JP2006523840A - 表面に固定された小胞の多層構造 - Google Patents
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Abstract
Description
−表面に固定された複数の無処置の小胞の多層構造、
−かかる多層構造を生成する方法及び手段、
−生物分析センサー用途におけるかかる多層構造の使用
に関する。
バイオセンサー用途における低シグナルをもたらし、
効率的な分子フィッシング(molecule fishing)用フィルターを生成する部位を過度に少なくし、
これらの問題の両方が、かかる分析化合物に結合することができる表面固定プローブの数を増加させることによって解決し得るという洞察に基づく。
(i)少なくとも1個の小胞付着リンカーに結合するようになされ、少なくとも1個の小胞付着リンカーとの結合に利用可能である少なくとも1個の表面固定リンカー、又は1個以上の小胞付着リンカーを各々が備える直接表面固定小胞の第1の層のどちらかを含む表面を用意し、
(ii)表面固定リンカー又は別の小胞付着リンカーに直接結合するようになされ、表面固定リンカー又は別の小胞付着リンカーとの直接結合に利用可能である少なくとも1個の外側に突出した小胞付着リンカーを各々が含む小胞を用意し、
(iii)表面固定リンカーとの、又は前記構造にすでに固定された小胞付着リンカーとの小胞付着リンカーの直接的結合を促進する条件下で前記小胞の少なくとも1個と前記表面をインキュベートし、その結果
(iv)別の小胞付着リンカー(5)との結合に利用可能である少なくとも1個の構造固定リンカー及び/又は表面固定リンカーをこの段階の後に含む前記構造に小胞及び小胞結合リンカーが固定され、
(v)小胞(2)の所望の量が前記構造に固定されるまで前の段階又は前の2段階を繰り返す
各段階を含む。
−多層構造の形成がモニターされ、かつ/又は
−前記付随生物活性化合物及び/又は分析物間の相互作用が研究される。
用語の定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
実験及び結果
複数の脂質小胞及びタンパク質リポソームは、その後の相補DNA改変脂質小胞間のハイブリッド形成を利用して固体基質上に固定された。調製物は表面プラズモン共鳴(SPR)によって分析された。表面調製物は、金(表面被覆度90ng/cm2(1440RU)、続いてneutravidin(表面被覆度130ng/cm2(2020RU))に吸収されたビオチン化アルブミンに基づき、類似のシステムによる以前の結果と良く一致した(Jung等 1998;Jung等 2000;Svedhem等 2003。次いで、ビオチン化DNA(bio−DNA)は、neutravidin(表面被覆度17ng/cm2(260RU))と結合され、一本鎖DNAのカップリングを与えた。次いで、表面固定DNAに相補的な一本鎖DNAを有する脂質小胞又はタンパク質リポソームが表面に暴露された。複数の層は、表面上の最外層中の小胞にある未反応DNAに相補的である一本鎖DNAを有するリポソーム又はタンパク質リポソームのその後の暴露によって作製された(図3参照)。
実験の詳細
タンパク質及びタンパク質アッセイ:この多層システムのシグナル増強をプローブするために使用される膜タンパク質は、細菌エシェリキア コリ(Escherichia coli)由来のプロトン転移ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(TH)である。(Meuller等 1997)シグナルの増強を検証するために、いくつかの小胞層が1つの小胞層と比較され、タンパク質の1/3がトリプシン処理によってタンパク質の残りから切断され、(Tong等 1991)SPR測定におけるシグナルの低下、例えば、SPRによって感知される領域内の質量の減少がもたらされた。
結果
金表面上のリポソーム多層の固定についてのSPR−結果:多層におけるリポソームの固定化は、図3に示すようにSPRによって測定された。表面プラズモンに伴い、表面からの距離に対するSPR感度も測定するエバネッセント波は、図3に模式的に示されたように、減衰長さ(decay length)が約400nmの指数挙動に従う。表面からの距離の増加に伴うエバネッセント波によって感知される体積の減少を考慮して、測定応答単位(AMRU)を式1によって真の応答単位(ARRU)に変換することができる(Liedberg等 1993)。
ここで、zは(QCM−Dによって評価された(図3の挿入図参照)吸着層の厚さであり、dzはエバネッセント場の減衰長さであり、この場合400nmである。
ここで、Δmは結合質量(coupled mass)であり、Cは1のΔRRUの変化に相当する質量(ng)/c2である。Cは、異なる分子の屈折率を用いてタンパク質に対して0.066ng/cm2、脂質に対して0.059ng/cm2と求められた。(Liedberg等 1993)表面に吸着した脂質質量の計算値を表1に示す。
Claims (62)
- 表面(1)から十分離隔した複数の小胞(2)を含み、前記小胞は、表面固定リンカー(4)と小胞付着リンカー(5)によって生物学的に機能的な表面固定多層構造に直接付着され、前記小胞は、小胞付着リンカーによって別の小胞に場合によっては直接付着されてもよく、前記小胞は、その生物学的機能を有する前記構造をもたらす生物活性化合物(6)を含む、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
- 前記小胞が、小胞付着リンカー(5)によって表面固定リンカー(4)に直接付着され、その結果、少なくとも2個の小胞が各リンカー(4)に付着され、各小胞付着リンカーは、前記リンカー(4)には結合するが、別の小胞付着リンカーには結合しないようになされている、請求項1に記載の構造。
- 前記構造に2個以上の小胞層を与えるように、前記小胞が、
a) 前記表面固定リンカー、及び
b) 小胞付着リンカー
