JPH02138295A - 回転型カラムを利用した液中蛋白質の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産呈上■肌■公団 本発明は、種々の液体中に存在する有用な特定蛋白質、
特に微量で存在する蛋白質を効率良く分離、回収するた
めの方法に関する。

皿来肢血 従来、いわゆるアフィニティゲル担体やイオン交換担体
を利用した蛋白質の分離、精製には、実験室規模並びに
小規模での工業生産においては充填層型カラムを用いる
ことが一般的である。

しかし、牛乳中に含まれる微量の生理活性蛋白質を分離
、精製する場合のように、大容量の液を通液する際充填
層型カラムに注入すると担体の圧密化などのために吸着
効率が低下するという欠点がみられる。また、担体の吸
着効率を保つためには液の注入量を低くする必要があり
、そのため注入時間が長くなって大量の液の処理には適
さないという実用上の問題がある。

一方、流動層型カラムにおいては、いわゆるバッチシス
テムにより吸着反応を行う方法が提案されているが、こ
の方法では長時間機械的撹拌を行うため担体が破損を受
ける場合が多い。

そして、この担体の破損を防止するためにアップフロー
による流動化も考案されているが、それには担体の沈降
速度を大きくしなければならず、担体の粒径を大きくし
たり、或は担体の密度を高くして担体の沈降速度を高め
ることが必要となる。

したがって、上記方法では使用し得る担体の種類が制限
されるという問題がある。

また、最近、固定化酵素の活性化を効率的に行うための
回転型カラム反応器が開発されたが（特公昭５６−４３
２２８）　、この反応器は、固定化酵素を内蔵した回転
型カラムとその回転型カラムを内装した容器から成って
いて、使用した固定化酵素の活性化と使用後の洗浄を効
率的に行うことを目的とするものであって、液体中に存
在する微量の有用蛋白質を回収することについては全く
言及していない。

゛　しよ°と　る 本発明は、種々の液体中に微量存在する有用な蛋白質を
効率良く分離、回収し得る方法について検討した結果、
液体中の目的蛋白質を蛋白質吸着用担体（以下ゲル担体
という）と液体中で乱流状態で接触させると、該蛋白質
がゲル担体に効率良く吸着されることを見出し、本発明
をなすに至った。

したがって、本発明は、液体中に存在する有用蛋白質を
、それが微量に存在する場合でも、大規模の処理で効率
良く回収することができ、しかも蛋白質を吸着させるた
めのゲル担体を破損することも少ない、液体中の蛋白質
を有利に分離、回収するための方法を堤供することを課
題とする。

量　　　°　るための 本発明において用いる蛋白質含有液としては、脱脂乳、
乳、ホエー、血液、微生物並びに動植物の有用蛋白質を
含む培養液、或はこれらの液体を噴霧乾燥、凍結乾燥な
どで乾燥したものを再度水又は適当な緩衝液に溶解した
溶液を例示し得る。

ここでいう“°蛋白質°”とは、脱脂乳や乳に含まれる
ラクトフェリン、血液の血小板、リンパ細胞および微生
物細胞中に存在する各種酵素（例えば、ポリヌクレオチ
ドフォスフォリラーゼ）、ヒトβ型インターフェロン、
種々の抗体、さらには２種以上の蛋白質から成る蛋白質
複合体等を包含する広範囲な種類の生物学的活性蛋白質
を意味する。

また、本発明において、液中に含有される蛋白質を特異
的に吸着させるために用いる担体としては、アガロース
、セルロース、シリカ、キトサン、アクリルアミド及び
その他の高分子物質等のゲル担体に特異抗原か抗体、も
しくはヘパリン、レクチン、プロティンＡ、プロティン
Ｇを固定したもの、或は上記ゲル担体に硫酸基又はその
他の活性基を導入したアフィニティゲルやイオン交換樹
脂を用いることができる。

すなわち、ここで用いるゲル担体は、回収すべき蛍白質
に対して親和性を有する物質又は活性基を有しているも
のであればよく、したがって、ゲル担体として従来使用
されている種々の公知のゲル担体を用い得る。

