CN101057141B - 一种从流体中分离细胞、生物颗粒和/或分子以应用于动物、生物技术（包括生物学研究）和医疗诊断的方法和仪器 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种仪器和方法，在其帮助下，特定的生物颗粒和可溶性的生物分子能被识别和使用合适的载体和已知的固定方法从流体中分离。该仪器可以间断地使用，也可直接和连续处理流体。本发明应用于动物，生物技术(包括生物学研究)和医疗诊断领域。

Description

一种从流体中分离细胞、生物颗粒和/或分子以应用于动物、生物技术(包括生物学研究)和医疗诊断的方法和仪器
技术领域
本发明涉及一种从流体中分离细胞、生物颗粒和/或分子的方法和仪器。通过本发明并使用合适的载体和已知的固定方法，能识别和分离特殊的生物颗粒。本发明应用于动物，生物技术(包括生物学研究)和医疗诊断领域。
背景技术
在很多领域，从流体中分离细胞、生物颗粒和/或分子是很重要的，且许多方法已为人们所熟知。
使用荧光激活细胞分选(FACS)的方法进行细胞分析和细胞分离已经很多年了。该方法是一种通过表面标志分析特殊细胞群的较佳方法。但应用FACS分离大量细胞时会产生问题。包含细胞的介质必须高度稀释，对大量的细胞分离的时间相对长，且不能满足无菌条件。总之，该方法成本相当昂贵。
近10多年来，磁性分离被不断用于识别和分离生物颗粒和细胞。该方法要么是俘获分子被铁俘获要么包含铁芯的微粒被俘获分子包覆。分离通过强磁场进行。免疫-磁性分离，通过Dynal和Miltenyi Biotec已成功商业化，已经建立了它自己简单、相对有价值的细胞分离方法。特别相对于流式细胞仪，磁性分离已经证明它分离相对较少细胞类型的价值，例如，对作怀孕诊断的母亲血液中胎儿细胞的分离。进一步的应用是在手术切除主要的肿瘤后检测血液中的肿瘤细胞以作进一步治疗。
以治疗为目的，现在某些恶性血液形式系统疾病病人的先天的CD34+造血外周血干细胞一般从再移植获得。较佳的方法是通过特异性抗体偶联的磁珠除去白细胞。因为在血液/细胞捐献期间的细胞分级，许多系统都可通过血细胞的不同尺寸和特定密度在重力场中(离心法)进行分离。
所有这些分类法的缺点是它们不能持续地运作，也就是说，采集血液或淋巴细胞样品并和免疫-磁性颗粒培养。通过分离和洗脱，细胞从磁性颗粒分离，该细胞才能用于治疗的目的。
关于FACS和MACS的全面评述在″Fow Cytometry and Sorting“(Ed.Melamed et al.，Wiley&Sons，Inc.，New York，1990)有述。
其它的分离和/或去除细胞的方法在EP 12311956A2，US 6900029，US6432630，US 20020012953A1，DE 10022635A1，US 5246829，US 5739033，US 5763203，EP 0016552A1，WO 00/38762，EP 0502213B1以及EP0554460B1中有述。
发明内容
本发明的目的是发展一种简单的分离细胞、生物颗粒和其它分子的系统，该系统能用于动物以及生物技术领域，包括生物学研究和医疗诊断。
本发明是根据权利要求1，14和29-30来实现的，从属权利要求是不同的优选形式。
本发明描述了一种简单的分离方法，该方法可用于任何作用于混合物表面的功能性固定的特异性基团的分离。实际的分离通过颗粒尺寸的分选完成(过滤，筛)。
为实现上述目的，使用特异性基团与固相载体偶联的标准方法。
固相载体使用已知的生物高聚物，如来自器官的或合成的聚合物的膜或颗粒。其表面能生物相容且包含胶原质，清洗蛋白质，清洗肽，多聚糖，如壳聚糖、海藻、葡聚糖、纤维素、粘多糖或合成聚合物，如聚苯乙烯、聚酯、聚醚、聚酸酐、丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚原酸酯、聚醋酸乙烯酯、嵌段共聚物、聚丙烷、聚四氟乙烯(PTFE)或聚氨酯。
