JP4797396B2 - 細胞培養基板の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞を高精細なパターン状に接着させた細胞培養基板の製造方法に関するものである。

現在、いろいろな動物や植物の細胞培養が行われており、また、新たな細胞の培養法が開発されている。細胞培養の技術は、細胞の生化学的現象や性質の解明、有用な物質の生産などの目的で利用されている。さらに、培養細胞を用いて、人工的に合成された薬剤の生理活性や毒性を調べる試みがなされている。

一部の細胞、特に多くの動物細胞は、何かに接着して生育する接着依存性を有しており、生体外の浮遊状態では長期間生存することができない。このような接着依存性を有した細胞の培養には、細胞が接着するための担体が必要であり、一般的には、コラーゲンやフィブロネクチンなどの細胞接着性タンパク質を均一に塗布したプラスチック製の培養皿が用いられている。これらの細胞接着性タンパク質は、培養細胞に作用し、細胞の接着を容易にしたり、細胞の形態に影響を与えることが知られている。

一方、培養細胞を基材上の微小な部分にのみ接着させ、配列させる技術が報告されている。このような技術により、培養細胞を人工臓器やバイオセンサ、バイオリアクターなどに応用することが可能になる。培養細胞を配列させる方法としては、細胞に対して接着の容易さが異なるような表面がパターンをなしているような基材を用い、この表面で細胞を培養し、細胞が接着するように加工した表面だけに細胞を接着させることによって細胞を配列させる方法がとられている。

例えば、特許文献１には、回路状に神経細胞を増殖させるなどの目的で、静電荷パターンを形成させた電荷保持媒体を細胞培養に応用している。また、特許文献２では、細胞接着阻害性あるいは細胞接着性の光感受性親水性高分子をフォトリソグラフィ法によりパターニングした表面上への培養細胞の配列を試みている。

さらに、特許文献３では、細胞の接着率や形態に影響を与えるコラーゲンなどの物質がパターニングされた細胞培養用基材と、この基材をフォトリソグラフィ法によって作製する方法について開示している。このような基材の上で細胞を培養することによって、コラーゲンなどがパターニングされた表面により多くの細胞を接着させ、細胞のパターニングを実現している。

しかしながら、このような細胞培養部位のパターニングは、用途によっては高精細であることが要求される場合がある。上述したような感光性材料を用いたフォトリソグラフィ法等によるパターニングを行う場合は、高精細なパターンを得ることはできるが、細胞接着性材料が感光性を有する必要があり、例えば生体高分子等にこのような感光性を付与するための化学的修飾を行うことが困難な場合が多く、細胞接着性材料の選択性の幅を極めて狭くするといった問題があった。また、フォトレジストを用いたフォトリソグラフィ法では、現像液等を用いる必要性があり、これらが細胞培養に際して悪影響を及ぼす場合があった。

さらに、高精細な細胞接着性材料のパターンの形成方法として、マイクロ・コンタクトプリンティング法が、ハーバード大学のジョージ Ｍ，ホワイトサイズ(George M. Whitesides)により提唱されている（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７等）。しかしながら、この方法を用いて工業的に細胞接着性材料のパターンを有する細胞培養基材を製造することは難しいといった問題があった。

特開平２−２４５１８１号公報 特開平３−７５７６号公報 特開平５−１７６７５３号公報 米国特許第５，５１２，１３１号公報 米国特許第５，９００，１６０号公報 特開平９−２４０１２５号公報 特開平１０−１２５４５号公報

そこで、基材上に細胞を高精細なパターン状に接着し、培養させるために用いられる細胞培養基板の新たな製造方法の提供が望まれている。

本発明は、基材上に、エネルギー照射の際の光触媒の作用により、細胞との接着性を有する細胞接着部と、細胞と接着阻害性を有する細胞接着阻害部とを形成することができる細胞培養パターニング用層を形成し、パターニング用基板とするパターニング用基板形成工程と、上記細胞培養パターニング用層に、エネルギーを照射し、光触媒の作用により上記細胞接着部と上記細胞接着阻害部とをパターン状に形成するエネルギー照射工程と、上記パターン状の細胞接着部に対して、選択的に細胞含有液を塗布する部位選択塗布法により細胞接着部上に細胞含有液を塗布する細胞含有液塗布工程とを有することを特徴とする細胞培養基板の製造方法を提供する。

本発明においては、光触媒の作用によりパターン状に形成された上記細胞接着部に対して、インクジェット法等の選択的に細胞含有液を塗布する部位選択塗布法により細胞含有液を塗布するものであるので、細胞の接着パターンが高精細な細胞培養基板を製造することができる。また、例えば細胞組織等を形成する場合は、同一基板上に２種類以上の細胞を接着させる必要性があるが、本発明の方法によれば、極めて容易に２種類以上の細胞を接着させることが可能となる。

また、従来より行われている、基材全面に細胞を播種した後、パターニングする手法においては、実際にパターニングされる細胞数よりも過剰の細胞を播種し、パターニングされずに余った細胞を洗い流す手法が一般的であったため、使用する細胞にロスが発生し、容易に得ることの出来ない細胞種の場合はこのようなパターニング方法の適用は困難であった。一方、本発明によれば、目的とする領域のみに細胞含有液を塗布することから、細胞数のロスを軽減することが可能となり、種々の細胞種をパターニングできる、という利点も有する。

上記本発明の細胞培養基板の製造方法は、上記パターニング用基板形成工程におけるパターニング用基板の種類および上記エネルギー照射工程の違いから、以下の６つの態様に分けることができる。

まず、第１の態様における細胞培養基板の製造方法は、上記パターニング用基板が、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する光触媒含有細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、上記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、上記光触媒含有細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成することを特徴とするものである。

また、本発明の第２の態様における細胞培養基板の製造方法は、上記パターニング用基板が、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有する光触媒含有細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、上記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、上記光触媒含有細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、上記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成することを特徴とするものである。

これら第１の態様および第２の態様においては、細胞培養パターニング用層がいずれも光触媒を含む光触媒含有細胞接着層および光触媒含有細胞接着阻害材料層を有するものであるので、単一の層とすることが可能であり工程上有利であり、かつ感度が良好である。

また、本発明の第３の態様における細胞培養基板の製造方法は、上記パターニング用基板が、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層、および、上記光触媒含有層上に形成された細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、上記細胞接着層は、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を少なくとも含有するものであり、上記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成することを特徴とするものである。

さらに、本発明の第４の態様における細胞培養基板の製造方法は、上記パターニング用基板が、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層、および、上記光触媒含有層上に形成された細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、上記細胞接着阻害材料層は、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有するものであり、上記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、上記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成することを特徴とするものである。

これら第３の態様および第４の態様においては、光触媒含有層上に細胞接着層および細胞接着阻害材料層を有するものであるので、細胞が直接光触媒に接触する可能性が少ない。したがって、経時的な劣化の恐れが少ないといった利点を有する。さらに、これらの態様においては光触媒材料と細胞接着性材料あるいは細胞接着阻害材料とが直接混合不可能な場合でも実施可能であるという利点も有する。

また、本発明の第５の態様における細胞培養基板の製造方法は、上記パターニング用基板が、基材と、上記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、上記エネルギー照射工程では、上記細胞接着層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成することを特徴とするものである。

さらに、本発明の第６の態様における細胞培養基板の製造方法は、上記パターニング用基板が、基材と、上記基材上に形成され、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性される細胞接着阻害材料を含有する細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、上記エネルギー照射工程では、上記細胞接着阻害材料層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着阻害材料層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、上記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成することを特徴とするものである。

これら、第５および第６の態様においては、細胞培養基板自体に光触媒を含む必要がなく、経時的な劣化の可能性が少ないといった利点を有する。

上記本発明の第２、第４、および第６の態様の細胞培養基板の製造方法においては、上記細胞接着部が親水性領域であり、上記細胞接着阻害部が撥水性領域であることが好ましい。インクジェット法等の選択的に細胞含有液を塗布する部位選択塗布法を用いて、細胞含有液を塗布する場合、細胞含有液は親水性の材料や水溶液である為、細胞接着部が親水性領域であり、細胞接着阻害部が撥水性領域であることにより、高精細に細胞接着部に細胞含有液を塗布することができるからである。また、細胞を親水性領域と撥水性領域という異なる性質の境界域に接着させる事により、細胞種によっては細胞の伸展や配向等の形態変化を引き起こすが、このような変化は細胞の組織化を促すとの報告事例もあり、上記方法によれば、このような細胞の形態変化等を促すことが可能となる場合があるからである（Donald E. Ingber 他, Journal of cell biology (1989) p.317-、Kevin E. Healy 他, Biotechnology and Bioengineering (1994) p.792-等参照）。

また、上記本発明の細胞培養基板の製造方法においては、上記基材または上記光触媒含有層上にパターン状に遮光部が形成されているものであってもよい。このように、遮光部が設けられていると、エネルギー照射の際にフォトマスクを用いる必要がないことから、位置合わせ等の煩雑な工程が必要無く、また細胞培養パターニング用層と遮光部との距離が極めて近いことから、フォトマスク等を用いた場合より、より高精細なパターンを得ることができる。

さらに、上記本発明の製造方法においては、上記部位選択塗布法が、インクジェット法であることが好ましい。効率的に製造することができるからである。

また、本発明は、インクジェット法により基板上にパターン状に吐出されることにより、パターン状に細胞が接着した細胞培養基板を形成するインクジェット用細胞含有液であって、細胞と、培養液と、生物学的細胞接着性材料とを有するものであることを特徴とするインクジェット用細胞含有液を提供する。このようなインクジェット用細胞含有液を用いた場合は、基板との接着性を良好なものとすることができるからである。また、生物学的細胞接着性材料は一般的に粘度が高いものが多く、このような生物学的細胞接着性材料を細胞含有液に含ませることにより、細胞含有液の粘度を上げ、吐出された細胞が細胞含有液中で運動することを防ぐこと等も可能となるからである。

さらに、本発明は、インクジェット法により基板上にパターン状に吐出されることにより、パターン状に細胞が接着した細胞培養基板を形成するインクジェット用細胞含有液であって、上記インクジェット用細胞含有液中に含有される細胞がマイクロカプセルに包含されていることを特徴とするインクジェット用細胞含有液を提供する。細胞がマイクロカプセルに包含されているので、吐出等において細胞が傷つくことがなく、良好な品質の細胞培養基板を製造することができるからである。

これらのインクジェット用細胞含有液は、上述した細胞基板の製造方法において、部位選択塗布法が、インクジェット法である場合に好適に用いられる。なお、ここでいうインクジェット法とは、細胞もしくは細胞液を吐出する方式であって、細胞にダメージを与えない方法であれば、ピエゾ駆動方式、バブルジェット（登録商標）方式、静電ジェット方式、電界ジェット方式、超音波ジェット方式、遠心ジェット方式、慣性力ヘッド方式など、その方式は問わない。特に細胞にダメージを与えないという点でピエゾ駆動方式が特に好適である。

