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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, ein Verfahren zum Betrieb derselben sowie auf eine die mikrofluidische Vorrichtung umfassende Kartusche nach dem Oberbegriff der unabhängigen Ansprüche.
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Stand der Technik
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In der
WO 2019/010587 A1 ist eine mikrofluidische Leitung mit Kavitäten vorgesehen, in denen ein Hydrogel-Precursor vorgelagert ist. Zellen gelangen in die Kavitäten und somit den Hydrogel-Precursor, welcher schließlich ausgehärtet wird. Anschließend werden die Zellen in den entstandenen Hydrogel-Kugeln kultiviert.
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Krebspatienten mit soliden Tumoren sprechen unterschiedlich gut auf eine medikamentöse Krebstherapie an. Es besteht hoher Bedarf an einer zunehmenden Personalisierung der Krebsbehandlung, welche u.a. zelluläre Besonderheiten des einzelnen Patienten berücksichtigt, um eine individuell optimierte Therapie ableiten zu können.
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Das Interesse an der Verwendung von dreidimensionalen Zellagglomeraten, wie beispielsweise von Organoiden oder Sphäroiden für die Erforschung, Diagnose und Behandlung von Krankheiten, wie beispielsweise Tumorerkrankungen, hat in den vergangenen Jahren stark zugenommen, da solche dreidimensionalen Zellagglomerate zum Beispiel organspezifische Eigenschaften gut abbilden können.
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Typischerweise erfolgt deren Handhabung manuell mit Hilfsmitteln wie Pipetten, Reaktionsgefäßen und Laborgeräten. Hier bietet die Mikrofluidik im Vergleich zu herkömmlichen Labortests Vorteile wie beispielsweise geringere benötigte Probenvolumina und Reagenzien, verkürzte Analysezeiten sowie parallel ablaufende Vorgänge.
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Bei der Implementierung erforderlicher Prozessschritte in ein mikrofluidisches System gibt es jedoch aufgrund deren Komplexität zahlreiche Herausforderungen, die es zu meistern gilt. Eine dieser Herausforderungen ist beispielsweise die Kultivierung und Vermehrung solcher dreidimensionaler Zellagglomerate in einem mikrofluidischen System.
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Sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme, kurz LoC-Systeme, sind mikrofluidische Systeme, welche Funktionalitäten eines makroskopischen Labors auf einem Kunststoffsubstrat für eine automatisierte Prozessierung unterbringen. Solche Systeme ermöglichen es, biochemische Prozesse weitestgehend oder vollständig automatisiert zu prozessieren.
Lab-on-a-Chip-Systeme umfassen typischerweise zwei Hauptkomponenten. Die erste ist ein Testträger, beispielsweise in Form einer Kartusche, welcher Strukturen und Mechanismen für die Manipulation einer aufgenommenen Probe umfasst, insbesondere passive Komponenten wie Kanäle, Reaktionskammern oder vorgelagerte Reagenzien oder auch aktiven Komponenten wie Ventile, Pumpen oder Mischer. Die zweite Hauptkomponente ist eine Steuereinheit zur Steuerung der mikrofluidischen Abläufe in der Kartusche.
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Offenbarung der Erfindung
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Zur Erforschung von Tumorerkrankungen kommen zum Beispiel sogenannte Tumor-Organoide zum Einsatz. Eine Möglichkeit zur Herstellung von Tumor-Organoiden ist die Entnahme einzelner Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärtumor eines Krebspatienten und deren anschließende Kultivierung. Hierbei erfolgt eine Differenzierung und Vermehrung dieser Zellen oder Gewebefragmente, die sich schließlich zu dreidimensionalen Strukturen selbstorganisieren. Die daraus entstehenden Tumor-Organoide sind somit 3D-Zellagglomerate, welche eine ähnliche Zusammensetzung und Architektur aufweisen wie das primäre Tumorgewebe des Patienten. Mittels Tumor-Organoiden können die Gegebenheiten in vivo gut repräsentiert werden.
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Für die Herstellung von Organoiden bzw. Tumor-Organoiden werden aktuell etablierte Methoden der 3D-Zellkultivierung verwendet.
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Hauptprozessschritte hierbei sind die Kultivierung der entnommenen Zellen oder Gewebefragmente aus dem Primärmaterial sowie die anschließende Expansion der entstandenen Tumor-Organoide.