该表面是能生物降解的或非生物降解的。
用于细胞表面靶分子的结合的特异性基团可以是天然的或合成的，比如抗原、抗原片段、肽、多肽、糖肽、受体、甾体、激素、分裂素、抗体、超抗体、生长因子、细胞因子、凝集素、病毒蛋白、黏附分子或趋化因子。
作为特例，至少使用一种抗体或抗体片段，并通过间隔和链将它们与特异性基团共价结合或固定。
载体物质可显示任意几何形状。膜如毛细血管或微粒提供了表面大的优点。如以下所述，微粒的直径为>10μm<800μm，较佳的是使用50-500μm。而对于其他目的，也可使用较大或较小的颗粒。
被特异性基团激活的颗粒(例如：抗CD34或CD1d的抗体，或抗HIV-gp120抗体)将体细胞基因与血液相接触，用传统的抗凝血剂处理。这是在一个单独的反应区进行。如果反应区安置在体外循环，则与安全技术相关的连接管，阀门，过滤器和水泵可确保系统在相应的抗凝血剂下对病人作无副作用的操作。
靶细胞用功能化的微小颗粒结合。此处所述的微小颗粒的分离是利用膜(筛)的流体压力，最好是管子的形状使血液成分无障碍地通过(小孔尺寸>10μm<800μm)，但留下微小颗粒。过滤可通过垂直压力和切线压力来实现。保留在内腔的颗粒返回或导入到反应容器中以用于分析或制备。
当血液停止流动时，用反应容器从微粒中分离细胞。以这种方式分离的分散细胞能从颗粒中以相同的程序去除，可以供诊断应用。
进一步的应用是目的性分离不同类型的细胞，其目的是随时将需要表面分子的有疑问的细胞类型和/或像其它类型的细胞因子的生物分子共同培养以实现它们所需要的功能。
为了达到足够的因必需的细胞-细胞接触的需要的靶细胞的亲近，将许多特异性基团结合在颗粒上。
本发明应用的特异细胞可以是T细胞，B细胞或干细胞。
本方法可以间断和连续地使用。根据材料、直径和表面修饰在颗粒设计上的高度可变性，可导致在动物，医疗诊断，以及生物技术和生物研究方面上的巨大不同。
具体实施方式
实施方式1
从大鼠全血中分离CD4阳性细胞
腹水抗体(RIB5/2)根据Millipore Montage的抗体纯化试剂盒(LSK2ABG20)的方案完成。
纯化后用SDS变性胶(10％)检测
抗CD4抗体和聚丙烯(PMA)颗粒的偶联
1、1ml PMA(颗粒直径＝40μm+/-10μm；10mg/ml；COOH/PEG-COOH修饰)离心2分钟，3,000xg，去掉上清吸入在1ml0.1M MES pH6.3的溶液中。
2、将2mg EDC和2.4mg N-羟基琥珀酰亚胺溶解在0.5ml0.1M MES pH6.3的缓冲溶液中，加到PMA颗粒的悬浮液中。在室温旋转(颗粒的活化)下培养1小时。
3、分离PMA颗粒：离心，用0.1M MES r pH6.3溶液洗脱两次。
4、吸活性的PMA颗粒到有100-150μg的抗体的1ml0.1M MES pH6.3的缓冲溶液中；在室温偶联16小时(过夜)。
5、加入100μl1M的氨基乙醇培养1小时，中和空余的结合位点。
6、用PBS洗脱功能化的PMA颗粒，重复3次，离心，分离。
7、吸收小鼠IgG PMA颗粒到1ml PBS中，4℃下贮存。通过羊抗小鼠抗体的PE标记检测抗体的偶联。(图1)
从全血的CD4阳性细胞中分离特异性细胞
1、4ml抗凝血的大鼠全血与1ml(1mg颗粒)功能化的抗CD4PMA颗粒的悬浮液混合。
2、在室温摇动培养60分钟。
3、通过带细胞筛(40μm)的特殊的腔体过滤血液颗粒混合物从全血分离抗CD4PMA颗粒(有或没有结合细胞)。
4、用30ml PBS(1％FCS)洗涤抗CD4PMA颗粒。
5、从筛腔吸颗粒到约1ml PBS中，旋转(混合)15—20秒。
6、移去颗粒样品做显微分析(图2)
7、在用抗CD4PMA颗粒处理之前和之后，用FACS分析大鼠全血中的白细胞部分。
