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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Licht-reaktive Zusammensetzung
mit solchen Eigenschaften, dass Zellen an der Zusammensetzung anhaften,
jedoch von der Zusammensetzung nach Lichtbestrahlung der Zusammensetzung
freigesetzt werden, betrifft eine Zellkultiviervorrichtung, die
die Licht-reaktive Zusammensetzung umfasst, betrifft ein Verfahren
zum Zellkultivieren/Sortieren unter Verwendung der Vorrichtung und
ein Gerät
zur Verwendung mit der Vorrichtung.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Bis
jetzt waren verschiedene Zellsortierungstechnologien bekannt, wie
beispielsweise Durchflusszytometriesysteme (FACS) und magnetische Zellauftrennungssysteme
(MACS), die in der Praxis Anwendung fanden. Während solche Systeme in erster
Linie zum Sortieren/Sammeln suspendierter Zellen verwendet werden,
wie beispielsweise von Leukozyten oder Lymphozyten, können diese
ebenfalls beim Sortieren/Sammeln von Verankerungs-abhängigen Zellen
verwendet werden, wenn die Zellen zunächst aus dem Substrat, auf
dem sie gezüchtet
werden, freigesetzt werden.
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Verankerungs-abhängige Zellen,
die an einem Substrat anhaften bzw. an dieses gebunden sind, können einfach
durch Enzymbehandlung unter Verwendung von Trypsin oder dergleichen
freigesetzt werden. Jedoch können
Membranproteine, die für eine
einwandfreie Zellfunktion notwendig sind, unerwünschterweise während der
Enzymbehandlung zusammen mit Zelladhäsionsmolekülen abgebaut werden, was eine
verminderte Verwendbarkeit der gesammelten Zellen zur Folge hat.
Zusätzlich
kann die Verwendung von Durchflusszytometriesystemen eine ernsthafte
Schädigung
für Zellen
während
des Prozesses der physikalischen Abtrennung der Zellen mit einer
Ultraschalldüse
zur Folge haben.
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Nicholau
et al. (Biosensors & Bioelectronics, Band
11, Nr. 12, Seiten 1237 - 1252 (1996)) offenbaren die Kontrolle
einer Nervenzellanlagerung durch funktionelle Manipulierung einer
Diazo-naphthochinon/Novolakphotoresist-Oberfläche.
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Nicholau
et al. (Biosensors & Bioelectronics, Band
14, Nr. 3, Seiten 317 – 325
(1999)) offenbaren die Strukturierung von Nerven- und Glia-Zellen
auf Licht-unterstützten
funktionalisierten Photoresisten.
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Von
weiteren Technologien zum Freisetzen von kultivierten Verankerungs-abhängigen Zellen wurden
berichtet. Eine ist eine Technik der Freisetzung/Sammlung kultivierter
Verankerungsabhängiger
Zellen in Form eines Blattes bzw. einer Schicht, während die
organspezifischen Funktionen der Zellen aufrechterhalten werden,
indem Zelladhäsionssubstanzen
und Membranproteine nicht abgebaut werden (Kikuchi et al., J. Biomater.
Sci., Polym. Edn., 9, 1331 (1998)). Eine weitere Technik ist eine
Strukturierung eines adhäsiven
Substrats auf einem Kulturgefäß unter
Verwendung eines Mikrofabrikationsprozesses, wie beispielsweise
eine Elektronenlithographie und danach das Einbringen von bioaktiven Substanzen
oder künstlicher
Verbindungen in das adhäsive
Substrat, um die Bedingungen der Zelladhäsion und der Einflüsse der
biologischen Aktivitäten zu
analysieren (Ito, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 45, 727 (2000)).
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Es
existieren bei diesen Techniken jedoch einige Probleme. Beispielsweise
wird bei der Technik der Freisetzung/Sammlung kultivierter Verankerungs-abhängiger Zellen
in Form eines Blattes die Adhäsivität der Zellen
an das Substrat durch Verändern
der Temperatur kontrolliert bzw. gesteuert. Dies ist ebenfalls der
Fall, wenn die Zellen auf dem in
EP 0 382 214 A offenbarten Bettmaterial kultiviert
werden. Diese Technik ist jedoch insofern problematisch, als, wenn
eine spezifische Zelle oder Zellpopulation (Kolonie) zur Sammlung
aus verschiedenen Arten von Zellen oder Zellpopulationen in einem
Kulturgefäß ausgewählt wird,
es extrem schwierig ist, das Anhaften/Ablösen spezifisch ausgewählter Zellen
oder Zellpopulationen und nicht von solchen, die sich nahe gelegen
in der Kulturvorrichtung befinden, zu kontrollieren.
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Bezüglich der
Technik der Strukturierung bzw. Mustergebung eines haftenden Substrates
auf einer Kulturvorrichtung werden, während von einigen Veränderungen
im Haftvermögen
des haftenden Substrates mit Zellen berichtet wurde, solche Veränderungen
durch Einbringen der bioaktiven Substanzen in das Substrat verursacht,
und das Haftvermögen
von Zellen an das Substrat kann nicht flexibel ohne solche Substanzen
kontrolliert werden.
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Aus
diesen Gründen
wurde in der Technologie des Sortierens/Sammelns kultivierter Verankerungs-abhängiger Zellen
eine genaue Auftrennung von Zellen, während die organspezifischen
Funktionen der aufgetrennten Zellen aufrecht erhalten wurden, nicht
erreicht.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Im
Hinblick auf die obigen Umstände
ist es deswegen eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung
und ein Verfahren zum Kultivieren und Sortieren gesammelter Zellen
bereitzustellen, insbesondere von Verankerungs-abhängigen Zellen, durch
einen einfachen Vorgang, während
die jeweiligen organspezifischen Funktionen der Zellen ohne eine
Schädigung
der Zellen aufrecht erhalten werden.
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Als
Folge einer kontinuierlichen Forschung bezüglich des oben genannten Gegenstandes
haben die Erfinder eine Licht-reaktive Zusammensetzung identifiziert,
die die Eigenschaft eines unterschiedlichen Haftvermögens nach
Lichtbestrahlung aufweist, die als haftende Oberfläche für das Wachstum
von Verankerungs-abhängigen
Zellen in einer Kulturvorrichtung verwendet werden können und
die dazu verwendet werden kann, das Anhaften/Ablösen von kultivierten Zellen
oder Zellpopulationen von der Kulturvorrichtung einfach zu regulieren,
während
die jeweiligen organspezifischen Funktionen der Zellen aufrecht
erhalten werden.
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Auf
Grundlage dieses Wissens haben die Erfinder letztendlich die vorliegende
Erfindung abgeschlossen.
