JP4914835B2 - 細胞培養用の潅流バイオリアクタ - Google Patents
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Description
本発明は、一般に、バイオリアクタ分野、より詳細には、単一のチャンバまたは高スループットフォーマットで細胞を潅流下に培養するシステムおよび方法に関するものである。
細胞／組織工学における最近の発展は、動的環境における細胞の成長および探査に利益をもたらすことが認識されている。スピナーフラスコ、回転式デバイス、潅流バイオリアクタ、または流体剪断チャンバは、すべて、細胞内外への栄養および代謝物拡散を増進させるために使用されている。流体剪断力の機械的側面は、また、セカンドメッセンジャーシグナルを誘発し、細胞の遺伝子発現を変化させることが示されている。これらの新しい培養条件は、細胞機能（成長、シグナル伝達、形態、分化など）に影響を与えると認識されているが、これらの環境を探査するデバイスは、高スループットプラットフォームにはなっていない。さらに、流体流路を長期的に制御するための、高度に整列した孔隙をもつ３次元の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）を組み込んだシステムも確立されていない。
流体流れは、初めに、ガラススライドに接着した細胞の上を培養培地が流れる２次元培養系で、細胞の遺伝子発現の調節因子として確立された。細胞は、力の方向に配向し、かつそれら細胞の遺伝子発現を変化させることによって、流体の剪断に反応する。これらの２次元デバイスは、現在、例えば、Ｆｌｅｘ−Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌならびに他の販売業者から市販されている。流体流れの探査は、近年、３次元の足場へと変わってきており、流体の剪断が肝細胞および骨分化を維持する際のもう１つの重要な因子であることが証明されてきた。しかし、これだけに限るものではないが、いくつか例を挙げれば、成長因子、ＥＣＭ、サイトカイン、培地因子、小分子などのシグナル伝達因子を含め、細胞機能を変化させることがわかっている他の過剰な環境刺激（ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｃｕｅｓ）に対するスクリーニングも、またそれらの環境刺激と併せた探査も困難であるので、環境シグナル伝達因子としての流体流れの真の重要性は、まだ完全には理解されていない。例えば、今日まで、これらの力が細胞培養にどのような影響を与えるかについて探査するように設計されたデバイスは、すべて、ワンポットまたは単一チャンバデバイスである。これらのデバイスを使用して、回転もしくは流体剪断力が細胞にどのような影響を与えるかについて一度に１つの条件下で探査することができるが、異なる条件下または多様な条件下では探査できず、これらのデバイスの有用性を大きく制限している。したがって、現在のデバイスは、制御可能な細胞表現型についての条件の最適化のため、または関連性の高い細胞もしくは工学的に設計された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）組織培養物で特定の機能を変化させる未知の機能の分子などの物質を試験するための、中スループットまたは高スループット実験を実施するには適していない。
さらに、新薬発見の分野では、薬物のＡＤＭＥＴｏｘ（ＡＤＭＥＴｏｘは、候補薬物の吸収（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、分布（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）、代謝（ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）、排出（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）、および毒性（ｔｏｘｉｃｉｔｙ）を評価する一連の分析の頭字語である）特性を探査するためにプライマリーヒト細胞を使用することがきわめて望ましい。このことは、動物個体（ｗｈｏｌｅ ａｎｉｍａｌ）の探査が高価であり、その結果が常にヒトでの反応を予測するとは限らないという事実に起因する。プライマリーヒト細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ探査は、アプローチの経済的側面ならびにヒト細胞由来のデータが動物データよりも関連性が高いはずであるという事実から、魅力的である。残念なことに、プライマリーヒト細胞の培養は、ほとんどの細胞タイプできわめて困難であり、ｉｎ ｖｉｖｏ組織および臓器の関連モデルを作り出すことのできるモデル系は、ほとんど存在しない。動物個体とプライマリー細胞との中間として、組織または臓器切片が、細胞をそれらの本来の環境で維持する（細胞をそれらの微小環境から切り離さずにおく）と同時に、細胞生存能力、代謝、および他の望まれるＡＤＭＥＴタイプの側面に生体異物が及ぼす影響についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を可能にする、代替手段を提供する。例えば、肝臓切片は、しばしば、肝臓特異的な薬物毒性ならびにＣＹＰ誘導を評価するために使用される。
また、組織切片のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養にもいくつかの課題がある。例えば、重要な１つの課題は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組織切片が必要とする、高い代謝速度および栄養要件である。組織切片が高い栄養負荷を必要とするので、これらの切片を大量の培地内で培養する必要がある。しかし、より多くの培地を培養物に添加すると、組織による酸素消費速度が酸素の拡散よりも速くなるほどに酸素の拡散距離が増大して、低酸素状態および細胞死をまねく。したがって、中スループットから高スループットの並列試験フォーマットを維持しながら、栄養および代謝産物輸送を増進させるバイオリアクタタイプのデバイスが大いに必要とされている。