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Bei der Kultivierung werden Zellen bzw. Zellagglomeraten in einer sogenannten extrazellulären Matrix (ECM, engl. extracellular matrix) suspendiert. Die ECM ist beispielsweise ein Hydrogel mit geeigneten Inhaltsstoffen. Tropfen dieser Suspension werden in ein Zellkulturgefäß, beispielsweise eine Multiwellplatte, pipettiert und durch Inkubation bei 37°C kommt es zu einer Polymerisation des Gels. Hierbei bilden sich Gelstrukturen (engl. gel domes) aus.
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Nach der Verfestigung des Gels wird ein geeignetes Kulturmedium in das Gefäß pipettiert, so dass die Gelstrukturen von diesem vollständig überdeckt sind. Es folgt eine Kultivierungsphase in einem Inkubator. Dabei vermehren sich die Zellen innerhalb der Gelstrukturen und Organoide mit unterschiedlicher Größe und Form bilden sich aus. Das Wachstum der Organoide wird beispielsweise mikroskopisch überwacht und zu einem geeigneten Zeitpunkt mit einem Passagieren der Organoide begonnen. Hierfür werden die Gelstrukturen in ein anderes Gefäß transferiert, gewaschen, aufgebrochen und die Organoide resuspendiert.
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Anschließend erfolgt die Expansion der Organoide, wobei diese in multizelluläre Fragmente oder einzelne Zellen dissoziiert werden.
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Diese Prozessschritte zur Kultivierung und Expansion sind sehr arbeits- und zeitintensiv und können nur von ausgebildetem und erfahrenem Fachpersonal in geeignet ausgestatteten Laboren durchgeführt werden.
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Die vorliegende Erfindung adressiert Prozesse zur Kultivierung von Zellen, beispielsweise zu dreidimensionalen Zellagglomeraten, insbesondere Organoiden oder Sphäroiden, die für eine mikrofluidische Implementierung als sehr kritisch anzusehen sind, und beschreibt eine technische Lösung für die mikrofluidische Umsetzung der für die Kultivierung relevanten Arbeitsschritte.
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Erfindungsgemäß werden eine mikrofluidische Vorrichtung zur Kultivierung von Zellen, umfassend einen Kanal mit zumindest einer Kavität zur Aufnahme zumindest eines Mikropartikels, welche sich ausgehend von einer Außenfläche des Kanals ausstülpt, sowie ein Verfahren zum Betrieb derselben mit den kennzeichnenden Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche bereitgestellt.
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Dies beruht insbesondere darauf, dass die zumindest eine Kavität der mikrofluidischen Vorrichtung einen mit einer Pumpeinheit verbundenen fluidischen Anschluss aufweist, welcher von dem Kanal wegführt. Bevorzugt weist die mikrofluidische Vorrichtung eine Mehrzahl an Kavitäten mit je einem fluidischen Anschluss, welcher mit einer Pumpeinheit verbunden ist, auf.
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Unter einer sich von einer Außenfläche des Kanals ausstülpenden Kavität kann insbesondere eine seitliche Ausbuchtung oder Bucht im Kanal verstanden werden, welche insbesondere als Ausnehmung in einer Innenwand des Kanals für die Aufnahme des zumindest einen Mikropartikels angeordnet ist.
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Die Kavitäten weisen beispielsweise einen Durchmesser von 200 - 1500µm, und insbesondere von 400-750µm auf. Die Form und Abmessungen der Kavitäten sind bevorzugt so gewählt, das darin jeweils ein Mikropartikel Platz findet und nachfolgend angeströmte Mikropartikel zur nächsten freien Kavität weitertransportiert werden. Alternativ können die Kavitäten auch so dimensioniert sein, dass mehrere Mikropartikel darin aufgenommen werden können.
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Jede der Kavitäten besitzt einen fluidischen Anschluss, der mit einer Pumpeinheit direkt oder über geeignet geschaltete Ventile verbunden ist. Dadurch ist es möglich, Flüssigkeiten aus einer Kavität herauszufördern bzw. in eine Kavität hineinzufördern. Hierfür geeignete Pumpeinheiten sind beispielsweise Spritzen-, Membran- oder Peristaltikpumpen.
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Vorteilhaft ist, dass die fluidischen Anschlüsse die Realisierung von strömungsinduzierten Prozessen innerhalb der Kavitäten bzw. der mikrofluidischen Vorrichtung ermöglichen. Diese erfolgen durch Hinein- bzw. Herausfördern von Flüssigkeiten in die Kavitäten oder aus diesen heraus über die einzelnen fluidischen Anschlüsse.