また、本発明は、細胞含有液が充填された細胞含有液供給部、および上記細胞含有液供給部から供給される細胞含有液を細胞培養用パターニング基板に吐出するピエゾ駆動型ヘッド部を有する吐出部と、上記細胞培養用パターニング基板を固定するステージとを有する細胞培養基板製造用インクジェット装置であって、上記細胞含有液供給部には、充填された細胞含有液中の細胞を均一に分散させるための攪拌手段が設けられており、上記吐出部およびステージには、吐出前後の細胞含有液の温度を一定に保つための温度制御手段が設けられていることを特徴とする細胞培養基板製造用インクジェット装置を提供する。このような細胞培養基板製造用インクジェット装置を用いることにより、高品質な細胞培養基板を製造することができる。

この場合、上記ピエゾ駆動型ヘッド部と、上記ステージに固定された上記細胞培養用パターニング基板との間の湿度を制御する湿度制御手段が設けられていることが好ましい。細胞含有液が乾燥して、細胞が死滅、あるいは損傷したり、細胞活性が低下すること等を防止することができるからである。

本発明によれば、細胞の接着パターンが高精細な細胞培養基板を製造することができる。また、例えば細胞組織等を形成する場合は、同一基板上に２種類以上の細胞を接着させる必要性があるが、本発明の方法によれば、極めて容易に２種類以上の細胞を接着させることが可能となる。

本発明は、細胞が高精細なパターン状に接着された細胞培養基板を得ることができる細胞培養基板の製造方法、またインクジェット法により細胞培養基板を製造する際に好適に用いることができるインクジェット用細胞含有液、さらには、細胞培養基板を効率よくかつ高品質に製造することができる細胞培養基板製造用インクジェット装置に関するものである。以下、それぞれについてわけて説明する。

Ａ．細胞培養基板の製造方法
まず、本発明の細胞培養基板の製造方法について説明する。本発明の細胞培養基板の製造方法は、基材上に、エネルギー照射の際の光触媒の作用により、細胞との接着性を有する細胞接着部と、細胞と接着阻害性を有する細胞接着阻害部とを形成することができる細胞培養パターニング用層を形成し、パターニング用基板とするパターニング用基板形成工程と、上記細胞培養パターニング用層に、エネルギーを照射し、光触媒の作用により上記細胞接着部と上記細胞接着阻害部とをパターン状に形成するエネルギー照射工程と、上記パターン状の細胞接着部に対して、選択的に細胞含有液を塗布する部位選択塗布法により細胞接着部上に細胞含有液を塗布する細胞含有液塗布工程とを有することを特徴とするものである。

本発明の細胞培養基板の製造方法においては、細胞含有液を選択的に塗布する部位選択塗布法により細胞接着部上に塗布するものであるので、高精細なパターンを有する細胞培養基板を製造することができる。また、このような塗布方法を用いるものであることから、複数種類の細胞含有液を塗布することが可能となる。したがって、複数種類の細胞からなる、例えば細胞組織等を形成する場合に効果的に用いることができる。

ここで、一般的に細胞培養領域に細胞を付着させて細胞を培養し、組織を形成する場合、個々の細胞が形態変化をして配列することが必要である。一般的な基材上に細胞含有液を塗布した場合、この細胞の形態変化や配列等を生じさせることが困難であり、組織を形成することが困難である。一方本発明によれば、上記細胞接着阻害部と細胞接着部とを有する細胞培養パターニング用層上の細胞接着部上に、細胞含有液を塗布することから、この細胞接着部と細胞接着阻害部とのパターンに沿って、細胞接着部上に塗布された細胞が、容易に配列したり、形態変化を生じることが可能となるため、組織が容易に形成される、という利点も有する。
以下、このような細胞培養基板の製造方法について、各工程に分けて説明する。

１．パターニング用基板形成工程
本発明におけるパターニング用基板形成工程は、基材上に、エネルギー照射の際の光触媒の作用により、細胞との接着性を有する細胞接着部と、細胞と接着阻害性を有する細胞接着阻害部とを形成することができる細胞培養パターニング用層を形成し、パターニング用基板とする工程である。

本工程において、基材上に細胞培養パターニング用層を形成し、パターニング用基板とする方法としては、細胞培養パターニング用層の種類に応じて種々の方法が用いられる。例えばスピンコート法、スプレーコート法、ディップコート法、ロールコート法、ビードコート法、ダイコート法等の湿式法や、ＰＶＤ法やＣＶＤ法等の乾式法を挙げることができる。また、吸着法も好適に用いることができる。
このようなパターニング用基板形成工程は、形成されるパターニング用基板の種類によって、以下に説明する６つの態様に分けることができる。

（１）第１の態様
まず、本工程の第１の態様により形成されるパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する光触媒含有細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを有するものである。

本態様において形成される細胞培養パターニング用層中に含まれる上記光触媒含有細胞接着層中には、光触媒が含有されていることから、後述するエネルギー照射工程において、エネルギーが照射された際に、細胞接着材料をその光触媒の作用によって分解または変性することができる。したがって、細胞培養パターニング用層中に、光触媒を含有する層等を別途形成する必要がなく、細胞培養パターニング用層を単一の層とすることができ、製造効率等の面から好ましいものとすることができる。なお、必要がある場合には、上記光触媒含有細胞接着層以外の他の層を含むように、上記細胞培養パターニング用層を形成してもよい。
以下、本態様のパターニング用基板形成工程に用いられる基材、および本態様において形成される光触媒含有細胞接着層について説明する。

（基材）
まず、本態様に用いられる基材について説明する。本態様に用いられる基材は、後述する光触媒含有細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層を形成可能なものであれば、特に限定されるものではなく、例えば金属、ガラス、シリコン等の無機材料、およびプラスチックで代表される有機材料等を用いることができる。

ここで、基材の可撓性等は最終的に得られる細胞培養基板の種類や用途等によって適宜選択される。また、上記基材の透明性は、細胞培養基板の種類や、後述するエネルギー照射工程において上記細胞接着材料を分解または変性させるために照射されるエネルギーの照射方向等によって、適宜選択され、上記エネルギーの照射が、基材側から行われる場合等には、基材が透明性を有するものとされる。

なお、本態様に用いられる基材は平坦なものであってもよいが、基材に凹部が形成されていてもよい。このような基材としては、例えば図７（ａ）に示すように、１つの凹部が形成されているものであってもよく、また例えば図７（ｂ）に示すように、複数の凹部が形成されているものであってもよい。

またこの際、上記凹部を有する基材の側壁に後述する光触媒含有細胞接着層が形成されないように処理が施されたものであってもよい。このような処理としては、例えばマスク等を用いてＣＶＤ法により上記側壁のみに撥液性を有する材料を付着させる方法や、上記凹部全面に撥液性を有する材料を付着させた後、筒状のマスク等を用いて紫外線処理やプラズマ処理等を行い、上記凹部の底面のみ、親液化させる方法等が挙げられる。

ここで、本態様において、上記基材は、アルカリ洗浄等の薬液洗浄されたものであってもよく、また酸素プラズマ処理や紫外線処理等のドライ洗浄が行われたものであってもよい。この場合、上記光触媒含有細胞接着層を形成するための光触媒含有細胞接着層形成用塗工液等の濡れ性が向上する。またさらに表面に反応性の官能基が配置されることとなることから、光触媒含有細胞接着層の密着性が向上する、という利点を有する。

ここで、本態様に用いられる基材には、必要に応じて遮光部が形成されていてもよい。本態様の基材に用いることが可能な遮光部としては、後述するエネルギー照射工程において照射されるエネルギーを遮断することが可能なものであれば、特に限定されるものではなく、例えばスパッタリング法、真空蒸着法等により厚み１０００〜２０００Å程度のクロム等の金属薄膜を形成し、この薄膜をパターニングすることにより形成されてもよい。このパターニングの方法としては、スパッタ等の通常のパターニング方法を用いることができる。

また、樹脂バインダ中にカーボン微粒子、金属酸化物、無機顔料、有機顔料等の遮光性粒子を含有させた層をパターン状に形成する方法であってもよい。用いられる樹脂バインダとしては、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ゼラチン、カゼイン、セルロース等の樹脂を１種または２種以上混合したものや、感光性樹脂、さらにはＯ／Ｗエマルジョン型の樹脂組成物、例えば、反応性シリコーンをエマルジョン化したもの等を用いることができる。このような樹脂製遮光部の厚みとしては、０．５〜１０μｍの範囲内で設定することができる。このような樹脂製遮光部のパターニングの方法は、フォトリソ法、印刷法等一般的に用いられている方法を用いることができる。

なお、上記遮光部は、後述する細胞培養パターニング用層が形成される側の面に形成されるものであってもよく、また反対側の面に形成されるものであってもよい。

また、上記遮光部を形成する場合には、上記細胞培養パターニング用層と遮光部との間にプライマー層を形成してもよい。このプライマー層の作用・機能は必ずしも明確なものではないが、プライマー層を形成することにより、光触媒の作用による光触媒含有細胞接着層中の細胞接着材料の分解または変性を阻害する要因となる遮光部および遮光部間に存在する開口部からの不純物、特に、遮光部をパターニングする際に生じる残渣や、金属、金属イオン等の不純物の拡散を防止する機能を示すものと考えられる。したがって、プライマー層を形成することにより、後述するエネルギー照射工程で、高感度で細胞接着材料を分解または変性させることができ、その結果、細胞接着部と細胞接着阻害部とを、高精細なパターン状に形成することができるのである。

なお、本態様においてプライマー層は、遮光部のみならず遮光部間に形成された開口部に存在する不純物が光触媒の作用に影響することを防止するものであるので、プライマー層は開口部を含めた遮光部全面にわたって形成されていることが好ましい。

本発明におけるプライマー層は、上記遮光部と上記細胞培養パターニング用層とが接触しないようにプライマー層が形成された構造であれば特に限定されるものではない。
このプライマー層を構成する材料としては、特に限定されるものではないが、光触媒の作用により分解されにくい無機材料が好ましい。具体的には無定形シリカを挙げることができる。このような無定形シリカを用いる場合には、この無定形シリカの前駆体は、一般式ＳｉＸ_４で示され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物であり、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
また、プライマー層の膜厚は、０．００１μｍから１μｍの範囲内であることが好ましく、特に０．００１μｍから０．１μｍの範囲内であることが好ましい。