流体剪断の存在下で、細胞が他の化学的もしくは物理的刺激に反応する能力を新しい環境がどのように変化させるかについて試験するため、かつ／もしくは知るために、また細胞の成長および分化のための動的細胞培養条件の体系的かつ高スループットな発見を促進するために、中スループットから高スループットのフォーマットで細胞を流体潅流下で培養し、次いでこれらの最適化された環境を用いて、治療、診断、もしくは探査目的の、工学的に設計されたｉｎ ｖｉｔｒｏ組織を作り出すシステムおよび方法が必要である。また、ＡＤＭＥＴおよび組織培養用途で様々な組織または臓器切片の動的／多重培養を可能にする潅流システムも必要である。
本発明は、潅流ユニットと、該潅流ユニットと流体連通するポンプユニットと、該ポンプユニットと流体連通する流体源ユニットとを含む、バイオリアクタシステムを対象とする。潅流ユニットは、細胞培養物を容れるように構成された複数の細胞ウェルのアレイを含み、流体源ユニットは、細胞培養培地を容れるように構成された複数の培地ウェルのアレイを含む。ポンプユニットは、細胞ウェルおよび培地ウェルと流体連通する複数のポンプ要素のアレイを含み、培地ウェルから細胞ウェルへと細胞培養培地を送り出すように構成される。
好ましい一実施形態では、前記細胞ウェルそれぞれが、多孔質構造を有する足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）を容れるように適合かつ構成される。一実施形態では、足場は、２次元の足場である。他の実施形態では、足場は、３次元の足場である。一実施形態では、３次元の足場は、１方向に整列した孔隙を含むことができる。
一実施形態では、流体は、前記足場の内部構造に直接供給可能である。他の実施形態では、流体が複数の細胞ウェルのアレイから複数の培地ウェルのアレイへと流れるように、戻り経路が設けられる。好ましい一実施形態では、各経路は、単一の細胞ウェルおよび単一の培地ウェルと流体連通する。
他の実施形態では、潅流ユニットは、ポンプユニットに取外し可能に結合することができ、各ポンプ要素は、流体ポートをその中に有する流体ステムを含むことができる。各ステムは、細胞ウェルへと延びるように構成することができる。本発明の他の態様では、各細胞ウェルは、それに結合された、ステムの一部分をその内部で受けるように構成された足場を含むことができる。流体源ユニットは、やはりポンプユニットに取外し可能に結合することができる。
本発明は、また、細胞を成長させる方法であって、流体源ユニットの複数のウェルの第１のアレイから潅流ユニットの複数のウェルの第２のアレイへと細胞培養培地を送り出すステップを含んでおり、該潅流ユニットの各ウェルが細胞接着構造を収めるように適合かつ構成される方法を対象とする。一実施形態では、該方法は、培地を足場内へと潅流させるステップをさらに含む。一実施形態では、細胞接着構造は、２次元の足場を含み、他の実施形態では、細胞接着構造は、３次元の足場を含む。複数のウェルの第１のアレイは、培地が複数のウェルの第２のアレイへと戻るように、複数のウェルの第２のアレイと流体連通している。他の方法では、複数のウェルの第１のアレイの各ウェルは、単独で、複数のウェルの第２のアレイの対応するウェルと流体連通している。
本発明は、また、複数のバイオリアクタユニットのアレイを含む、潅流バイオリアクタシステムも対象とする。各バイオリアクタユニットは、流体リザーバ内に貯蔵された流体と流体連通する細胞接着構造を含んでおり、動作時には、流体が流体源から細胞接着構造内へと直接流れ込む。一変形形態では、細胞接着構造は、多孔質構造を有する３次元の足場であり、他の変形形態では、細胞接着構造は、２次元の足場である。他の好ましい実施形態では、細胞接着構造は、ポンプユニットによって流体リザーバと流動可能に相互連結される。
本発明は、一般に、バイオリアクタに関し、より詳細には、細胞機能および工学的に設計された組織発達を制御する複雑な環境を高スループットで発見するための、単一のチャンバまたは高スループットフォーマットで細胞試料を潅流下で培養するシステムおよび方法に関する。本発明は、また、新薬発見、薬物検査、またはＡＤＭＥＴｏｘ用途で動的細胞培養下の細胞に直接薬物検査を実施するための、関連性の高い細胞培養物およびシステムを作り出すために使用することもできる。
図１を参照すると、バイオリアクタシステム５の好ましい一実施形態は、一般に、複数のバイオリアクタユニット１０のアレイを備えたマルチウェルプラットフォームを含んでおり、各バイオリアクタユニットで、独立した細胞探査または実験を実施することができる。図１に示したように、バイオリアクタシステム５は、ポンプユニットもしくはステーション１６によって流動可能に相互連結された、潅流ユニット１２と、流体源ユニット１４とを含む。
好ましい一実施形態では、潅流ユニット１２は、細胞培養物を収めるもしくは容れるように構成された複数のメインチャンバまたはウェル１８を含む、マルチウェルプレートである。同様に、流体源ユニット１４は、細胞培養培地などの流体を貯蔵するために複数の流体リザーバチャンバもしくはウェル２０を含む、１つもしくは複数の別個のマルチウェルプレートを含むことができる。動作時には、各メインチャンバもしくはウェル１８は、対応する個々の流体リザーバチャンバ２０と流体連通する。好ましい一実施形態では、上部の潅流ユニット１２および流体源ユニット１４は、２４個のチャンバもしくはウェルを含むが、代替的な実施形態では、任意の数のチャンバもしくはウェルを設けることができる。例えば、上部の潅流ユニット１２および流体源ユニット１４のウェルを、プレート当たりに４８個のウェルや９６個のウェルを含むように、またはさらに小さくなるように小型化することができる。同様に、同様の設置面積（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）をもつ、より小さいバイオリアクタシステムを成すように、ポンプコンポーネントを小型化することもでき、また、設置面積を増大させて、１つのシステムにより多くの個別の潅流ユニットをもつようにすることもできる。図２を参照すると、マルチウェル潅流プレート１２の一例が示されており、各ウェルが、流体がそれを通過できるようにするための、該ウェルの底部を貫いて延びる通路もしくは穴１５を含む。三角ポスト構造１７が、各ウェル１８の底部分に固定され、穴１５の上方に延びている。ポスト構造１７は、細胞培養物を成長させるために、細胞接着構造もしくは足場２２（図４に示されている）の付着を促進する。各ウェルは、また、流体戻り経路１９を含むことができる。好ましい一実施形態では、潅流ユニット１２および流体源ユニット１４を、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、他のプラスチック、または他のいずれか適切な材料から作製することができ、分割して、または全体として射出成形することができる。