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Dies ermöglicht beispielsweise eine strömungsinduzierte Bewegung und Positionierung von einem oder mehreren Mikropartikeln in einer Kavität durch Herausfördern einer Flüssigkeit über den fluidischen Anschluss. Ebenso können die Mikropartikel oder nach deren Auflösung Bestandteile der Mikropartikel, insbesondere Zellen oder dreidimensionale Zellagglomerate, durch Zuführen von einer Flüssigkeit über den fluidischen Anschluss wieder aus der Kavität in den Kanal gespült werden.
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Desweiteren können die Kultivierungsbedingungen, und somit der Kultivierungsprozess von einem sich in der Kavität befindlichen Mikropartikel bzw. von einer sich in dem Mikropartikel befindlichen Zelle und/oder dreidimensionalen Zellagglomerat, beeinflusst werden. Dies erfolgt durch eine genau dosierte Zuführung von geeignet ausgewählten Flüssigkeiten.
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Es lassen sich damit insbesondere unterschiedliche Kultivierungsbedingungen für jede Kavität realisieren und somit Einflüsse auf das Verhalten bzw. die Eigenschaften der Zellen oder dreidimensionalen Zellagglomerate untersuchen. Durch die Zuführung geeigneter Flüssigkeiten über den fluidischen Anschluss der zumindest einen Kavität ist außerdem sichergestellt, dass sich in den Kavitäten mit den Mikropartikeln immer frische für die Kultivierung benötigte Nährstoffe und Gase befinden. Sie werden also direkt dort eingebracht, wo sie benötigt werden, und müssen nicht erst über einen Kanal oder andere Strukturen in die Kavitäten eindiffundieren. Die fluidischen Anschlüsse verbessern so die Versorgung der zu kultivierenden Zellen.
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Desweiteren vorteilhaft kann über den fluidischen Anschluss jeder Kavität ein definiertes Volumen an Flüssigkeit aus der Kavität für eine anschließende Analyse entnommen werden, sodass der Kultivierungsprozess überwacht und gegebenenfalls angepasst werden kann.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung bietet außerdem den Vorteil, dass die Kultivierung von Zellen und/oder dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert innerhalb eines mikrofluidischen Systems erfolgt, wodurch die Kultivierung reproduzierbar, automatisierbar, standardisierbar und bedienerfreundlich ist. Somit sind keine erfahrenen Fachexperten und geeignet ausgestattete Labore erforderlich, wodurch das Fachpersonal entlastet wird und Zeit und Kosten eingespart werden. Dadurch, dass manuell durchzuführende Prozessschritte entfallen, treten beispielsweise keine Beeinflussungen bzw. Fehler durch den Bedienung auf und der Eintrag von möglichen Kontaminationen wird verhindert. Insbesondere die Standardisierbarkeit ist für die Verwendung von dreidimensionalen Zellagglomeraten, wie beispielsweise Organoiden, für verlässliche Medikamententests erforderlich.
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Weitere vorteilhafte Ausführungsformen der mikrofluidischen Vorrichtung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
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In einer vorteilhaften Ausführungsform weist der fluidische Anschluss der zumindest einen Kavität ein integriertes Rückhalteelement auf. Alternativ oder zusätzlich weist der fluidische Anschluss der zumindest einen Kavität Abmessungen von 5 - 75 µm auf.
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Vorteilhaft hierbei ist, dass der oder die Mikropartikel größere Abmessungen aufweisen als der fluidische Anschluss bzw. diesen aufgrund des Rückhalteelements nicht passieren können, und somit die Kavität nicht über den fluidischen Anschluss verlassen können. Auf diese Weise ist es möglich Flüssigkeiten in die Kavität ein- und auszubringen ohne, dass es zu Verlusten der Mikropartikel kommt.
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Zudem vorteilhaft ist es, wenn der Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung Abmessungen von 100 - 1000µm, aufweist. Unter dem Begriff Abmessung wird im Sinne der vorliegenden Erfindung die Höhe und/oder Breite des mikrofluidischen Kanals verstanden.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist der Kanal zumindest eine Biegung auf, wobei die zumindest eine Kavität in der Biegung des Kanals an der äußeren Bogenfläche angeordnet ist.
Vorteilhaft hierbei ist, dass auf Bestandteile, wie beispielsweise Mikropartikel, die durch den Kanal gefördert werden aufgrund der Biegung eine Zentrifugalkraft wirkt, welche die Bestandteile in Richtung der zumindest einen Kavität und in diese hinein transportiert.
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Es ist in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, dass die Vorrichtung eine Einrichtung zur Temperierung des Kanals und/oder der zumindest einen Kavität aufweist.