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Insbesondere
wird gemäß eines
ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung eine Zellkultivierungsvorrichtung
bzw. Zellkultiviervorrichtung bereitgestellt, wobei diese Vorrichtung
eine Kulturschale mit einer Licht-reaktiven Zusammensetzung darin aufweist,
wobei die Lichtreaktive Zusammensetzung ein Licht-reaktives Material
umfasst, das die Eigenschaft eines unterschiedlichen Haftvermögens für eine Zelle
auf Grundlage der Menge der Lichtbestrahlung aufweist, der die Licht-reaktive
Zusammensetzung ausgesetzt wird, wobei die Eigenschaft eines unterschiedlichen
Haftvermögens
dazu in der Lage ist, das Anhaften bzw. die Anlagerung und das Ablösen einer
Zelle, die auf dieser Vorrichtung vorliegt, zu regulieren.
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In
der im ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung dargelegten Licht-reaktiven
Zusammensetzung können
die Lichtbestrahlungs-induzierten Eigenschaften der Zusammensetzung
in Abwe senheit einer Lichtbestrahlung reversibel sein, und die Fähigkeit
der Zusammensetzung, einen Kreislauf zwischen den Eigenschaften,
die durch Lichtbestrahlung induziert wurden und zu einem nicht-induzierten
Zustand zurückzukehren,
zu bilden, können
uneingeschränkt
sein.
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Die
Licht-reaktive Zusammensetzung ist insofern extrem flexibel, als
sie mehrere unterschiedliche Lichtbestrahlungs-induzierte Eigenschaften
aufweisen kann. Beispielsweise kann das Haftvermögen der Licht-reaktiven Zusammensetzung
unter Lichtbestrahlung abnehmen und kann in Abwesenheit von Licht
oder bei einer Abnahme der Menge oder Intensität des Lichtes wiedererlangt
werden. Alternativ kann das Haftvermögen der Licht-reaktiven Zusammensetzung
unter Lichtbestrahlung zunehmen und kann in Abwesenheit von Licht
abnehmen oder bei einer Abnahme der Menge oder Intensität des Lichtes. Das
Haftvermögen
der Licht-reaktiven Zusammensetzung kann ebenfalls erhöht oder
gesenkt werden, wenn es einer speziellen Wellenlänge (oder einem Wellenlängenbereich)
von Licht ausgesetzt wird, und kann in seinen ursprünglichen
Zustand in Abwesenheit einer speziellen Wellenlänge zurückkehren.
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Das
Haftvermögen
der Licht-reaktiven Zusammensetzung, die durch Exposition der Lichtreaktiven
Zusammensetzung gegenüber
einer speziellen Lichtwellenlänge
verändert
wird, kann in der Dunkelheit stabil gehalten werden, bis eine weitere
Exposition gegenüber
derselben Wellenlänge
von Licht die Veränderung
erhöht
oder eine andere Wellenlänge von
Licht die Veränderung
umkehrt.
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Weiterhin
kann die Veränderung
in der Eigenschaft eines differentiellen Haftvermögens zumindest
eine Reduktion oder Zunahme der Adhäsivität bzw. des Haftvermögens an
Zellen einschließen.
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Die
Zellkultiviervorrichtung kann als Kammer ausgebildet sein.
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Gemäß eines
zweiten Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Züchten und
Sammeln einer Zelle bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte
des Züchtens
einer Zelle in der Zellkultiviervorrichtung des ersten Aspektes
der vorliegenden Erfindung, das Bestrahlen der Licht-reaktiven Zusammensetzung
der Zellkulturvorrichtung mit Licht zur Freisetzung der an der Licht-reaktiven
Zusammensetzung anhaftenden Zelle; und das Sammeln der freigesetzten
Zelle umfasst. In einem verwandten Aspekt kann die Zellkultiviervorrichtung dazu
verwendet werden, die Zelle einfach zu züchten, ohne die Zelle von der
Vorrichtung zu sammeln.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zum Sammeln einer Zelle aus einer Zellkultiviervorrichtung
des ersten Aspektes der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei
das Verfahren die Schritte umfasst, die Licht-reaktive Zusammensetzung
der Zellkultiviervorrichtung mit Licht zu bestrahlen, um eine an
der Licht-reaktiven Zusammensetzung anhaftende Zelle freizusetzen;
und das Sammeln der freigesetzten Zelle.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird ein Verfahren zum selektiven Sammeln einer Zelle
aus einer Zellkultiviervorrichtung des ersten Aspektes der vorliegenden
Erfindung bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
umfasst: Bestrahlen der Licht-reaktiven Zusammensetzung der Zellkultiviervorrichtung
mit Licht, wobei das Licht auf einen ausgewählten Bereich der Licht-reaktiven
Zusammensetzung gestrahlt wird, um eine an der ausgewählten Region
anhaftende Zelle freizusetzen; und das sortierende Sammeln der freigesetzten
Zelle.
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Im
oben dargelegten Verfahren kann der Bestrahlungsschritt weiterhin
das physische bzw. physikalische Stimulieren der Zellkultiviervorrichtung und/oder
das Zuführen
eines Eluats in die Zellkultiviervorrichtung umfassen. Darüber hinaus
ist in jedem dieser Aspekte der vorliegenden Erfindung vorzugsweise
die Zelle eine Verankerungs-abhängige Zelle.
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Gemäß eines
dritten Aspektes der vorliegenden Erfindung wird eine Zellkultivier/Sortiervorrichtung
bereit gestellt, die eine Zellkultiviervorrichtung gemäß des ersten
Aspektes der vorliegenden Erfindung, ein Mittel zum Zuführen einer
Kulturlösung
in die Vorrichtung, ein Mittel zum selektiven Bestrahlen einer vorgegebenen
Position auf der Licht-reaktiven Zusammensetzung der Vorrichtung
mit Licht, ein Mittel zum Nachweisen der jeweiligen Positionen der Zellen
auf die Licht-reaktive Zusammensetzung und ein Mittel zum Sortieren
der Zellen, die aus der Licht-reaktiven Zusammensetzung freigesetzt
wurde, durch Lichtbestrahlung, bereitstellt.
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Die
Vorrichtung kann weiterhin ein Mittel zum physikalischen Stimulieren
der Zellkultiviervorrichtung und/oder ein Mittel zum Zuführen eines
Eluats in die Zellkulturvorrichtung einschließen.