また、上記基材には、所定の位置に位置検知マークが形成されていることが好ましい。これにより、後述するエネルギー照射工程や、細胞含有液塗布工程において位置合わせが容易となり、所定の位置に細胞接着阻害部を形成したり、細胞接着部上にのみ選択的に、高精細に細胞含有液を塗布すること等が可能となるからである。このような位置検知マークとしては、上記エネルギー照射工程や細胞含有液塗布工程において検知可能なものであれば特に限定されるものではなく、一般的に基板の位置合わせに用いられているもの等と同様とすることができる。

（光触媒含有細胞接着層）
次に、本工程において形成される光触媒含有細胞接着層について説明する。本工程において形成される光触媒含有細胞接着層は、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する層である。本態様においては、このような層が形成可能であれば、その形成方法等は特に限定されるものではなく、例えば、光触媒および上記細胞接着材料を含有する光触媒含有細胞接着層形成用塗工液を、上述した塗布方法等によって塗布することにより、形成することができる。

また、例えば上述したように基材に凹部が形成されている場合には、上記凹部に光触媒含有細胞接着層形成用塗工液を滴下し、乾燥させて光触媒含有細胞接着層とするキャスト法や、上記基材の凹部に光触媒含有細胞接着層形成用塗工液を滴下し、所定時間後、洗浄する吸着法等も用いることができる。
また、このような光触媒含有層の膜厚は、細胞培養基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．０１μｍ〜１．０μｍ程度、中でも０．１μｍ〜０．３μｍ程度とすることができる。
以下、上記光触媒含有細胞接着層に用いられる各材料について説明する。

ａ．細胞接着材料
まず、本態様において形成される光触媒含有細胞接着層に用いられる細胞接着材料について説明する。本態様において形成される光触媒含有細胞接着層に含有される細胞接着材料は、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性されるものであれば、その種類等は特に限定されるものではない。ここで、細胞と接着性を有するとは、細胞と良好に接着することをいい、細胞との接着性が細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする細胞と良好に接着することをいう。

本態様に用いられる細胞接着材料は、このような細胞との接着性を有しており、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性されて、細胞との接着性を有しなくなるものや、細胞との接着を阻害する細胞接着阻害性を有するものに変化するもの等が用いられる。

ここで、上記のような細胞と接着性を有する材料には、物理化学的特性により細胞と接着性を有する材料と、生物化学的特性により細胞と接着性を有する材料との２種類がある。
物理化学的特性により細胞と接着性を有する材料の、細胞との接着性を決定する物理化学的な因子としては、表面自由エネルギーや、静電相互作用等が挙げられる。例えば細胞との接着性が材料の表面自由エネルギーにより決定される場合には、材料が所定の範囲内の表面自由エネルギーを有すると細胞と材料との接着性が良好となり、その範囲を外れると細胞と材料との接着性が低下することとなる。このような表面自由エネルギーによる細胞の接着性の変化としては、例えば資料ＣＭＣ出版 バイオマテリアルの最先端 筏 義人（監修）ｐ．１０９下部に示されるような実験結果が知られている。このような因子により細胞との接着性を有する材料としては、例えば親水化ポリスチレン、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、例えば上記材料の表面の官能基が置換等されたり、分解されること等によって、表面自由エネルギーが変化し、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。

また、静電相互作用等により細胞と材料との接着性が決定される場合、例えば材料が有する正電荷の量等によって細胞との接着性が決定されることとなる。このような静電相互作用により細胞との接着性を有する材料としては、例えばポリリジン等の塩基性高分子、アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン等の塩基性化合物およびそれらを含む縮合物等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、上記材料が分解または変性されることによって、例えば表面に存在する正電荷量を変化させることができ、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。

また、生物学的特性により細胞と接着性を有する材料としては、特定の細胞と接着性が良好なもの、または多くの細胞と接着性が良好なもの等が挙げられ、具体的には、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン、アルブミン、γ‐グロブリン等が挙げられる。このような材料を用いた場合、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により、例えば上記材料の構造の一部を破壊したり、主鎖を破壊すること等によって、細胞との接着性を有しないもの、または細胞接着阻害性を有するものとすることができる。

このような細胞接着材料は、上記材料の種類等によって異なるものであるが、光触媒含有細胞接着層中に通常０．０１重量％〜９５重量％、中でも１重量％〜１０重量％含有されることが好ましい。これにより、細胞接着材料を含有する領域を細胞との接着性が良好な領域とすることができるからである。

ｂ．光触媒
次に、本態様において形成される光触媒含有細胞接着層に含有される光触媒について説明する。本態様に用いられる光触媒は、上述した細胞接着材料を、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性させることが可能なものであれば、特に限定されるものではない。

ここで、後述するような酸化チタンに代表される光触媒の作用機構は、必ずしも明確なものではないが、光の照射によって生成したキャリアが、近傍の化合物との直接反応、あるいは、酸素、水の存在下で生じた活性酸素種によって、有機物の化学構造に変化を及ぼすものと考えられている。本態様においては、このキャリアが上述した細胞接着材料に作用を及ぼすものであると思われる。

本態様に用いられる光触媒として、具体的には、光半導体として知られる例えば二酸化チタン（ＴｉＯ_２）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化スズ（ＳｎＯ_２）、チタン酸ストロンチウム（ＳｒＴｉＯ_３）、酸化タングステン（ＷＯ_３）、酸化ビスマス（Ｂｉ_２Ｏ_３）、および酸化鉄（Ｆｅ_２Ｏ_３）を挙げることができ、これらから選択して１種または２種以上を混合して用いることができる。

本態様においては、特に二酸化チタンが、バンドギャップエネルギーが高く、化学的に安定で毒性もなく、入手も容易であることから好適に使用される。二酸化チタンには、アナターゼ型とルチル型があり本態様ではいずれも使用することができるが、アナターゼ型の二酸化チタンが好ましい。アナターゼ型二酸化チタンは励起波長が３８０ｎｍ以下にある。

このようなアナターゼ型二酸化チタンとしては、例えば、塩酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（石原産業（株）製ＳＴＳ−０２（平均粒径７ｎｍ）、石原産業（株）製ＳＴ−Ｋ０１）、硝酸解膠型のアナターゼ型チタニアゾル（日産化学（株）製ＴＡ−１５（平均粒径１２ｎｍ））等を挙げることができる。

光触媒の粒径は小さいほど光触媒反応が効果的に起こるので好ましく、平均粒径が５０ｎｍ以下が好ましく、２０ｎｍ以下の光触媒を使用するのが特に好ましい。
本態様により形成される光触媒含有細胞接着層中に含有される光触媒の量は、５〜９５重量％、好ましくは１０〜６０重量％、さらに好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。これにより、後述するエネルギー照射工程において、光触媒含有細胞接着層のエネルギーが照射された領域の細胞接着材料を分解または変性することが可能となるからである。
ここで、本態様に用いられる光触媒は、細胞との接着性が低いものであることが好ましい。これにより、上述した細胞接着材料が分解等されて光触媒が露出した領域を、細胞との接着性が低い領域として用いることが可能となるからである。

ｃ．その他
本態様においては、光触媒含有細胞接着層中に、上記細胞接着材料や光触媒だけでなく、必要に応じて例えば、強度や耐性等を向上させるバインダ等を含有するものであってもよい。本態様においては、特にバインダとして、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有する材料が用いられることが好ましい。これにより、後述するエネルギー照射工程においてエネルギーが照射された領域の細胞との接着性を低いものとすることができるからである。このような材料としては、例えばエネルギー照射される前から上記細胞接着阻害性を有するものであってもよく、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着阻害性を有するものとなるものであってもよい。
本態様においては、このようなバインダは、光触媒含有細胞接着層中に５重量％〜９５重量％、中でも４０重量％〜９０重量％、特に６０重量％〜８０重量％の範囲内含有されることが好ましい。

（２）第２の態様
第２の態様により形成されるパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有する光触媒含有細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものである。

本態様により形成される上記光触媒含有細胞接着阻害材料層中には、光触媒が含有されていることから、後述するエネルギー照射工程において、エネルギーが照射された際に、細胞接着阻害材料をその光触媒の作用によって分解または変性することができる。したがって、細胞培養パターニング用層中に、別途光触媒を含有する層等を形成する必要がなく、細胞培養パターニング用層を単一の層とすることができ、製造効率等の面から好ましいものとすることができる。なお、必要がある場合には、上記光触媒含有細胞接着阻害材料層以外の層を含むように、上記細胞培養パターニング用層を形成してもよい。
以下、本工程より形成される光触媒含有細胞接着阻害材料層について説明する。なお、本工程に用いられる基材については、上述した第１の態様で用いられる基材と同様のものを用いることができるので、ここでの説明は省略する。

（光触媒含有細胞接着阻害材料層）
本工程により形成される光触媒含有細胞接着阻害材料層は、少なくとも光触媒および、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有する層である。本態様においては、このような層が形成可能であれば、その形成方法等は特に限定されるものでなく、例えば光触媒および細胞接着阻害材料を含有する光触媒含有細胞接着層形成用塗工液を、上述した塗布方法等により塗布して形成することができる。
また、例えば上述したように基材に凹部が形成されている場合には、上記凹部に光触媒含有細胞接着阻害材料層形成用塗工液を滴下し、乾燥させて光触媒含有細胞接着阻害材料層とするキャスト法や、上記基材の凹部に光触媒含有細胞接着阻害材料層形成用塗工液を滴下し、所定時間後、洗浄する吸着法等も用いることができる。

また、このような光触媒含有層の膜厚としては、細胞培養基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．０１μｍ〜１．０μｍ程度、中でも０．１μｍ〜０．３μｍ程度とすることができる。
以下、本工程により形成される光触媒含有細胞接着阻害材料層に用いられる各材料について説明する。なお、上記光触媒含有細胞接着阻害材料層に用いられる光触媒については、第１の態様で用いられるものと同様であるので、ここでの説明は省略する。

ａ．細胞接着阻害材料
まず、本態様において形成される光触媒含有細胞接着阻害材料層に用いられる、細胞接着阻害材料について説明する。

本態様に用いられる細胞接着阻害材料は、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有し、かつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性されるものであれば、その種類等は特に限定されるものではない。
ここで、上記細胞接着阻害性を有するとは、細胞が細胞接着阻害材料と接着することを阻害する性質を有することをいい、細胞との接着性が細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする細胞との接着を阻害する性質を有することをいう。

本態様に用いられる細胞接着阻害材料は、このような細胞接着阻害性を有しており、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって分解または変性されて、細胞接着阻害性を有しなくなるものや、細胞との接着性が良好となるものが用いられる。

このような細胞接着阻害材料としては、例えば水和能の高い材料を用いることができる。水和能の高い材料は、周りに水分子が集まった水和層が形成され、通常、このような水和能の高い物質は水分子との接着性の方が細胞との接着性より高いことから、細胞は上記水和能の高い材料と接着することができず、細胞との接着性が低いものとなるのである。ここで、上記水和能とは、水分子と水和する性質をいい、水和能が高いとは、水分子と水和しやすいことをいうこととする。