Hierdurch kann eine geeignete Temperatur zur Kultivierung der Zellen und oder/ dreidimensionalen Zellagglomerate eingestellt werden. Dies wird beispielsweise durch eine Temperierung, insbesondere unterhalb der mikrofluidischen Vorrichtung, realisiert, beispielsweise durch die Verwendung eines oder mehrerer, insbesondere unterhalb der mikrofluidischen Vorrichtung, angebrachter Peltier-Elemente.
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Desweiteren ist es in einer weiteren Ausführungsform vorteilhaft, wenn der Kanal und/oder die zumindest eine Kavität zumindest teilweise optisch transparent ausgestaltet ist und eine Kontrolleinheit, insbesondere eine Kamera und/oder einer Mikroskopeinheit umfasst. Vorteilhaft hierbei ist, dass eine optische Beobachtung des Kultivierungsprozesses der Zellen und/oder dreidimensionalen Zellagglomerate möglich ist. Es können beispielsweise die Abmessungen der kultivierten dreidimensionalen Zellagglomerate ermittelt werden und der Kultivierungsprozess gestoppt werden, wenn diese eine definierte Größe erreicht haben.
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Desweiteren ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn die mikrofluidische Vorrichtung zumindest ein Reservoir für ein Fluid umfasst, welches mit dem fluidischen Anschluss der zumindest einen Kavität in fluidischer Verbindung steht. In dem Reservoir ist ein Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologische Wirkstoffe vorgelagert.
So ist eine schnelle und einfache Zuführung des Kulturmediums, der Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologischen Wirkstoffen sichergestellt.
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Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen unter Verwendung der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung mit nachfolgenden Schritten:
- a) Fördern eines Mediums mit Mikropartikeln über den Kanal, wobei ein Mikropartikel zumindest eine Zelle umschließt, und Einbringen zumindest eines Mikropartikels in zumindest eine Kavität. Die Mikropartikel werden hierbei beispielsweise in einem Kulturmedium transportiert.
- b) Kultivierung der zumindest einen Zelle in dem sich in der Kavität befindlichen Mikropartikel, insbesondere zu einem dreidimensionalen Zellagglomerat. Hierbei erfolgt eine dosierte Zuführung von einem Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und/oder pharmakologischen Wirkstoffen über den fluidischen Anschluss der Kavität in diese.
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Bei der Kultivierung diffundiert das umgebende Kulturmedium in die Kavitäten und in die Mikropartikel hinein, sodass die Zellen mit gelösten Nährstoffen und Gasen versorgt sind.
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Das Kulturmedium wird beispielsweise über den mikrofluidischen Kanal kontinuierlich oder zu bestimmten Zeiten weiter gefördert.
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Über die fluidischen Anschlüsse der Kavitäten wird den Mikropartikeln und somit den Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomeraten während des Kultivierungsprozesses frisches Kulturmedium mit der gleichen oder einer anderen Zusammensetzung zugeführt, sodass verbrauchtes Kulturmedium beispielsweise zu bestimmten Zeiten durch frisches Kulturmedium ersetzt wird. Alternativ oder zusätzlich werden Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologische Wirkstoffe genau dosiert zugeführt. Es können beispielsweise unterschiedliche Wachstumsfaktoren in definierten Konzentrationen zugegeben werden.
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Vorteilhaft hierbei ist, dass auf diese Weise die Kultivierung der Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate gezielt beeinflusst werden kann. Das Kulturmedium, die Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und/oder pharmakologischen Wirkstoffe gelangen über den fluidischen Anschluss direkt in die Kavität und somit an deren Bestimmungsort um bei der Kultivierung gezielt auf die Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate einzuwirken. So ist sichergestellt, dass die Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate in ausreichender Konzentration mit dem jeweiligen Kulturmedium, Wachstumsfaktoren, Nährstoffen und/oder pharmakologischen Wirkstoffen in Kontakt kommen. Durch Zugabe von Medikamentenlösungen mit definierten Konzentrationen in eine Kavität über den fluidischen Anschluss kann insbesondere der Einfluss auf den Kultivierungsprozess und die Eigenschaften der Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate untersucht werden. Es können beispielsweise einzelne oder mehrere Chemotherapeutika mit wählbaren Konzentrationen über die fluidischen Anschlüsse in die Kavitäten eingebracht werden.
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Desweiteren vorteilhaft lassen sich damit insbesondere unterschiedliche Kultivierungsbedingungen für jede Kavität realisieren und somit Einflüsse auf das Verhalten bzw. die Eigenschaften der Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate untersuchen.
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Zur Kultivierung werden die Kavitäten beispielsweise auf eine geeignete Temperatur temperiert, beispielsweise auf 37 °C. Zusätzlich können auch der Kanal und die fluidischen Anschlüsse der Kavität beheizt werden.