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Gemäß eines
vierten Aspektes der vorliegenden Erfindung wird ein Licht-reaktives
Material bereitgestellt, wobei das Material ein wärmeempfindliches
Polymer mit sowohl hydrophilen als auch hydrophoben Eigenschaften
umfasst, die sich in Reaktion auf eine Temperaturveränderung
verändern,
und wobei das Polymer durch einen photochromen Farbstoff modifiziert
wird, wobei das Licht-reaktive Material ein unterschiedliches Haftvermögen bzw.
Klebekraft für
eine Zelle auf Grundlage der Menge einer Lichtbestrahlung zeigt,
gegenüber
der das Licht-reaktive Material exponiert wird, sodass die Eigenschaft
eines unterschiedlichen Haftvermögens
dazu in der Lage ist, das Anhaften und Ablösen einer Zelle, die auf einer
Zellkultiviervorrichtung vorliegt, zu regulieren.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 ist
ein Flussdiagramm, das ein Zellkultivier-/Sortierverfahren der vorliegenden
Erfindung zeigt.
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2 ist
ein schematisches Flussdiagramm, das ein Zellsortierverfahren der
vorliegenden Erfindung zeigt, bei dem unterschiedliche Arten von
Zellen sortierend gesammelt werden.
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3 ist
eine schematische Darstellung, die eine Modifikation der Zellkultivier/Sortiervorrichtung gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt.
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4 ist
ein Blockdiagramm, das eine Zellkultivier-/Sortiervorrichtung gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zeigt.
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5 ist
ein erklärendes
Blockdiagramm, das einen selektiven Zellfreisetzungsprozess in einer Zellkultiviervorrichtung
des Zellkultivier-/Sortiergerätes
in 4 zeigt.
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BESCHREIBUNG
DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
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Der
Begriff „Licht-reaktive
Zusammensetzung" bedeutet
hierin eine Zusammensetzung mit zumindest einer Oberfläche, die
unter speziellen Bedingungen einer Lichtbestrahlung an Zellen anhaftet und
die als Verankerungsfläche
für eine
Verankerungs-abhängige
Zelle oder eine Oberfläche,
an die eine Zelle anhaften kann, dienen kann. In der vorliegenden
Erfindung ist die Lichtreaktive Zusammensetzung aus einem Licht-reaktiven
Material hergestellt, das zumindest die Eigenschaft eines unterschiedlichen
Haftvermögens
an Zellen in Reaktion auf Veränderungen
der Lichtbestrahlung aufweist, einschließlich der Veränderung
der Zeitdauer, Intensität
und Wellenlänge
der Bestrahlung. Beispielsweise kann das Licht-reaktive Material
zur Ausbildung der Licht-reaktiven Zusammensetzung (1) ein Material
sein, das zur Umwandlung von Licht energie in Wärme zur Bereitstellung einer
lokal erhöhten
Temperatur in der Lage ist, die wiederum Veränderungen in den Oberflächeneigenschaften
der Licht-reaktiven Zusammensetzung verursacht, (2) ein Material
sein, das eine derartige Zusammensetzung aufweist, das der Oxidationszustand
der Oberfläche
der Licht-reaktiven Zusammensetzung sich in Reaktion auf eine Lichtbestrahlung
verändern
kann, oder (3) ein Material sein, das eine derartige Zusammensetzung
aufweist, dass die Struktur des Materials in Reaktion auf eine Lichtbestrahlung
isomerisiert werden kann, was wiederum zu Veränderungen in der Polarisierbarkeit und/oder
den hydrophilen/hydrophoben Eigenschaften der Licht-reaktiven Zusammensetzung
führt.
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Vorzugsweise
sind die Lichtbestrahlungs-induzierten Eigenschaften der Licht-reaktiven
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in Abwesenheit einer
Lichtbestrahlung umkehrbar, und das Vermögen der Licht-reaktiven Zusammensetzung,
zwischen den durch Lichtbestrahlung induzierten Eigenschaften und
dem Umkehren zu einem nicht-induzierten Zustand, hin und her zu
schwenken, ist nicht eingeschränkt.
Diese Zyklisierungsfähigkeit
wird hierin als „unterschiedliches
Haftvermögen" bezeichnet.
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Es
sollte klar sein, dass die Licht-reaktive Zusammensetzung auch Zusammensetzungen
einschließt,
(a) deren Haftvermögen
sich in Reaktion auf Veränderungen
der Zeitdauer, Intensität
oder Lichtwellenlänge
erhöht,
(b) deren Haftvemögen
in Reaktion auf Veränderungen
der Zeitdauer, Intensität
oder Lichtwellenlänge
abnimmt, und (c) dass die Veränderungen
des Haftvermögens
temporär,
reversibel oder permanent sein können.
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Insbesondere
kann das obige Licht-reaktive Material (1) ein Licht-reaktives Material
umfassen, das durch Binden eines Farbstoffes oder Pigmentmoleküls, das
zur Umwandlung von Licht in Wärme
geeignet ist (ein Farbstoff oder Pigment weist im Allgemeinen die
Eigenschaft auf, Licht in Wärme
umzuwandeln), an ein wärmeempfindliches
Polymer hergestellt werden kann, das hydrophile/hydrophobe Eigenschaften
aufweist, die sich in Reaktion auf eine Temperaturveränderung ändern, wie
beispielsweise Poly-(N-isopropylacrylamid) und Polyvinylether. In diesem
Fall kann der Farbstoff oder das Pigmentmolekül und das wärmeempfindliche Polymer auf
der Substratoberfläche
einer Kultiviervorrichtung polymerisiert werden.
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Vorzugsweise
ist der Farbstoff oder das Pigment ein Material, das Licht absorbiert
und organische Farbstoffe, Mineralpigmente und Kohlenstoffe enthält. Bevorzugte
Beispiele schließen
Indigo, Chinacridone, Porphyrine, Fe2O3, HgS, CoO'nAl2O3 und Kohlenschwarz bzw. Ruß ein.
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Vorzugsweise
ist das wärmeempfindliche Polymer
bzw. thermoempfindliche Polymer, das hydrophile/hydrophobe Eigenschaften
aufweist, eines des folgenden: ein Homopolymer oder Copolymer, zusammengesetzt
aus N-Isopropylacrylamid, Vinylmethylether, Dimethylaminoethylmethacrylat,
Oxyethylenvinylether, Natriumstyrolsulfonat und/oder Vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid.
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Der
Farbstoff oder das Pigment und das thermoempfindliche Polymer können zusammen
durch kovalente Bindung, Wasserstoffbrückenbindung, Ionenbindung und/oder
hydrophobe Bindung gebunden werden.