他の好ましい実施形態では、潅流ユニット１２および流体源ユニット１４が、ポンプユニット１６に取外し可能に結合されるように構成かつ寸法設定されることが好ましい。したがって、潅流ユニット１２および流体源ユニット１４をシステムの取替え可能なコンポーネントとすることができ、その結果、望むなら、類似の複数のユニットもしくはプレートを交換することができ、またポンプユニット１６に取外し可能に結合させることができる。例えば、培地を追加するために流体源ユニット１４を再利用可能または使い捨て可能にできるように、該流体源ユニット１４は、ポンプユニット１６に取外し可能に結合されるように構成される。同様に、細胞培養物を様々な流体／動的環境に関係付けるために、潅流ユニット１２をあるポンプユニット１６から取り外して別のポンプユニットに移すこともできる。
ポンプユニット１６は、各メインチャンバ１８と各流体リザーバチャンバ２０とを流動可能に連結するために、複数の流体コネクタおよび／または金属製コンポーネントのアレイを含む。好ましい一実施形態では、ポンプユニットもしくはステーション１６は、例えば、（１つもしくは複数の）モータ付きポンプ、弁、チューブ、パイプ、流体を送り出すもしくは移送する他のデバイスまたは手段など、流体源ユニット１４から潅流ユニット１２へと流体を移送するもしくは送り出すのに適したいずれかの金属製コンポーネントを含むことができる。一般に、これだけに限るものではないが、蠕動、遠心、振動、ピエゾ、または空気もしくは流体駆動式ポンプ機構、または個別の電子ポンプを含め、いずれのタイプのポンプ機構を使用することもでき、その際、各潅流ユニットを異なるポンプ速度でプログラミングすることができる。図３に示した特定の好ましい実施形態では、ポンプユニットもしくはステーション１６は、駆動ロッド３２上に据え付けられた複数のポンピングプレート３０のアレイを含む蠕動ポンプ機構を使用する。ロッド３２は、ベアリング３６内のハウジング３４に摺動自在に据え付けられ、動作時には、カプリングプレート３８に取り付けられたモータによってロッド３２の軸に沿って前後に駆動される。ロッド３２が駆動されると、ポンピングプレート３０は、可撓性チュービング４０を固定プレート４２に当てて圧搾し、可撓性チュービング４０内に入った流体を送り出す。図４から最もよくわかるように、流体源ユニット１４の流体リザーバチャンバ２０から潅流ユニット１２のメインチャンバ１８に向かって流体流れを一方向に送り出すまたは誘導するために、単方向弁４１が、可撓性チュービング４０の両側に設けられ、入口チューブ４７と出口チューブ４９との間に置かれる。ポンプユニット１６を戻り経路２５に流動可能に連結して潅流ユニット１２から流体源ユニット１４への流体の戻りをもたらす戻り経路１９が、潅流ユニット１２の各メインチャンバ１８に組み込まれ、それによって複数のまたは一連の個別の分離バイオリアクタユニット１０を作り出すことが好ましい。この点に関して、潅流ユニット１２および流体源ユニット１４がポンプユニット１６に結合されるときには、各バイオリアクタユニット１０は、独立した流動自給式の物体（ｆｌｕｉｄｌｙ ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｅｎｔｉｔｙ）となる。
図４を参照すると、例示的な個別のバイオリアクタユニット１０の断面図が示されており、各バイオリアクタユニットが、一般に、例えば単一の流体リザーバチャンバもしくはウェル２０内に収められた、流体源と流体連通する単一のメインチャンバもしくはウェル１８を含む。高密度細胞培養物の成長を促進するために、細胞接着構造もしくは足場２２が各メインチャンバ１８内に収められることが好ましい。この実施形態では、細胞接着構造は、複数の３次元細胞接着表面を有する多孔質体など、３次元の足場であるが、代替的な実施形態では、細胞接着構造を、２次元細胞接着表面を有するスライドもしくはプレートなど、２次元のものとすることができる。他の代替的な実施形態では、生物学的コンポーネントを備えた移植可能な医用デバイス／インプラントを高スループットデバイスで工学的に設計できるように、細胞接着構造を、例えば、管形や円筒形など、多様な形状のものとすることができる。この点に関して、細胞および／もしくは組織を管状構造の上に接着または成長させて、例えば、患者の体内に移植するための、血管グラフト、ステント、神経管、シャントなど、細胞もしくは組織を含むチューブを発展させることができる。他の実施形態では、軟骨および／もしくは骨を、所定の形状に成長させる、または工学的に設計することができる。
好ましい一実施形態では、細胞接着構造は、流体が該細胞接着構造内または該細胞接着構造の周りに直接流れるように、流体ポート４４の周りでメインチャンバに結合される。例えば潅流プレート１２がポンプユニット１６に結合されるときに、ステムもしくは流体ポート４４が足場の中央部分もしくは内部へと延びるように、例えば、３次元の足場２２をメインチャンバ１８に結合させる、成型する、接着する、合成する、または他の何らかの形で取り付けることができる。他の好ましい実施形態では、潅流プレート１２の各メインチャンバ１８は、当業者に公知のいずれか適切な手段によって各メインチャンバ１８の一部分に結合させる、固定する、または他の何らかの形で連結することのできる足場を受けるように構成される。好ましい一実施形態では、足場２２をメインチャンバ１８に取外し可能に差し込むまたは取り付けることができる。