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c) Beenden der Kultivierung und Ausführen des zumindest einen Mikropartikels oder der zumindest einen kultivierten Zelle, insbesondere des dreidimensionalen Zellagglomerats, aus der Kavität heraus in den Kanal.
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Das Beenden des Kultivierungsprozesses der Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate erfolgt zu einem wählbaren Zeitpunkt, beispielsweise bei Erreichen einer gewünschten Größe oder Morphologie der dreidimensionalen Zellagglomerate. Das Beenden kann hierbei für eine einzelne oder mehrere Kavitäten erfolgen.
Abschließend können die sich im mikrofluidischen Kanal befindlichen Mikropartikel weitertransportiert und -prozessiert werden.
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Ein derartiges Verfahren bietet neben den zu den einzelnen Verfahrensschritten erläuterten Vorteilen den weiteren Vorteil, dass die Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate für nachfolgende Kultivierungs- oder Analyseschritte, insbesondere für eine Expansion oder für Medikamententests zur Verfügung stehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet außerdem den Vorteil, dass die Kultivierung von Zellen und/oder dreidimensionalen Zellagglomeraten automatisiert erfolgt, wodurch die Kultivierung reproduzierbar, automatisierbar, standardisierbar und bedienerfreundlich ist. Dadurch ergeben sich die bereits zu der mikrofluidischen Vorrichtung beschriebenen Vorteile.
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Weitere vorteilhafte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ergeben sich aus den Unteransprüchen.
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In einer vorteilhaften Ausführungsform erfolgt in Schritt a) das Einbringen des zumindest einen Mikropartikels in die zumindest eine Kavität aufgrund einer auf die Mikropartikel wirkenden Zentrifugalkraft, welche aufgrund einer Biegung des Kanals bei dessen Durchströmung auftritt. Hierbei ist die Kavität an der äußeren Bogenfläche des Kanals angeordnet.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die auf die Mikropartikel wirkende Zentrifugalkraft die Mikropartikel direkt in Richtung der zumindest einen Kavität und in diese hinein transportiert.
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In einer alternativen oder zusätzlichen vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass
in Schritt a) das Einbringen des zumindest einen Mikropartikels in die zumindest eine Kavität strömungsinduziert durch ein Herausfördern von Medium über den fluidischen Anschluss der Kavität erfolgt. Vorteilhaft hierbei ist, dass die Mikropartikel dadurch strömungsinduziert in Richtung der Kavitäten bewegt werden und sich in diesen positionieren.
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Alternativ oder zusätzlich kann die Bewegung und Positionierung der Mikropartikel in die Kavitäten auch mittels anderer Technologien erfolgen oder unterstützt werden, beispielsweise mittels Dielektrophorese und einem angelegten inhomogenen elektrischen Feld zum Bewegen und Einfangen der Mikropartikel und/oder mittels Anlegen magnetischer Felder und magnetischem Labeling der Mikropartikel und/oder mittels stehender Ultraschallwellen zur Erzeugung von Druckknoten, welche die Mikropartikel anziehen und festhalten.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform werden in Schritt b) der Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt im über den fluidischen Anschluss der Kavität zugeführten Kulturmedium variiert.
Hierdurch können vorteilhaft hypoxische Kultivierungsbedingungen innerhalb der Kavität realisiert werden, die charakteristisch für die in vivo Situation bei soliden Tumoren sind.
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Es ist in einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform vorgesehen, dass in Schritt b) während der Kultivierung über den fluidischen Anschluss der zumindest einen Kavität ein Flüssigkeitsvolumen aus dieser herausgefördert wird und auf
bestimmte Parameter untersucht wird. Diese Parameter sind beispielsweise der pH-Wert, die Konzentration von Glukose und/oder Laktat im Kulturmedium, der Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt im Kulturmedium und/oder das Vorhandensein bzw. die Konzentration von Proteinen im Kulturmedium, insbesondere von Zytokinen.
Vorteilhaft hierbei ist, dass die Analyse und Überwachung während des Kultivierungsprozesses erfolgen kann, ohne diesen zu stoppen bzw. zu stören. Zudem kann eine Untersuchung charakteristischer Eigenschaften frühzeitig Aufschluss über die Qualität der Kultivierung geben, sodass eine Anpassung der Kultivierungsbedingungen bereits direkt während der Kultivierung erfolgen kann.