本発明で用いる回転型カラムは、カラムの回転運動によ
り該カラムに内蔵した担体を流動させるためのカラム回
転手段、蛋白質含有液をカラムへ供給して流動化された
担体と接触させるための液体供給機構を備えた回転型カ
ラムであればよい。

そして、このような構造を有する回転カラムを用いると
、カラムに供給された液体は乱流状態で担体と接触して
、液体と担体との間の反応を著しく促進し、担体におけ
る蛋白質の効率的な吸着をもたらすと共に、少量の液体
による洗浄及び溶出処理を可能にする。

したがって、本発明によると、カラムに内蔵した担体が
カラムの回転運動によって流動化され、かつ供給液体が
カラムへ導入されることにより、供給液体と担体を十分
に接触させながら、大量の液体を高い流速でカラムへ供
給できるようになる。

また、本発明では担体を攪拌等の機械的手段で流動化し
ないので、従来技術にみられるような担体の破損が起ら
ない。

次に、本発明に係る方法の実施態様を、それに用いる回
転カラムを例示した添付図を参照して説明する。

添付の第１図は、回転カラムの側面の概略断面図であり
、第２図は同カラムの概略正面図である。

図に示されるように、回転カラムは、ゲル担体を内蔵す
るための内筒ｌと該内筒ｌを収容するための外筒２から
成っており、該内筒は微小孔の網状体で構成されている
。

図中、１２は多数のオリフィス１１を有する中空シャフ
トであり、適当なサイズの網目を有する金属膜、布又は
ナイロンで覆われている。担体を内蔵する円筒ｌは適当
なサイズの開口１３を有する仕切板４により中空シャフ
ト１２に沿って仕切られている。１４は液の供給口、１
５は液の流出口を示す。因に、本発明では、特公昭５６
−４３２２８号に開示された回転カラムを利用すること
もできる。

本発明においては、まず、ゲル担体をカラムの内筒１に
充填する。ここで用いるゲル担体の粒径は１０μ請乃至
７ｍｍの範囲のサイズであって、粒径が１０μｍより小
さいと該担体を内蔵する内筒の網目のメツシュをさらに
小さ（しなければならず、液体を均一に分散することが
困難となる。一方、上記粒径が７ｍｍより大きいとゲル
担体の有効面積が小さくなって効率的な蛋白質の回収に
適さなくなる。

このような粒径のゲル担体を上記内筒１に充填するに際
しては、ゲル担体の体積Ｖ、が該内筒１の体積Ｖ、に対
してＶｏ／２００≦Ｖ１≦ｖ０の範囲になるように調整
し、好ましくはＯ，ＩＶ、≦ｖ１≦０．７５ＶＯの範囲
にする。充填するゲル担体の体積ｖ１が１／２００Ｖ、
より小さいとゲル担体の洗浄及び溶出のための液量がゲ
ル担体の容量と比べて相対的に大きくなって蛋白質の回
収効率が悪くなる。

なお、カラムの内筒１の体積ｖ０との関係でカラムの長
さしを考慮すると、長さＬはＬ≧（１０’Ｖｏ）　”３
の範囲にあることが好ましく、この範囲より短くなると
オリフィス１１から噴出される流出液の分布が不均一と
なって効果的な液押抜を行うことが困難となる。

本発明に従って、蛋白質含有液を如上の回転カラムへ供
給して該液中の蛋白質を回収するには、中空シャフト１
２の一端に設けた供給口より蛋白質含有液を導入し、回
転軸３を介して中空シャフト１２を回転し、該中空シャ
フトに設けた多数のオリフィスより、ゲル担体を充填し
た内筒１へ流出させる。この場合内筒１も回転軸３を介
して回転しているので、内筒１内に充填されたゲル体は
乱流状態となって該内筒内に流出した蛋白質含有液と接
触するようになる。

この際、回転カラムの内筒１の回転速度ｒをｌ　ｒｐｎ
＋’；　ｒ≦１１００Ｏｒｐの範囲、好ましくは、５　
ｒｐｔａ≦ｒ≦１１００ｒｐに調節する。上記回転速度
は、実際上目的蛋白質に対するゲル担体の親和性や内筒
１の径等を考慮して、ゲル担体と蛋白質含有液との接触
が均密に行われるように決めるとよいが、この回転速度
が１　、　ＯＯＯｒｐｍより大きくなると回転の遠心力
でゲル担体の乱流状態が妨げられて効率的な液とゲル担
体との接触が行われなくなるので留意する必要がある。

