KR20070001969A

KR20070001969A - 항체 정제

Info

Publication number: KR20070001969A
Application number: KR1020067017115A
Authority: KR
Inventors: 보-레나르트 요한손; 한스 제이. 요한손; 안드레스 륭글뢰프; 장-루 말로이셀; 니콜라스 테베닌
Original assignee: 지이 헬스케어 바이오-사이언시스 에이비
Priority date: 2004-02-27
Filing date: 2005-02-24
Publication date: 2007-01-04
Also published as: EP1718668B1; CN1925898B; JP2008505851A; CN1926146B; CN1925898A; CN1926146A; KR101149969B1; US20070112178A1; CA2552823C; ATE440858T1; JP4776615B2; AU2005217348A1; EP1718668A1; IL176635A; IL176635A0; CA2552823A1; NZ548127A; US7385040B2; DE602005016220D1; SE0400501D0

Abstract

본 발명은 다중 양식 리간드가 하나 이상의 양이온 교환기 및 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리계를 포함하는 것인 용액을 다중 양식 리간드가 고정화된 지지체를 포함하는 크로마토그래피 수지와 접촉시켜 항체 및(또는) 오염물질을 수지에 흡착시키는 것을 포함하는 용액 중 오염물질로부터 항체를 분리시키는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 방향족 또는 헤테로방향족의 고리 형성 원자는 C, S 또는 O 중에서 선택되고, 양이온 교환기는 약한 양이온 교환제이다. 본 방법은 단일 단계 절차로서 또는 단백질 A 컬럼 상에서 포획 후 폴리싱 단계로서 사용될 수 있다.

항체 정제, 다중 양식 리간드

Description

항체 정제{ANTIBODY PURIFICATION}

본 발명은 항체 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 방법은 친화성 크로마토그래피의 후속 단계로서 친화성 수지로부터 발생하는 오염물질을 제거하는 데 유리하게 사용된다. 또한, 본 발명은 친화성 크로마토그래피 수지로부터 항체와 잔여물 사이에 형성된 오염 착물로부터의 항체 정제용 키트를 포함한다.

면역계는 박테리아, 기생충, 진균류, 바이러스 감염 및 종양 세포의 성장으로부터 신체를 총괄적으로 보호하는 많은 상호의존적 세포 유형들로 구성된다. 면역계의 파수꾼은 숙주의 혈류를 계속 떠도는 마크로파지이다. 마크로파지는 감염 또는 면역화에 의해 공격받는 경우, 항원으로 공지된 외래 분자로 표지 침입자를 집어삼킴으로써 반응한다. 헬퍼(helper) T 세포에 의해 매개되는 이러한 사건은 B 세포를 자극시키는 복잡한 연쇄 반응을 나타낸다. 이로써, 이 B 세포는 외래 침입자에 결합하는 항체로 불리는 단백질을 생산한다. 항체와 항원 사이의 결합 사건은 식균작용 또는 보체 계의 활성화를 통해 파괴할 외래 침입자를 표지화한다. 다수의 상이한 부류의 항체, 또는 면역글로불린, 예를 들면 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재한다. 이들은 생리학적 역할, 뿐만 아니라 구조가 상이하다. 구조적 측면에서, IgG 항체는 아마도, 성숙한 면역 반응에서 지배적인 역할을 수행하기 때 문에 널리 연구된 특정 부류의 면역글로불린이다.

오늘날, 면역글로불린이 갖는 생물학적 활성은 인간 및 수의학적 진단, 건강 관리 및 치료 분야의 광범위한 다양한 적용분야에서 연구되고 있다. 사실상, 최근 10년간, 단일클론 항체 및 재조합 항체 구성체는 현재 임상 시험에서 조사되고, 치료제 및 진단제로서 FDA의 승인을 받은 가장 큰 부류의 단백질이 되었다. 발현 시스템 및 생산 전략을 보완하여, 정제 프로토콜은 매우 순수한 항체를 간단히 경제적으로 얻도록 설계된다.

면역글로불린을 단리시키는 통상적인 방법은 용액 중에 단백질의 다른 기들은 남겨두면서 면역글로불린을 포함하는 단백질 분획을 선택적으로 가역적으로 침전시키는 것에 기초한다. 전형적 침전제로는 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 농도전이성(lyotropic) 염, 예를 들면 황산암모늄 및 인산칼륨 및 카프릴산이 있다. 전형적으로, 이러한 침전 방법은 매우 불순한 생성물을 제공하며, 동시에 시간과 노동력이 많이 소모된다. 또한, 원료에 침전제를 첨가하면, 상청액을 다른 목적으로 사용하기 어렵고, 특히 면역글로불린의 대규모 정제시 관련되는 폐기 문제를 일으킨다.

면역글로불린을 단리시키는 별법은 크로마토그래피이며, 이는 한 족의 밀접하게 관련된 분리 방법을 포함한다. 대부분의 다른 물리적 화학적 분리 방법과 구별되는 크로마토그래피의 특징은 한 상이 정지성이고 다른 상이 이동성인 두 상호 혼화가능하지 않은 상들이 접촉한다는 점이다. 이동상으로 도입된 샘플 혼합물은 정지상 및 이동상이 이동상에 의해 시스템을 통해 운반되기 전에 다수 회 일련의 상호작용을 한다. 이러한 상호작용은 샘플 중 성분들의 물리적 또는 화학적 성질 차이를 이용한다. 이러한 차이는 정지상을 함유하는 컬럼을 통해 이동하는 이동상의 영향 하에서 개개의 성분의 이동률을 지배한다. 분리된 성분은 정지상과의 상호작용이 큰 순서대로 출현한다. 가장 적게 지체되는 성분이 먼저 용리되고, 가장 강하게 보유되는 물질이 마지막으로 용리된다. 샘플 성분이 컬럼으로부터 용리됨에 따라, 한 성분이 인접 용질의 대역과의 중첩을 방해하도록 충분히 지체되는 경우 분리가 일어난다. 각각의 특수한 분리 목적에 걸맞은 최적 정지상을 설계하기 위한 끊임없는 노력이 이루어지고 있다. 통상, 이러한 정지상은 관능기 즉, 결합기를 포함하는 리간드가 부착된 지지체 또는 기저 메트릭스를 포함한다. 통상, 활용되는 상호작용의 원리를 기초로 한 각각의 종류의 크로마토그래피를 참조로 한다.

따라서, 이온 교환 크로마토그래피는 면역글로불린의 단리에 흔히 사용된다. 음이온 교환 크로마토그래피에서, 면역글로불린의 음하전된 아미노산 측쇄는 크로마토그래피 메트릭스의 양하전된 리간드와 상호작용한다. 한편, 양이온 교환 크로마토그래피에서, 면역글로불린의 양하전된 아미노산 측쇄는 크로마토그래피 메트릭스의 음하전된 리간드와 상호작용한다.

또한, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 면역글로불린의 단리에 대해 널리 기재되는 방법이다. 그러나, 소수성 메트릭스는 농도전이성 염을 원료에 첨가하여 면역글로불린이 효과적으로 결합하게 할 것을 필요로 한다. 결합된 항체는 연속적 또는 단계식 구배로 농도전이성 염의 농도를 낮춤으로써 메트릭스로부터 방 출된다. 매우 순수한 생성물이 대상인 경우, 소수성 크로마토그래피를 추가 단계와 합칠 것을 권장한다. 이 절차의 단점은 농도전이성 염을 원료에 반드시 첨가하여야 하기 때문에 문제를 일으켜 대규모 사용자의 경우 비용이 증가된다는 점이다. 세포 배양 상청액 이외의 원료, 예를 들면 유장, 혈장 및 난황의 경우, 원료에 농도전이성 염을 첨가하면, 많은 경우 이 염이 면역글로불린 고갈된 원료를 경제적으로 실행가능하게 사용할 수 없게 하기 때문에 대규모 적용분야에서는 사용이 금지된다. 대규모 적용분야에서의 추가적인 문제점은 수천 리터의 폐기물을 폐기하는 것이다.

단백질 A 및 단백질 G 친화성 크로마토그래피는 주로, 사용 편이성 및 고 순도의 수득으로 인해 면역글로불린을 단리 및 정제하는, 특히 단일클론 항체를 단리시키는 대중적인 널리 보급된 방법이다. 이온 교환, 소수성 상호작용과 병용하여, 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 및(또는) 겔 여과 단계, 특히 단백질 A 기재 방법은 많은 생물의약 회사들에게 선택가능한 항체 정제 방법이 되었다(예를 들면, WO 8400773 및 US 5,151,350 참조). 그러나, 단백질 A 기재 크로마토그래피 수지는 통상의 활용도 및 많은 이점에도 불구하고, 리간드의 펩티드 결합으로 인해 특정한 알칼리 민감도를 제공한다는 점이 공지되어 있다. 또한, 단백질 A 기재 수지가 세포 배양 배지로부터 항체를 정제하는 데 사용되는 경우, 그 안의 프로테아제의 존재는 단백질 리간드 또는 그의 펩티드 단편을 누출시킬 수 있다. 대부분의 누출된 단백질 A는 여전히 항체와 착물을 형성하기 쉬우므로, 친화성 컬럼으로부터의 용리액은 단백질 A-항체 착물, 뿐만 아니라 단백질 A로 오염된 항체를 포함할 수 있다.