上記水和能が高く細胞接着阻害材料として用いられる材料としては、例えばポリエチレングリコールや、ベタイン構造等を有する両性イオン材料、リン脂質含有材料等が挙げられる。このような材料を上記細胞接着阻害材料として用いた場合、後述するエネルギー照射工程においてエネルギーが照射された際、光触媒の作用によって、上記細胞接着阻害材料が分解または変質等され、表面の水和層が離れることにより、上記細胞接着阻害性を有しないものとすることができるのである。

また、本態様においては、上記細胞接着阻害材料として、光触媒の作用により分解されるような、撥水性または撥油性の有機置換基を有する界面活性剤も用いることができる。このような界面活性剤としては、例えば、日光ケミカルズ（株）製ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ、ＢＣ、ＢＯ、ＢＢの各シリーズ等の炭化水素系、デュポン社製ＺＯＮＹＬ ＦＳＮ、ＦＳＯ、旭硝子（株）製サーフロンＳ−１４１、１４５、大日本インキ化学工業（株）製メガファックＦ−１４１、１４４、ネオス（株）製フタージェントＦ−２００、Ｆ２５１、ダイキン工業（株）製ユニダインＤＳ−４０１、４０２、スリーエム（株）製フロラードＦＣ−１７０、１７６等のフッ素系あるいはシリコーン系の非イオン界面活性剤を挙げることができ、また、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面活性剤、両性界面活性剤を用いることもできる。

このような材料を細胞接着阻害材料として用いて光触媒含有細胞接着阻害材料層を形成した際に、表面に上記細胞接着阻害材料が偏在することとなる。これにより、表面の撥水性や撥油性を高いものとすることができ、細胞との相互作用が小さく、細胞との接着性が低いものとすることができるのである。また、この層にエネルギー照射工程において、エネルギーが照射された場合には、光触媒の作用によって、容易に分解されて上記光触媒が露出し、上記細胞接着阻害性を有しないものとすることができるのである。

本態様においては、上記細胞接着阻害材料として、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞との接着性が良好となるものが用いられることが特に好ましく、このような細胞接着阻害材料としては、例えば撥油性や撥水性を有する材料が挙げられる。
細胞接着阻害材料として、上記撥水性または撥油性を有する材料を用いた場合には、細胞接着阻害材料の撥水性または撥油性によって、細胞と細胞接着阻害材料との間における、例えば疎水性相互作用等の相互作用が小さく、細胞との接着性を低いものとすることができる。

このような撥水性または撥油性を有する材料としては、例えば骨格が光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような撥水性または撥油性の有機置換基を有するもの等を挙げることができる。

骨格が光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものであって、光触媒の作用により分解されるような撥水性または撥油性の有機置換基を有するものとしては、例えば、（１）ゾルゲル反応等によりクロロまたはアルコキシシラン等を加水分解、重縮合して大きな強度を発揮するオルガノポリシロキサン、（２）反応性シリコーンを架橋したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。

上記の（１）の場合、一般式：
Ｙ_ｎＳｉＸ_{（４−ｎ）}
（ここで、Ｙはアルキル基、フルオロアルキル基、ビニル基、アミノ基、フェニル基またはエポキシ基、またはこれらを含む有機基であり、Ｘはアルコキシル基、アセチル基またはハロゲンを示す。ｎは０〜３までの整数である。）
で示される珪素化合物の１種または２種以上の加水分解縮合物もしくは共加水分解縮合物であるオルガノポリシロキサンであることが好ましい。なお、ここでＹで示される基の炭素数は１〜２０の範囲内であることが好ましく、また、Ｘで示されるアルコキシ基は、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基であることが好ましい。

また、上記有機基として、特にフルオロアルキル基を含有するポリシロキサンを好ましく用いることができ、具体的には、下記のフルオロアルキルシランの１種または２種以上の加水分解縮合物、共加水分解縮合物が挙げられ、一般にフッ素系シランカップリング剤として知られたものを使用することができる。

ＣＦ_３（ＣＦ_２）_３ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_５ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_７ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_９ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
（ＣＦ_３）_２ＣＦ（ＣＦ_２）_４ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
（ＣＦ_３）_２ＣＦ（ＣＦ_２）_６ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
（ＣＦ_３）_２ＣＦ（ＣＦ_２）_８ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（Ｃ_６Ｈ_４）Ｃ_２Ｈ_４Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_３（Ｃ_６Ｈ_４）Ｃ_２Ｈ_４Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_５（Ｃ_６Ｈ_４）Ｃ_２Ｈ_４Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_７（Ｃ_６Ｈ_４）Ｃ_２Ｈ_４Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_３ＣＨ_２ＣＨ_２ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_５ＣＨ_２ＣＨ_２ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_７ＣＨ_２ＣＨ_２ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_９ＣＨ_２ＣＨ_２ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
（ＣＦ_３）_２ＣＦ（ＣＦ_２）_４ＣＨ_２ＣＨ_２ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
（ＣＦ_３）_２ＣＦ（ＣＦ_２）_６ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ ＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
（ＣＦ_３）_２ＣＦ（ＣＦ_２）_８ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ ＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
ＣＦ_３（Ｃ_６Ｈ_４）Ｃ_２Ｈ_４ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_３（Ｃ_６Ｈ_４）Ｃ_２Ｈ_４ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_５（Ｃ_６Ｈ_４）Ｃ_２Ｈ_４ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_７（Ｃ_６Ｈ_４）Ｃ_２Ｈ_４ＳｉＣＨ_３（ＯＣＨ_３）_２；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_３ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_５ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_７ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_９ＣＨ_２ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_２ＣＨ_３）_３；
ＣＦ_３（ＣＦ_２）_７ＳＯ_２Ｎ（Ｃ_２Ｈ_５）Ｃ_２Ｈ_４ＣＨ_２Ｓｉ（ＯＣＨ_３）_３。

上記のようなフルオロアルキル基を含有するポリシロキサンを細胞接着阻害材料として用いることにより、撥水性や撥油性を高いものとすることができ、細胞との相互作用が小さく、細胞との接着性が低いものとすることができる。また、上記のような材料にエネルギーが照射された場合には、容易にフッ素等を除去して表面にＯＨ基等を導入することができ、細胞との相互作用を大きなものとできることから、細胞との接着性を良好なものとすることができるのである。

また、上記の（２）の反応性シリコーンとしては、下記一般式で表される骨格をもつ化合物を挙げることができる。

ただし、ｎは２以上の整数であり、Ｒ^１，Ｒ^２はそれぞれ炭素数１〜２０の置換もしくは非置換のアルキル、アルケニル、アリールあるいはシアノアルキル基であり、モル比で全体の４０％以下がビニル、フェニル、ハロゲン化フェニルである。また、Ｒ^１、Ｒ^２がメチル基のものが表面エネルギーが最も小さくなるので好ましく、モル比でメチル基が６０％以上であることが好ましい。また、鎖末端もしくは側鎖には、分子鎖中に少なくとも１個以上の水酸基等の反応性基を有する。

また、上記のオルガノポリシロキサンとともに、ジメチルポリシロキサンのような架橋反応をしない安定なオルガノシリコン化合物を別途混合してもよい。
上記のような反応性シリコーンを用いることにより、撥水性や撥油性を高いものとすることができ、細胞との相互作用が小さく、細胞との接着性が低いものとすることができる。また、上記のような材料にエネルギーが照射された場合には、容易に置換基を除去して表面にＯＨ基等を導入することができ、細胞との相互作用を大きなものとできることから、細胞との接着性を良好なものとすることができるのである。

ここで、上記のようなポリシロキサンや反応性シリコーンを細胞接着阻害材料として用いた場合、エネルギー照射工程においてエネルギーが照射された領域を、親水性を有する領域とすることができ、エネルギーが照射されていない細胞接着阻害部を撥水性とすることができる。これにより、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により、細胞含有液を塗布する際に、細胞接着阻害部には細胞が付着せず、細胞接着部のみに細胞が付着するため、より高精細なパターン状に細胞を付着させることができる、という利点を有する。

上記親水性とは、水との接触角が小さいことをいい、また、撥水性とは、水との接触角が大きいことをいう。具体的には、エネルギー照射していない部分、すなわち撥水性を有する細胞接着阻害部においては、水との接触角が、１００°以上、中でも１１０°〜１３０°の範囲内であることが好ましい。上記範囲より水との接触角が小さい場合には、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により塗布された細胞含有液が、細胞接着阻害部上に付着してしまう可能性があるからである。なお、例えば“Ogawa他, Japanese Journal of Applied Physics P2,32, (1993) L614-”に述べられている手法、例えば減圧プラズマ処理を基材に施し、基材に微細な凹凸を刻み、さらにその上に撥水撥油性材料を塗布することにより、表面の撥水撥油性をさらに向上させることができる。このような表面を用いた場合には、上記細胞接着阻害部の水との接触角を１６０°程度まで、高くすることも可能である。

また、エネルギー照射された部分、すなわち親水性を有する細胞接着部においては、水との接触角が、５０°以下、中でも１０°〜４０°、特に１５°〜３０°の範囲内であることが好ましい。上記範囲より水との接触角が大きい場合には、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により塗布された細胞含有液を細胞接着部がはじいてしまい、細胞を付着させることができない可能性があるからである。

なお、ここでいう水との接触角は、水、もしくは同等の接触角を有する液体との接触角を接触角測定器（協和界面科学（株）製ＣＡ−Ｚ型）を用いて測定（マイクロシリンジから液滴を滴下して３０秒後）し、その結果から、もしくはその結果をグラフにして得たものである。

このような細胞接着阻害材料は、光触媒含有細胞接着阻害材料層中に０．０１重量％〜９５重量％、中でも１重量％〜１０重量％の範囲内含有されることが好ましい。これにより、細胞接着阻害材料を含有する領域を細胞との接着性が低い領域とすることができるからである。

なお、上記細胞接着阻害材料は、界面活性を有することが好ましい。例えば、上記細胞接着阻害材料を含有する光触媒含有細胞接着阻害材料層形成用塗工液等を塗布した後、乾燥させる際等に、塗膜表面に偏在する割合が高まり、結果として良好な細胞接着阻害性を得られるからである。

（その他）
また、本態様の光触媒含有細胞接着阻害材料層には、例えば層を形成する際の塗工性や、層を形成した際の強度や耐性等、パターニング用基板用コーティング液が必要とされる特性に合わせてバインダ等が含有されていてもよい。また、上記細胞接着阻害材料が上記バインダとしての機能を果たすものであってもよい。