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Vorzugsweise
wird die Flächendichte
des Farbstoffs oder Pigments im Licht-reaktiven Material von ungefähr 10-9 mol/cm2 bis ungefähr 10-3 mol/cm2, besonders
bevorzugt von ungefähr
10-8 mol/cm2 bis ungefähr 10-4 mol/cm2, am meisten
bevorzugt von ungefähr
10-7 mol/cm2 bis
ungefähr
10-5 mol/cm2 eingestellt
und die optische Dichte des Farbstoffs oder Pigments im effektiven
Wellenlängenbereich
ist von ungefähr
0,01 bis ungefähr
4, besonders bevorzugt von ungefähr
0.05 bis ungefähr
2, am meisten bevorzugt von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1.
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Die
Polymerisation des Farbstoffes oder Pigmentmoleküls des thermoempfindlichen
Polymers an die Substratoberfläche
einer Kultiviervorrichtung kann durch irgendein geeignetes Verfahren
durchgeführt
werden, einschließlich
einer Oberflächenpfropfpolymerisation,
initiiert durch Plasmabestrahlung oder Elektronenbombardement und
eine Ionenkomplexbildung.
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Vorzugsweise
ist die Dicke der Licht-reaktiven Zusammensetzung, die den Farbstoff
oder das Pigmentmolekül
und das thermoempfindliche Polymer auf der Kulturschale umfasst,
von ungefähr 0,001 μm bis ungefähr 5 μm, bevorzugter
von ungefähr
0,005 μm
bis ungefähr
1 μm, am
meisten bevorzugt von ungefähr
0,01 μm
bis ungefähr
0,1 μm.
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Das
obige Licht-reaktive Material (2) kann ein Photokatalysator bzw.
Lichtkatalysatormaterial, wie beispielsweise Titanoxid, sein. Das
Lichtkatalysatormaterial kann direkt als Licht-reaktive Zusammensetzung
zur Ausbildung einer Lichtkatalysatorschicht auf der Substratoberfläche einer
Kulturschale verwendet werden, durch ein Sinterverfahren oder dergleichen.
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Zusätzlich zu
Titanoxid kann das Photokatalysatormaterial ebenfalls ein photokatalytisches
Metalloxid, wie beispielsweise VO2, WO3 und MoO3 sein.
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Vorzugsweise
ist die Dicke der Licht-reaktiven Zusammensetzung, die das Photokatalysatormaterial
auf der Kulturschale umfasst, von ungefähr 0,001 μm bis ungefähr 5 μm, besonders bevorzugt von ungefähr 0,005 μm bis ungefähr 1 μm, am meisten
bevorzugt von ungefähr
0,01 μm
bis ungefähr
0,1 μm.
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Das
Licht-reaktive Material (3) kann folgendes einschließen: Ein
Licht-reaktives Material, das direkt als Licht-reaktive Zusammensetzung
verwendet wird, wie beispielsweise das Derivat einer organischen
Verbindung, beispielsweise Azobenzol, Diarylethen, Spiropyran, Spirooxazin,
Fulgid oder Leuko-Chromophor; ein Monomer, hergestellt durch Binden
der Licht-reaktiven Moleküle
selbst; und ein Polymer, hergestellt durch Polymerisieren der Monomere.
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Wenn
ein Licht-reaktives Molekül
selbst direkt als Licht-reaktive Zusammensetzung verwendet wird,
kann sie chemisch an die Substratoberfläche einer Kulturschale durch
Verwendung eines Silan-Kopplungsmittels oder dergleichen gebunden werden,
oder kann physikalisch hieran durch hydrophobe Wechselwirkung gebunden
werden. Wenn das Monomer verwendet wird, kann es auf der Substratoberfläche einer
Kulturschale polymerisiert werden. Wenn das Polymer verwendet wird,
kann es in einem geeigneten Lösungsmittel
gelöst
werden und die erzielte Lösung
kann auf die Substratoberfläche einer
Kulturschale aufgebracht werden.
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Zusätzlich zum
Licht-reaktiven Molekül
der Licht-reaktiven Zusammensetzung können weitere Bestandteile in
die Licht-reaktive Zusammensetzung eingebaut werden, wie beispielsweise
Homopolymere oder Copolymere, die aus N-Isopropylacrylamid, Vinylmethylether,
Dimethylaminoethylmethacrylat, Oxyethylenvinylether, Natriumstyrolsulfonat und/oder
Vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid zusammengesetzt sind.
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Die
Einbringung der Licht-reaktiven Zusammensetzung, die das Licht-reaktive
Molekül
enthält, in
die Substratoberfläche
einer Kulturschale kann durch Spin-Coating bzw. Rotationsbeschichtung, physikalische
Adsorption, Silan-Kopplung und das Gold-Thiol-Verfahren durchgeführt werden.
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Die
Polymerisation der Licht-reaktiven Zusammensetzung, die das Licht-reaktive
Molekül
umfasst, an die Substratoberfläche
einer Kulturschale kann durch Oberflächenpfropf-Polymerisation durchgeführt werden,
initiiert durch Plasmabestrahlung oder Elektronenbombardierung oder
ein Ionenkomplex-Verfahren.
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Geeignete
Lösungsmittel
zum Lösen
des Polymers schließen
Wasser, Alkohole, Ester, aromatische Lösungsmittel, Ketone, Ether
(einschließlich
cyclischer Ether, wie beispielsweise THF und Dioxan), Haloparaffine
und DMSO ein.
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Vorzugsweise
beträgt
die Dicke der Licht-reaktiven Zusammensetzung, die das Licht-reaktive Molekül umfasst,
auf der Kulturschale von ungefähr 0,001 μm bis ungefähr 5 μm, besonders
bevorzugt von ungefähr
0,005 μm
bis ungefähr
1 μm, am
meisten bevorzugt von ungefähr
0,01 μm
bis ungefähr
0,1 μm.
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Die
Licht-reaktive Zusammensetzung, die aus ein oder mehreren der obigen
Licht-reaktiven Materialien hergestellt wurde, weist die Eigenschaft der
Freisetzung einer hieran haftenden Zelle in Reaktion auf eine Lichtbestrahlung
auf. Sogar dann, wenn die Zelle nicht vollständig durch die Lichtbestrahlung freigesetzt
wird, wird das Haftvermögen
der Zusammensetzung ausreichend reduziert und die Zelle kann durch
Zusatz eines Eluats, wie beispielsweise einer verdünnten Lösung von
Protease oder einer Salzlösung,
leicht freigesetzt werden oder durch Anwenden einer physikalischen
Stimulation, wie beispielsweise von Vibration. In der vorliegenden
Erfindung muss keine Menge oder eine unwirksame Menge eines Enzyms,
wie beispielsweise Trypsin, verwendet werden, um die Zellen von
der Oberfläche der
Zellkultiviervorrichtung freizusetzen bzw. abzulösen. Dieses Merkmal stellt
einen signifikanten Vorteil insofern bereit, als es der Zelle ermöglicht wird,
freigesetzt zu werden während
die Integrität
der Zelladhäsionsmoleküle, wie
beispielsweise ECM (extrazelluläre
Matrix) und von Membranproteinen, die eine bedeutende Rolle beim
Exprimieren und bei der Aufrechterhaltung von Zellfunktionen spielen,
adäquat aufrecht
zu erhalten.