足場は、いずれかのタイプのポリマー、セラミック、金属、または細胞をそれらに接着させるのに適したいずれかのタイプの混合物から作製することができる。好ましい一実施形態では、足場は、共有結合架橋したアルギン酸塩、ヒアルロン酸、または望ましい任意の混合パーセンテージの２つの多糖類のブレンドから合成できる、ヒドロゲルベースの材料から作製される。例えば、最終用途に望ましい分解プロファイルを達成するように、混合パーセンテージを調整することができる。代替的な実施形態では、足場を、「Programmable scaffold and methods for making and using same」という名称の特許文献１に開示されているような他の適切な材料で作製することができ、該文献の内容全体を参照により本願に援用する。好ましい一実施形態では、足場を、ランダムに配向した孔隙を有する多孔質構造とすることができる。代替的な実施形態では、あまりランダムではない孔隙パターンを得られるように、また流体流れが足場の孔隙すべてを通って流れることをさらに保証できるように、１方向に整列した孔隙を有する足場を使用することができる。代替的な実施形態では、足場を、「Programmable scaffold and methods for making and using same」という名称の特許文献１に開示されているような任意の数もしくはタイプの細胞シグナル伝達または細胞相互作用分子によって修飾することができる。
動作時には、流体は、内部の足場構造へと直接送り込まれ、足場２２の内部４６から足場２２の外部４８へと潅流するもしくは流れることができる。好ましい一実施形態では、流体は、毎分約１０から０．１ミリリットルの範囲の速度で送り出される。この点に関して、流体は、足場を迂回するのでも、主に足場の外部に沿って流れるのでもなく、容易に足場の内部の孔隙を通って流れることができる。潅流される流体流れによってもたらされる拡散質量輸送の増進が、有利には、代謝産物および栄養を足場２２の内外に拡散させる。この点に関して、灌流培養は、長期にわたる組織工学実験を可能にし、高密度細胞培養物の成長が組織を模倣できるようになる。
流体が足場を迂回することが許された従来技術のデバイスでは、酸素が足場の外側に接着した細胞によって消費され、足場の内側に接着した細胞が酸素欠乏状態になることがあるので、深刻な酸素制限が引き起こされる虞がある。
図５を参照すると、メインチャンバ１８の代替的な実施形態が示されており、流体流れ５０が、足場全体を通じてランダムに流れるのではなく、入口５２から誘導されて代替的な足場５４内を通り、出口５６のところで足場およびチャンバから出る。
図６を参照すると、メインチャンバ１８が細胞接着上面を備えた２次元の細胞接着構造６２を含む、バイオリアクタユニット１０の他の代替的な実施形態が示されている。この実施形態では、流体が流体ポート４４を通って経路６３に沿って流れ、構造６２の２次元表面を横切り、戻り通路６４を通って戻ることができるように、細胞接着構造６２がチャンバ１８に結合される。流体が細胞接着表面の上を直接流れるように、プレート６６は、構造６２を覆い、流体が入るように該構造６２から離隔されている。
図７を参照すると、当業者に公知のいずれか適切な手段によって細胞試料７０を各メインチャンバ１８の一部分に結合する、固定する、または他の何らかの形で連結することのできる、メインチャンバ１８の他の代替的な実施形態が示されている。一部の実施形態では、細胞試料７０を、細胞接着構造または足場とすることができ、他の実施形態では、細胞試料７０が、組織の一部分または切片を含むことができる。例えば、細胞試料７０は、肝臓切片、膵島、肝臓スフェロイド、３−Ｄ組織モデル（Ｍａｔｔｅｋ，Ｉｎｃ．もしくはＲｅｇｅｎｅｍｅｄ，Ｉｎｃ．から市販のものなど）、３−Ｄ癌モデル（Ｍｉｎａ Ｂｉｓｓｅｌｌから市販のものなど）、マイクロキャリアもしくは繊維ディスク上の細胞（ｆｉｂｒａｃｅｌｌから市販のものなど）、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで成長させることのできる他のいずれかの細胞体を含むことができる。
一実施形態では、細胞試料７０は、円筒形またはディスク形であり、例えば、１対のワッシャ７２間で、メインチャンバ１８内の適所で保持することができる。ワッシャ７２は、その中を流体が流れるようにするための中央開口部を含む。動作時には、流体は、ポート４４を通って流れ、細胞試料７０内を潅流され、上部ワッシャ７２の中央開口部を通って出て、戻り経路７５を通じて戻ることができる。この点に関して、この実施形態は、切片もしくは細胞試料を常に培地内で浮かび上がった（ｅｍｅｒｇｅｄ）状態に保持すると同時に、組織もしくは細胞試料をｉｎ ｖｉｖｏ条件に類似した流体流れにさらし、気体および栄養輸送を増進させるように構成される。好ましい一実施形態では、このシステムは、細胞の生存能力の維持、ならびに薬物検査用フォーマットでの試料または組織切片の維持を容易にする。この実施形態の構成は、有利には、例えば、組織切片とともに、あるいはポリマーもしくはセラミック材料製または適所で合成できない他の材料製の足場とともに使用することができる。
図８〜１０を参照すると、バイオリアクタシステム８０の他の実施形態が示されている。一般に、バイオリアクタシステム８０は、使い捨て可能または再利用可能な３つの部品もしくはコンポーネント、すなわち、培地を容れるように構成された底部リザーバプレート８２と、培地の運動を誘発するポンプデバイス８４と、底部リザーバプレートおよびポンプデバイスと対合する、培地流れの中で組織切片もしくは細胞試料７０の位置を維持し、かつ培地が底部リザーバプレート８２へと戻るための閉じた流路を作り出すように構成された上部潅流プレート８６とを含む、空気圧式システムである。底部リザーバプレートおよび上部潅流プレートは、一般に、多数のウェルもしくはチャンバ８３を含んでおり、各プレートは、射出成形することができ、また使い捨て可能もしくは再利用可能な品目とすることができる。また、プレートは、当業者に公知のいずれか適切な滅菌方法を使用して滅菌することもできる。潅流プレート８６の各ウェルは、一般に、入口部分８８と出口部分９０とを含む。底部リザーバプレート８２の各ウェルは、一般に、流体リザーバ９２と１対の一方向弁もしくは逆止弁９４とを含む。一実施形態では、一方向弁を、成型して１部品プレートにすることができる。流体もしくは培地が流体リザーバ９２から入口８８へと流れ、出口９０から出て、流体リザーバ９２に戻るように誘導するため、かつ／またはそのように流れさせるために、１対の一方向弁は、それぞれ、潅流プレートの対応する入口部分８８および出口部分９０と位置合わせされる。一実施形態では、細胞試料７０を、潅流プレート８６の各ウェルの入口部分８８内に位置決めすることができる。一変形形態では、２枚のメッシュディスクと１つのリテーニングリングとを使用して、組織切片もしくは細胞試料７０を潅流プレート上の所定の位置で保持することができる。細胞試料の最適な幾何学形状および向きは、組織のタイプに応じて異なることがある。例えば、組織を流体流れに対して垂直または水平な向きにすることができる。