このようなバインダとしては、例えば主骨格が上記光触媒の作用により分解されないような高い結合エネルギーを有するものを用いることができる。具体的には、有機置換基を有しない、もしくは接着性に影響を与えない程度の有機置換基を有するポリシロキサン等を挙げることができ、これらはテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン等を加水分解、重縮合することにより得ることができる。

本態様においては、このようなバインダは、光触媒含有細胞接着阻害材料層中に５重量％〜９５重量％、中でも４０重量％〜９０重量％、特に６０重量％〜８０重量％の範囲内含有されることが好ましい。これにより、各種の特性を発揮することが可能となるからである。

また、本態様においては特に、上記光触媒含有細胞接着阻害材料層中に、少なくともエネルギー照射された後に、細胞と接着性を有する細胞接着材料が含有されることが好ましい。これにより、光触媒含有細胞接着阻害材料層が、後述するエネルギー照射工程において、エネルギーが照射された領域の細胞との接着性をより良好なものとすることができるからである。このような細胞接着材料としては、上記バインダとして用いられるものであってもよく、また、バインダと別に使用されるものであってもよい。また例えば、エネルギー照射される前から細胞と良好な接着性を有するものであってもよく、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞と良好な接着性を有するものとなるものであってもよい。ここで、上記細胞と接着性を有するとは、細胞と良好に接着することをいい、細胞との接着性が細胞の種類によって異なる場合等には、目的とする細胞と良好に接着することをいう。

本態様においては、少なくともエネルギー照射された後に、上記細胞接着材料が細胞と良好な接着性を有するものであれば、細胞との接着が、例えば疎水性相互作用や、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワールス力等の物理的相互作用により良好なものとされるものであってもよく、生物学的特性により、良好なものとされるものであってもよい。

本態様においては、このような細胞接着材料は、光触媒含有細胞接着阻害材料層中に０．０１重量％〜９５重量％、中でも１重量％〜１０重量％の範囲内含有されることが好ましい。これにより、光触媒含有細胞接着阻害材料層が、後述するエネルギー照射工程においてエネルギー照射された領域の細胞との接着性をより良好なものとすることができるからである。また、エネルギー照射される前から細胞と良好な接着性を有する材料を細胞接着材料として用いる場合には、エネルギーが照射されない領域において、上記細胞接着阻害材料の細胞接着阻害性を阻害しない程度含有されることが好ましい。

（３）第３の態様
本工程の第３の態様により得られるパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層、および、上記光触媒含有層上に形成された細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、上記細胞接着層は、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を少なくとも含有するものである。

本態様においては、上記細胞培養パターニング用層が、上記細胞接着層および光触媒含有層を有することから、後述するエネルギー照射工程において、エネルギー照射をすることにより、光触媒含有層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着層中の細胞接着材料を分解または変性させて、細胞接着阻害部を形成することができるのである。

ここで、本態様によれば、上記光触媒含有層上に上記細胞接着層が形成されていることから、細胞を培養する際、細胞が直接光触媒と接触することがなく、細胞が経時で光触媒の影響を受ける可能性を低いものとすることができる、という利点を有する。
以下、本態様により形成される細胞培養パターニング用層の細胞接着層、および光触媒含有層について説明する。なお、本態様に用いられる基材については、上述した第１の態様で説明したものと同様のものを用いることができるので、ここでの説明は省略する。

（細胞接着層）
まず、本態様において形成される細胞培養パターニング用層に含まれる細胞接着層について説明する。本態様において形成される細胞接着層は、後述する光触媒含有層上に形成されるものであり、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を少なくとも含有する層である。

本態様においては、このような層が形成可能であれば、その形成方法等は特に限定されるものではなく、例えば、上記細胞接着材料を含有する細胞接着層形成用塗工液を、上述した塗布方法等によって塗布することにより、形成することができる。
また、上述したように基材に凹部が形成されている場合には、上記基材の凹部に後述する光触媒含有層を形成した後、上記凹部に細胞接着層形成用塗工液を滴下し、乾燥させて細胞接着層とするキャスト法や、上記基材の凹部に後述する光触媒含有層を形成した後、細胞接着層形成用塗工液を滴下し、所定時間後、洗浄する吸着法等も用いることができる。

このような細胞接着層の膜厚は、細胞培養基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．００１μｍ〜１μｍ程度、中でも０．００５μｍ〜０．１μｍ程度とすることができる。

ここで、本態様において形成される細胞接着層に用いられる具体的な細胞接着材料としては、第１の態様で説明した光触媒含有細胞接着層に用いられる細胞接着材料と同様のものを用いることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。また、本態様の細胞接着層にも、第１の態様で説明した光触媒含有細胞接着層で説明した細胞接着阻害性を有する材料が含有されていることが好ましい。これにより、エネルギー照射工程において、エネルギー照射された領域の細胞との接着性を低いものとすることが可能となるからである。

（光触媒含有層）
次に、本態様において形成される細胞培養パターニング用層に含まれる光触媒含有層について説明する。本態様において形成される光触媒含有層は、少なくとも光触媒を含有する層であれば、特に限定されるものではなく、光触媒のみからなる層であってもよく、またバインダ等、他の成分を含有する層等であってもよい。

本態様で使用する光触媒としては、第１の態様における光触媒含有細胞接着層に用いられるものと同様とすることができ、本態様においても特に酸化チタンが用いられることが好ましい。

ここで、光触媒のみからなる光触媒含有層を用いた場合には、上記細胞接着層中の細胞接着材料の分解または変性に対する効率が向上し、処理時間の短縮化等のコスト面で有利である。一方、光触媒とバインダとからなる光触媒含有層を用いた場合には、光触媒含有層の形成が容易であるという利点を有する。

光触媒のみからなる光触媒含有層の形成方法としては、例えば、スパッタリング法、ＣＶＤ法、真空蒸着法等の真空製膜法を用いる方法を挙げることができる。真空製膜法により光触媒含有層を形成することにより、均一な膜でかつ光触媒のみを含有する光触媒含有層とすることが可能であり、これにより細胞接着材料を均一に分解または変性させることが可能であり、かつ光触媒のみからなることから、バインダを用いる場合と比較して効率的に細胞接着材料を分解または変性させることが可能となる。なお、上述した基材に凹部が形成されている場合にも、上記方法により光触媒含有層を形成することができる。

また、光触媒のみからなる光触媒含有層の形成方法の他の例としては、例えば光触媒が二酸化チタンの場合は、基材上に無定形チタニアを形成し、次いで焼成により結晶性チタニアに相変化させる方法等が挙げられる。ここで用いられる無定形チタニアとしては、例えば四塩化チタン、硫酸チタン等のチタンの無機塩の加水分解、脱水縮合、テトラエトキシチタン、テトライソプロポキシチタン、テトラ−ｎ−プロポキシチタン、テトラブトキシチタン、テトラメトキシチタン等の有機チタン化合物を酸存在下において加水分解、脱水縮合によって得ることができる。次いで、４００℃〜５００℃における焼成によってアナターゼ型チタニアに変性し、６００℃〜７００℃の焼成によってルチル型チタニアに変性することができる。

また、バインダを用いる場合は、バインダの主骨格が上記の光触媒の光励起により分解されないような高い結合エネルギーを有するものが好ましく、例えばこのようなバインダとしては、上述した細胞接着層の項で説明したオルガノポリシロキサン等を挙げることができる。

このようにオルガノポリシロキサンをバインダとして用いた場合は、上記光触媒含有層は、光触媒とバインダであるオルガノポリシロキサンを必要に応じて他の添加剤とともに溶剤中に分散して塗布液を調製し、この塗布液を基材上に塗布することにより形成することができる。使用する溶剤としては、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系の有機溶剤が好ましい。塗布はスピンコート、スプレーコート、ディップコート、ロールコート、ビードコート等の公知の塗布方法により行うことができる。バインダとして紫外線硬化型の成分を含有している場合、紫外線を照射して硬化処理を行うことにより光触媒含有層を形成することができる。

また、上述した基材に凹部が形成されている場合には、上記塗布液を凹部に滴下し、乾燥させて光触媒含有層を形成するキャスト法等も行うことができる。
また、バインダとして無定形シリカ前駆体を用いることができる。この無定形シリカ前駆体は、一般式ＳｉＸ₄で表され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。

具体的には、テトラエトキシシラン、テトライソプロポキシシラン、テトラ−ｎ−プロポキシシラン、テトラブトキシシラン、テトラメトキシシラン等が挙げられる。また、この場合には、無定形シリカの前駆体と光触媒の粒子とを非水性溶媒中に均一に分散させ、透明基材上に空気中の水分により加水分解させてシラノールを形成させた後、常温で脱水縮重合することにより光触媒含有層を形成できる。シラノールの脱水縮重合を１００℃以上で行えば、シラノールの重合度が増し、膜表面の強度を向上できる。また、これらの結着剤は、単独あるいは２種以上を混合して用いることができる。

光触媒含有層中の光触媒の含有量は、５〜６０重量％、好ましくは２０〜４０重量％の範囲で設定することができる。また、光触媒含有層の厚みは、０．０５〜１０μｍの範囲内が好ましい。
また、光触媒含有層には上記の光触媒、バインダの他に、上述した細胞接着層に用いられる界面活性剤等を含有させることもできる。

また、本態様においては、上述したように上記光触媒含有層上に遮光部が形成されていてもよい。これにより、後述するエネルギー照射工程において、上記細胞接着層の全面にエネルギーを照射した場合であっても、遮光部が形成された領域上の光触媒は励起されず、遮光部が形成された領域以外の細胞接着層中に含有される細胞接着材料を分解または変性させることができるからである。またこの場合、遮光部が形成されている領域の光触媒は励起されないことから、エネルギーが照射される方向が特に限定されない、という利点も有する。
このような遮光部としては、第１の態様の基材の項で説明したものと同様のものを用いることが可能であるので、ここでの詳しい説明は省略する。

（４）第４の態様
本工程の第４の態様により形成されるパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成され、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層、および、上記光触媒含有層上に形成された細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、上記細胞接着阻害材料層は、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有するものである。

本態様においては、上記細胞培養パターニング用層が、上記細胞接着阻害材料層および光触媒含有層を有することから、後述するエネルギー照射工程において、エネルギー照射をすることにより、光触媒含有層中に含有される光触媒の作用により、細胞接着阻害材料層中の細胞接着阻害材料を分解または変性させることができ、細胞接着部を形成することが可能となるのである。
以下、本態様により形成される細胞培養パターニング用層に含まれる細胞接着阻害材料層について説明する。なお、本態様に用いられる基材については、上述した第１の態様で説明したものと同様のものを用いることができ、また光触媒含有層については、上述した第３の態様で説明したものと同様のものを用いることができるので、ここでの説明は省略する。

（細胞接着阻害材料層）
本態様において形成される細胞接着阻害材料層は、上記光触媒含有層上に形成されるものであり、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有するものであれば特に限定されるものである。