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Die
Licht-reaktive Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann nur
eines der Lichtreaktiven Materialien (1), (2) und (3), oben diskutiert,
umfassen. Die Licht-reaktive Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
kann optional irgendeine Kombination aus ein oder mehreren jeder
der drei Typen umfassen.
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Die
Zellkultiviervorrichtung der vorliegenden Erfindung umfasst eine
Kulturschale, wobei die Licht-reaktive Zusammensetzung auf der Substratoberfläche der
Kulturschale ausgebildet wird, die als Zellaufnahmeraum dient.
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Die
Kulturschale kann aus Materialien konstruiert werden, die üblicherweise
zur Herstellung von Kulturschalen verwendet werden, einschließlich Glas,
Polystyrol, Polyvinylchlorid, Polymethylpenten, Polyethylenterephthalat,
Polyethylen und Polypropylen.
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Die
Zellkulturvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann Bestandteil
einer Zellkultivierkammer sein. Die Zellkultivierkammer ist eine
Kammer, die dazu verwendet wird, Temperatur, Feuchtigkeit und Konzentration
spezieller Gase, wie beispielsweise O2 und
CO2, aufrecht zu erhalten, denen die Zellen
in den Kulturschalen ausgesetzt werden. Die Zellkultivierkammer
kann ebenso andere Bestandteile umfassen, wie beispielsweise ein
System zur Zuführung von
Zellkulturmedien zur Zellkultiviervorrichtung, ein System zum Entfernen
von Zellkulturmedien aus der Zellkulturvorrichtung, und ein System
zum Identifizieren der Position einer speziellen Zelle oder Zellpopulation
in der Zellkultiviervorrichtung.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Licht-reaktiven Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung,
die das obige Licht-reaktive Material (1) umfasst, umfasst das Licht-reaktive
Material (1) ein wärmeempfindliches
Copolymer, das 20% Natriumstyrolsulfat, 20% Vinylbenzyltrimethylammoniumchlorid
und 60% N,N'-Methylen-bis-acrylamid
umfasst, wobei die Dicke der Licht-reaktiven Zusammensetzungen ungefähr 0,1 μm umfasst,
aufgebracht auf eine dünne
Schicht aus Ruß,
und in einer bevorzugten Ausführungsform
der Zellkultiviervorrichtung wird die so erzeugte Licht-reaktive
Zusammensetzung auf die Substratoberfläche einer Kulturschale aufgebracht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Licht-reaktiven Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung,
die das obige Licht-reaktive Material (2) umfasst, umfasst das Licht-reaktive
Material (2) Titanoxid als Photokatalysatormaterial, und in einer
bevorzugten Ausführungsform
der Zellkultiviervorrichtung wird die Licht-reaktive Zusammensetzung
auf die Substratoberfläche
einer Kulturschale aufgebracht, wobei die Dicke der Licht-reaktiven
Zusammensetzungen ungefähr
1 μm beträgt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Licht-reaktiven Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung,
die das obige Licht-reaktive Material (3) umfasst, umfasst das Licht-reaktive
Material (3) ein Licht-reaktives Copolymer, das 5% einer Vinylverbindung
umfasst, die Nitrospiropyran und 95% N-Isopropylacrylamid umfasst,
und in einer bevorzugten Ausführungsform
der Zellkultiviervorrichtung wird die Licht-reaktive Zusammensetzung
auf die Substratoberfläche
einer Kulturschale aufgebracht, wobei die Dicke der Licht-reaktiven
Zusammensetzungen ungefähr
0,1 μm beträgt.
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Unter
Bezugnahme auf die Zeichnungen wird eine Zellkultivier-/Sortiervorrichtung
gemäß der obigen
Zellkultiviervorrichtung nunmehr beschrieben werden.
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1 ist
ein schematisches Flussdiagramm, das eine Zellkultivier-/Sortiervorrichtung
der vorliegenden Erfindung zeigt.
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Eine
Zellkultivierlösung
wird in eine Zellkultiviervorrichtung der vorliegenden Erfindung
aufgenommen, um eine Probe, die beispielsweise eine Vielzahl von
Zelltypen (1, 2) enthält,
zu verteilen/kultivieren/proliferieren. Die Zellen haften an der Licht-reaktiven
Zusammensetzung, die das Licht-reaktive Material in der Zellkultiviervorrichtung
umfasst an und proliferieren unter Verwendung der Licht-reaktiven
Zusammensetzung als Verankerung. Ein polyklonaler oder monoklonaler
Antikörper,
der ein Epitop spezifisch erkennt und bindet, exprimiert von einer
der Vielzahl von Zelltypen, wird beispielsweise mit einem fluoreszierenden
Farbstoff markiert und wird der Zellkulturvorrichtung zugesetzt
und ermöglicht
an die Zellen zu binden. In diesem Prozess kann ein Typ eines Antikörpers verwendet
werden, der einem Zelltyp entspricht. Alternativ kann eine Vielzahl von
Antikörpern
verwendet werden, die jeweiligen Zelltypen entsprechen und die Antikörper können mit unterschiedlichen
fluoreszierenden Farbstoffen markiert werden. Der zugesetzte Antikörper macht
es möglich,
eine Positionsinformation der Zelle oder Zellkolonie, die sortiert
werden soll (3), nachzuweisen. Danach wird die Zelle oder Zellkolonie,
die in der Zellkultiviervorrichtung sortiert werden soll, durch eine
Farb-CCD-Kamera nachgewiesen, und die nachgewiesene Positionsinformation
wird auf einen Personal Computer (PC) (4) übertragen. Auf Grundlage der
Positionsinformationen wird Licht auf die Position der Zielzelle
oder der Zielzellkolonie gestrahlt. Die Lichtbestrahlung verursacht
eine Veränderung der
Hafteigenschaften der Licht-reaktiven Zusammensetzung oder eine
Reduktion des Haftvermögens
der Licht-reaktiven Zusammensetzung, wo die Zelle oder Zellkolonie
sich befindet. Somit kann die Zielzelle oder Zielzellkolonie selektiv
von der Oberfläche
der Zellkultivierungsvorrichtung freigesetzt und sortierend gesammelt
werden (5).