分离和评定来自颗粒的细胞
1、将粘附细胞的抗CD4PMA颗粒通过小心的离心沉淀。
2、吸沉淀物到PBS，2mM EDTA，3mM巯基乙醇和20U木瓜蛋白醇中。
3、混合培养30分钟。
4、通过带细胞屏(40μm)的特殊的腔体过滤分离细胞和颗粒；用30mlPBS(1％FCS)洗涤颗粒；从筛腔吸颗粒到约1ml PBS中，旋转(混合)15—20秒，重复洗涤。
5、通过离心350xg浓缩分离的淋巴细胞部分，通过FACS分析(图5)
实施方式2
从细胞溶解物中分离蛋白质(IgG)
腹水抗体(RIB5/2)根据Millipore Montage的抗体纯化试剂盒(LSK2ABG20)的方案完成。
纯化随后用SDS变性胶(10％)检测。
(小鼠IgG2)抗CD4抗体和聚丙烯(PMA)颗粒的偶联
1、1ml PMA(颗粒直径＝40μm+/-10μm；10mg/ml；COOH/PEG-COOH修饰)离心2分钟，3,000xg，去掉上清吸入在1ml0.1M MES pH6.3的缓冲溶液中。
2、将2mg EDC和2.4mg N-羟基琥珀酰亚胺缓冲在0.5ml0.1M MES pH6.3的缓冲溶液中，加到PMA颗粒的悬浮液中。在室温旋转(颗粒的活化)下培养1小时。
3、分离PMA颗粒：离心，用0.1M MES r pH6.3缓冲溶液洗脱两次。
4、吸活性的PMA颗粒到有100-150μg的抗体的1ml0.1M MES pH6.3的缓冲溶液中；在室温偶联16小时(过夜)
5、加入100μl1M的氨基乙醇培养1小时，中和空余的结合位点。
6、用PBS洗脱功能化的PMA颗粒，重复3次，离心，分离。
7、吸收小鼠IgG PMA颗粒到1ml PBS pH7.4中，4℃下贮存。通过羊抗小鼠抗体的PE标记检测抗体的偶联。(图1)
从细胞溶解物中特殊分离羊抗小鼠IgG
1、将1ml的细胞溶解物(HepG2，4x106)与1mg的羊抗小鼠IgG混合。
2、将0.1ml(100μg颗粒)功能化的羊抗小鼠IgG PMA颗粒悬浮物加到蛋白混合物中。
3、室温摇动培养60分钟。
4、通过带细胞筛(10μm)的特殊的腔体过滤从细胞溶解物分离小鼠IgGPMA颗粒(有或没有结合羊抗小鼠IgG)。
5、用PBS洗涤PMA颗粒3次，每次5ml。
分离和限定来自颗粒的蛋白
1、吸来自筛腔的具粘附蛋白的功能化PMA颗粒到0.5ml pH2.2柠檬酸盐溶液中；培养30分钟。
2、通过带筛膜(10μm)的特殊的腔体过滤分离颗粒；用2ml柠檬酸盐溶液洗涤颗粒。
3、分析在柠檬酸盐溶液中单独的蛋白。(图6)
实施方式3
图7-11显示了基于仪器实现的本发明或其一部分的例子，图7表示了一个可以持续使用的典型系统，点状箭头表示软管系统，箭头尖端标示出液体的流向，从生物体(哺乳动物)开始，体液，如血液，被泵到或导向一个包含功能颗粒的反应容器，其可能通过血泵或真空管(在图8中标记为一个圈)，与体液的成分在混合物状态下互相作用。将细胞混合物和功能颗粒的介质导向一个颗粒分离系统，依据一个实例，细胞混合物和功能颗粒的介质被导向一个筛并通过一个中空纤维膜，然后分离成为一个不含功能颗粒的细胞混合物和一个包含功能颗粒的细胞混合物(图9)。但浓度降低的不含功能颗粒的混合物通过真空管导出流入生物体，含有功能颗粒的混合物以及依附在上面的靶细胞/生物颗粒/分子被返回到反应容器中。图10典型地表示了在中空纤维膜中的分离原理。细胞混合物和功能颗粒的介质被导向一个中空管膜，后者配备的小孔尺寸(点划线)使得只允许细胞混合物通过，现在本质上不再含有靶细胞/生物颗粒/分子，但含有分离出的靶细胞/生物颗粒/分子的功能颗粒被留在中空管系统的内部。
图11描述了可用于不同直径的两类功能化颗粒的相应颗粒分离系统的细节。

Claims (11)

1.应用于动物、生物技术和医学诊断目的的，用来从体液中离析细胞、生物颗粒和/或分子的器具，包含：