また、蛋白質含有液のカラム内筒１への通液流速Ｖｓ　
（ｉｔ　／ｈｒ）はＶｓ≦１０”Ｖｏの範囲が好ましく
、Ｖｓが１００Ｖｏ　（１／ｈｒ）より大きいと蛋白質
含有液とゲル担体との接触効率が低下し、膣液よりの蛋
白質の回収が効率的に行われない。一方、Ｖｓが余り小
さくなると供給液の通液時間が徒らに長くなって作業効
率を悪くする。

上述したような条件下においてカラムに供給した蛋白質
含有液とゲル担体を乱流状態で接触させることができる
。

蛋白質含有液のカラムへの通液は循環式でもよく、又ｏ
ｎｅ　ｐａｔｈ方式でもよい。

蛋白質含有液を回転カラムに通液させ与場合には、通液
金時間Ｔ　（ｈｒ）は回収すべき蛋白質の濃度と上記通
液流速Ｖ−（２／ｈｒ）及びゲル担体の吸＠能に因って
コントロールする。

この通液時間Ｔ　（ｈｒ）は下記条件を満たすことが好
ましい。

ｖｓ 〔式中のＣは蛋白質含有液中の蛋白質濃度を表わし、ｑ
　（ｇ／　ｌゲル担体）は過剰の蛋白質含有液をゲル担
体に通液した時の飽和吸着量を表わす〕 通液時間が上記条件を満たさない場合、すなわ液をする
ことになり、また通液時間も徒に長くなって非効率的で
ある。

本発明に従って、叙上の条件で蛋白質含有液を回転カラ
ムに通液すると後記実施例に示したごとく、該液中に存
在する微量の蛋白質でも効率よく回収することが可能と
なる。

上述のようにして、蛋白質含有液を回転カラムに通液す
ることにより、液中の蛋白質はカラム（内筒１）に内蔵
したゲル担体に吸着されるので、この蛋白質を吸着した
担体ゲルを水もしくは塩水ｉ？＆ｃ例えば塩化ナトリウ
ム水溶液）或はバッファー（例えば０．２Ｍ　ＮａＣ１
を添加した０、０１Ｍ　リン酸緩衝液）で回転カラム内
で洗浄する。

この除用いる洗浄液ｆｆｉ　Ｖｗｍｓｈはゲル担体体積
Ｖ、≦Ｖｗｍい＜１００Ｖ、が好ましく、洗浄は循環式
もしくはｏｎｅ　ｐａｔｈ方式で１回乃至数回にわけて
行ってもよい。

次いで、ゲル担体に吸着された蛋白質は、食塩水のよう
な塩溶液もしくはバッファー（例えば、前記洗浄に用い
たリン酸緩衝液）を用いて回転カラム内で溶出する。こ
の場合、溶出に用いる溶出液量ｖｏｕＬ（ｐ）はＶ、≦
Ｖｏｕｔ≦１００Ｖ、（７）範囲が好ましく、また溶出
は循環式もしくはｏｎｅ　ｐａｔｈ方式のいずれで行っ
てもよい。

因に、上記溶出量Ｖ。ｕＬを１００ＶＩを超えないよう
にして溶出を行うと、目的蛋白質を約９５％以上の収率
で回収することができる。

このようにして回収した蛋白質は乾燥して固体形態にし
てもよい。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。

実施例１ 内筒体積５１、カラム外筒容積２１０同転型カラム（長
さ２６５ｃｎ＋）に、ゲル担体として硫酸化セルロファ
イン８００ｃｃを内蔵させた。この担体の最大ラクトフ
ェリン吸着量は３．０ｍｇ／＋ａ　ｌゲルである。