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2 ist
ein Flussdiagramm, das ein Zellsortierverfahren der vorliegenden
Erfindung zeigt, bei dem eine Vielzahl von Zelltypen sortierend
gesammelt wird. Zum sortierenden Sammeln einer Vielzahl von Zelltypen
werden eine Vielzahl unterschiedlich markierter Antikörper verwendet, beispielsweise
jeweils mit einem unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoff,
die jeweils einem jeweiligen Zelltyp entsprechen. Jeweils unterschiedliche
Antikörper
erkennen speziell und binden an ein Epitop, das für eine der
Vielzahl von Zelltypen (1) einzigartig ist. Die Positionsinformation
jeder der Zelltypen wird auf Grundlage von Unterschieden in der
Fluoreszenz der fluoreszierenden Farbstoffe gewonnen und danach
wird Licht lokal auf die Position der Zelle, die eine spezielle
Fluoreszenz erzeugt, aufgestrahlt, um diesen einen Zelltyp oder
diese eine Zellkolonie, der/die sich an dieser Position befindet,
freizusetzen und danach wird die freigesetzte Zelle oder Zellkolonie
gesammelt (2). Danach wird Licht auf eine andere Position gestrahlt,
wo sich ein zweiter Typ von Zelle oder Zellkolonie, der anschließend gesammelt
werden soll, befindet, wodurch die zweite Zelle oder Zellkolonie freigesetzt
wird, die dann gesammelt wird (3). Das obige Verfahren kann wiederholt
werden, um die Zellen für
jede der Vielzahl von Zelltypen sortierend zu sammeln.
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Während eine
Vielzahl von Zelltypen jeweils in der obigen Beschreibung sortiert
wird, ist die vorliegende Erfindung nicht auf diesen Prozess beschränkt. Beispielsweise
kann Licht über
die Gesamtoberfläche
der Zellkultivierungsvorrichtung gestrahlt werden, um alle Zellen
freizusetzen, die an der Licht-reaktiven Zusammensetzung anhaften
und die Zellen werden dann gesammelt. Dieses Verfahren ist insbesondere
dann nützlich,
wenn eine große
Menge einer Art von Zellen kultiviert und gesammelt werden soll.
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In
der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Fluoreszenzmarkierungsverfahren
verwendet, ebenso wie das obige Verfahren zur Verwendung eines fluoreszierenden
Farbstoffes. Beispielsweise kann ein Polynukleotid, das ein Enzym
kodiert, das ein Leuchtsystem darstellt, wie beispielsweise Luziferase,
in eine Zelle eingebracht werden. Weiterhin kann zum Sortieren von
Zellen mit unterschiedlichen Morphologien eine Zielzelle sortierend
durch Lichtbestrahlung unter mikroskopischer Beobachtung gesammelt
werden, ohne spezielle Fluoreszenzmarkierung.
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Unter
Bezugnahme auf 3 wird eine Modifikation des
vorher erwähnten
Kultivier/Sortierverfahrens unten beschrieben werden.
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In 3 zeigt
ein Flussdiagramm (I) ein Verfahren zum Kultivieren einer reinen
Kultur nur eines speziellen Zelltyps.
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Um
eine reine Kultur nur eines speziellen Zelltyps zu kultivieren,
wird die Licht-reaktive Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung
beispielsweise auf der vorher erwähnten Kulturschale ausgebildet
und der spezifische Zelltyp wird in der Vorrichtung (1) kultiviert.
Wenn ein weiterer Zelltyp darin während des Kultivierens eindringt,
kann Licht sequentiell auf die Positionen der eindringenden Zellen gestrahlt
werden, um die eindringenden Zellen freizusetzen und zu entfernen
(2), und nur der erwünschte Zelltyp
wird auf der Licht-reaktiven Zusammensetzung übrig bleiben und kontinuierlich
kultiviert werden (3). Zum Identifizieren der eindringenden Zellen kann
der spezielle Zelltyp, das als Reinkultur kultiviert werden soll,
mit Fluoreszenz markiert werden, um zuu ermöglichen, dass nicht-Fluoreszenz-markierte Zellen
als eindringende Zellen identifiziert zu werden. Alternativ können, wenn
die eindringenden Zellen morphologisch identifiziert werden können, die
eingedrungenen Zellen freigesetzt und durch Lichtbestrahlung unter
mikroskopischer Beobachtung ohne spezielle Fluoreszenzmarkierung
entfernt werden, in derselben Weise, wie oben beschrieben.
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In 3 zeigt
ein Flussdiagramm (II) einen Prozess des Gestaltens oder Strukturierens
von Zellen und des Cokultivierens einer Vielzahl von gemusterten
Zellen.
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Zum
Zellstrukturieren wird ein bestimmter Zelltyp kultiviert und proliferiert,
bis sich die Zellen über
die Licht-reaktive Zusammensetzung (1) verteilen. Danach wird gemäß eines
vorherbestimmten Musters Licht auf ein oder mehrere spezielle Regionen
der Zellkultiviervorrichtung gestrahlt, um die in den speziellen
Regionen befindlichen Zellen zu entfernen. Die verbleibenden Zellen
bilden das vorherbestimmte Muster (2). Danach wird ein anderer Zelltyp
in den speziellen Regionen, denen Zellen fehlen, verteilt, was eine
Vielzahl von Zelltypen führt,
die unterscheidbar strukturiert sind (3). Alternativ kann das Strukturieren
von Zellen durch periodische Bestrahlung einer spezifizierten Region
mit Licht erreicht werden, während
die Zellen kultiviert werden, um zu verhindern, dass sich Zellen
an der speziellen Region anhaften. In diesem Fall können die
Zellen mit einer verstärkten
Flexibilität
angeordnet werden.
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Die
obigen Verfahren sind zum Analysieren der Kommunikation zwischen
Zellen oder zur Verwendung von Zellen zur Erzeugung einer bioaktiven Substanz,
die unter der Koexistenz einer Vielzahl von Zelltypen produziert
wird, von Nutzen.
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Ein
Zellkultivier-/Sortiergerät
der vorliegenden Erfindung umfasst eine Zellkultiviervorrichtung, einschließlich einer
Licht-reaktiven Zusammensetzung, die ein unterschiedliches Haftvermögen mit Zellen
in Reaktion auf eine Lichtbestrahlung, ein Mittel zum Zuführen einer
Kulturlösung
zur Vorrichtung, ein Mittel zur Bestrahlung irgendeiner ausgewählten Position
der Lichtreaktiven Zusammensetzung der Vorrichtung mit Licht, ein
Mittel zum Nachweisen jeweiliger Positionen der Zellen auf der Licht-reaktiven Zusammensetzung
und ein Mittel zum Sortieren der Zellen, die aus der Licht-reaktiven
Zusammensetzung durch Lichtbestrahlung freigesetzt werden, aufweist.