친화성 크로마토그래피 메트릭스로부터의 리간드 누출을 감소시키려는 한 시도가 WO 03/041859(베링커 인겔하임 파마(Boehringer Ingelheim Pharma) KG)에 제공되었으며, 이는 예를 들면, 단백질 A 메트릭스를 하나 이상의 계면활성제로 전처리하여 리간드 누출을 감소시키는 것을 제안한다. 친화성 메트릭스를 예를 들면, 5-15 상(bed) 부피의 계면활성제로 처리할 수 있다. 접촉 시간은 방법의 유효성에 중요하다. 예를 들면, 실온에서는 누출을 감소시키는 데 16 시간 이상의 접촉 시간을 필요로 한다. 더 높은 온도에서는 접촉 시간이 짧아질 수 있다.

리간드 누출 문제에 대한 대안적 접근이 US 4,983,722(밀레스 인크.(Miles Inc.))에 제공되며, 여기서 항체-단백질 A 혼합물을 음이온 교환 물질에 노출시켜 양쪽 성분들을 흡착시킨 다음, 이온 강도를 증가시키는 조건 하에서 항체 및 단백질 A를 순차적으로 용리시킴으로써 단백질 A는 항체-단백질 A 혼합물로부터 선택적으로 단리된다. 예시적인 음이온 교환제로 디에틸아미노에틸(DEAE) 트리스아크릴(Trisacryl) M 또는 DEAE 세파로오스(Sepharose)^TM가 있다.

US 5,429,746(스미스클라인 비참 코퍼레이션(SmithKline Beecham Corp.))은 항체의 정제시 소수성 상호작용 크로마토그래피를 한 단계로 적용하는 것에 관한 것이다. 여기에는, 예를 들면, 단백질 A를, 임의적으로 중간 양이온 교환 크로마토그래피 단계와 함께 사용하여 친화성 크로마토그래피 후 어떻게 HIC를 사용할 수 있는지 개시하고 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 약한 양이온 교환제(CM 세 파로오스^TM FF)로 예시되며, 여기서 이는 흡착시 pH 5.5로 조정되고, 100 mM 염화나트륨, 40 mM 시트레이트의 용리 완충제로 용리된다(pH 6). 친화성 및(또는) 양이온 교환 크로마토그래피 후 HIC 컬럼에 가해지는 혼합물은 불순물, 예를 들면 면역글로불린 응집물, 미스폴딩된(misfolded) 종, 숙주 세포 단백질 및 친화성 크로마토그래피 단계로부터의 잔여 물질을 함유할 수 있다. 이러한 방법에서, 항체를 먼저 단백질 A 크로마토그래피 지지체에 흡착시키고 용리시킨 다음, 양이온 교환 크로마토그래피 지지체에 흡착시키고, 이로부터 선택적으로 용리시키고, 마지막으로 HIC 지지체에 흡착시키고 용리시킨다.

또한, 세라믹 히드록시아파타이트는 면역글로불린 폴리싱(polishing)에 유용한 것으로 제안되었다. 더욱 구체적으로, IgG1이 CHT 세라믹 히드록시아파타이트(바이오-라드(Bio-Rad)) 상의 비분획 배지에서 IgG1-단백질 A 착물로부터 분해될 수 있는 것으로 보고되었다(미국 94547 캘리포니아주 헤라쿨레스 알프레드 노벨 드라이브 2000 소재의 바이오-라드 라보라토리즈, 인크.(Bio-Rad Laboratories, Inc.)의 S. G. Franklin의 [Chromatography, tech note 2849]). 더욱 구체적으로, 히드록시아파타이트(Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)는 인산칼슘의 형태이고, 유니크한 분리 성질을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 히드록시아파타이트 기재 메트릭스도 특정한 단점을 포함하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들면, 이들은 Ca-누출로 인해 산성 pH 값에서 불안정하고, 킬레이트화제, 예를 들면 EDTA에 민감하다. 또한, 히드록시아파타이트를 패킹하고 큰 컬럼에서 성능을 유지시키는 것이 어렵기 때문에, 예를 들면, 히드록시아파타이트 기재 메트릭스를 사용하여 강건한 재현가능한 정제 방법을 개발하고 스케일 업(scale up)하는 것이 어려운 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 금속 이온 오염 및 칼슘 이온의 교환에 의해 수지 성질이 변화될 위험이 있으며, 이러한 변화는 규제 권위에 심각한 문제이다.

안정성 문제 및 단백질 기재 친화성 컬럼으로부터의 누출을 피하기 위해, 상이한 선택성을 갖는 순수한 화학 수지가 제안되었다. 항체 정제의 경우, 예를 들면, 상이하지만 협동적인 부위들이 표적과 상호작용하는 다중 양식(multi-modal) 크로마토그래피가 제안되었다. 더욱 구체적으로, 머캅토-벤즈이미다졸-술폰산 리간드를 포함하는 흡착제인 MBI 하이퍼셀(Hypercel)®(바이오세프라(BioSepra))은 단일클론 및 다클론 항체와 소수성 상호작용, 뿐만 아니라 이온성 상호작용을 제공하는 것으로 알려져 있다. 소수성 상호작용은 방향족 고리계로 인한 것이라 추측되며, 이온성 상호작용은 강한 양이온 교환제로 공지된 SO₃ ^- 치환체로 인한 것이다. 또한, MBI 리간드의 방향족 계 중 질소 원자는 특정한 조건 하에서 하전될 수 있어 음하전된 기와 이온성 상호작용을 제공할 수 있다. MBI 하이퍼셀®은 치료 및 진단용 항체의 포획 및 정제를 위한 단백질 A 기재 수지에 대한 대안으로서 개시되었다.

US 6,498,236(업프론트 크로마토그래피(Upfront Chromatography))은 용액, 예를 들면 하미브리도마(hybridoma) 세포 배양 상청액, 동물 혈장 또는 혈청으로부터 면역글로불린을 단리 또는 정제하는 방법을 개시하고 있다. 이 방법은 리간드 및 면역글로불린의 분자량 간의 적은 차이, 뿐만 아니라 서로 결합하려는 자연적 경향으로 인한 결점을 포함하는 것으로 알려져 있는 단백질 A, 단백질 G, 합성 펩티드 및 다른 비교적 고 분자량 리간드 사용에 대한 대안으로서 제안되고 있다. US 6,498,236에 따르면, 리간드, 예를 들면 벤젠 고리에 존재하는 치환체는 면역글로불린을 유효하게 결합시키는 데 결정적이다. 더욱 구체적으로, 개시된 방법에 사용된 고체상 메트릭스는 화학식 M-SP1-X-A-SP2-ACID(여기서, M은 메트릭스 골격을 나타내고, SP1은 스페이서(spacer)를 나타내고, X는 O, S 또는 NH를 나타내고, A는 임의적으로 치환된 모노시클릭 또는 바이시클릭 방향족 또는 헤테로방향족 잔지를 나타내고, SP2는 임의적인 스페이서를 나타내고, ACID는 산기를 나타냄)에 의해 설명된다. 바람직하게는, 리간드는 벤즈이미다졸, 벤조티아졸 및 벤조옥사졸로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물로부터 유도된다.

WO 97/10887(노보 노르디스크(Novo Nordisk) A/S)은 단백질 물질, 예를 들면 면역글로불린, 인슐린, 팩터(Factor) VII 또는 인간 성장 호르몬 또는 그들의 유사체, 유도체 및 단편의 정제에 유용한 친화성 리간드-메트릭스 공액화물에 관한 것이다. WO 97/10887 발명은 소수성 성분의 복잡도 및 공간 기하를 증가시킴으로써 소수성 리간드의 선택성이 증가될 수 있다는 개념에 기초한다. 이 개념으로 인해 하나 이상의 고리 형성 원자가 질소인 헤테로방향족을 갖는 구조로 한정되는 친화성 리간드의 일반적 기를 발견하였다. 컴퓨터 모델링 기술 및(또는) 모사 리간드 라이브러리의 스크리닝에 의해 설계되는 WO 97/10887에 개시된 리간드는 양쪽 모두 발효 액체로부터 면역글로불린을 포획하는 것으로 공지된 리간드인 단백질 A 또는 단백질 G 대신에 사용할 것이 제안되고 있다.

또한, 다중 양식 양이온 교환제 배지를 합성하는 방법도 WO 03/024588(아머샴 바이오사이언시즈 아베(Amersham Biosciences AB))에 개시되어 있다. 더욱 구체적으로, 두 관능가를 포함하는 스캐폴드(scaffold), 바람직하게는 호모시스테인 티오락톤을 유도체화시키고, 고체 기저 메트릭스와 반응시킨다. 더욱 구체적으로, 두 관능가 중 하나, 바람직하게는 황은 메트릭스에 커플링하는 데 사용되고, 두 번째 관능가는 이온성 기로 변환될 수 있는 것이다. 따라서, 이로써 생성된 다중 양식 배지는 이온성 상호작용, 뿐만 아니라 유도체화의 특성에 따라 추가의 상호작용, 예를 들면 소수성 상호작용을 할 수 있게 된다. 실험부에서는, 생성된 양이온 교환제를 세 모델 단백질, 즉 시토크롬(Cytochrome) C(Cyt C), 소 혈청 알부민(BSA) 및 면역글로불린 G(IgG)를 사용하여 시험한다.