この回転型カラムに、脱脂乳１００１を、内筒回転数１
８ｒｐｍ、通液流量１８０１　／ｈｒの条件下に通液し
た。

次いで、０．３Ｍ食塩水を用いて、上記ラクトフェリン
を吸着したゲル担体を１回に２０１宛を用いて４回洗浄
した。

洗浄後、１Ｍ食塩水２０ｆｆｉを用いて回転型カラムに
循環式で通液し、担体に吸着されたラクトフェリン２．
１６ｇを回収した。

回収したラクトフェリンの純度は９５％であった。

実施例２ モノクローナル抗ラクトフェリン抗体の固定化ゲルを実
施例１で用いたと同様の回転型カラムに内蔵し、この回
転型カラムに、脱脂乳５０Ｉｌを、内筒回転数１８ｒｐ
ｍ、通液液量１８０　乏／ｈｒの条件で通液させた。

なお、ここで用いた上記固定化ゲル担体の最大ラクトフ
ェリン吸着量は２．５ｍｇ／ｄゲルである。

次いで、ラクトフェリンを吸着したゲル担体を０、５Ｍ
食塩水で２０１づつ２回洗浄し、更にＰＢＳで２０Ｑづ
つ３回洗浄した。

洗浄後、ｐ）ｌ　３．７の０．２Ｍ酢酸バッファー２１
をカラムに循環式で通液して担体に吸着されたラクトフ
ェリン１．８５ｇ（２，３１１１ｇ／ｄｉゲル）を回収
した。

得られたラクトフェリンの純度は９８％であった。

実施例３ 内筒体積５００ｍ　ｌ、カラムの外筒容積６００ｒＩＩ
！、の回転型カラム（長さ１３０ｃｍ）に、ゲル担体と
して硫酸化キトサンビーズ２００Ｉｌｌを内蔵させ、ゲ
ル担体を０．２Ｍ塩化ナトリウム添加０．０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ８，０、比電導度的１７．５ｍｓ／ｃｍ）
で浸し、カラム内で平衡化させた。

ここでゲル担体として用いた硫酸化キトサンビズはＦ　
−ＨＡ　（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒＬｕｓｓｉｓ
（ｐｈａｓｅ　１　）　）の細胞からの蛋白質を最大８
ｍｇ／ｄゲルの吸着量を有する。

次いで、上記緩衝液を排出した後、百日咳■相菌東浜株
のファーメンタ−による培養上清（ＦＨＡの含有１０．
０２％）８ｆを希釈して比電導度的１７．５ｍｓ／ｃｍ
、　ｐＨ８，０に調製した液を、回転型カラムに、内筒
回転数１８ｒｐｍ、循環液量３０　Ｉ！、／ｈの条件下
に、３０分通液した。

通液後、上記培養上清の希釈液を排出させた後、前記緩
衝液５２で２回洗浄した。

次いで、１．５Ｍ塩化ナトリウム添加リン酸緩衝液（ｐ
）Ｉ　７．６）６００ｍ　ｌをカラムに注入して、ゲル
担体に吸着している百日咳１相菌体の蛋白質、Ｆ−ＨＡ
を溶出した。　溶出により得られたＦ−ＨＡの回収率は
９１．４％であって、その精製度（精製したＦＨＡ画分
の比活性／培養上清の比活性）は３２倍であった。

実施例４ 内筒体積５００ｍ　ｌ、カラムの外筒容積６００ｍ　ｌ
の回転型カラム（長さ１３０ｃｍ）に担体としてヘパリ
ンセファロース２００ｍ　１２を内装し、この担体ゲル
は０゜０５１’ｌ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍマ
ツキルベン緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化した。

上記ヘパリンセファロースはゲル担体として最大８ｍｇ
／ｍｌゲルのＨＢｓ抗原（Ｂ型肝炎ウィルスから誘導さ
れる）を吸着する。

この回転型カラムに、Ｂ型肝炎ウィルスのＨＢ。

抗原陽性ヒト血清８０ｍ　ｌを上記緩衝液で希釈した液
６００ｓ　ｊ！をＶ＆環式で通液した。この際の循環液
量は３０　ｆｆｉ　／ｈで、３０分間循環させた。

次いで、通液後、担体ゲルを上記緩衝液２０Ｉ！、を用
いて充分洗浄した後、０．６Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０２７Ｍマツキルベン緩衝液（ｐｆｌ　７．２）６０
０ｍＡをカラムに注入して、ゲルに吸着したＨＢ、抗原
を溶出した。