Das Zellkultivier-/Sortiergerät
kann weiterhin ein Mittel zum Zuführen eines Eluats gemäß des Bedarfs
einschließen.
Bezüglich
den 4 und 5 wird die Zellkultivier/Sortiervorrichtung
der vorliegenden Erfindung ausführlicher
beschrieben werden.
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4 ist
ein Blockdiagramm, das ein Zellkultivier-/Sortiergerät gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zeigt. 5 ist ein
erklärendes
Blockdiagramm, das einen selektiven Zellfreisetzungsprozess in einer
Zellkultivierkammer des Zellkultivier-/Sortiergeräts in 4 zeigt.
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Das
Gerät umfasst
eine Zellkultivierkammer (1), das eine Zellkulturvorrichtung
einschließt,
die die Licht-reaktive Zusammensetzung (8), ein Kulturreservoir
zum Zuführen
einer Kulturlösung
zur Vorrichtung (2), einen Projektor (3), der
als optisches 2-dimensionales Musterbestrahlungsmikrosystem zum Bestrahlen
irgendeiner ausgewählten
Position der Licht-reaktiven Zusammensetzung (8) der Zellkultivierkammer
mit Licht dient, eine Farb-CCD-Kamera (4) zum Nachweisen
der jeweiligen Positionen von Zellen auf der Licht-reaktiven Zusammensetzung
(8) und zum Übertragen
eines Signals der nachgewiesenen Positionsinformation auf eine später erwähnte Kontrolleinheit,
eine Vorrichtung (5) zum sortierenden Sammeln, die eine
Vielzahl von umschaltbaren Sammelgefäßen (5') einschließt, um die aus der Licht-reaktiven
Zusammensetzung (8) durch die Lichtbestrahlung freigesetzten
Zellen zu sortieren, Umschaltventile (6) und (6'), die jeweils
in einer ersten Passage zur Bereitstellung einer Flüssigkeitsverbindung
zwischen dem Kulturreservoir (2) und der Zellkultivierkammer
(1) bereitgestellt sind, und eine zweite Passage zur Bereitstellung
einer Flüssigkeitsverbindung
zwischen der Zellkultivierkammer und der sortierend sammelnden Vorrichtung
(5), und die Kontrolleinheit (7) zum Kontrollieren
des Gesamtbetriebs des Gerätes,
umfasst. Das Gerät
kann weiterhin eine Vorrichtung zum Zuführen von Eluat (nicht dargestellt)
zum bedarfsgemäßen Zuführen eines Eluats
zur Zellkultivierkammer (1) einschließen.
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Der
Betrieb der Vorrichtung wird nun beschrieben werden. Das Umschaltventil
(6') wird
zunächst
geöffnet
und geschlossen, um eine vorgegebene Menge einer Kulturlösung aus
dem Kul turreservoir (2) der Zellkultivierkammer (1)
zuzuführen.
Danach werden die Zellen in der Zellkulturvorrichtung (1)
verteilt und darin kultiviert. Unter den Zellen können Zielzellen
(10) mit Fluoreszenz im Voraus markiert werden oder können mit
Fluoreszenz nach dem Kultivieren markiert werden. Die Licht-reaktive
Zusammensetzung (8) der Zellkulturkammer (1) wird aus
einem Licht-reaktiven Material hergestellt und auf dem Substrat
(9) der Kulturschale der Zellkultiviervorrichtung gebildet.
Die jeweilige Position der Zellen auf der Licht-reaktiven Zusammensetzung
(8) werden durch Farb-CCD-Kamera (4) nachgewiesen. Das
Positionsinformationssignal wird in die Kontrolleinheit (7)
eingegeben. Danach werden die zu sortierenden Zielzellen (10)
gemäß der Fluoreszenzmarkierung
identifiziert und der Projektor wird eingestellt, um die Zielzellen
(10) mit Licht zu bestrahlen. Die mit Licht aus dem Projektor
mit Licht zu bestrahlende Position („Lichtbestrahlungsposition") kann automatisch durch
die Kontrolleinheit eingestellt werden oder kann manuell eingestellt
werden, während
der Monitorschirm beobachtet wird.
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Die
Lichtbestrahlung verändert
lokal die Eigenschaften der Licht-reaktiven Zusammensetzung (8)
oder reduziert lokal das Haftvermögen der Licht-reaktiven Zusammensetzung
(8) mit den Zielzellen (10). Somit werden nur
die Zielzellen (10) freigesetzt und in Kulturlösung suspendiert.
Sogar dann, wenn die Zellen nicht vollständig freigesetzt werden, wird
das Haftvermögen
der Licht-reaktiven Zusammensetzung (8) ausreichend reduziert
und die Zellen (10) können
selektiv durch Öffnen
eines Umschaltventils (nicht dargestellt) der Eluatzuführvorrichtung freigesetzt
werden, um das Eluat aus der Kulturkammer (1) zuzuführen. Alternativ
kann eine Vorrichtung zur Aufbringung einer physikalischen Stimulierung, wie
beispielsweise Vibration, in Kombination mit oder als Ersatz für die Eluatzuführvorrichtung
verwendet werden. Die durch Lichtbestrahlung freigesetzten Zellen
und das Eluat oder die physikalische Stimulierung erhalten die Integrität ihrer
ECM (extrazelluläre Matrix)
und Membranproteine bei.
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Danach
werden die Umschaltventile (6) und (6') geöffnet, um
Kulturlösung
aus dem Kulturreservoir (2) an die Zellkultivierkammer
(1) zuzuführen,
um die freigesetzten Zellen (10) in einem Sammelgefäß (5') der sortierend
sammelnden Vorrichtung (5) zu sammeln.
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Der
obige Prozess wird zum sortierenden Sammeln weiterer Zellen (11)
und (12) sequentiell wiederholt.