本態様においては、このような層が形成可能であれば、その形成方法等は特に限定されるものではなく、例えば、上記細胞接着阻害材料を含有する細胞接着阻害材料層形成用塗工液を、上述した塗布方法等によって塗布することにより、形成することができる。

また、上述したように基材に凹部が形成されている場合には、上記基材の凹部に後述する光触媒含有層を形成した後、上記凹部に細胞接着阻害材料層形成用塗工液を滴下し、乾燥させて細胞接着阻害材料層とするキャスト法や、上記基材の凹部に後述する光触媒含有層を形成した後、細胞接着阻害材料層形成用塗工液を滴下し、所定時間後、洗浄する吸着法等も用いることができる。

また、このような細胞接着阻害材料層の膜厚は、細胞培養基板の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常０．０１μｍ〜１．０μｍ程度、中でも０．１μｍ〜０．３μｍ程度とすることができる。

ここで、本態様において形成される細胞接着阻害材料層に用いられる具体的な細胞接着阻害材料としては、第２の態様で説明した光触媒含有細胞接着阻害材料層に用いられる細胞接着阻害材料と同様のものを用いることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。また、本態様の細胞接着阻害材料層にも、第２の態様で説明した光触媒含有細胞接着阻害材料層で説明した細胞接着性を有する材料が含有されていることが好ましい。これにより、後述するエネルギー照射工程において、エネルギー照射された領域の細胞との接着性を高いものとすることが可能となるからである。

また本態様においても、後述するエネルギー照射工程においてエネルギーが照射された領域を、親水性を有する領域とすることができ、エネルギーが照射されていない細胞接着阻害部を撥水性とすることができる材料を細胞接着阻害材料として用いることが好ましい。これにより、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により、細胞含有液を塗布する際に、細胞接着阻害部には細胞が付着せず、細胞接着部のみに細胞が付着するため、より高精細なパターン状に細胞を付着させることができる、という利点を有する。

具体的には、エネルギー照射していない部分、すなわち撥水性を有する細胞接着阻害部においては、水との接触角が、１００°以上、中でも１１０°〜１３０°の範囲内であることが好ましい。上記範囲より水との接触角が小さい場合には、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により塗布された細胞含有液が、細胞接着阻害部上に付着してしまう可能性があるからである。なお、上記水との接触角は、基材に凹凸を形成して測定した場合には、上述したように、１６０°程度まで、高くすることも可能である。

また、エネルギー照射された部分、すなわち親水性を有する細胞接着部においては、水との接触角が、５０°以下、中でも１０°〜４０°、特に１５°〜３０°の範囲内であることが好ましい。上記範囲より水との接触角が大きい場合には、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により塗布された細胞含有液を細胞接着部がはじいてしまい、細胞を付着させることができない可能性があるからである。なお、ここでいう水との接触角は、上述した方法により測定することができる。

（５）第５の態様
本工程の第５の態様により形成されるパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものである。

本態様においては、上記細胞接着層中に、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性させる細胞接着材料が含有されていることから、後述するエネルギー照射工程において、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板を用いてエネルギーを照射することによって、上記細胞接着層の細胞接着材料を分解または変性させることができ、細胞被接着部を形成することができるのである。ここで、本態様においては、上記細胞培養パターニング用層中に光触媒が含有されている必要がないことから、経時的に劣化が少ないものとすることができる。
なお、本態様に用いられる基材については、上述した第１の態様で説明したものと同様のものを用いることができ、また細胞接着層については、第３の態様で説明したものと同様のものを用いることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。

（６）第６の態様
本工程の第６の態様により得られるパターニング用基板は、基材と、上記基材上に形成され、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性される細胞接着阻害材料を含有する細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものである。

本態様においては、上記細胞接着阻害材料層中に、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性させる細胞接着阻害材料が含有されていることから、後述するエネルギー照射工程において、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板を用いてエネルギーを照射することによって、上記細胞接着阻害材料層の細胞接着阻害材料を分解または変性させることができる。ここで、本態様においては、上記細胞培養パターニング用層中に光触媒が含有されている必要がないことから、経時的に劣化が少ないものとすることができる。

なお、本態様に用いられる基材については、上述した第１の態様で説明したものと同様のものを用いることができ、細胞接着阻害材料層については、第４の態様で説明したものと同様のものを用いることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。

ここで、本態様においても、エネルギー照射工程においてエネルギーが照射された領域を、親水性を有する領域とすることができ、エネルギーが照射されていない細胞接着阻害部を撥水性とすることができる材料を細胞接着阻害材料として用いることが好ましい。これにより、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により、細胞含有液を塗布する際に、細胞接着阻害部には細胞が付着せず、細胞接着部のみに細胞が付着するため、より高精細なパターン状に細胞を付着させることができる、という利点を有する。

具体的には、エネルギー照射していない部分、すなわち撥水性を有する細胞接着阻害部においては、水との接触角が、１００°以上、中でも１１０°〜１３０°の範囲内であることが好ましい。上記範囲より水との接触角が小さい場合には、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により塗布された細胞含有液が、細胞接着阻害部上に付着してしまう可能性があるからである。なお、上記水との接触角は、基材に凹凸を形成して測定した場合には、上述したように、１６０°程度まで、高くすることも可能である。

また、エネルギー照射された部分、すなわち親水性を有する細胞接着部においては、水との接触角が、５０°以下、中でも１０°〜４０°、特に１５°〜３０°の範囲内であることが好ましい。上記範囲より水との接触角が大きい場合には、後述する細胞含有液塗布工程において、部位選択塗布法により塗布された細胞含有液が、細胞接着部がはじいてしまい、細胞を付着させることができない可能性があるからである。なお、ここでいう水との接触角は、上述した方法により測定することができる。

２．エネルギー照射工程
次に、本発明の細胞培養基板の製造方法におけるエネルギー照射工程について説明する。本発明におけるエネルギー照射工程は、上記細胞培養パターニング用層に、エネルギーを照射し、光触媒の作用により上記細胞接着部と上記細胞接着阻害部とをパターン状に形成する工程である。

本工程は、エネルギーを照射し、細胞接着部と細胞接着阻害部とを形成する態様としては、上記パターニング用基板の６つの態様に応じて、同様に６つの態様とすることができる。

（１）第１の態様
本工程の第１の態様は、上記パターニング用基板が第１の態様の場合に行われるものであり、所定の方向からエネルギー照射し、上記光触媒含有細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成するものである。

本態様のエネルギー照射工程は、例えば図１に示すように、基材１上に形成された、上記細胞接着材料および光触媒を含有する光触媒含有細胞接着層２に、例えばフォトマスク３等を用いてエネルギー４を、細胞接着阻害部を形成するパターン状に照射する工程である（図１（ａ））。これにより、エネルギー照射された領域の細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部５と、エネルギー照射されず、細胞接着材料が残存する細胞接着部６とを形成することができる（図１（ｂ））。

本態様においては、細胞接着阻害部を形成するパターン状に、エネルギーを照射することにより、光触媒含有細胞接着層中に含有される光触媒が励起し、細胞接着材料を分解または変性させることができ、エネルギーが照射された領域は、細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部、エネルギーが照射されていない領域は、細胞接着材料が残存する細胞接着部とすることができるのである。この際、細胞接着阻害部には、光触媒、および細胞接着材料の分解物や変性物等が含有されることとなる。

ここで、本態様でいうエネルギー照射（露光）とは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着材料を分解または変性させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、光の照射に限定されるものではない。

通常このようなエネルギー照射に用いる光の波長は、４００ｎｍ以下の範囲、好ましくは３８０ｎｍ以下の範囲から設定される。これは、上述したように光触媒として用いられる好ましい光触媒が二酸化チタンであり、この二酸化チタンにより光触媒作用を活性化させるエネルギーとして、上述した波長の光が好ましいからである。
このようなエネルギー照射に用いることができる光源としては、水銀ランプ、メタルハライドランプ、キセノンランプ、エキシマランプ、その他種々の光源を挙げることができる。

上述したような光源を用い、フォトマスクを介したパターン照射により行う方法の他、エキシマ、ＹＡＧ等のレーザを用いてパターン状に描画照射する方法を用いることも可能である。また、上述したように、基材が細胞接着部と同じパターン状に遮光部を有する場合には、基材側からエネルギーを全面に照射することにより、行うことができる。この場合、フォトマスク等が必要なく、位置あわせ等の工程が必要ない、という利点を有する。

ここで、上述したように、上記基材が凹部を有しており、上記凹部内に上記光触媒含有細胞接着層が形成されている場合、上述した方法によりエネルギー照射を行ってもよい。また、例えば上記凹部が複数形成されている場合には、例えば各凹部ごとにそれぞれ異なるパターン状に露光を行ってもよい。このように各凹部ごとにそれぞれ露光を行う方法としては、例えば１つ１つの凹部に異なるマスクを配置してエネルギー照射する方法や、例えば光ファイバの先に、クロムマスクやステンシルマスク等を配置し、エネルギー照射する方法等が挙げられる。

なお、上記凹部の側壁にエネルギーが照射されないように、例えば筒状のマスク等を用い、上記凹部の底面のみ露光を行う方法を用いてもよい。
また、エネルギー照射に際してのエネルギーの照射量は、光触媒の作用によって細胞接着材料が分解または変性されるのに必要な照射量とする。

この際、光触媒が含有される光触媒含有細胞接着層を加熱しながらエネルギー照射することにより、感度を上昇させることが可能となり、効率的に細胞接着材料を分解または変性させることができる点で好ましい。具体的には３０℃〜８０℃の範囲内で加熱することが好ましい。

本態様におけるフォトマスクを介して行うエネルギー照射の方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および光触媒含有細胞接着層側のいずれの方向からエネルギー照射を行っても良い。一方、基材が不透明な場合は、光触媒含有細胞接着層側からエネルギー照射を行う必要がある。

なお、本態様においては、上記細胞接着部および細胞接着阻害部がパターン状に形成されたパターニング用基板（以下、細胞培養用パターニング基板ともいう。）の一部を切り取り、この細胞培養用パターニング基板の一部を凹状の基材の底部等に貼り付けた後、後述する細胞含有液塗布工程を行ってもよい。

（２）第２の態様
本工程の第２の態様は、上記パターニング用基板が第２の態様の場合に行われるものであり、所定の方向からエネルギー照射し、上記光触媒含有細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、上記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成するものである。

本態様においては、細胞接着部を形成するパターン状に、エネルギーを照射することにより、光触媒含有細胞接着阻害材料層中に含有される光触媒が励起され、細胞接着阻害材料を分解または変性させることができ、エネルギーが照射された領域を細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部、エネルギーが照射されていない領域を細胞接着阻害材料が残存する細胞接着阻害部とすることができるのである。この際、細胞接着部には、光触媒、および細胞接着阻害材料の分解物や変性物等が含有されることとなる。なお、エネルギーの照射方法等については、第１の態様と同様であるので、ここでの説明は省略する。