발명의 간단한 설명

한 측면에서, 본 발명은 강건한 항체 정제 방법을 제공한다. 본 발명의 구체적인 측면에서, 친화성 크로마토그래피 컬럼, 예를 들면 단백질 A 컬럼으로부터의 용리액으로부터의 누출을 제거하는 방법이 제공된다. 이는 첨부되는 청구범위에 정의된 바와 같이 얻어질 수 있다.

따라서, 구체적인 측면에서, 본 발명은 단일클론 또는 다클론 항체의 고 순도 정제용 단백질 A 기재 친화성 크로마토그래피에 보충으로서 유용한 방법을 제공한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 현재 사용되는 폴리싱 방법과는 상이한 선택성을 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 측면 및 이점은 하기의 상세한 개시내용으로부터 명백해질 것이다.

도 1은 대조군 실험 결과를 도시하며, 여기서 하기 실험부에 개시된 바와 같이, MAb-단백질 A가 지연 부피(delay volume)가 정확하도록 컬럼 대신 모세관을 통과하였다.

도 2는 제 2 대조군 실험 결과를 도시하며, 여기서 하기 실험부에 개시된 바와 같이, 단백질 A 용액을 기준 메트릭스(세파로오스^TM FF, 아머샴 바이오사이언시즈) 상에 러닝(running)시켰다.

도 3은 제 3 대조군 실험 결과를 도시하며, 하기 실험부에 개시된 바와 같이, 단백질 A 용액을 다중 양식 수지에 가하였다.

도 4는 하기 실험부에 개시된 바와 같이, 결합 양식으로 MAb와 MAb-단백질 A 응집물을 분리하는 것을 도시한다.

도 5는 하기 실험부에 개시된 바와 같이, 최적화된 용리 계획을 사용함으로써 최적화된 MAb와 MAb-단백질 A 응집물을 결합 양식으로 분리하는 것을 도시한다.

도 6은 하기 실험부에 기재된 바와 같이, 겔 여과에 의한 도 5로부터의 피크의 분석을 도시한다.

도 7은 하기하는 바와 같이, 즉, MAbs가 흡착되지 않고 컬럼을 통과하는 경우인 '통과 유체(flow through) 양식'으로 순수 MAb와 MAb-단백질 A 응집물을 분리하는 것을 도시한다.

도 8은 하기 실험부에 기재된 바와 같이, 겔 여과에 의한 도 7로부터의 피크 분석을 도시한다.

도 9는 하기 실험부에 기재된 바와 같이, 도 7보다 실질적으로 큰 샘플 부피를 사용하여 순수 MAb와 MAb-단백질 A 응집물을 통과 유체 양식으로 분리하는 것을 도시한다.

도 10은 하기 실험부에 기재된 바와 같이, 도 9로부터의 피크의 겔 여과 분석 결과를 도시한다.

정의

용어 "항체" 및 "면역글로불린"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

용어 "용리액"은 당 분야에서의 그의 통상적인 의미, 즉 분리 메트릭스로부터 하나 이상의 화합물을 방출시키기 적합한 pH 및(또는) 이온 강도로 된 완충제로 사용된다.

용어 "친화성 크로마토그래피"는 락키(lock-key) 인식을 원리로 하는 표적 생체분자와 생체특이적 리간드 간의 특이적 상호작용에 기초한 크로마토그래피를 의미한다. 따라서, 표적 및 리간드는 친화성 쌍, 예를 들면 항원/항체, 효소/수용체 등을 구성하게 된다.

용어 "크로마토그래피 수지"는 본 명세서에서 리간드로서 공지된 관능기가 커플링된 담체를 나타내는 것으로 사용된다.

용어 "다중 양식 크로마토그래피 리간드"는 결합되는 물질과 상호작용하는 2 개 이상의 상이하지만, 협동적인 부위를 제공할 수 있는 리간드를 지칭한다. 이들 부위 중 하나는 리간드와 해당 물질 사이에 인력 유형의 전하-전하 상호작용을 제공한다. 전형적으로, 다른 부위는 전자 수용체-공여체 상호작용 및(또는) 소수성 및(또는) 친수성 상호작용을 제공한다. 전자 공여체-수용체 상호작용은 수소 결합, π-π, 양이온-π, 전하 전이, 쌍극자-쌍극자, 유도된 쌍극자 등과 같은 상호작용을 포함한다. 또한, 다중 양식 크로마토그래피 리간드는 "혼합된 양식" 크로마토그래피 리간드로도 공지되어 있다.

구 "전자 공여체-수용체 상호작용"은 전자의 자유 쌍을 갖는 전기음성 원자가 공여체로 작용하고, 공여체의 전자 쌍에 대한 수용체로 작용하는 전자 결핍 원자에 결합하는 것을 의미한다(예를 들면, 문헌[Karger et al., An Introduction into Separation Science, John Wiley & Sons (1973) page 42] 참조).

용어 "양이온 교환기"는 본 명세서에서, 음하전되거나 또는 음하전가능한 기를 의미한다.

액체 크로마토그래피와 관련하여, 용어 "포획 단계"는 분리 절차의 초기 단계를 지칭한다. 가장 통상적으로, 포획 단계는 정화, 농축, 안정화 및 가용성 불순물로부터의 상당한 정제를 포함한다. 포획 단계 후, 중간 정제를 수행할 수 있으며, 이는 DNA, 바이러스 및 내독소를 비롯한 상당한 불순물의 대부분을 제거한다.

액체 크로마토그래피와 관련하여, 용어 "폴리싱 단계"는 미량의 오염물질 및 불순물을 제거하여 안전한 활성 생성물을 남기는 최종 정제 단계를 지칭한다. 종종, 폴리싱 단계 동안 제거되는 오염물질은 표적 분자 또는 의심되는 누출 생성물의 콘포머(conformer)이다.

용어 "Fc 결합 단백질"은 항체의 결정성 부(Fc)에 결합할 수 있는 단백질을 의미하고, 예를 들면, 단백질 A 및 단백질 G, 또는 상기 결합 성질을 유지한 그의 임의의 단편 또는 융합 단백질을 포함한다.

발명의 상세한 설명

한 측면에서, 본 발명은 용액을, 하나 이상의 양이온 교환기 및 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리계를 포함하는 다중 양식 리간드가 고정화된 지지체를 포함하는 크로마토그래피 수지와 접촉시켜 항체 및(또는) 오염물질을 수지에 흡착시키는 것을 포함하는, 용액 중 하나 이상의 오염물질로부터 항체를 분리시키는 방법에 관한 것이다.

유리한 실시양태에서, 오염물질은 다중 양식 리간드에 흡착되고, 항체의 본질적으로 순수한 분획은 통과 유체로서, 즉 흡착되거나 또는 선택적 후속 용리에 의한 결합 양식이 아닌 상태로 회수된다. 이와 관련하여, 용어 "본질적으로 순수한"은 실질적으로 모든 오염물질이 제거된 것을 의미하는 것으로 이해된다. 가장 유리하게는, 오염물질 중 약 80% 이상, 예를 들면 약 95% 이상, 즉, 95-100%, 예를 들면 약 98% 이상, 즉 98-100%, 바람직하게는 약 99% 이상, 즉 99-100%가 다중 양식 크로마토그래피 수지 상에서 제거된다. 그러나, 당업자가 명확히 이해하듯이, 가능한 순도는 크로마토그래피 수지에 가해지는 용액 중 항체의 농도, 뿐만 아니라 사용되는 다른 조건에 따라 좌우된다.

본 방법의 구체적인 실시양태에서, 다중 양식 크로마토그래피 수지에 가해진 용액은 친화성 크로마토그래피 수지로부터 유래한 항체 함유 용리액이다. 유리한 실시양태에서, 상기 친화성 크로마토그래피 수지의 리간드는 Fc 결합 단백질, 예를 들면 단백질 A, 예를 들면, 천연 또는 재조합 단백질 A를 포함한다. 이러한 친화성 수지는 예를 들면, 아머샴 바이오사이언시즈로부터 MabSe-lect^TM로서 상업적으로 입수가능하다. 따라서, 이 실시양태에서, 제거될 오염물질은 방출된 단백질 A, 단백질 A 한 분자 당 다수의 항체, 예를 들면 한 단백질 A 분자와 착화된 2-4 개의 항체를 포함할 수 있는 단백질 A와 항체 사이에 형성된 착물, 예를 들면 단백질 A-MAb 착물, 및 방출된 단백질 A 또는 항체의 응집물을 포함할 수 있다.

유리한 실시양태에서, 본 방법은 통상적인 액체 크로마토그래피를 사용함으로써, 즉 용액을 크로마토그래피 컬럼에 통과시킴으로써 수행된다. 용리는 흡착된 물질을 회수하기 위해, 완충제를 컬럼에 통과시킴으로써 수행된다. 필요에 따라, 이러한 통행(들) 전 또는 사이에 하나 이상의 세척 단계를 가할 수 있다. 당업자가 이해하듯이, 생성되는 용리액은 임의의 선행 단계, 예를 들면 친화성 크로마토그래피에 사용되는 특수한 조건에 따라 적합한 첨가 또는 조정에 의한 상태조절을 필요로 할 수 있다. 단백질 A 컬럼으로부터 용리액을 정제하는 경우, 비록 실시상의 이유로 바람직할 수는 있지만, 본 방법을 친화성 크로마토그래피 직후에 수행하 거나, 또는 심지어 동일한 설비로 수행할 필요는 없다.