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Im
Zellkultivier-/Sortiergerät
gemäß einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist die Zellkultivierkammer so konfiguriert,
dass sie einer Licht-reaktiven Zusammensetzung der Zell kulturvorrichtung
ermöglicht
mit Licht von außerhalb
bestrahlt zu werden und die Überwachung
von Zellen ermöglicht,
die an der Licht-reaktiven Zusammensetzung anhaften. Das optische
2-dimensionale Musterbestrahlungsmikrosystem
ist dazu vorgesehen, irgendeinen ausgewählten Bereich der Licht-reaktiven Zusammensetzung
der Zellkultivierkammer mit Licht im räumlichen Rahmen einer einzelnen
Zelle oder Zellpopulation zu bestrahlen. Vorzugsweise weist der Monitor
eine ausreichende Auflösung,
Lichtstärke und
Empfindlichkeit auf, um eine einzelne Zelle oder Zellpopulation
zu identifizieren. Wenn eine Vielzahl von Fluoreszenzfarbstoff-tragenden
Antikörpern
zum Identifizieren der Zelltypen verwendet wird, können die
Zelltypen vorzugsweise durch Farbe identifiziert werden. Vorzugsweise
ist die Kontrolleinheit dazu vorgesehen, die Positionsinformationen
der kultivierten Zellen auf Grundlage der Beobachtung des Monitors
zu erfassen und die Lichtbestrahlung aus dem optischen 2-dimensionalen
Muster-Bestrahlungsmikrosystem
gemäß der erfassten
Positionsinformationen zu kontrollieren und die Kulturlösung zum
Sammeln der freigesetzten Zellen an die Kammer zuzuführen.
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Während der
Verteilungs-/Kultivierungs-/Proliferationsprozess in einer Zellkulturvorrichtung,
wie beispielsweise in der oben beschriebenen Zellkultivierkammer,
durchgeführt
wird, kann die vorliegende Erfindung ebenfalls auf ein Verfahren zum
einfachen Einbringen von Zellen in eine Zellkultiviervorrichtung
angewandt werden, indem es diesen ermöglicht wird, sich an einer
Licht-reaktiven Zusammensetzung der Vorrichtung anzuhaften und dann
die Zellen zu einem gegebenen Zeitpunkt sortierend zu sammeln. Beispielsweise
ist dieses Verfahren beim Auftrennen einer Vielzahl von Zelltypen, die
in einem Gewebe enthalten sind, von Nutzen.
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BEISPIEL 1
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10%
TiO2-Hydrosollösung wurden auf ein Glassubstrat
gegossen und für
30 Minuten bei 80°C getrocknet.
Danach wurde es für
5 Minuten bei 150°C gesintert
und eine Schicht aus einer Lichtreaktiven Zusammensetzung mit einer
Dicke von ungefähr
1 μm ergab
sich auf der Oberfläche
des Glassubstrates (eine „Licht-reaktive
Oberfläche"). Sie wurde auf
dem Boden der Zellkulturschale fixiert und CHO (Chinesische Hamster-Ovar-Zellen)
wurden auf der Licht-reaktiven Oberfläche dispergiert und für 6 Stunden
inkubiert. Wenn das Licht, das die Licht-reaktive Oberfläche aktiviert,
in einer Intensität
von 100 mW/cm2 auf die Licht-reaktive Oberfläche aufgestrahlt
wurde, veränderte
sich die polygonale Form der Zellen, die an der Oberfläche anhafteten,
und sich von dieser weg erstreckten, zu einer runden Form. Obwohl
kein offensichtlicher Beweis einer Zellexfoliation durch die Lichtbestrahlung
ersichtlich war, legt diese Veränderung
der Form der Zellen stark die Abnahme der Haftfestigkeit der Zellen
nahe.
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BEISPIEL 2
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Das
Diarylethenderivat, Cis-1,2-dicyano-1,2-bis(2,4,5-trimethyl-3-thienyl)ethan,
das ein photochromer Farbstoff ist und strukturell isomerisiert wird
und sein Absorptionsspektrum in Reaktion auf eine Lichtbestrahlung
verändert,
wurde gleichförmig auf
ein Glassubstrat durch ein Spin-Coating-Verfahren aufgebracht, um
eine Schicht aus einer Licht-reaktiven Zusammensetzung auf der Oberfläche des Glassubstrates
zu erzielen (eine „Licht-reaktive Oberfläche"). Die gewonnene
Licht-reaktive Oberfläche
wurde in ein System eingebaut, das aus einem optischen 2-dimensionalen
Musterbestrahlungsmikrosystem, einem Monitor und einem Kontrollsystem zu
deren Kontrolle bestand. Ein experimenteller Test wurde durchgeführt, um
zu überprüfen, ob
die Eigenschaften der Licht-reaktiven Oberfläche reversibel waren, kontrolliert
durch eine Lichtbestrahlung unter Verwendung von blauem Licht mit
einer Wellenlängenbande
von 400 bis 440 nm (Intensität:
180 mW/cm2), um den photochromen Farbstoff
in einem farbigen ringgeschlossenen Zustand zu isomerisieren und
von gelbem Licht mit einer Wellenlängenbande von 500 bis 600 nm
(Intensität:
160 mW/cm2), um den Farbstoff in einen gebleichten
ringoffenen Zustand zurückzubringen.
Es wurde als Folge verifiziert, dass der Isomerisierungszustand
der Lichtreaktiven Oberfläche
in einer gegebenen Position auf der Licht-reaktiven Oberfläche in einer
Zeitskala von ungefähr
5 Sekunden mit einer Genauigkeit einer 30 μm Auflösung reversibel verändert werden
konnte. Der Grad der Isomerisierung war kontinuierlich durch Kontrollieren
der Lichtintensität
und der Bestrahlungszeit einstellbar und veränderte sich nicht in Abwesenheit
von Licht. Die Isomerisierungseigenschaft der Licht-reaktiven Oberfläche verändert sich
nach mehr als 10.000 Isomerisierungswiederholungen nicht.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung können Zellen
mit einem hohen Grad an Genauigkeit aufgetrennt und gesammelt werden,
was bis jetzt nicht erreicht wurde, während die Integrität und Funktion
von ECM und Membranproteinen während
der Auftrennung der Zellen aufrechterhalten werden kann. Somit können zusätzlich zur
Genauigkeit der Zellauftrennung die jeweiligen organspezifischen
Funktionen der Zellen ebenfalls aufrechterhalten werden. Als Folge
hiervon stellt die vorliegende Erfindung ein Zellkultivier-/Auftrennungs-/Sammelsystem
bereit, das signifikant für
Verankerungs-abhängige
Zellen von Nutzen ist. Weiterhin machen es Licht-reaktive Zusammensetzungen,
die ein photoreaktives Material mit reversibel veränderbaren
Oberflächen eigenschaften
umfasst, möglich,
den Freisetzungsvorgang durch Lichtbestrahlung und die Verteilung
unterschiedlicher Zelltypen zu wiederholen, um Typ, Position und
Anordnung der kultivierten Zellen auf der Licht-reaktiven Zusammensetzung
mit einem hohen Grad an Genauigkeit zu kontrollieren.