溶出により得られたＨＢ、抗原の血清からの回収率は９
４．２％であった。

また、回収蛋白質の精製度（抗原量／蛋白質）は１４．
３倍に達した。

実施例５ 実施例１と同様の回転カラムにカルボキシメチルセルロ
ースイオン交換体（ＣＭ−セルロファイン）を２１！、
内蔵させた。ｐ１１４の０．１Ｍ酢ｆＩＩ緩衝液で平衡
化した後、生脱脂乳を塩酸でｐＨ４，０としカゼインを
沈澱除去した酸ホエー８２を流速５０１　／ｈｒで通液
した。ｐＨ４の０．１Ｍリン酸緩衝液１０！で担体を洗
浄後、ｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩衝液（食塩０．１５モ
ルを含む）１０１！、を通液しβ−ラクトグロブリン３
３ｇを得た。純度は７８％であうた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いる回転カラムの側面断面図の概略
を示し、第２図は同カラムの内筒部の概略正面図を示す
。 図において、 １・・−−−一−・−・カラムの内筒 ２−・・・・−・カラムの外筒 ３・−・−−−一−−−・オリフィスを有する中空シャ
フト４−・−・−−−−−一仕切板 １１・　　オリフィス １２−・・−・−・・−中空シャフトを覆う網状体１３
・・−・−−−−ｍ−仕切板を設けた開口１４　　　液
の供給口 １５−　　液の流出口 第１図 第２図

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）蛋白質含有液から蛋白質吸着用担体を用いて蛋白
   質を分離、回収するに際し、蛋白質吸着用担体を内蔵し
   た回転型カラムに蛋白質含有液を、該カラムを回転させ
   ながら通して該蛋白質含有液を上記蛋白質吸着用担体に
   接触させて吸着し、次いで回転しているカラムに洗浄液
   を通してカラムを洗浄した後、該カラム中に吸着の蛋白
   質を溶出することを特徴とする蛋白質含有液から蛋白質
   を回収する方法。
2. （２）蛋白質含有液は、ラクトフェリン含有乳もしくは
   ラクトフェリン含有脱脂乳である請求項（１）に記載の
   蛋白質を回収する方法。
3. （３）蛋白質含有液を、下記条件で回転型カラムに通す
   請求項（１）に記載の蛋白質を回収する方法；ａ）カラ
   ムの長さＬ（ｃｍ） Ｌ≧（１０＾５Ｖ＿ｏ）＾１＾／＾３ 〔式中、Ｖ＿ｏ（ｌｉｔｅｒｓ）はカラムの蛋白質吸着
   用担体の内蔵部の体積を示す〕 ｂ）カラムの回転数（ｒ） ｌｒｐｍ≦ｒ≦１０００ｒｐｍ ｃ）蛋白質含有液の通液速度Ｖｓ（ｌ／ｈｒ）Ｖｓ≦１
   ０＾２Ｖ＿ｏ ｄ）通液時間Ｔ（ｈｒ） Ｔ≦５００（ｑＶ＿ｌ／ＣＶ＿ｓ） 〔式中Ｃ（ｇ／ｌ）は回収すべき蛋白質の液体中濃度を
   、ｑは担体の飽和吸着量（ｇ／ｌゲル）を、Ｖ＿ｌはカ
   ラムに内蔵された担体の容積（ｌ）をそれぞれ表わす。 〕
4. （４）蛋白質含有液はラクトフェリン含有脱脂乳であり
   、蛋白質吸着用担体が硫酸化多糖類であり、洗浄液が塩
   化ナトリウム水溶液であり、溶出に用いる溶出液が塩化
   ナトリウム水溶液である請求項（２）に記載の蛋白質を
   回収する方法。
5. （５）蛋白質含有液はラクトフェリン含有脱脂乳であり
   、蛋白質吸着用担体がモノクローナル抗ラクトフェリン
   抗体の固定化ゲル担体であり、洗浄液が塩化ナトリウム
   水溶液であり、溶出に用いる溶出液が酢酸緩衝液である
   請求項（２）に記載の蛋白質を回収する方法。