また本態様においても、上記細胞接着部および細胞接着阻害部がパターン状に形成されたパターニング用基板（以下、細胞培養用パターニング基板ともいう。）の一部を切り取り、この細胞培養用パターニング基板の一部を凹状の基材の底部等に貼り付けた後、後述する細胞含有液塗布工程を行ってもよい。

（３）第３の態様
本工程の第３の態様は、上記パターニング用基板が第３の態様の場合に行われるものであり、上記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成するものである。

本態様においては、細胞接着阻害部を形成するパターン状に、エネルギーを照射することにより、光触媒含有層中に含有される光触媒が励起され、細胞接着材料を分解または変性させることができ、エネルギーが照射された領域を、細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部、エネルギーが照射されていない領域を、細胞接着材料が残存する細胞接着部とすることができるのである。この際、細胞接着阻害部には、例えば上記細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、細胞接着材料が少量含有されている、または細胞接着材料の分解物等が含有されている、もしくは細胞接着層が完全に分解除去されて光触媒含有層が露出すること等となる。また、上記細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、細胞接着阻害部中にはその変性物等が含有されていることとなる。なお、エネルギーの照射方法等については、第１の態様と同様であるので、ここでの説明は省略する。

また本態様においても、上記細胞接着部および細胞接着阻害部がパターン状に形成されたパターニング用基板（以下、細胞培養用パターニング基板ともいう。）の一部を切り取り、この細胞培養用パターニング基板の一部を凹状の基材の底部等に貼り付けた後、後述する細胞含有液塗布工程を行ってもよい。

（４）第４の態様
本工程の第４の態様は、上記パターニング用基板が第４の態様の場合に行われるものであり、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、上記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成する工程である。

本態様においては、細胞接着部を形成するパターン状に、エネルギーを照射することにより、光触媒含有層中に含有される光触媒が励起され、細胞接着阻害材料を分解または変性させることができ、エネルギーが照射された領域を、細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部、エネルギーが照射されていない領域を、細胞接着阻害材料が残存する細胞接着部とすることができるのである。

ここで、上記細胞接着阻害材料が分解または変性されているとは、上記細胞接着阻害材料が含有されていない、もしくは上記細胞接着阻害部に含有される細胞接着阻害材料の量と比較して、細胞接着阻害材料が少ない量含有されていることをいう。例えば上記細胞接着阻害材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、細胞接着部中にはその細胞接着阻害材料が少量含有されている、または細胞接着阻害材料の分解物等が含有されている、もしくは細胞接着阻害材料層が完全に分解除去されて光触媒含有層が露出すること等となる。また、上記細胞接着阻害材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、細胞接着部中にはその変性物等が含有されていることとなる。本態様においては、上記細胞接着部に、少なくともエネルギー照射された後に、細胞との接着性を有する細胞接着物質が含有されていることが好ましい。これにより、細胞接着部の細胞との接着性をより高いものとすることができ、上記細胞接着部のみに、高精細に細胞を接着させることが可能となるからである。なお、エネルギーの照射方法等については、第１の態様と同様であるので、ここでの説明は省略する。
また本態様においても、上記細胞接着部および細胞接着阻害部がパターン状に形成されたパターニング用基板（以下、細胞培養用パターニング基板ともいう。）の一部を切り取り、この細胞培養用パターニング基板の一部を凹状の基材の底部等に貼り付けた後、後述する細胞含有液塗布工程を行ってもよい。

（５）第５の態様
本工程の第５の態様は、上記パターニング用基板が第５の態様の場合に行われるものであり、上記細胞接着層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、上記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成するものである。

本態様のエネルギー照射工程は、例えば図２に示すように、基材１上に形成された細胞接着層１２と、光触媒を含有する光触媒含有層２１および基体２２を有する光触媒含有層基板２３の光触媒含有層２１とを、対向するように配置した後、例えばフォトマスク３等を用いて、細胞接着阻害部を形成するパターン状にエネルギー４を照射する（図２（ａ））。これにより、エネルギーが照射されて細胞接着材料が分解または変性された領域を細胞接着阻害部５、エネルギーが照射されずに細胞接着材料が残存する領域を細胞接着部６が形成される（図２（ｂ））。

本態様においては、細胞接着阻害部を形成するパターン状に、上記光触媒含有層側基板を用いてエネルギーを照射することにより、光触媒含有層中に含有される光触媒が励起し、細胞接着材料を分解または変性させることができ、エネルギーが照射された領域を、細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部、エネルギーが照射されていない領域を、細胞接着材料が残存する細胞接着部とすることができるのである。この際、細胞接着阻害部は、例えば上記細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、細胞接着阻害部中にはその細胞接着材料が少量含有されている、または細胞接着材料の分解物等が含有されている、もしくは細胞接着層が完全に分解除去されて基材が露出すること等となる。また、上記細胞接着材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、細胞接着阻害部中にはその変性物等が含有されていることとなる。
以下、本態様に用いられる光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板、およびエネルギーの照射方法について、説明する。

ａ．光触媒含有層側基板
まず、本態様に用いられる光触媒を含有する光触媒含有層を有する光触媒含有層側基板について説明する。本態様に用いられる光触媒含有層側基板としては、通常、光触媒を含有する光触媒含有層を有するものであり、通常、基体と、その基体上に光触媒含有層が形成されているものである。この光触媒含有層側基板は、例えばパターン状に形成された光触媒含有層側遮光部やプライマー層等を有していてもよい。以下、本態様に用いられる光触媒含有層側基板の各構成について説明する。

（ｉ）光触媒含有層
まず、光触媒含有層側基板に用いられる光触媒含有層について説明する。本態様に用いられる光触媒含有層は、光触媒含有層中の光触媒が、近接する細胞接着層中の細胞接着材料を分解または変性させるような構成であれば、特に限定されるものではなく、光触媒とバインダとから構成されているものであってもよく、光触媒単体で製膜されたものであってもよい。

本態様において用いられる光触媒含有層は、例えば図２（ａ）に示すように、基体２２上に光触媒含有層２１が全面に形成されたものであってもよいが、例えば図３に示すように、基体２２上に光触媒含有層２１がパターン上に形成されたものであってもよい。

このように光触媒含有層をパターン状に形成することにより、細胞接着阻害部を形成するためにエネルギーを照射する際に、フォトマスク等を用いてパターン照射をする必要がなく、全面に照射することにより、細胞接着層に含有される細胞接着材料がパターン状に分解または変性された細胞接着阻害部を形成することができる。
この光触媒含有層のパターニング方法は、特に限定されるものではないが、例えばフォトリソグラフィー法等により行うことが可能である。

また、実際に光触媒含有層に面する細胞接着層上の部分のみの、細胞接着材料が分解または変性されるものであるので、エネルギーの照射方向は上記光触媒含有層と細胞接着層とが面する部分にエネルギーが照射されるものであれば、いかなる方向から照射されてもよく、さらには、照射されるエネルギーも特に平行光等の平行なものに限定されないという利点を有するものとなる。
ここで、本態様で用いられる光触媒含有層については、上述した「１．パターニング用基板形成工程」の第３の態様で説明した光触媒含有層と同様のものを用いることが可能であるので、ここでの詳しい説明は省略する。

（ii）基体
次に、光触媒含有層側基板に用いられる基体について説明する。通常、光触媒含有層側基板は、少なくとも基体とこの基体上に形成された光触媒含有層とを有するものである。この際、用いられる基体を構成する材料は、後述するエネルギーの照射方向や、得られるパターン形成体が透明性を必要とするか等により適宜選択される。

また本態様に用いられる基体は、可撓性を有するもの、例えば樹脂製フィルム等であってもよいし、可撓性を有しないもの、例えばガラス基板等であってもよい。これは、エネルギー照射方法により適宜選択されるものである。
なお、基体表面と光触媒含有層との密着性を向上させるために、基体上にアンカー層を形成するようにしてもよい。このようなアンカー層としては、例えば、シラン系、チタン系のカップリング剤等を挙げることができる。

（iii）光触媒含有層側遮光部
本態様に用いられる光触媒含有層側基板には、パターン状に形成された光触媒含有層側遮光部が形成されたものを用いても良い。このように光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板を用いることにより、エネルギー照射に際して、フォトマスクを用いたり、レーザ光による描画照射を行う必要がない。したがって、光触媒含有層側基板とフォトマスクとの位置合わせが不要であることから、簡便な工程とすることが可能であり、また描画照射に必要な高価な装置も不必要であることから、コスト的に有利となるという利点を有する。
このような光触媒含有層側遮光部を有する光触媒含有層側基板は、光触媒含有層側遮光部の形成位置により、下記の二つの態様とすることができる。

一つが、例えば図４に示すように、基体２２上に光触媒含有層側遮光部２４を形成し、この光触媒含有層側遮光部２４上に光触媒含有層２１を形成して、光触媒含有層側基板とする態様である。もう一つは、例えば図５に示すように、基体２２上に光触媒含有層２１を形成し、その上に光触媒含有層側遮光部２４を形成して光触媒含有層側基板とする態様である。

いずれの態様においても、フォトマスクを用いる場合と比較すると、光触媒含有層側遮光部が、上記光触媒含有層と細胞接着層との配置部分の近傍に配置されることになるので、基体内等におけるエネルギーの散乱の影響を少なくすることができることから、エネルギーのパターン照射を極めて正確に行うことが可能となる。

ここで、本態様においては、図５に示すような光触媒含有層２１上に光触媒含有層側遮光部２４を形成する態様である場合には、光触媒含有層と細胞接着層とを所定の位置に配置する際に、この光触媒含有層側遮光部の膜厚をこの間隙の幅と一致させておくことにより、上記光触媒含有層側遮光部を上記間隙を一定のものとするためのスペーサとしても用いることができるという利点を有する。

すなわち、所定の間隙をおいて上記光触媒含有層と細胞接着層とを対向させた状態で配置する際に、上記光触媒含有層側遮光部と細胞接着層とを密着させた状態で配置することにより、上記所定の間隙を正確とすることが可能となり、そしてこの状態でエネルギーを照射することにより、細胞接着層と遮光部とが接触している部分の細胞接着層は、細胞接着材料が分解または変性されないことから、細胞接着阻害部を精度良く形成することが可能となるのである。

このような光触媒含有層側遮光部の形成方法は、特に限定されるものではなく、光触媒含有層側遮光部の形成面の特性や、必要とするエネルギーに対する遮蔽性等に応じて適宜選択されて用いられ、「１．パターニング用基板形成工程」の第１の態様で説明した基材上に設けられる遮光部と同様のものとすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。