この実施形態のポンプデバイス８４は、一般に、空気入口９８を有する圧力チャンバ９６と、底部リザーバプレート８２と相互作用する可撓性ダイアフラム１００とを含む。図９から最もよくわかるように、動作時には、空気圧が入口９８を通じて圧力チャンバ９６に導入され、可撓性ダイアフラム１００が膨張し、底部プレート８２の流体リザーバ９２に圧力を及ぼして、培地もしくは流体の上向きの流れを引き起こす。図１０に示したように、空気圧が入口９８を通じて解放されると、ダイアフラム１００が収縮して、流体リザーバ９２に加わる圧力を解放し、培地もしくは流体の下向きの流れもしくは戻り流れを引き出す、または誘発する。この実施形態の有利な特徴の１つは、培地もしくは流体が、重力駆動的ではなく、セルフパージ的または能動排出的であることである。この点に関して、潅流プレートのウェルに培地もしくは流体が容れられた後、ポンプデバイス８４は、動作中に潅流プレートウェルをパージする。一実施形態では、ポンプデバイスは、使い捨て可能または再利用可能なものとすることができる。また、ポンプデバイスは、当業者に公知のいずれか適切な滅菌方法を使用して滅菌することもできる。また、電気、蠕動、および当業者に公知の他のダイアフラムポンプ技術を含め、マルチウェルプレートポンプデバイスのいくつかの変形形態も使用することができる。
図１１〜１２を参照すると、バイオリアクタシステム１１０の他の実施形態が示されている。一般に、バイオリアクタシステム１１０は、バイオリアクタシステム８０と同様に、使い捨て可能または再利用可能な３つの部品もしくはコンポーネント、すなわち、培地を容れるように構成された底部リザーバプレート１１２と、培地の運動を誘発するポンプデバイス１１４と、ポンプデバイスと対合する、培地流れの中で組織切片もしくは細胞試料７０の位置を維持し、かつ培地が底部リザーバプレート１１２へと戻るための閉じた流路を作り出すように構成された上部潅流プレート１１６とを含む、空気圧式システムである。底部リザーバプレート１１２および上部潅流プレート１１６は、前述のプレート８２、８６とほぼ同様であり、一般に、多数のウェルもしくはチャンバ１１３を含む。各プレートは、射出成型することができ、また使い捨て可能もしくは再利用可能な品目とすることができる。また、プレートは、当業者に公知のいずれか適切な滅菌方法を使用して滅菌することもできる。潅流プレート１１６の各ウェルは、一般に、入口部分１１８と出口部分１２０とを含む。底部リザーバプレート１１２の各ウェルは、一般に、流体リザーバ１２２と１対の一方向弁もしくは逆止弁１２４とを含む。一実施形態では、一方向弁を、成型して１部品プレートにすることができる。流体もしくは培地が流体リザーバ１２２から入口１１８へと流れ、出口１２０から出て、流体リザーバ１２２に戻るように誘導するため、かつ／またはそのように流れさせるために、１対の一方向弁１２４は、それぞれ、可撓性通路もしくはチュービング１３２と別の１対の一方向弁１２５とを介して、潅流プレートの対応する入口部分１１８および出口部分１２０と連結される。一実施形態では、細胞試料７０を、潅流プレート１１６の各ウェルの入口部分１１８内に位置決めすることができる。一変形形態では、２枚のメッシュディスクと１つのリテーニングリングとを使用して、組織切片もしくは細胞試料７０を潅流プレート上の所定の位置で保持することができる。細胞試料の最適な幾何学形状および向きは、組織のタイプに応じて異なることがある。例えば、組織を流体流れに対して垂直または水平な向きにすることができる。
この実施形態のポンプデバイス１１４は、一般に、空気入口１２８を有する圧力チャンバ１２６と、可撓性通路１３２を取り囲む複数の可撓性ダイアフラム１３０とを含む。可撓性通路１３２は、底部プレートの流体リザーバ１２２と、潅流プレート１１６の入口部分１１８および出口部分１２０と位置合わせされた１対の一方向弁もしくは逆止弁１２５との間を延びる。図１２から最もよくわかるように、動作時には、空気圧が入口１２８を通じて圧力チャンバ１２６に導入され、可撓性ダイアフラム１３０が膨張し、可撓性通路もしくはチュービング１３２に圧力を及ぼして、潅流プレート１１６の入口部分１１８を通る培地もしくは流体の上向きの流れと、また同時に、潅流プレート１１６から出て出口部分１２０を通って流体リザーバ１２２へと流れる培地もしくは流体の下向きの流れとを引き起こす。この実施形態の有利な特徴の１つは、培地もしくは流体が、重力駆動的ではなく、セルフパージ的または能動排出的であることである。この点に関して、潅流プレートのウェルに培地もしくは流体が容れられた後、ポンプデバイス１１４は、動作中に潅流プレートウェルをパージする。一実施形態では、ポンプデバイスは、使い捨て可能または再利用可能なものとすることができる。また、ポンプデバイスは、当業者に公知のいずれか適切な滅菌方法を使用して滅菌することもできる。また、電気、蠕動、および当業者に公知の他のダイアフラムポンプ技術を含め、マルチウェルプレートポンプデバイスのいくつかの変形形態も使用することができる。
前述したマルチウェルバイオリアクタシステムすべてに関して、様々な細胞タイプを、ウェルの同一のセットで培養することができる。例えば、図４の実施形態では、流体リザーバチャンバ２０では肝細胞を培養することができ、他方、メインチャンバ１８では島細胞を培養することができる。細胞は、図４のバイオリアクタユニット１０内に容れられた培地を介して流体連通している。他の変形形態では、多数の平行ウェルが互いに流体連通することができる。例えば、図１の実施形態を参照すると、図１のウェルＡ１では肝細胞を培養することができ、他方、図１のウェルＤ６では島細胞を培養することができる。すべてのウェルをチャネルもしくは他の流体経路によって流動可能に１つに連結できるので、一定の時間後、ウェルＡ１、Ｄ６、および流体連通しているウェルの多くからの培地が、互いに混ざり合い、定常状態になることがある。