본 방법의 한 실시양태에서, 원하는 항체를 포함하는 용액을 다중 양식 크로마토그래피 컬럼에 통과 유체 양식으로 가하며, 이 경우, 대부분의 항체는 바로 통과하고 오염물질은 흡착된다. 당업자는 예를 들면, 정제될 항체의 전하 및 전하 분포에 따라 좌우되는 pH를 조정함으로써, 조건을 용이하게 적합시켜 통과 유체를 얻을 수 있다. 따라서, 앞서 논의된 바와 같이, 이 실시양태는 리간드를 특이적으로 선택하여 면역글로불린에 효과적으로 결합시킨 US 6,498,236과는 본질적으로 상이하다. 또한, 상기 US 6,498,236에 개시된 방법은 본 발명의 한 유리한 실시양태인 단백질 크로마토그래피에 대한 보충으로, 즉 단백질 A 컬럼으로부터의 누출을 제거하는 것으로서 시사되지 않는다. 하기로부터 명백해지는 바와 같이, 본 발명과 US 6,498,236의 교시의 추가적인 차이는 리간드의 특성이다.

별법의 실시양태에서, 원하는 항체를 포함하는 용액을 다중 양식 크로마토그래피 컬럼에 결합 조건 하에서 가하며, 이 경우, 항체, 뿐만 아니라 오염물질은 다중 양식 크로마토그래피 수지에 흡착된다. 또한, 당업자는 예를 들면, pH 및(또는) 염 농도, 즉 용액의 전도성을 조정함으로써 조건을 용이하게 적합시켜 원하는 결합을 얻을 수 있다, .

본 방법에 사용되는 다중 양식 크로마토그래피 수지는 당업자에 의해 용이하게 제조된다. 간략히, 수지는 때때로 기저 메트릭스로 불리는 유기 또는 무기 지지체에 직접 또는 스페이서를 통해 커플링된 다중 양식 리간드를 포함한다. 지지체는 입자, 예를 들면 본질적으로 구형 입자, 모노리스(monolith), 필터, 막, 표 면, 모세관 등의 형태로 존재할 수 있다. 한 실시양태에서, 지지체는 천연 중합체, 예를 들면 가교결합된 탄수화물 물질, 예를 들면 아가로오스, 한천, 셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 칸자크(konjac), 카라기닌, 겔란(gellan), 아르기네이트 등으로부터 제조된다. 고 흡착 능력을 얻기 위해서는, 지지체는 다공성이고, 리간드는 외부 표면, 뿐만 아니라 다공 표면에 커플링되는 것이 바람직하다. 이러한 천연 중합체 지지체는 표준 방법, 예를 들면 역 현탁 겔화(문헌[S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398(1964)] 참조)에 따라 용이하게 제조된다. 별법으로, 지지체는 합성 중합체, 예를 들면 가교결합된 합성 중합체, 예를 들면, 스티렌 또는 스티렌 유도체, 디비닐벤젠, 아크릴아미드, 아크릴레이트 에스테르, 메타크릴레이트 에스테르, 비닐 에스테르, 비닐 아미드 등으로부터 제조된다. 이러한 합성 중합체는 표준 방법(예를 들면, 문헌["Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75(1988)) 참조)에 따라 용이하게 제조된다. 또한, 다공성 천연 또는 합성 중합체 지지체도 상업적 공급처, 예를 들면 스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언시즈로부터 입수가능하다.

다중 양식 리간드를 사용한 항체 정제에 유용한 지지체의 구체적인 예로는 팽창상 흡착용 수지, 즉 고 밀도 충전제, 바람직하게는 스테인레스강 충전제를 함유하는 중합체 지지체가 있다. 또한, 이러한 팽창상 흡착 수지는 포획 단계에서 항체, 예를 들면 단일클론 항체를 포획하는 데 유용하다.

앞서 언급한 바와 같이, 본 방법에 사용되는 크로마토그래피 수지의 다중 양 식 리간드는 하나 이상의 양이온 교환기 및 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리계를 포함한다. 표적 분자와 소수성 상호작용을 할 수 있는 방향족 고리계는 하나 이상의 원자에 의해 분리되거나 또는 예를 들면, 나프틸기로서 하나 또는 2 개의 시클릭 구조를 포함할 수 있다. 또한, 임의적으로 고리계는 예를 들면, 알킬옥시기, 예를 들면 메톡시기로 치환된다. 한 실시양태에서, 방향족 또는 헤테로방향족 고리계는 질소 원자를 함유하지 않으며, 시클릭 구조의 구성 원자는 탄소 원자(들), 황 원자(들) 및(또는) 산소 원자(들)에 한정된다. 따라서, 유리한 실시양태에서, 방향족 또는 헤테로방향족의 고리 형성 원자는 C, S 및 0로 이루어진 군으로부터 선택된다.

한 실시양태에서, 본 방법에 사용되는 수지는 다음과 같이 설명된다: Su-스페이서-X-양이온 교환기-스페이서-방향족 또는 헤테로방향족 고리(여기서, Su는 지지체이고, 스페이서는 임의적이고, X는 커플링 원자, 예를 들면 O, S 또는 N임). 적합한 스페이서 및 이러한 스페이서를 생성하는 커플링 화학작용은 당 분야에 공지되어 있다. 따라서, 이 실시양태는 양이온 교환기로 작용하는 산기가 방향족에 대한 치환체인 상기 논의된 US 6,498,236과 실질적으로 상이하다 . 따라서, 본 실시양태에 사용된 수지는 그 구조가 방향족과 양이온 관능 사이에 추가의 거리를 생성하기 때문에 표적 화합물에 대해 상이하고 더욱 공간적으로 연장되게 결합할 수 있을 것으로 예측될 수 있다. 임의의 이론에 한정되길 원치 않지만, 본 메트릭스가 항체 흡착에 최적화된 것으로 알려진 US 6,498,236보다 비교적 큰 항체 함유 착물에 대해 더 유리한 흡착을 제공하는 것으로 가정될 수 있다.

바람직하게는, 양이온 교환기는 즉, 특정한 pH 값에서 양자화될 수 있는 기인 약한 양이온 교환제이다. 강한 양이온 교환기는 약한 양이온 교환제와는 달리, 모든 pH 값에서 전하를 유지시키는 기를 포함한다. 따라서, 한 실시양태에서, 다중 양식 리간드는 카르복실기, 예를 들면 하나 또는 2 개의 카르복실기를 포함한다.

그러나, 당업자가 이해하듯이, 상기한 다중 양식 리간드도 추가의 상호작용, 예를 들면 수소 결합을 제공할 수 있다. 또한, 본 방법에 사용된 다중 양식 크로마토그래피 리간드는 상기 논의된 기 외에도 오염물질 및 항체와의 상호작용에 기여할 수 있거나 없는 하나 이상의 술포닐기, 아민 또는 카르보닐기를 포함할 수 있다.

본 방법에 사용된 다중 양식 크로마토그래피 수지를 제조하기 위해 상기 논의된 담체에 커플링된 리간드는 예를 들면, 상기 논의된 WO 03/024588(아머샴 바이오사이언시즈)에 기재된 바와 같이 합성될 수 있고, 여기서 약한 양이온 관능을 포함하는 다중 양식 리간드는 호모시스테인 티오락톤으로부터 출발하여 합성된다. 다중 양식 리간드의 합성에 대한 추가 참조를 위해, 예를 들면, WO 02/059059(아머샴 바이오사이언시즈)를 참조할 수 있다. 리간드를 스페이서로 알려진 적합한 이격화 요소를 통해 담체에 커플링시킬 수 있다. 이 목적에 유용한 커플링 방법의 검토시, 예를 들면, 문헌[Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanson et al, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia and Paul K. Smith, Academic Press, INC, 1992]을 참조할 수 있다. 당 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 매개변수, 예 를 들면 리간드 밀도 또는 치환 수준, 지지체의 다공 크기 등을 변화시켜 원하는 성질을 갖는 크로마토그래피 수지를 제공할 수 있다.

본 방법은 임의의 단일클론 또는 다클론 항체, 예를 들면 포유류 숙주, 예를 들면 마우스, 설치류, 영장류 및 인간으로부터 유래하는 항체, 또는 배양된 세포, 예를 들면 하미브리도마로부터 유래하는 항체를 회수하는 데 유용하다. 한 실시양태에서, 회수되는 항체는 인간 또는 인간화된 항체이다. 항체는 임의의 부류일 수 있으며, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 실시양태에서, 정제되는 항체는 단백질 A, 또는 Fc-함유 항체 단편 또는 융합 단백질에 결합할 수 있는 항체이다. 구체적인 실시양태에서, 회수되는 항체는 면역글로불린 G(IgG)이다. 이와 관련하여, 용어 "항체"가 항체 단편, 및 항체 또는 항체 단편을 포함하는 임의의 융합 단백질도 포함한다는 점이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 앞서 언급된 항체, 뿐만 아니라 이러한 항체를 포함하는 융합 단백질 중 하나의 단편을 정제하는 것도 포함한다. 본 발명에 따라 단리된 항체는 약물, 예를 들면 특정 개인용 활성 성분을 포함하는 개인별 맞춤 의약으로 유용하다. 본 발명에 따라 단리된 항체는 연구 및 진단 분야에도 유용하다.