a.生物相容性材料的反应容器，其用于放置包含细胞、颗粒和分子的体液，
b.与配体结合的微颗粒，其能识别并结合所需的细胞、生物颗粒和/或分子群体，当所述体液被放置于所述反应容器中时，所述与配体结合的微颗粒悬浮在所述体液中并可自由移动，
c.基于一层或多层带孔的膜的颗粒分离系统，其允许细胞、生物颗粒和/或分子通过，但不允许微颗粒通过，
d.以及，为了连续使用，各种软管系统、膜、泵和阀门，以便能进行所有的离析、分离、加工和移除细胞、生物颗粒和/或分子的动作。
2.如权利要求1所述的器具，其中
-特定的细胞、生物颗粒和/或分子是体细胞、亚细胞结构、蛋白质和/或核酸，如可适用，病毒、细菌和/或原生动物，所述体液是分泌物和排泄物、血液、淋巴液、分泌液、从器官移除物得到的被分离的细胞的漂洗样品或悬浮液或营养培养基或发酵沉淀物并且含有细胞、生物颗粒和/或分子；和/或
-通过使用进一步与配体结合的微颗粒将细胞/生物颗粒/分子分离物与细胞、生物颗粒和/或分子的吸附成分结合，特别是其中被结合的与配体结合的微颗粒就其大小尺寸而言是不同的；和/或
-所述的与配体结合的微颗粒带有一个以上的特异的配体，因此两个或多个不同的细胞、生物颗粒和/或分子被特异性地吸附在微颗粒上。
3.如权利要求2所述的器具，在所述的通过使用进一步与配体结合的微颗粒将细胞/生物颗粒/分子分离物与细胞、生物颗粒和/或分子的吸附成分结合时，通过附加的配体可产生对活细胞的细胞刺激功能，或通过膜/介体相互作用，使得导致至少一个细胞类型的刺激作用的至少两个不同的细胞类型经由附加的配体而被分离。
4.如权利要求1-3任一项所述的器具，其中，
-微颗粒通过机械作用保持在悬浮状态；
-从反应区域出来带有微颗粒的体液通过过滤除去微颗粒；和/或
-用于过滤的膜是带有一定直径的透过孔，其允许不被特异性吸附的所有组分通过，但不允许使用过的微颗粒通过；和/或
-用于分离的是孔径为＞1μm并＜1000μm的平坦或中空管膜；和/或
-反应容器用来进一步加工离析的细胞。
5.通过使用如权利要求1所述的器具从体液中分离细胞、生物颗粒和/或分子的方法，其中要被分离的细胞通过确定的表面抗原来表征。
6.如权利要求5所述的分离细胞、生物颗粒和或分子的方法，其中识别表面抗原的成分是天然的或合成来源的配体，特别是其中配体是抗原、肽、受体、甾体、激素、抗体、细胞因子、凝集素、病毒蛋白、或黏附分子。
7.如权利要求5-6任一项所述的方法，其中，
-配体共价或非共价地结合在微颗粒上；和/或
-生物可相容的聚合物被用作固体载体；和/或
-配体优选和琼脂糖偶联；和/或
-存在连续的或不连续的细胞、生物颗粒和/或分子的分离；和/或
-反应容器可逐次与作为单个模块的不同与配体结合的微颗粒以任意量接通；和/或
-为了连续分离，将与配体结合的微颗粒插入反应容器中，用含有细胞、生物颗粒和/或分子的体液流过反应容器；和/或
-用特殊的缓冲液将细胞、生物颗粒和/或分子与微颗粒分离；和/或
-在同一个反应容器中进行细胞的释放，如果需要，进行更多的细胞、生物颗粒和/或分子的释放；和/或
-通过与用于体液分离一样的相同的膜过滤将细胞、生物颗粒和/或分子与微颗粒悬浮液分离；和/或
-所分离的细胞、生物颗粒和/或分子用于分析的目的和/或进一步加工和/或处理的目的而不应用于人。
8.如权利要求1-3中任意一项所述的器具，用来在体外循环中血液的体外处理。
9.如权利要求5或6所述的方法，用来在体外循环中血液的体外处理。
10.如权利要求1-3中任意一项所述的器具，适合用来细胞、生物颗粒和/或分子的清洗、富集或浓度降低，用于诊断或进一步加工。
11.如权利要求5或6所述的方法，适合用来细胞、生物颗粒和/或分子的清洗、富集或浓度降低，用于进一步加工。
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