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Desweiteren ist es in einer weiteren Ausführungsform vorteilhaft, wenn in Schritt c) das Beenden der Kultivierung durch die Generierung einer Flüssigkeitsströmung über den fluidischen Anschluss der Kavität in Richtung des Kanals erfolgt. Hierdurch wird das Kulturmedium um die Mikropartikel herum weggespült, sodass der Kultivierungsprozess gestoppt ist. Auch die Mikropartikel selbst oder die Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate aufgelöster Mikropartikel können hierbei mittels der Flüssigkeitsströmung aus der Kavität heraus in den Kanal transportiert werden. Bei der zugeführten Flüssigkeit kann es sich beispielsweise um ein Kulturmedium oder einen Puffer handeln. Vorteilhaft ist, dass diese Schritte strömungsinduziert über die fluidischen Anschlüsse der Kavitäten ablaufen können und das Ausbringen der Mikropartikel oder Zellen bzw. dreidimensionalen Zellagglomerate aus den Kavitäten nahezu vollständig gewährleistet ist im Vergleich zu lediglich über den Kanal hervorgerufene Strömungen.
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In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform sind die Mikropartikel zumindest eine Zelle und/oder ein dreidimensionales Zellagglomerat umfassende, insbesondere kugelförmige, Hydrogel-Strukturen. Desweiteren sind die dreidimensionalen Zellagglomerate beispielsweise Organoide oder Sphäroide. Als Hydrogel der Hydrogel-Struktur wird bevorzugt Matrigel™ (Corning) verwendet. Alternativ können auch andere Hydrogele wie beispielsweise Agarose, Gelatine oder Polyethylenglykol verwendet werden.
Die Hydrogel-Strukturen werden so groß gewählt, dass ein bzw. mehrere dreidimensionale Zellagglomerate, insbesondere Organoide, darin kultivierbar sind. Die Durchmesser der für Medikamententests besonders geeigneten Tumor-Organoide liegen beispielsweise zwischen 100 - 750 µm.
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Zudem ist es in einer Ausführungsform vorteilhaft, wenn in Schritt c) die Hydrogel-Strukturen depolymerisiert werden und die Zellen und/oder dreidimensionalen Zellagglomerate, insbesondere Organoide oder Sphäroide, in der Kavität freigesetzt werden. Zur Depolymerisation wird ein Reagenz über den fluidischen Anschluss der Kavität zugeführt. Das Reagenz weist beispielsweise eine die Depolymerisierung hervorrufende oder unterstützende Temperatur auf.
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Im Fall des Hydrogels Matrigel ist dieses depolymerisierende Reagenz beispielsweise die Lösung Corning™ Dispase (Corning) bzw. Corning™ cell recovery solution (Corning). Alternative Reagenzien sind Enzymlösungen, die beispielsweise Trypsin oder TrypLE™ Express Enzym (Thermofisher) enthalten. Ergänzend oder alternativ kann die Depolymerisierung des Matrigels™ (Corning) durch eine Senkung der Temperatur auf ca. 4°C erfolgen. Hierfür wird beispielsweise Kulturmedium mit einer Temperatur von ca. 4°C über die fluidischen Anschlüsse der Kavitäten und/oder den Kanal der mikrofluidischen Vorrichtung zugeführt. Alternativ wird die mikrofluidische Vorrichtung, insbesondere die Kavität, auf eine Temperatur von ca. 4°C temperiert.
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Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Kartusche, insbesondere eine mikrofluidische Kartusche, wie beispielsweise in
DE102016222072A1 oder
DE102016222075A1 beschrieben, umfassend die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung.
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Kurze Beschreibung der Zeichnung
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Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und in der nachfolgenden Figurenbeschreibung näher erläutert. Es zeigt:
- 1: die schematische Darstellung eines Querschnitts durch eine erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung mit einem Kanal und Kavitäten, die je einen fluidischen Anschluss aufweisen,
- 2: die schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Kartusche umfassend die mikrofluidische Vorrichtung gemäß 1, und
- 3: die schematische Darstellung eines Flussdiagramms eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Ausführungsformen der Erfindung
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In 1 ist eine mikrofluidische Vorrichtung 10 zur Kultivierung von Zellen 9 dargestellt. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 umfasst einen Kanal 1 mit drei Kavitäten 5a, 5b, 5c, wobei die Kavitäten 5a, 5b, 5c sich ausgehend von einer Außenfläche des Kanals 1 ausstülpen. In 1 ist die Anzahl der Kavitäten 5a, 5b, 5c lediglich beispielhaft dargestellt, vorzugsweise weist der Kanal 1 eine Vielzahl an Kavitäten 5a, 5b, 5c auf. Jede Kavität 5a, 5b, 5c weist einen mit einer Pumpeinheit verbundenen fluidischen Anschluss 55a, 55b, 55c auf, welcher vom Kanal 1 wegführt. Die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c weisen beispielsweise ein nicht dargestelltes integriertes Rückhalteelement und/oder Abmessungen von 5 - 75 µm auf, sodass die Hydrogel-Strukturen 3 größere Abmessungen aufweisen als die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c und diese nicht passieren und verlassen können. Die Pumpeinheit ist in 1 nicht dargestellt. Der Kanal 1 weist eine Biegung 11 auf, wodurch der Kanal 1 im Bereich der Biegung 11 in eine innere Bogenfläche 12, eine neutrale Achse 13 und eine äußere Bogenfläche 14 aufweist. Die Kavitäten 5a, 5b, 5c sind in der Biegung des Kanals 1 an der äußeren Bogenfläche 14 angeordnet. Vorzugsweise und nicht in 1 dargestellt umfasst die Vorrichtung eine Einrichtung zur Temperierung des Kanals 1 und/oder der zumindest einen Kavität 5a, 5b, 5c.