한 실시양태에서, 상기와 같이, 본 방법은 단백질 크로마토그래피 수지 상의 제 1 포획 단계 및 다중 양식 크로마토그래피 수지 상의 후속 폴리싱 단계를 포함한다. 단백질 A 단계에 가해지는 용액은 세포 배지 액체 또는 발효 브로쓰일 수 있으며, 이는 임의적으로 전처리, 예를 들면 여과, pH 및(또는) 전도도 등을 조정함으로써 상태조절 받았다. 따라서, 포획 단계는 숙주 세포 잔여물, 예를 들면 세 포 파편 및 단백질, DNA, 내독소 등을 제거하고, 폴리싱 단계는 주로 포획 단계로부터의 잔여물 형태의 오염물질, 예를 들면 앞서 논의한 단백질 A-항체 응집물을 제거한다. 따라서, 본 발명은 예를 들면, 단백질 A 기재 크로마토그래피 후 두 개의 추가 단계를 개시한 상기 논의된 US 5,429,746(스미스클라인 비참 코퍼레이션)보다 더 간단한 절차를 제공한다. 또한, 단백질 A 기재 크로마토그래피에 대한 대안으로 제안된 작은 유기 리간드에 비해, 본 발명은 매우 순수한 항체 생성물을 얻을 수 있으면서, 선택성 및 용량에 대한 단백질 A의 실질적인 이점을 유지시킨다.

그러나, 본 명세서에 기재된 다중 양식 크로마토그래피 수지를 사용한 항체 정제를 단일 단계로 사용할 수 있으며, 이 경우 상기 예시된 오염물질모두가 제거될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 단일 단계 절차에 사용된 다중 양식 리간드는 본 리간드의 방향족 고리계를 형성하는 원자가 탄소 원자로 한정되거나 또는 탄소 원자, 황 원자 및 산소 원자로 이루어진 군으로부터 선택(즉, 질소 원자가 고리에 존재하지 않음)된다는 점에서 상기 논의된 다중 양식 MBI^TM 하이퍼셀 리간드와 상이하다. 이러한 질소는 하전가능하기 때문에, MBI^TM 하이퍼셀 리간드의 성질은 특정한 조건 하에서 본 리간드와 실질적으로 상이하게 된다. 또한, 본 다중 양식 리간드는 모든 pH 값에서 하전되는 MBI^TM 하이퍼셀의 강한 SO₃ ^-와는 달리 오직 약한 양이온 교환기만을 포함한다.

제 2 측면에서, 본 발명은 다중 양식 리간드가 하나 이상의 양이온 교환기 및 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리계를 포함하는 것인 다중 양식 크로마토그래피 수지, 2 개 이상의 상이한 완충제, 및 항체 정제법을 기술하는 서면 지침을 별도의 구획으로 포함하는 키트이다. 유리한 실시양태에서, 이 지침은 단백질 A와 항체 사이에 형성된 착물로부터 항체를 분리시키는 키트의 사용 설명을 제공한다. 한 실시양태에서, 방향족 또는 헤테로방향족의 고리 형성 원자는 C, S 또는 O 중에서 선택된다. 본 키트는 항체의 정제에 대해 상기한 방법 중 하나에 사용될 수 있다. 유리한 실시양태에서, 수지는 임의의 통상적인 물질, 예를 들면 생체적합성 플라스틱, 예를 들면 폴리프로필렌 또는 유리로부터 제조된 컬럼에 존재한다. 컬럼은 항체의 실험실 규모 또는 대규모 정제에 적합한 크기로 이루어질 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 컬럼에 루어 어뎁터(luer 어뎁터), 튜빙 연결기(tubing connector) 및 둥근 천장형 너트(domed nut)를 제공한다. 한 실시양태에서, 컬럼은 멸균된다. 구체적인 실시양태에서, 컬럼은 폐기가능하다.

마지막으로, 본 발명의 또다른 측면은 바람직하게는, 세포 배양액으로부터 유래하는 액체 중 세포 성분 및(또는) 오염물질로부터 항체를 정제하는 시스템이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 리간드가 단백질 A 또는 단백질 G를 포함하는 수지로 패킹된 제 1 크로마토그래피 컬럼, 하나 이상의 양이온 교환기 및 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리계를 포함하는 다중 양식 크로마토그래피 수지로 패킹된 제 2 크로마토그래피 컬럼, 샘플 및 용리 완충제를 제 1 컬럼에 첨가하는 수단, 제 1 컬럼으로부터 유래한 용리액을 제 2 컬럼에 첨가하는 수단, 펌핑 수단 및 밸브를 포함하는, 액체로부터 항체를 정제하기 위한 시스템이다. 제 1 및 제 2 크로마토그래피 컬럼용 수지는 앞서 논의한 바와 같을 수 있다. 유리한 실시양태에서, 이 시스템은 자동화된다. 이러한 자동화된 시스템은 공정 통제를 위한 통상적인 수단에 의해 통제될 수 있다.

도면의 상세한 설명

하기 크로마토그램(도 1-6, 7 및 9)에서, 색상 표시는 다음과 같다: 청색 또는 적색 선(XX): A₂₈₀ nm; 녹색 선(YY): 형광; 갈색 선(ZZ): 전도성(mS/cm); 회색 선(OO): pH.

도 1은 하기 실시예 2(a)에 개시된 바와 같이, 대조군 실험 1의 결과를 도시한다. 2 ml MAb-단백질 A 혼합물을 바이패스를 통해 주입하고, 0.5 ml 분획을 수집하였다. 도 1로부터, 형광 방출 및 A₂₈₀ 곡선의 상대 강도가 잘 일치한다는 점이 명확히 드러난다.

도 2는 하기 실시예 2(a)에 개시된 바와 같이, 대조군 실험 2의 결과를 도시한다. 형광-표지 단백질 A를 포함하는 2 ml의 용액을 기준 수지 SP 세파로오스^TM 패스트 플로우(FF)(아머샴 바이오사이언시즈)를 포함하는 컬럼에 주입하였다. 구배 용리를 사용하고, 1 ml 분획을 수집하였다. 또한, A₂₈₀ 곡선과 형광 방출이 잘 일치한 것으로 관찰되었다.

도 3은 하기 실시예 2(a)에 개시된 바와 같이, 대조군 실험 3의 결과를 도시한다. 단백질 A-용액을 이하 실시예 2, 물질 및 방법에 기재되는 다중 양식 배지 원형 U790 P73에 주입하였다. 구배 용리를 사용하고, 1 ml 분획을 수집하였다. 또한, 이 경우, 또한, A₂₈₀ 곡선과 형광 방출이 잘 일치한 것으로 관찰되었다.

도 4는 이하 실시예 2(b)에 개시된 바와 같이, MAb 및 MAb-단백질 A 응집물을 결합 양식으로 분리한 것을 도시한다. 또한, 다중 양식 배지 원형 U790 P73을 사용하였다. 용리에 20 컬럼 부피(CV) 중 0-100 % B의 구배를 사용하였다. A-완충제(평형)(pH 5.0) 및 B-완충제를 하기 실시예 2, 물질 및 방법에 정의된 바와 같이 사용하였다.

도 5는 이하 실시예 2(b)에 개시된 바와 같이, 추가의 최적화된 조건을 사용한 MAb와 MAb-단백질 A 응집물을 분리한 것을 도시한다. 다중 양식 배지 원형 U790 P73을 사용하였다. 0 CV에서 0-77% B, 30 CV에 대해 77% B, 및 CV에 대해 77-100% B의 최적화된 구배를 사용하였다. A-완충제(평형)(pH 4.5) 및 B-완충제를 하기 실시예 2, 물질 및 방법에 정의된 바와 같이 사용하였다.

도 6은 하기 실시예 2에 기재된 바와 같이 슈퍼덱스^TM 200 상에서의 겔 여과에 의한 피크 분석 결과를 도시한다. 분석된 피크를 도 5에 도시한다. 더욱 구체적으로, 도 6A는 분획 A9(주 UV-피크의 상부로부터)의 겔 여과로부터의 결과를 도시하고, 도 6B는 겔 여과 분획 C7(형광 피크의 상부로부터)로부터의 결과를 도시한다. 도 6A에서는, 어떠한 MAb-단백질 A 응집물도 검출가능하지 않았다. 도 6B에서, MAb-단백질 A 응집물은 MAb 피크 전 크로마토그램에서 두 피크에 의해 검출가능하였다. 이는 MAb-단백질 A 응집물이 발명에 따른 다중 양식 크로마토그래피 방법을 사용한 MAbs로부터 분리될 수 있다는 좋은 표시이다.

도 7은 하기 실시예 2(c)에 기재된 바와 같이, 통과 유체 양식으로 순수 MAb와 MAb-단백질 A 응집물을 분리한 것을 도시한다. 원형 다중 양식 리간드 U790 P73을 사용하였다. 샘플 부피는 6.5 ml(4.4 mg MAb/ml)였다. 샘플은 미표지(청색선) 또는 형광 표지(적색선) 단백질 A가 첨가된 MAb를 포함하였다. 97% B = 0.13 M NaCl(평형)을 사용하였다. A-완충제 및 B-완충제는 이하 물질 및 방법에 기재된 방법과 같았다.