によって前記構造に付着されている、請求項1に記載の構造。 - 前記リンカー(4、5)がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項1から3のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞付着リンカー(5)が、前記リンカー(5)に含まれる疎水性固着部分の少なくとも1個によって前記小胞(2)に付着され、前記リンカー(5)に含まれる官能基によって前記小胞(2)に共有結合する、請求項1又は4のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞(2)が、ポリエチレングリコール、S層(S−layer)タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われ、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項1から5のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞(2)の内部体積(8)が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の構造。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項4から7のいずれか一項に記載の構造。
- 前記表面(1)から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項1から8のいずれか一項に記載の構造。
- 前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項9に記載の構造。
- 前記表面から十分離隔した複数の小胞(2)を含み、前記小胞が、小胞付着リンカーによって表面固定リンカー(4)に沿って直接付着されており、それによって少なくとも2個の小胞が各リンカー(4)に付着されている、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
- 各小胞付着リンカーが、前記表面固定リンカーには結合するが、別の小胞付着リンカーには結合しないようになされている、請求項11に記載の構造。
- 前記表面固定リンカー(4)が、生物学的機能を有する少なくとも1個の非リンカー付着領域を含む、請求項12に記載の構造。
- 前記小胞が、生物学的機能を示す化合物(6)を含む、請求項12又は13のいずれか一項に記載の構造。
- 前記非リンカー付着領域が分析物と特異的に結合可能である、請求項12から14のいずれか一項に記載の構造。
- 前記リンカー(4、5)がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項12から15のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞付着リンカー(5)が、前記リンカー(5)に含まれる疎水性固着部分の少なくとも1個によって前記小胞(2)に付着されており、前記リンカー(5)に含まれる官能基によって前記小胞(2)に共有結合する、請求項12から16のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞(2)が、ポリエチレングリコール、S層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われており、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項12から17のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞(2)の内部体積(8)が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項12から18のいずれか一項に記載の構造。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項16から19のいずれか一項に記載の構造。
- 前記表面(1)から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項12から20のいずれか一項に記載の構造。
- 前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項21に記載の構造。
- 複数の小胞(2)を含み、前記小胞は、表面固定化によって生物学的に機能的な表面固定多層構造に直接付着されており、及び小胞付着リンカー(5)によって別の小胞に直接付着されており、少なくとも前記小胞の選択集団が、その生物学的機能を有する前記構造をもたらす生物活性化合物(6)を含む、生物学的に機能的な表面固定多層構造。
- 小胞の表面固定化が、表面固定リンカー(4)と小胞付着リンカー(5)による前記構造との直接付着を含む、請求項23に記載の構造。
- 小胞の表面固定化が、別の小胞付着リンカーに結合可能な少なくとも1個の小胞付着リンカー(5)を各々が有する直接表面付着用の第1の小胞集団を含む、請求項23に記載の構造。
- 前記リンカー(4、5)がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項23又は24のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞付着リンカー(5)が、前記リンカー(5)に含まれる疎水性固着部分の少なくとも1個によって前記小胞(2)に付着されており、前記リンカー(5)に含まれる官能基によって前記小胞(2)に共有結合している、請求項23から26のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞(2)が、ポリエチレングリコール、S層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われており、又は脂質自体が重合によって連結されている、請求項23から27のいずれか一項に記載の構造。
- 前記小胞(2)の内部体積(8)が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項23から28のいずれか一項に記載の構造。
- 前記オリゴヌクレオチドの前記ハイブリッド形成が実質的に配列特異的である、請求項23から29のいずれか一項に記載の構造。
- 前記表面(1)から前記多層構造が放出されるようになされている、請求項23から30のいずれか一項に記載の構造。
- 前記放出が電位、光、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされるように設計されている、請求項31に記載の構造。
- (i)少なくとも1個の小胞付着リンカー(5)に結合するようになされ、少なくとも1個の小胞付着リンカー(5)との結合に利用可能である少なくとも1個の表面固定リンカー(4)、又は1個以上の小胞付着リンカー(5)を各々が備える直接表面固定小胞の第1の層のどちらかを含む表面(1)を用意する段階と、