Desweiteren kann der Kanal 1 und/oder die Kavitäten 5a, 5b, 5c zumindest teilweise optisch transparent ausgestaltet sein und eine nicht dargestellte Kontrolleinheit, insbesondere eine Kamera und/oder einer Mikroskopeinheit aufweisen.
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Im Folgenden wird ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Kultivierung von Zellen 9 mittels der mikrofluidischen Vorrichtung 10 beschrieben. Hierbei werden beispielhaft für die die zumindest eine Zelle 9 umschließenden Mikropartikel 3 kugelförmige Hydrogel-Strukturen 3 und für die dreidimensionalen Zellagglomerate 7 Organoide 7 beschrieben. Als Hydrogel wird bevorzugt Matrigel™ (Corning) verwendet.
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Die Hydrogel-Strukturen 3 werden so groß gewählt, dass ein bzw. mehrere Organoide 7, darin kultivierbar sind. Die Durchmesser der Organoide 7 liegen beispielsweise bei 100 - 750 µm.
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In 1 bilden die Kavitäten 5a, 5b, 5c unterschiedliche Schritte des Verfahrens ab. In der ersten Kavität 5a ist der erste Schritt a) des Verfahrens dargestellt, die zweite Kavität 5b zeigt den zweiten Verfahrensschritt b) und die dritte Kavität 5c bilden den dritten Schritt c) des Verfahrens ab.
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Im ersten Schritt a) wird ein Medium, insbesondere ein Kulturmedium, mit kugelförmigen Hydrogel-Strukturen 3 über den Kanal 1 gefördert. Die Strömungsrichtung ist durch die Pfeile 15 angedeutet. Die Hydrogel-Strukturen 3 umschließen je eine Zelle 9 und werden mit der Flüssigkeitsströmung im Kanal 1 transportiert. Der Kanal 1 weist eine Biegung 11 auf. Beim Transport der Hydrogel-Strukturen 3 durch die Biegung 11 wirkt eine Zentrifugalkraft auf die Hydrogel-Strukturen 3 ein, welche diese in Richtung der äußeren Bogenfläche 14 des Kanals 1, an welcher die Kavitäten 5a, 5b, 5c lokalisiert sind, transportiert und in diese hinein. Zusätzlich wird Medium über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c herausgefördert, dargestellt als Ausstrom 17, sodass ein Sog in Richtung der Kavitäten 5a, 5b, 5c entsteht, welcher die Hydrogel-Strukturen 3 in diese hineinzieht.
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Vorzugsweise sind die Kavitäten 5a, 5b, 5c so dimensioniert, dass genau eine Hydrogel-Struktur 3 darin Platz findet und nachfolgende Hydrogel-Strukturen 3 zur nächsten freien Kavität 5a, 5b, 5c weitertransportiert werden. Alternativ und nicht in 1 dargestellt können die Kavitäten 5a, 5b, 5c auch so dimensioniert sein, dass mehrere Hydrogel-Strukturen 3 von einer Kavität 5a, 5b, 5c aufgenommen werden.