도 8은 실시예 2에 기재된 바와 같이, 슈퍼덱스^TM 200에 대한 겔 여과에 의한 피크 분석 결과를 도시한다. 분석된 피크를 도 7에 도시한다. 샘플 부피는 100 ㎕이고, 유량은 0.5 ml/분이고, 완충제는 이하 물질 및 방법에 기재된 방법과 같았다. 더욱 구체적으로, 도 8A는 비표지 단백질 A를 사용한 런으로부터의 분획 A7(통과 유체 피크의 상부)을 나타내고, 도 8B는 비표지 단백질 A를 사용한 런으로부터의 분획 B3(용리된 피크의 상부)를 나타내고, 도 8C는 형광 표지 단백질 A를 사용한 런으로부터의 분획 B3을 나타낸다. 적색 곡선은 UV를 나타내고, 녹색 플롯은 형광을 나타낸다.

도 9는 하기 실시예 2(c)에 기재된 바와 같이, 순수 MAb 및 MAb-단백질 A 응집물을 유체 통과 양식으로 분리한 것을 도시한다. 원형 U790 P73을 사용하였다. 샘플은 상기 도 7을 얻는 데 사용된 것보다 실질적으로 더 컸으며, 즉 50 ml MAb 4.2 mg/ml(총 210 mg MAb; 형광 표지 단백질 A를 첨가)였다. 실험 조건: 97% B = 0.13 M NaCl(평형). A-완충제 및 B-완충제는 물질 및 방법 하에서 상기와 같았다. 청색선: UV(280 nm), 갈색선: 전도도, 녹색 플롯: 형광.

도 10은 실시예 2에 기재된 바와 같이 슈퍼덱스^TM 200 상의 겔 여과에 의해 얻어진 도 9에 제공된 피크 분석 결과를 도시한다: 통과 유체 분획: A2, A5, A8, A11, A15, B3, B6, B9 및 B11. 용리된 분획: C2. 샘플 부피는 100 ㎕이고, 유량은 0.5 ml/분였다. 완충제는 하기 물질 및 방법에 기재된 바와 같다. 도 10A는 도 9로부터 선택된 분획으로부터의 겔 여과의 크로마토그램 중첩을 도시하고, 도 10B는 도 10A의 확대도를 도시한다. MAb-단백질 A 응집물은 용리된 피크에서는 검출가능하지만, 통과 유체 분획에서는 검출가능하지 않았다. 이 결과는 실질적으로 모든 MAb-단백질 A 응집물이 컬럼에 흡착하고, 전도도 증가에 의해 또다시 용리된다는 점을 시사한다

실험부

본 실시예는 오직 예시의 목적으로 제공되며, 첨부되는 청구범위에 의해 정해진 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서에서 하기 및 다른 곳에서 제공된 모든 참고문헌은 본 명세서에 참고문헌으로써 포함된다.

실시예 1: 다중 양식 크로마토그래피 수지

이하 제공되는 메트릭스의 부피는 고정층 부피를 기준으로 한다. 그램 단위로 제공된 메트릭스의 중량은 흡인(물 펌프) 건조 중량을 기준으로 한다. 이 메트 릭스는 여전히 수 용매화된 물질인 것으로 이해된다. 이하 지칭되는 교반은, 자성 막대 교반기를 사용하면 비드에 손상을 주기 때문에 현탁된 모터 구동 교반기에 의한 것이었다. 관능가의 분석 및 알리화도, 에폭시화도, 또는 비드 상의 이온 교환제 기의 치환도의 결정은 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 기준으로 한다. 하기 방법은 특히, 황 원자의 경우 최종적으로 겔의 추가적인 원소 분석에 의해 보완되었다.

실시예 1(a): 다중 양식 리간드 원형 U1012054

본 실시예에서는 3-아미노-4(프로필술포닐)티오펜-2-카르복실산이 어떻게 NHS 활성화 아가로오스 담체에 커플링되었는지 기재한다.

티오프로피온산 세파로오스의 제조: 지속적인 황색 색상이 얻어질 때까지 브롬을 100 ml의 알릴 활성화된(0.3 mmol 알릴/ml) 세파로오스^TM 6 패스트 플로우(Fast Flow) 겔(아머샴 바이오사이언시즈), 4 g의 AcONa 및 100 ml의 증류수의 교반된 현탁액에 첨가하였다. 그 다음, 현탁액이 완전히 탈색될 때까지 포름산나트륨을 첨가하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 겔을 500 ml의 증류수로 세척하였다. 그 다음, 활성화된 겔을 바로 반응 용기에 옮기고, 첨가 전 50 % NaOH 수용액으로 pH를 11.5로 조정한 17.5 ml의 티오프로피온산(알릴기 당 6 당량) 및 12 g의 NaCl의 수용액(50 ml의 증류수)으로 처리하였다. 반응물을 50 ℃에서 교반하면서 18 시간 동안 두었다. 반응 혼합물을 여과하고, 500 ml의 증류수로 세척하여 겔 1 ml 당 CO₂H 기 0.29 mmol의 치환도를 갖는 티오프로피온산 세파로오스 겔을 생성하였다.

N- 히드록시숙신이미드를 사용한 겔의 활성화: 그 다음, 100 ml의 생성되는 티오프로피온산 세파로오스를 300 ml 1 M NaCl, 500 ml 0.1 MHC1, 500 ml 50% 수성 아세톤, 500 ml 아세톤으로 연속적으로 세척하였다. 세척 후, 겔이 아세톤에 침전되게 하고, 상청액을 사이펀으로 빨아내고, 20 ml의 아세톤의 도움으로 침전된 비드를 반응 용기로 옮겼다. 그 다음, 80 ml의 아세톤 중의 15.2 g의 N-히드록시숙신이미드(NHS)의 용액 및 80 ml의 아세톤 중의 디시클로헥실카르보디이미드의 또다른 용액을 첨가하였다. 반응 슬러리를 30 ℃에서 18 시간 동안 교반하면서 두었다. 여과 후, 겔을 전체 작업일 동안 150 ml 이소프로판올로 천천히 10 회 세척하였다(중력류). NH₄0H와의 반응 후 NHS-활성화도는 약 80%인 것으로 평가되었고, 이는 겔 1 ml 당 약 0.23 mmol의 NHS 관능의 활성화에 대응하는 것이다.

NHS 활성화 티오프로피온산 세파로오스에 대한 리간드의 커플링: 3-아미노-4(프로필술포닐)티오펜-2-카르복실산을 WO 02/05959(리간드 12)에 기재된 바와 같이 제조하였다. 2 ml의 증류수, 2 ml의 1M NaHCO₃ 및 2 ml의 에탄올 중의 565 mg의 3-아미노-4(프로필술포닐)티오펜-2-카르복실산(2.27 mmol)의 용액의 가용성 혼합물을 제조하고, 50% 수성 NaOH를 조심스럽게 첨가하여 pH를 8.5로 조정하였다.

NHS 활성화 티오프로피온산 세파로오스(10 ml)를 20 ml 얼음 냉각된 1 mM HCl 용액으로 신속하게 세척하였다. 그 다음, 겔을 티네일 세린(thineyl serine) 용액이 첨가되는 에를렌마이어(Erlenmeyer)에 옮겼다. 반응 혼합물을 실온에서 18 시간 동안 진탕대(150 rpm)에 올려놓았다.

반응 혼합물을 여과한 후, 겔을 40 ml 증류수, 20 ml 에탄올, 20 ml 0.25 M aq. 에탄올아민, 20 ml의 증류수, 20 ml 1M aq. NaCl, 및 20 ml의 증류수로 연속적으로 세척하였다.

실시예 1(b)-(d)

다음의 실시예 1(b)-(d)에서, WO 03/024588에 기재된 바와 같이 스캐폴드로서 D,L-호모시스테인 티오락톤을 사용하여 다중 양식 리간드 원형 U790P65, U790P71 및 U790P73을 제조하였다. 간략히, 호모시스테인 티오락톤을 아실 클로리드 또는 무수물과 반응시킴으로써 결합된 아미드를 형성시킨 후, 염기성 가수분해로 티오락톤 고리를 개환시키고, 생성되는 화합물을 활성화된 세파로오스^TM 6 FF(스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)에 추가 커플링시켰다.

실시예 1(b): 리간드 원형 U790P73

30 ml DCM 중의 벤조일 클로리드(8.7 ml, 75 mmol)의 용액을 0 ℃에서 디클로로메탄(DCM, 120 ml) 중의 D,L-호모시스테인 티오락톤(11.5 g, 75 mmol) 및 디이소프로필아민(DIPEA)(26 ml, 150 mmol)의 용액에 적가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 반응 잔여물을 에틸 아세테이트(300 ml)로 추출하였다. 유기상을 aq. 시트르산 10%(w/w, 200 ml), aq. K₂CO₃ 10 %(200 ml), 물(200 ml)로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 용매를 제거하여 백색 고체(13.8 g, 83%)를 얻었다. 0 ℃에서, 5N 수산화나트륨 용액(5 ml)을 276 mg(1.25 mmol)의 백색 고체에 첨가하고, 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 추가 교반하였다. 알릴화된 세파로오스^TM 6 패스트 플로우(250 μmol/ml)로부터 출발하여 공지된 절차를 따라 얻어진 브롬화된 세파로오스^TM 6 패스트 플로우(10 ml)아머샴 바이오사이언시즈)를 리간드의 알칼리 용액(상기와 같음)과 혼합시키고, 밤새 50 ℃로 가온하였다. 반응 후, 겔을 여과하고, 물(2×150 ml), 에탄올(2×150 ml), 아세트산 0.2M(2×150 ml) 및 물(2×150 ml)로 세척하였다. 그 다음, 겔의 이온 용량을 산기를 적정함으로써 측정하고, 이는 겔 1 ml 당 103 μmol을 제공하였다.