(ii)表面固定リンカー(4)又は別の小胞付着リンカー(5)に直接結合するようになされ、表面固定リンカー(4)又は別の小胞付着リンカー(5)との直接結合に利用可能である少なくとも1個の外側に突出した小胞付着リンカー(5)を各々が含む小胞(2)を用意する段階と、
(iii)表面固定リンカーへの、又は表面固定多層構造にすでに固定された小胞付着リンカーへの小胞付着リンカーの直接的結合を促進する条件下で、前記小胞(2)の少なくとも1個を前記表面(1)とともにインキュベートする段階と、その結果、
(iv)別の小胞付着リンカー(5)との結合に利用可能である少なくとも1個の構造固定リンカー及び/又は表面固定リンカーをこの段階の後に含む前記構造に、小胞と小胞に付着されたリンカーとが固定される段階と、
(v)小胞(2)の所望の量が前記構造に固定されるまで前の段階又は前の2段階を繰り返す段階と、
を含む、複数の小胞の表面固定多層構造を生成する方法。 - 前記表面固定リンカー(4)が、小胞付着リンカー(5)の結合用の少なくとも2個の部位を含む、請求項33に記載の方法。
- 各小胞付着リンカー(5)が、前記表面固定リンカー(4)には結合するが、別の小胞付着リンカー(5)には結合しないようになされている、請求項34に記載の方法。
- 前記表面固定リンカー(4)が、小胞付着リンカー(5)の結合用の1個のみの部位を含む、請求項33に記載の方法。
- 各小胞が、少なくとも2個の小胞付着リンカー(5)を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記リンカー(4、5)がオリゴヌクレオチドを含み、別のリンカーへのリンカーの前記結合が前記オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成によって媒介される、請求項33から37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記小胞付着リンカー(5)が、前記リンカーに含まれる疎水性固着部分の少なくとも1個によって前記小胞(2)に付着されており、前記リンカーに含まれる官能基によって前記小胞に共有結合している、請求項33から38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記小胞(2)が、生物学的機能を示す生物活性化合物(6)を含む、請求項33から39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記小胞(2)が、ポリエチレングリコール、S層タンパク質、ペプチド、金属クラスター及びポリマーを含む群から選択される化合物を含む外殻で覆われた、請求項33から40のいずれか一項に記載の方法。
- 前記小胞(2)の内部体積が、イオン、色素、薬物、抗体、酵素及び他のタンパク質を含む群から選択される化合物を含む、請求項33から41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面(1)が、前記構造用結合マトリックスとして働くいくつかの表面固定小胞を含む、請求項33から42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記インキュベーションが、前記オリゴヌクレオチドの配列特異的ハイブリッド形成を促進する条件下で実施される、請求項38、又は請求項38に従属するときには請求項39から43のいずれか一項に記載の方法。
- 小胞(2)から化合物を放出する段階も含む、請求項33から44のいずれか一項に記載の方法。
- 前記放出が、印加された電位浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項45に記載の方法。
- 請求項33から46のいずれか一項に記載の方法と、それに続く前記表面(1)から前記多層構造を放出する段階とを含む、複数の小胞の多層構造を生成する方法。
- 前記放出が、電位、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項47に記載の方法。
- 請求項1から32のいずれか一項に記載の構造のバイオセンサーとしての使用、又は請求項33から48のいずれか一項によって生成される構造のバイオセンサーとしての使用。
- 請求項1から32のいずれか一項に記載の構造のバイオセンサーにおける使用、又は請求項33から48のいずれか一項によって生成される構造のバイオセンサーにおける使用。
- 前記構造の形成が前記バイオセンサーによってモニターされる、請求項50に記載の使用。
- 前記バイオセンサーが光学バイオセンサーであり、前記構造が前記光学バイオセンサーの信号を増大させるために使用される、請求項50又は51のいずれか一項に記載の使用。
- 前記バイオセンサーが機械的バイオセンサーであり、前記構造が前記機械的バイオセンサーの信号を増大させるために使用される、請求項50又は51のいずれか一項に記載の使用。
- 化合物の複雑な溶液から1種類若しくは数種類の化合物(7)を特異的に除去又は抽出するための、請求項1から32のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項33から48のいずれか一項によって生成される構造の使用。
- 小胞(2)からの化合物の放出を感知するための、請求項1から32のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項33から48のいずれか一項によって生成される構造の使用。
- 前記放出が、印加された電位、浸透応力、又は前記放出を刺激する化合物とのインキュベーションによって引き起こされる、請求項55に記載の使用。
- 前記放出が、特異的又は局所的薬物送達に使用される、請求項55又は56のいずれか一項に記載の使用。
- 前記放出がバイオセンサーとして使用される、請求項55又は56のいずれか一項に記載の使用。
- いくつかの化合物の同時分析のための、請求項49から58のいずれか一項に記載の使用。
- 画像処理のための、請求項1から32のいずれか一項に記載の構造の使用、又は請求項33から48のいずれか一項によって生成される構造の使用。
- リンカー(4、5)、小胞(2)、前記リンカーを前記小胞に付着させる化合物、及び前記リンカー(4、5)を表面(1)に固定する化合物を含む、請求項1から60のいずれか一項に記載の複数の小胞の表面固定多層構造の生成に適切な化学組成物を含む部品のキット。
- 生物活性化合物を前記小胞(2)に付着させる化合物の少なくとも1個及び生物活性化合物(6)も含む、請求項61に記載の部品のキット。
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