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In einem zweiten Schritt b) wird die Zelle 9 in der sich in der Kavität 5a, 5b, 5c befindlichen Hydrogel-Struktur 3 kultviert und wächst zu einem Organoid 7 heran. Hierbei wird beispielsweise Kulturmedium über den Kanal 1 für den Kultivierungsprozess bereitgestellt. Das Kulturmedium diffundiert in die Kavitäten 5a, 5b, 5c und in die Hydrogel-Strukturen 3 hinein. Die zur Kultivierung der Organoide 7 geeignete Temperatur, vorzugsweise ca. 37°C, wird durch eine Temperierung des Kanals 1 und/oder der Kavitäten 5a, 5b, 5c eingestellt. Über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c werden den Hydrogel-Strukturen 3 bzw. Zellen 9 während des Kultivierungsprozesses Flüssigkeiten genau dosiert zugeführt, dargestellt als Einstrom 19, und damit gezielt die Kultivierung der Zellen 9 zu Organoiden 7 beeinflusst. Diese Flüssigkeit ist ein Kulturmedium, beispielsweise mit einer veränderten Zusammensetzung und/oder umfassen Wachstumsfaktoren, Nährstoffe und/oder pharmakologische Wirkstoffe. Die Zuführung bzw. der Einstrom 19 der Flüssigkeit, kann hierbei kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten erfolgen. Bei einer Zugabe von Kulturmedium wird „verbrauchtes“ Kulturmedium durch „frisches“ ersetzt, so dass die Zellen 9 mit gelösten Nährstoffen und Gasen versorgt sind. Auf diese Weise wird ein Medienwechsel mikrofluidisch umgesetzt. Desweiteren kann beispielsweise ein Kulturmedium mit variiertem Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt zugeführt werden. Auf diese Weise ist es möglich hypoxische Kultivierungsbedingungen einzustellen. Während der Kultivierung wird beispielsweise über den fluidischen Anschluss 55a, 55b, 55c der Kavität 5a, 5b, 5c ein Flüssigkeitsvolumen aus dieser herausgefördert und auf Parameter, insbesondere den pH-Wert, die Konzentration von Glukose und/oder Laktat, den Sauerstoff- und/oder Kohlenstoffdioxidgehalt und/oder das Vorhandensein und die Konzentration von Proteinen, insbesondere von Zytokinen untersucht.
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In einem dritten Schritt c) wird zu einem bestimmten Zeitpunkt, beispielsweise bei Erreichen einer gewünschten Größe oder Morphologie der Organoide 7 der Kultivierungsprozess beendet. Hierfür werden einzelne oder alle Hydrogel-Strukturen 3 innerhalb der Kavitäten 5a, 5b, 5c depolymerisiert und aufgelöst, um die entstandenen Organoide 7 freizusetzen. Für die Depolymerisierung der Hydrogel-Strukturen 3 werden über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c geeignete flüssige Reagenzien, dargestellt als Einstrom 19, zugeführt. Ergänzend oder alternativ kann die Depolymerisierung des Hydrogels durch eine Senkung der Temperatur auf ca. 4°C erfolgen. Hierfür wird beispielsweise Kulturmedium mit einer Temperatur von ca. 4°C über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c und/oder den Kanal 1 zugeführt. Weiterhin alternativ oder zusätzlich kann hierzu auch die mikrofluidische Vorrichtung 10 auf 4°C temperiert werden. Die nach der Depolymerisierung aus den Hydrogel-Strukturen 3 freigesetzten Organoide 7 werden dann aus den Kavitäten 5a, 5b, 5c in den mikrofluidischen Kanal 1 transportiert. Hierfür wird beispielsweise ein Kulturmedium über die fluidischen Anschlüsse 55a, 55b, 55c der Kavitäten 5a, 5b, 5c eingebracht und über diesen Einstrom 19 eine Flüssigkeitsströmung in Richtung des Kanals 1 generiert. Abschließend werden die sich im mikrofluidischen Kanal 1 befindlichen Organoide 7 weitertransportiert und stehen für nachfolgende Kultivierungs- oder Analyseschritte, insbesondere für eine Expansion oder Medikamententests, zur Verfügung. Alternativ und nicht in 1 dargestellt, werden die Hydrogel-Strukturen 3 in den Kavitäten 5a, 5b, 5c zunächst nicht depolymerisiert, sondern als ganze Hydrogel-Strukturen 3 in den Kanal 1 geströmt.
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In 2 ist eine erfindungsgemäße Kartusche 100 dargestellt, welche die erfindungsgemäße mikrofluidische Vorrichtung 10 gemäß 1 umfasst. Die mikrofluidische Vorrichtung 10 ist beispielsweise auf einem Kunststoffsubstrat bzw. Chip untergebracht.
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3 zeigt ein Flussdiagramm des erfindungsgemäßen Verfahrens 500 zur Kultivierung von Zellen 9 mittels der in 1 dargestellten mikrofluidischen Vorrichtung und den dort beschriebenen Ausführungsbeispielen und Verfahrensschritten.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2019010587 A1 [0002]
- DE 102016222072 A1 [0055]
- DE 102016222075 A1 [0055]