실시예 1(c): 리간드 원형 U790P65

4 ml DCM 중의 3,4,5-트리메톡시-벤조일 클로리드(2.37 g, 10.3 mmol)의 용액을 0 ℃에서 디클로로메탄(DCM, 6 ml) 중의 D,L-호모시스테인 티오락톤(1.58 g, 10.3 mmol) 및 디이소프로필아민(DIPEA)(3.58 ml, 20.6 mmol)의 용액에 적가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 반응 잔여물을 에틸 아세테이트(50 ml)로 추출하였다. 유기상을 aq. 시트르산 10%(w/w,30 ml), aq. K₂CO₃ 10 %(30 ml), 물(30 ml)로 세척하고, 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과 후, 용매를 제거하여 백색 고체(2.21 g, 69%)를 얻었다. 0 ℃에서, 5N 수산화나트륨 용액(5 ml)을 389 mg(1.25 mmol)의 백색 고체에 첨가하고, 혼합물을 2 시간 동안 실온에서 추가 교반하였다. 알릴화된 세파로오스^TM 6 패스트 플로우(250 μmol/ml)로부터 출발하여 공지된 절차를 따라 얻어진 브롬화된 세파로오스^TM 6 패스트 플로우(10 ml)(스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 리간드의 알칼리 용액(상기와 같음)과 혼합시키고, 밤새 50 ℃로 가온하였다. 반응 후, 겔을 여과하고, 물(2×150 ml), 에탄올(2×150 ml), 아세트산 0.2M(2×150 ml) 및 물(2×150 ml)로 세척하였다. 그 다음, 겔의 이온 용량은 겔 1 ml 당 59 μmol로 측정되었다.

실시예 1(d): 리간드 원형 U790P71

4 ml DCM 중의 페닐 글루타르산 무수물(1.96 g, 10.3 mmol)의 용액을 0 ℃에서 디클로로메탄(DCM, 6 ml) 중의 D,L-호모시스테인 티오락톤(1.58 g, 10.3 mmol) 및 디이소프로필아민(DIPEA)(3.58 ml, 20.6 mmol)의 용액에 적가하였다. 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 반응 잔여물을 바로 5N 수산화나트륨 용액(10 ml)으로 처리하고, 2 시간 동안 실온에서 추가 교반하였다. 알릴화된 세파로오스^TM 6 패스트 플로우(250 μmol/ml)로부터 출발하여 공지된 절차를 따라 얻어진 브롬화된 세파로오스^TM 6 패스트 플로우(10 ml)(스웨덴 웁살라 소재의 아머샴 바이오사이언시즈)를 상기와 같은 1.4 ml의 리간드의 알칼리 용액과 혼합시키고, 밤새 50 ℃로 가온하였다. 반응 후, 겔을 여과하고, 물(2×150 ml), 에탄올(2×150 ml), 아세트산 0.2M(2×150 ml) 및 물(2×150 ml)로 세척하였다. 그 다음, 겔의 이온 용량은 겔 1 ml 당 110 μmol로 측정되었고, 이는 겔 1 ml 당 55 μmol의 리간드 치환 수준에 대응한다.

실시예 2: 항체의 분리

물질

크로마토그래피 시스템: UNICORN v. 4.0 소프트웨어(아머샴 바이오사이언시즈)가 구비된 AEKTA^TM 익스플로러 100

분광광도계: 울트로스펙(Ultrospec)^TM 3000pro(아머샴 바이오사이언시즈)

형광 분광계: JY 호리바(Horiba)(미국 뉴저지주 에디슨 소재)로부터의 SPEX 플루오로로그(Fluorolog)-3

아세트산: 머크(Merck) 분류 번호 1.00063, p.a.(프로에널리시(Pro Analysi))

Na-숙시네이트: BDH, 분류 번호 30219

NaCl: 머크 분류 번호 1.06404, p.a.

Tris: 머크 분류 번호 1.08382, p.a.

NaOH: 머크 분류 번호 1.06469, p.a.

MES: 시그마(SIGMA) 분류 번호 M3671

Na₂CO₃: 머크 분류 번호 1.06392.1000, p.a.

물: MilliQ-물을 사용하였음

Cy 5 반응성 염료: 아머샴 바이오사이언시즈

SP 세파로오스^TM 패스트 플로우(대조군): 아머샴 바이오사이언시즈

슈퍼덱스^TM 20010/300(겔 여과): 아머샴 바이오사이언시즈

결합 조건 하에서 순수 MAb와 MAb-단백질 A 응집물을 분리시키는 데 하기 완충제를 사용하였다:

A-완충제(평형): 100 mM 아세트산, 20 mM Na-숙시네이트 pH 4.5-5.0

B-완충제: 100 mM 아세트산, 20 mM Na-숙시네이트, 1.5 M NaCl pH 6.4.

통과 유체 양식으로 순수 MAb와 MAb-단백질 A 응집물을 분리시키는 데 하기 완충제를 사용하였다:

A-완충제: 50 mM MES,1 M NaCl pH 7

B-완충제: 50 mM MES 0.1 M NaCl pH 7.0.

겔 여과에 하기 조건를 사용하였다: 50 mM 포스페이트 완충제, 0.150 M NaCl, pH 7.0.

인간화된 단일클론 IgG1 항체(pI 9)(제넨테크(Genentech))를 단백질 A 배지(맵셀렉트(MabSelect), 아머샴 바이오사이언시즈) 상에서 초기 정제하였다.

천연 단백질 A를 노보자임스(Novozymes)(배치(Batch) NDP 1023)로부터 얻었다.

방법

컬럼 패킹 및 시험: 겔 슬러리를 Milli Q 물로 부분적으로 충전된 HR5/5 컬럼에 부었다. 겔을 압축시키지 않고 상부 어뎁터를 겔 표면을 향해 낮추었다. 그 다음, 상이 안정해질 때까지 겔을 1.2 ml/분에서 패킹하였다. 그 다음, 어뎁터를 낮추어 겔 표면에 닿게 하였다. 25 ㎕ 2% 아세톤을 주입함으로써 패킹 성능(즉, 플레이트 수 및 비대칭성)을 평가하였다.

단백질 A의 형광 표지화: 200 ㎕ 단백질 A 용액(~50 mg/ml)을 1000 ㎕ 0.1 M Na₂CO₃(pH 9.3)로 희석시켰다.

용액을 Cy5 반응성 염료의 바이알에 옮겼다. 30 분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 100 mM HAc, 20 mM Na-숙시네이트(pH 5.0)로 평형화된 PD10 컬럼 상에서 탈염시켰다. 그 다음, 표지화된 단백질 A를 미표지 단백질 A로 1:5 희석하여 최종 농도가 ~41 mg/ml가 되게 하였다.

샘플 제조: MAb-샘플의 세 복제물을 분광기에서 280 nm에서 측정하였다. 농도 결정에 흡광도의 평균값을 사용하였다. MAb 농도는 하기 식에 따라 4.4 mg/ml로 결정되었다:

C =A/(1 ×ε)

상기 식 중,

C = IgG의 농도

A = 280 nm에서의 흡광도

l = 경로 길이

ε = MAb에 대한 몰 소광 계수, mg ml^-1= 1.46.

형광 표지 단백질 A 용액을 1:1000(w/w)의 비율로 MAb 샘플에 첨가하였다.

통과 유체 양식에서, NaCl을 첨가함으로써 이온 강도를 조정하였다(상세한 설명에 대해서는 하기 참조).

단백질 A 검출에 대한 형광 측정: 수집된 분획 중 단백질 A 상대 농도 측정을 형광 분광계(SPEX 플루오로로그-3)를 사용함으로써 수행하였다. 630 nm에서 Cy5를 여기시키고, 670 nm에서 형광 방출을 검출하였다.

겔 여과: MAb-단백질 A 응집을 시험하기 위해, 슈퍼덱스^TM 200(아머샴 바이오사이언시즈)으로 예비패킹된 컬럼을 사용하여 겔 여과를 수행하였다. 원형 런으로부터 선택된 분획을 분석하였다. 샘플 부피는 100 ㎕이고, 유량은 0.5 ml/분이었다.

평형: 2 컬럼 부피(CV) 완충제(처음 사용).

평형: 0.1 CV 완충제(런 사이).

샘플 주입: 100 ㎕. 이소크래틱(isocratic) 용리: 1.2 CV 완충제.

단백질 A 농도의 분석: 200 ㎕ 샘플 + 800 ㎕ 희석제의 비율로 샘플을 희석하였다(단백질 A 분석시험의 경우 샘플 희석제 사용). 혼합 후, 시험관을 수조에서 10 분 동안 비등시킨 다음, 또다시 혼합시켰다. 그 다음, 샘플의 단백질 A 함량을 분석하였다.

실시예 2(a): 결합 조건 하에서의 대조군 실험

형광 표지 단백질 A를 상기한 MAb 용액과 혼합시켰다. 형광 표지화가 단백질 A의 크로마토그래피 성질에 영향을 주지 않게 하고, AEKTA^TM 익스플로러(Explorer)(아머샴 바이오사이언시즈)에서의 정확한 지연 값을 설정하기 위해, 세 가지 상이한 대조군 실험을 다음과 같이 수행하였다.