前述した本発明のマルチウェルバイオリアクタシステムを用いると、流体流れを組み込んだ独特の実験を実施することができる。例えば、ほぼ類似した流体流れ特徴をもつ多数の並列実験を実施することができる。この点に関して、中スループットまたは高スループットフォーマットで実験を実施するために、きわめて複雑な環境を作り出すことができる。また、当業者は、いくつか例を挙げれば、糖尿病、肥満、心臓血管疾患などの複合代謝疾患を探査するための、流体連通するいくつかのタイプの細胞および組織系から成る培養物を作り出すこともできる。細胞シグナル伝達環境を最適化する特定の一用途では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に分化した細胞培養物を得るための因子の最適な組合せの発見を促進するために、成長因子、サイトカイン、細胞外マトリックス分子などから成る様々な溶解性および非溶解性シグナル伝達分子を、様々な濃度で、様々な混合比で、かつ様々な時点で試験することができる。これらの環境は、骨髄、血管系、皮膚、膵臓、肝臓、骨、軟骨、平滑筋、心筋、骨格筋、腎臓などを含めた組織由来の様々な実質細胞および非実質細胞を用いて作り出すことができる。他の実施形態では、内皮細胞などの細胞を使用して、ホストによる血管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）をもたらすことができる。代替的な実施形態では、当業者は、また、代謝症候群など、複合代謝性疾患を探査するための、いくつかのタイプの組織系から成る培養物を作り出すこともできる。代替的な用途では、流体剪断および潅流を探査するために、例えば、脈管形成および組織発達のための細胞型分離を最も促進する可能性の高い流体流れを決定するために、いくつかの細胞タイプを組み込むことができる。他の用途では、新薬発見、薬物検査、またはＡＤＭＥＴｏｘのいずれかの用途で、動的細胞培養されている細胞に直接薬物検査を実施するために、マルチウェル設計で成長された細胞または組織を、中スループットから高スループットのフォーマットで薬物を試験するプラットフォームとして使用することができる。さらに、センシング技術をバイオリアクタシステムに組み込むこともできる。例えば、グルコース、アンモニア、尿素、ｐＨなどの重要な細胞培養変数を感知するバイオセンシング技術、または蛍光化合物の代謝を監視する一般的な蛍光検出器を、システムとともに使用することができる。
例示的な一変形形態または用途では、潅流ユニット１２を使用して、プリセット条件または特に望ましい特徴で細胞培養物を成長させることができ、後でそれらをさらなる実験および／または発見のために使用することができる。潅流ユニット１２のモジュール性および互換性は、有利には、さらなる実験および／または薬物検査もしくは発見を行うために別のポンプステーション１６または類似のデバイス上に容易に据え付け直すことのできる、複数の細胞培養物の発送および／または移送を可能にする。
ここで図１７〜２２を参照すると、高スループットおよび／もしくは並列スクリーニング環境で生物学的実験を実施するプラットフォームにおいて、足場を操作するまたは取り扱うシステムならびに方法が示されている。図１７および図１８に示したように、足場取扱システム２０１の好ましい一実施形態は、一般に、複数のウェルユニット２１０のアレイを備えるマルチウェルカートリッジもしくはキャリア２０５を含んでおり、各ウェルユニットでは、独立した足場２２０を保持することができ、また生物学的実験を実施することができる。図１７に示したように、一実施形態では、足場取扱システム２０１のキャリア２０５は、４つのウェルユニット２１１、２１２、２１３、および２１４を備えており、また、クロスメンバ２１７の側端から遠位に延びる、マルチウェルプレートと対合するための側壁もしくはフランジ２１６および２１８を含む。ただし、代替的な実施形態では、任意の数または多数のウェルユニット２１０を、キャリア２０５に含めることができる。例えば、一変形形態では、キャリア２０５は、１つのウェルユニットを有することができる。他の例示的な実施形態では、キャリア２０５は、８つのウェルユニットを有することができる。他の実施形態では、キャリア２０５は、３つのウェルユニットを有することができる。
各ウェルユニット２１０は、一般に、キャリア２０５の上部から遠位に延びる円錐台状またはテーパしたボディ２３０を備え、遠位端２３４のところに足場保持チャンバ２３２を含む。細胞接着構造もしくは足場２２０が、高密度細胞培養物の成長を促進するために各ウェルユニット２１０内に収容または保持されることが好ましい。好ましい一実施形態では、細胞接着構造は、遠位端２３４の周りで、ウェルユニット２１０に結合される、またはウェルユニット２１０内に詰め込まれる。例えば、３次元の足場２２０を、遠位チャンバ２３２に結合させる、成型する、接着する、合成する、または他の何らかの形で取り付けることができる。好ましい一実施形態では、足場２２０を、例えば摩擦嵌めによって、チャンバ２３２に取外し可能に差し込むまたは取り付けることができる。
図１９を参照すると、ウェルユニット２１０の１つを描く、キャリア２０５の底面斜視図が示されている。一実施形態では、足場保持チャンバ２３２は、テーパしている、すなわち、ウェルユニットの遠位端では広く、チャンバの上端もしくは近位端では狭くなっている。チャンバ２３２のこのテーパ特徴は、広範な足場サイズに対応することができる。例えば、一実施形態では、チャンバ２３２は、直径約４．８ｍｍから約５．１ｍｍの範囲の足場に対応することができる。加えて、チャンバ内で足場を摩擦によってさらに握持もしくは保持するために、１つもしくは複数のナブ（ｎｕｂｓ）または突起２３６をチャンバ２３２の周囲から径方向内側に延ばすこともできる。
