の方法。
7. 前記真核生物細胞が、脊椎動物細胞である請求項１に記載の方法。
8. 前記脊椎動物細胞が、カエル細胞、ウサギ細胞、齧歯類細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、非ヒト霊長類細胞及びヒト細胞からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
9. 真核生物細胞を潅流培養するための方法において、
   重炭酸塩含有培養液中に真核生物細胞を含んでなる細胞培養物を、容器に供給する工程であって、
   前記容器は、前記細胞培養物及び前記細胞培養物上部の気相ヘッド空間を封入する壁部を有し、かつ前記容器は、前記ヘッド空間に対するガスの流出入を提供する少なくとも一のポートを有する工程；
   前記容器を攪拌する工程；
   前記容器に新鮮培養培地を潅流し、前記容器から使用済み培養培地を除去する工程；及び
   前記容器のヘッド空間から蓄積ＣＯ_２をスイープするために、前記ポートを通して前記ヘッド空間にガスを供給し、これにより、前記細胞培養物の所定ｐＨを維持するために、前記細胞培養物のｐＨを調節する工程
   を含み、前記ＣＯ_２が、１日目に前記ガスの８％（ｖ／ｖ）の量で、２日目に前記ガスの５％（ｖ／ｖ）の量で、その後は、前記ガスの２％（ｖ／ｖ）の量で供給される方法。
10. 前記攪拌が、前記容器を、１５から３０ｒｐｍの揺動速度及び５°から１５°の揺動角度で揺動することによる請求項９に記載の方法。
11. 揺動速度が１９及び２５ｒｐｍの間であり、揺動角度が１２°から８°の間である請求項９に記載の方法。
12. 前記ガスが、前記ガスの０％及び５０％（ｖ／ｖ）の間のＯ_２の量を含む請求項９に記載の方法。
13. Ｏ_２が、前記ガスの２０％及び４０％（ｖ／ｖ）の間の量で供給される請求項１２に記載の方法。
14. Ｏ_２が、１日目及び２日目に前記ガスの０％（ｖ／ｖ）の量において、その後は前記ガスの３０％（ｖ／ｖ）の量において供給される請求項９に記載の方法。
15. 前記ガスの流量が、０．００１から１．０ｈｖｍの間である請求項９に記載の方法。
16. 前記ガスの流量が、０．００１及び０．０３ｈｖｍの間である請求項１５に記載の方法。
17. 前記ガスの流量が、０．０２ｈｖｍである請求項１６に記載の方法。
18. 前記真核生物細胞が脊椎動物細胞である請求項９に記載の方法。
19. 前記脊椎動物細胞が、カエル細胞、ウサギ細胞、齧歯類細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、非ヒト霊長類細胞及びヒト細胞からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
20. 前記容器が、硬質コンテイナである請求項１又は９に記載の方法。
21. 前記容器が、柔質コンテイナである請求項１又は９に記載の方法。
22. 前記容器が、ディスポーザブル培養バッグである請求項２１に記載の方法。
23. 細胞培養物のｐＨを連続的に又は断続的にモニタするための、ｐＨモニタを更に含んでなる請求項１又は９に記載の方法。
24. 前記細胞培養物のｐＨを調節するために、前記新鮮培養培地が、予め定められたｐＨを有する請求項９に記載の方法。
25. 前記新鮮培養培地の潅流が、前記培養培地での細胞の残留を可能にする潅流機器を介して実施される請求項９に記載の方法。
26. 細胞培養物が溶存ＣＯ_２の分圧を約１から２００ｍｍＨｇのレベルに維持するように、前記ガスが、前記ヘッド空間に供給される請求項１に記載の方法。
27. 細胞培養物が溶存ＣＯ_２の分圧を約１０から１５０ｍｍＨｇのレベルに維持するように、前記ガスが、前記ヘッド空間に供給される請求項２６に記載の方法。
28. 細胞培養物が溶存ＣＯ_２の分圧を約２０から１２０ｍｍＨｇのレベルに維持するように、前記ガスが、前記ヘッド空間に供給される請求項２７に記載の方法。
29. 細胞培養物が溶存ＣＯ_２の分圧を約２０から８０ｍｍＨｇのレベルに維持するように、前記ガスが、前記ヘッド空間に供給される請求項１に記載の方法。
30. 真核生物細胞を回分培養するための方法において、
    重炭酸塩含有培養液中に真核生物細胞を含んでなる細胞培養物を、容器に供給する工程であって、
    前記容器は、前記細胞培養物及び前記細胞培養物上部の気相ヘッド空間を封入する壁部を有し、かつ前記容器は、前記ヘッド空間に対するガスの流出入を提供する少なくとも一のポートを有する工程；
    前記容器を攪拌する工程；及び
    前記ポートを通して前記ヘッド空間にガスを供給する工程であって、前記ガスは、１日目の間は８％のＣＯ_２（ｖ／ｖ）のガスを、２日目には５％のＣＯ_２（ｖ／ｖ）のガスを、その後は２％のＣＯ_２（ｖ／ｖ）のガスを含む工程
    を含んでなる方法。
31. 前記容器が、２１から２３ｒｐｍの揺動速度で、ロッカー上で攪拌される請求項３０に記載の方法。
32. 前記容器が、８から１２°の揺動角度で、ロッカー上で攪拌される請求項３０に記載の方法。
33. 前記容器が、１０°の揺動角度で、ロッカー上で攪拌される請求項３２に記載の方法。

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