대조군 실험 1: 바이패스를 통해 MAb-단백질 A 혼합물을 주입하고, 0.5 ml 분획을 수집하였다. 수집된 분획에서 흡광도 곡선과 형광을 비교하였다. 도 1에 도시된 바와 같이, 시스템 지연 부피를 정확히 설정한 후, 형광 방출 및 A₂₈₀ 곡선의 상대 강도는 잘 일치하였다.

대조군 실험 2: 2 ml 단백질 A 용액을 SP 세파로오스^TM 패스트 플로우에 주입하였다. 구배 용리 및 분획 수집(1 ml/분획). 단백질 A의 용리를 280 nm에서의 흡광도 및 수집된 분획에서의 형광 측정에 의해 모니터링하였다. 또한, 이 경우 곡선과 형광 방출이 잘 일치함을 관찰할 수 있었다(도 2 참조).

대조군 실험 3: 단백질 A-용액을 배지 원형 U790 P73에 주입하는 것을 제외하고 대조군 2와 같이 수행하였다(상기 실시예 1(b) 참조). 또한, 다중 양식 배지 원형을 사용한 경우, A₂₈₀ 곡선과 형광 방출이 잘 일치함을 관찰할 수 있었고(도 3), 비표지 단백질 A와 표지 단백질 A 사이에서는 분리가 일어나지 않았다.

실시예 2(b):

MAb 와 MAb -단백질 A 응집물의 결합 양식 분리

2 ml MAb-단백질 A 혼합물을 상이한 배지 원형에 주입하였다. 구배 용리 및 분획 수집은 상기와 같다. MAb 및 MAb-단백질 A 응집물을 용리시킨 후, 280 nm에서 흡광도를 모니터링하고, 수집된 분획에서 형광 측정을 함으로써 용리 전도도도 모니터링하였다. 각각의 원형에 대해 흡광도 곡선과 형광 방출 사이의 보유 부피(retention volume)차를 결정하였다. 그 결과를 표 2 및 도 4에 나타낸다. 비록 데이터 점의 수는 적고 편차는 비교적 크지만, 용리 전도도가 높을수록 UV-피크와 형광 피크 사이(즉, MAb와 MAb-단백질 A 응집물 사이)의 우수한 분리가 얻어진다는 결론을 얻을 수 있다. 기준 메트릭스 SP 세파로오스^TM 패스트 플로우에서는 분리가 일어나지 않았다.

흡광도 곡선과 형광 방출 사이의 보유 부피(dRt) 및 용리 전도도 차이
배지	dRt(ml)	mS/cm
SP Seph FF	0	19.9
U2054	1	38.5
U790P65	1.6	50.4
U790P71	0.5	45.6
U790P73	3.5	84.2

분리에 근소한 영향을 미치는 샘플의 pH, 및 구배의 최적화를 조정함으로써 원형 U790 P73으로부터 얻어진 분리를 추가로 최적화하였다. 한 실험(결과는 도시되지 않음)에서, 얕은 구배, 즉 20 대신 40 CV를 사용함으로써 dRt를 6 ml로 증가시켰다. 단계 용리에 의해 더욱 우수한 분리를 얻었다(도 5). 이 방식으로, 형광의 일부를 주 피크로부터 완전히 분리시킬 수 있었다. 크로마토그램에서 다양한 분획들을 슈퍼덱스^TM 200 상에서 겔 여과함으로써 분석하였다(도 6). MAb-단백질 A 응집물을 형광 피크, 즉, 주 UV-피크에서가 아니라 MAb 피크 앞 크로마토그램 중 두 피크에서 검출할 수 있었다. 이 결과는 다중 양식 리간드를 사용함으로써 MAb로부터 MAb-단백질 A 응집물을 분리하는 것이 가능하다는 점을 시사한다.

실시예 2(c):

MAb 와 MAb -단백질 A 응집물의 통과 유체 양식 분리

미표지 단백질 A 및 형광 표지 단백질 A(조건: 97% B = 0.13 M NaCl)를 첨가함으로써 두 실험을 통과 유체 양식으로 수행하였다. 그 결과는 크로마토그램이 거의 동일하였음을 나타내었다(도 7). 상기와 같이, 슈퍼덱스^TM 200 상에서 겔 여과함으로써 다양한 분획들을 분석하였다(도 8A-B). MAb-단백질 A 응집물은 통과 유체에서가 아니라 용리된 피크에서 검출될 수 있었다. 또한, 슈퍼덱스^TM 분획에서의 형광 방출은 주 MAb-피크에서가 아니라 크로마토그램 중 두 개의 부 피크에서 검출될 수 있었다(도 8C). 따라서, 이러한 결과는 MAb로부터 MAb-단백질 A 응집물을 통과 유체 양식으로 분리시키는 것이 가능하다는 점을 나타낸다. 따라서, 대부분의 단백질 A-항체 응집물은 흡착되며, MAb 중 대략 95 %는 컬럼을 바로 통과하였다.

MAb와 MAb-단백질 A 응집물의 통과 유체 양식 분리 방법의 효능을 추가 조사하기 위해, 50 ml의 MAb-단백질 A 혼합물(총 210 mg MAb)을 1 ml 컬럼(도 9)에 가하였다. 단백질 중 98.4 %가 컬럼을 바로 통과하고(mAU*ml 기준), 전도도를 증가시킴으로써 작은 피크(1.6 %)를 용리시켰다. 슈퍼덱스^TM 200 상에서의 겔 여과 및 형광 방출의 검출에 의해 분획을 분석하였다. 또한, 상기와 같이, 단백질 A 분석을 위해 샘플을 제조하였다.

겔 여과로부터의 결과를 도 10에 나타낸다. 상기와 같이, MAb-단백질 A 응집물은 통과 유체 분획에서가 아니라 용리된 피크에서 검출될 수 있었다. 이 결과는 대부분의 MAb-단백질 A 응집물이 컬럼에 흡착되고, 전도도를 증가시킴으로써 또다시 용리된다는 점을 시사한다.

형광 측정은 형광 방출, 즉 단백질 A 함량이 샘플 적용 동안 통과 유체 중에서 점진적으로 증가하였음을 보여준다. 그러나, 용리된 피크에서 형광 중 90%가 발견되었다. 이러한 관측은 단백질 A 농도의 분석에 의해 확인되었다(표 3). 따라서, 40 mg MAb/ml 흡착제를 가한 때, MAb-단백질 A 응집물 중 대략 99%가 제거되고, 가장 높은 샘플 충전(210 mg/ml)에서는 96%가 제거되었다.

통과 유체 및 용리액 피크에서 단백질 A 농도 분석 결과
샘플	가해진 양(mg/ml 흡착제)	ng SPA/ml	단백질 A 농도(%)
출발 물질	-	1199	-
분획 A5	42	14.6	1.2
분획 A11	92.4	53.5	4.5
분획 B9	201.6	146	12.2
풀 분획 A1-A14	117.6	15.8	1.3
풀 분획 A1-B12	210	48.7	4.1
풀 분획 A15-B12	126 내지 210	84.3	7
분획 C2(용리된 분획)	210	10450	872

Claims

용액을, 다중 양식(multi-modal) 리간드가 고정화된 지지체를 포함하는 크로마토그래피 수지와 접촉시켜 항체 및(또는) 오염물질을 수지에 흡착시키는 것을 포함하는 방법으로, 다중 양식 리간드가 하나 이상의 양이온 교환기 및 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리계를 포함하는 것인, 용액 중 하나 이상의 오염물질로부터의 항체 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 방향족 또는 헤테로방향족의 고리 형성 원자가 C, S 또는 O 중에서 선택된 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양이온 교환기가 약한 양이온 교환제인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중 양식 크로마토그래피 수지에 가해진 용액이 친화성 크로마토그래피 수지, 바람직하게는 리간드가 단백질 A를 포함하는 수지로부터의 항체 함유 용리액인 방법.
제4항에 있어서, 상기 오염물질이 방출된 친화성 리간드 및 항체 및(또는) 방출된 친화성 리간드 및(또는) 항체의 응집물 사이에 형성된 착물을 포함하는 것 인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오염물질이 다중 양식 크로마토그래피 수지에 흡착되는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지로부터 항체 및(또는) 오염물질을 용리시키는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체인 방법.
다중 양식 리간드가 하나 이상의 양이온 교환기 및 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리계를 포함하는 것인 다중 양식 크로마토그래피 수지;

2 개 이상의 상이한 완충제; 및

단백질 A 및 항체 및(또는) 단백질 A 또는 항체의 응집물 사이에 형성된 착물로부터의 항체 분리 방법을 설명하는 서면 지침

을 포함하는 항체 정제용 키트.
제9항에 있어서, 상기 방향족 또는 헤테로방향족의 고리 형성 원자가 C, S 또는 O 중에서 선택된 것인 키트.
리간드가 단백질 A 또는 단백질 G를 포함하는 수지로 패킹된 제 1 크로마토그래피 컬럼;

하나 이상의 양이온 교환기 및 하나 이상의 방향족 또는 헤테로방향족 고리계를 포함하는 다중 양식 크로마토그래피 수지로 패킹된 제 2 크로마토그래피 컬럼;

샘플 및 용리 완충제를 제 1 컬럼에 첨가하는 수단;

제 1 컬럼으로부터 유래한 용리액을 제 2 컬럼에 첨가하는 수단;

펌핑 수단; 및 밸브

를 포함하는, 액체로부터의 항체의 정제용 시스템.
제11항에 있어서, 자동화된 것인 시스템.