図２０を参照すると、ウェルユニット２１０の１つを描く、キャリア２０５の上面斜視図が示されている。各ウェルユニット２１０の上端または近位端は、その中で保持された足場２２０への物理的および視覚的アクセスを可能にするために、開口部２３７を画定する。加えて、窓２３８がキャリア２０５内をウェルユニット２１０に隣接して延びて、それらを通じたウェルの底部へのアクセスをもたらす。この点に関して、各ウェルユニット２１０の開口した最上部、すなわち、開口部２３７および窓２３８は、ウェルユニット内の吸引またはピペッティングを容易にする。図２０および図２１から最もよくわかるように、一実施形態では、長手方向スロット、チャネル、もしくは開口部２３９が、ボディ２３０の側部に沿って延びる。開口部２３９は、流体のオーバーフローを促進し、キャリア２０５が潅流バイオリアクタと併せて使用されるときには潅流の循環を可能にする。これについては、以下でより詳細に説明する。やはり図２１からわかるように、足場２２０を長手方向に保持し、細胞を封じ込め、微粒子流れを最小限に抑えるためにスクリーンを収容するように、レッジ２４１をボディ２３０の遠位端に隣接して設けることができる。例えば、図２２に示したように、流体をそれに貫流させながら近位方向の足場２２０の動きを防ぐために、スクリーン２５０を、レッジ２４１に隣接して位置決めかつ／または成型することができる。
図１７および図１８の足場取扱システム２０１およびキャリア２０５は、細胞培養物もしくは細胞培養実験装置を収めるもしくは容れるために、複数のメインチャンバまたはウェルを有するマルチウェルプレートとともに使用されるように構成かつ寸法設定される。マルチウェルプレートは、当業者には周知である。例示的なマルチウェルプレートには、２４ウェルプレートおよび９６ウェルプレートが入手可能な、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ（商標）マルチウェルプレートが含まれる。この点に関して、この実施形態のキャリア２０５は、そのような２４ウェルプレートに挿入されるように、かつ／または該２４ウェルプレートと対合するように、構成かつ寸法設定される。作業時には、生物学的実験を実施できるように、各ウェルユニット２１１、２１２、２１３、および２１４が２４ウェルプレートの対応するウェルへと延びた状態で、キャリア２０５を、２４ウェルプレートの単一の列をまたいで設置することができる。マルチウェルプレートの各ウェル内で足場を保持できるように、多数のキャリア２０５を、マルチウェルプレートの別の列を覆って設置することができる。換言すれば、２４ウェルプレートの場合、６つのキャリア２０５を該２４ウェルプレートとともに用いることができる。言うまでもなく、マルチウェルプレート全体に細胞接着足場を含めることができるように任意の数のアレイおよび構成を使用できることが、当業者には理解されよう。
キャリア２０５の側壁もしくはフランジ２１６、２１８は、キャリア２０５の側部から遠位に延び、キャリア２０５を２４ウェルプレートと精確に対合させるためにマルチウェルプレートの外側部の周りを延びるように構成かつ寸法設定される。図１８から最もよくわかるように、フランジ２１６および２１８は、マルチウェルプレートに対する再位置決めを容易にするための、面取りされた縁部２１９を有することができる。加えて、図１９から最もよくわかるように、キャリア５とマルチウェルプレートの個々のウェルとの位置合わせを容易にするために、１つもしくは複数のナブ、位置決めピン、または突起２４０を、キャリア２０５の裏面に設けることができる。この点に関して、突起２４０と、フランジ２１６および２１８と、キャリア２０５の幾何学形状との組合せが、足場をマルチウェルプレートに対して適所で保持するための、信頼性および再現性のあるシステムをもたらす。
他の実施形態では、図１７および図１８の足場取扱システム２０１およびキャリア２０５を、やはり、前述の潅流バイオリアクタのマルチウェルプレートとともに使用することができる。この点に関して、この実施形態のキャリア２０５は、潅流バイオリアクタのそのようなマルチウェルプレートに挿入されるように、かつ／または該マルチウェルプレートと対合するように、構成かつ寸法設定される。作業時には、生物学的実験を実施できるように、各ウェルユニット２１１、２１２、２１３、および２１４がバイオリアクタのマルチウェルプレートの対応するウェルへと延びる、２４ウェルプレートに関して前述したのと同一の方式で、キャリア２０５を、潅流バイオリアクタのマルチウェルプレートの単一の列をまたいで設置することができる。この点に関して、取扱システム２０１の構成および設計は、有利には、足場内を通る細胞培養培地の潅流を可能にするように構成される。例えば、細胞培養培地が遠位端から足場を通って各ウェルユニット２１０の近位端へと流れるように、キャリア２０５の信頼性および再現性のある位置決めは、潅流バイオリアクタの流れの線内で（１つもしくは複数の）足場２２０を保持するように構成される。オーバーフローチャネルもしくは開口部２３９は、潅流培地の戻り流れが足場２２０の近位側を通って出ていくのを容易にする。
再び図１７を参照すると、また、本発明にしたがって１つもしくは複数の足場２２０を取り扱うまたは操作する例示的な方法が示されている。ウェルユニット２１１に関して示されているように、最初のステップとして、足場２２０または多数の足場を、キャリア２０５のウェルユニット２１０内に詰め込むまたは挿入することができる。ウェルユニット２１２に関して示したように、キャリア２０５内に取り付けられると、または詰め込まれると、（１つもしくは複数の）足場２２０を、化学物質による処理、紫外線滅菌、細胞の播種、もしくは他の処理などによって操作することができる。同様に、ウェルユニット２１３に関して示したように、足場を細胞培養培地または生物剤とともにマルチウェルプレートに挿入して、生物学的実験を実施することもできる。図１７のウェルユニット２１４に関して示したように、（１つもしくは複数の）足場２２０を通じて培地を潅流させることができる。また、顕微鏡検査が必要な場合、足場を直接取り扱う必要なしに、顕微鏡検査用の別個のまたは新しい乾いたプレートにキャリア２０５を容易に移動することができる。
図８を参照すると、本発明にしたがって実施された細胞生物学実験の一例が示されており、この実験では、プライマリーラット肝細胞を潅流チャンバ内のアルギン酸塩の足場上に播種し、Ｈｅｐａｔｏｓｔｉｍ培地を用いて潅流下で培養した。また、同じ細胞を、マトリゲルアルギン酸塩（ｍａｔｒｉｇｅｌ）基材（通常、ラット肝細胞の基礎ＣＹＰ ３Ａ１活性を維持することで知られる）上に播種し、受動コーティングされたコラーゲンタイプ１基材を陰性対照（通常、ラット肝細胞の基礎ＣＹＰ ３Ａ１活性を低下させることで知られる）として使用した。４８時間後、１００ｕＭのコルテキソロン（ｃｏｒｔｅｘｏｌｏｎｅ）を培地に添加して、ＣＹＰ ３Ａ１発現を誘発した。週に１度、ＨＰＬＣ分析を使用して、テストステロンが代謝されて６Ｂ−ヒドロキシテストステロンに変わることにより、基礎３Ａ１活性を監視した。したがって、培養物中の６Ｂ−ヒドロキシテストステロンのレベルは、ＣＹＰ ３Ａ１の発現および活性を示している。コラーゲン培養物は、ＣＹＰ ３Ａ１を発現させず、マトリゲル培養物は、肝細胞が３週間にわたってＣＹＰ ３Ａ１発現を維持するのを助けたが、３週の時点で発現が低下した。アルギン酸塩の足場上で流動条件下に培養された肝細胞は、やはり、高いＣＹＰ ３Ａ１活性を維持したが、４週目に低下するのではなく、マトリゲルに比べて活性が劇的に上昇した。この実施例は、このデバイス構成で細胞を成長させることができることを実証しており、また、新規の培養条件が、プライマリーラット細胞について、分化特異的な細胞機能の長期的でより高い発現を可能にしたことを示唆する。潅流下では、重要なｐ４５０ ３Ａ１機能が、業界標準のマトリゲル培養物よりも長い、４週間にわたって維持される。
図１４を参照すると、本発明にしたがって実施された細胞生物学実験の一例が示されており、この実験では、マウス骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３）をリン酸カルシウムの足場上に播種し、Ｇｉｂｃｏ Ａｌｐｈａ培地を用いて潅流下で培養した。また、同じ細胞を静的条件でリン酸カルシウムの足場上に播種した。細胞の代謝活性を、１５日間にわたり、静的条件下および潅流条件下で吸光度によって探査した。１５日後、潅流下の細胞は、静的条件の細胞を上回る、統計的に優位な代謝活性３４％の上昇を示す。
図１５を参照すると、本発明にしたがって実施された細胞生物学実験の一例が示されており、この実験では、ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をリン酸カルシウムの足場上に播種し、骨形成培地を用いて潅流下で培養した。また、同じ細胞を静的条件でリン酸カルシウムの足場上に播種した。細胞の代謝活性を、１０日間にわたり、静的条件下および潅流条件下で吸光度によって探査した。１０日後、潅流下の細胞は、静的条件の細胞を上回る、統計的に優位な代謝活性４２％の上昇を示す。
図１６を参照すると、本発明にしたがって実施された細胞生物学実験の一例が示されており、この実験では、ラット肝臓切片を、Ｇｉｂｃｏ培地を用いて潅流流れ下で培養した。また、切片を静的条件でも培養した。細胞の代謝活性を、５日間にわたり、静的条件下および潅流条件下で吸光度によって探査した。５日後、潅流下の切片は、静的条件の切片を上回る、統計的に優位な代謝活性１３６％の上昇を示す。
本発明を特定の実施形態およびそれらの実施例に即して記載したが、本開示を読めば多くの代替形態、修正形態、および変形形態が当業者には明らかであることが明白である。したがって、冒頭の特許請求の範囲の趣旨および広い範囲内に入るそのようなすべての代替形態、修正形態、および変形形態を包含するものとする。
Claims (14)
- バイオリアクタシステムであって、
細胞培養物を容れるように構成された複数の細胞ウェルのアレイを含む潅流ユニットと、
前記細胞ウェルと流体連通する複数のポンプ要素のアレイを含むポンプユニットと、
細胞培養培地を容れるように構成された複数の培地ウェルのアレイを含む流体源ユニットを含んでおり、
前記培地ウェルは、前記ポンプ要素と流体連通しており、前記ポンプ要素は、前記培地ウェルから前記細胞ウェルへと細胞培養培地を送り出すように構成され、
前記流体が前記複数の細胞ウェルのアレイから前記複数の培地ウェルのアレイへと流れるための、少なくとも１つの戻り経路をさらに含む、
ことを特徴とするシステム。 - 前記細胞ウェルは、それぞれ、多孔質構造を有する足場を容れるように適合かつ構成されていることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
- 前記細胞ウェルは、それぞれ、２次元の足場を容れるように適合かつ構成されていることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
- 前記細胞ウェルは、それぞれ、３次元の足場を容れるように適合かつ構成されていることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
- 前記３次元の足場は、１方向に整列した孔隙を含むことを特徴とする請求項４に記載のシステム。
- 前記足場は、管形状であることを特徴とする請求項４に記載のシステム。
- 前記足場の内部構造に流体を直接供給可能であることを特徴とする請求項２に記載のシステム。
- 前記戻り経路は、単一の細胞ウェルおよび単一の培地ウェルと流体連通することを特徴とする請求項１に記載のシステム。
- 前記潅流ユニットは、前記ポンプユニットに取外し可能に結合できることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
- 各ポンプ要素は、流体ポートをその中に有する流体ステムを含んでおり、各ステムは、前記細胞ウェルへと延びるように適合かつ構成されていることを特徴とする請求項９に記載のシステム。
- 各細胞ウェルは、それに結合された、前記ステムの一部分をその内部で受けるように構成された足場を含むことを特徴とする請求項１０に記載のシステム。
- 前記流体源ユニットは、前記ポンプユニットに取外し可能に結合できることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
- 前記ポンプ要素は、少なくとも１つの一方向弁を含み、空気圧によって動作可能であることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
- 複数のウェルユニットのアレイを含む足場キャリアカートリッジをさらに含んでおり、細胞接着足場を各ウェルユニット内に位置決めすることができ、前記カートリッジは、各ウェルユニットが前記潅流ユニットの細胞ウェルと位置合わせされるように前記潅流ユニットと結合可能であることを特徴とする請求項１に記載のシステム。
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