なお、上記説明においては、光触媒含有層側遮光部の形成位置として、基体と光触媒含有層との間、および光触媒含有層表面の二つの場合について説明したが、その他、基体の光触媒含有層が形成されていない側の表面に光触媒含有層側遮光部を形成する態様も採ることが可能である。この態様においては、例えばフォトマスクをこの表面に着脱可能な程度に密着させる場合等が考えられ、細胞接着阻害部のパターンを小ロットで変更するような場合に好適に用いることができる。

（iv）プライマー層
次に、本態様の光触媒含有層側基板に用いられるプライマー層について説明する。本態様において、上述したように基体上に光触媒含有層側遮光部をパターン状に形成して、その上に光触媒含有層を形成して光触媒含有層側基板とする場合においては、上記光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成してもよい。

このプライマー層の作用・機能は必ずしも明確なものではないが、光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層との間にプライマー層を形成することにより、プライマー層は光触媒の作用による細胞接着材料の分解または変性を阻害する要因となる光触媒含有層側遮光部および光触媒含有層側遮光部間に存在する開口部からの不純物、特に、光触媒含有層側遮光部をパターニングする際に生じる残渣や、金属、金属イオン等の不純物の拡散を防止する機能を示すものと考えられる。したがって、プライマー層を形成することにより、高感度で細胞接着材料の分解または変性の処理が進行し、その結果、高精細に形成された細胞接着阻害部を得ることが可能となるのである。

なお、本態様においてプライマー層は、光触媒含有層側遮光部のみならず光触媒含有層側遮光部間に形成された開口部に存在する不純物が光触媒の作用に影響することを防止するものであるので、プライマー層は開口部を含めた光触媒含有層側遮光部全面にわたって形成されていることが好ましい。
本態様におけるプライマー層は、光触媒含有層側基板の光触媒含有層側遮光部と光触媒含有層とが接触しないようにプライマー層が形成された構造であれば特に限定されるものではない。

このプライマー層を構成する材料としては、特に限定されるものではないが、光触媒の作用により分解されにくい無機材料が好ましい。具体的には無定形シリカを挙げることができる。このような無定形シリカを用いる場合には、この無定形シリカの前駆体は、一般式ＳｉＸ_４で示され、Ｘはハロゲン、メトキシ基、エトキシ基、またはアセチル基等であるケイ素化合物であり、それらの加水分解物であるシラノール、または平均分子量３０００以下のポリシロキサンが好ましい。
また、プライマー層の膜厚は、０．００１μｍから１μｍの範囲内であることが好ましく、特に０．００１μｍから０．１μｍの範囲内であることが好ましい。

ｂ．エネルギー照射方法
次に、本態様におけるエネルギー照射方法について説明する。本態様においては、上記細胞接着層と光触媒含有層側基板の光触媒含有層とを、所定の間隙をおいて配置し、エネルギーを照射する。
上記の配置とは、実質的に光触媒の作用が細胞接着層表面に及ぶような状態で配置された状態をいうこととし、実際に物理的に接触している状態の他、所定の間隔を隔てて上記光触媒含有層と細胞接着層とが配置された状態とする。この間隙は、２００μｍ以下であることが好ましい。

本態様において上記間隙は、パターン精度が極めて良好であり、光触媒の感度も高く、したがって細胞接着層中の細胞接着材料の分解または変性の効率が良好である点を考慮すると特に０．２μｍ〜１０μｍの範囲内、好ましくは１μｍ〜５μｍの範囲内とすることが好ましい。このような間隙の範囲は、特に間隙を高い精度で制御することが可能である小面積の細胞接着層に対して特に有効である。

一方、例えば３００ｍｍ×３００ｍｍ以上といった大面積の細胞接着層に対して処理を行う場合は、接触することなく、かつ上述したような微細な間隙を光触媒含有層側基板と細胞接着層との間に形成することは極めて困難である。したがって、細胞接着層が比較的大面積である場合は、上記間隙は、１０〜１００μｍの範囲内、特に５０〜７５μｍの範囲内とすることが好ましい。間隙をこのような範囲内とすることにより、パターンがぼやける等のパターン精度の低下の問題や、光触媒の感度が悪化して細胞接着材料を分解または変性させる効率が悪化する等の問題が生じることなく、さらに細胞接着材料の分解または変性にムラが発生しないといった効果を有するからである。

このように比較的大面積の細胞接着層をエネルギー照射する際には、エネルギー照射装置内の光触媒含有層側基板と細胞接着層との位置決め装置における間隙の設定を、１０μｍ〜２００μｍの範囲内、特に２５μｍ〜７５μｍの範囲内に設定することが好ましい。設定値をこのような範囲内とすることにより、パターン精度の大幅な低下や光触媒の感度の大幅な悪化を招くことなく、かつ光触媒含有層側基板と細胞接着層とが接触することなく配置することが可能となるからである。

このように光触媒含有層と細胞接着層表面とを所定の間隔で離して配置することにより、酸素と水および光触媒作用により生じた活性酸素種が脱着しやすくなる。すなわち、上記範囲より光触媒含有層と細胞接着層との間隔を狭くした場合は、上記活性酸素種の脱着がしにくくなり、結果的に細胞接着材料を分解または変性させる速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。また、上記範囲より間隔を離して配置した場合は、生じた活性酸素種が細胞接着層に届き難くなり、この場合も細胞接着材料の分解または変性の速度を遅くしてしまう可能性があることから好ましくない。

このような極めて狭い間隙を均一に形成して光触媒含有層と細胞接着層とを配置する方法としては、例えばスペーサを用いる方法を挙げることができる。そして、このようにスペーサを用いることにより、均一な間隙を形成することができると共に、このスペーサが接触する部分は、光触媒の作用が細胞接着層表面に及ばないことから、このスペーサを上述した細胞接着部と同様のパターンを有するものとすることにより、スペーサの形成されていない部分のみの細胞接着材料を分解または変性させることができ、高精細に細胞接着阻害部を形成することができるのである。また、このようなスペーサを用いることにより、光触媒の作用により生じた活性酸素種が拡散することなく、高濃度で細胞接着層表面に到達することから、効率よく高精細な細胞接着阻害部を形成することができる。

ここで、上述したように、上記基材が凹部を有しており、上記凹部内に上記細胞接着層が形成されている場合、上述した方法により全面にエネルギー照射を行ってもよい。また、例えば上記凹部が複数形成されている場合には、例えば各凹部ごとにそれぞれ異なるパターン状に露光を行ってもよい。このように各凹部ごとにそれぞれ露光を行う方法としては、例えば１つ１つの凹部に異なるマスクを配置し、上記光触媒含有層側基板を用いてエネルギー照射する方法や、例えば光ファイバの先に、クロムマスクやステンシルマスク等と上記光触媒含有層側基板とを配置し、エネルギー照射する方法等が挙げられる。

なお、上記凹部の側壁にエネルギーが照射されないように、例えば筒状のマスク等を用い、上記凹部の底面のみ露光を行う方法を用いてもよい。
本態様においては、このような光触媒含有層側基板の配置状態は、少なくともエネルギー照射の間だけ維持されればよい。
ここで、本態様でいうエネルギー照射（露光）とは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着材料を分解または変性させることが可能ないかなるエネルギー線の照射をも含む概念であり、光の照射に限定されるものではない。

ここで、本態様において照射されるエネルギーの種類等については、上述した第１の態様で説明したものと同様であるので、ここでの詳しい説明は省略する。
なお、本態様におけるフォトマスクを介して行うエネルギー照射の方向は、上述した基材が透明である場合は、基材側および光触媒含有層側基板のいずれの方向からエネルギー照射を行っても良い。一方、基材が不透明な場合は、光触媒含有層側基板側からエネルギー照射を行う必要がある。
また本態様においても、上記細胞接着部および細胞接着阻害部がパターン状に形成されたパターニング用基板（以下、細胞培養用パターニング基板ともいう。）の一部を切り取り、この細胞培養用パターニング基板の一部を凹状の基材の底部等に貼り付けた後、後述する細胞含有液塗布工程を行ってもよい。

（６）第６の態様
本工程の第６の態様は、上記パターニング用基板が第６の態様の場合に行われるものであり、上記細胞接着阻害材料層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、上記細胞接着阻害材料層と上記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、上記細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、上記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成するものである。

本態様においては、細胞接着部を形成するパターン状に、光触媒含有層側基板を用いてエネルギーを照射することにより、光触媒含有層中に含有される光触媒が励起され、細胞接着阻害材料を分解または変性させることができ、エネルギーが照射された領域を、細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部、エネルギーが照射されていない領域を、細胞接着阻害材料が残存する細胞接着部とすることができるのである。

ここで、上記細胞接着阻害材料が分解または変性されているとは、上記細胞接着阻害材料が含有されていない、もしくは上記細胞接着阻害部に含有される細胞接着阻害材料の量と比較して、細胞接着阻害材料が少ない量含有されていることをいう。例えば上記細胞接着阻害材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解されるものである場合には、細胞接着部中にはその細胞接着阻害材料が少量含有されている、または細胞接着阻害材料の分解物等が含有されている、もしくは細胞接着阻害材料層が完全に分解除去されて基材が露出すること等となる。また、上記細胞接着阻害材料がエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性されるものである場合には、細胞接着部中にはその変性物等が含有されていることとなる。本態様においては、上記細胞接着部に、少なくともエネルギー照射された後に、細胞との接着性を有する細胞接着物質が含有されていることが好ましい。これにより、細胞接着部の細胞との接着性をより高いものとすることができ、上記細胞接着部のみに、高精細に細胞を接着させることが可能となるからである。なお、エネルギーの照射方法等については、第５の態様と同様であるので、ここでの説明は省略する。

また本態様においても、上記細胞接着部および細胞接着阻害部がパターン状に形成されたパターニング用基板（以下、細胞培養用パターニング基板ともいう。）の一部を切り取り、この細胞培養用パターニング基板の一部を凹状の基材の底部等に貼り付けた後、後述する細胞含有液塗布工程を行ってもよい。

３．細胞含有液塗布工程
最後に、本発明の細胞培養基板の製造方法における細胞含有液塗布工程について説明する。本発明における細胞含有液塗布工程は、上記パターン状の細胞接着部に対して、選択的に細胞含有液を塗布する部位選択塗布法により細胞接着部上に細胞含有液を塗布する工程である。

本発明においては、このように部位選択塗布法により細胞含有液を塗布するものであるので、得られる細胞培養基板を高精細なものとすることが可能であり、かつ基板上に２種類以上の細胞を接着させることも可能とすることができるのである。
以下、本工程における各構成について詳しく説明する。

（部位選択塗布法）
本発明における部位選択塗布法とは、インクジェット法等の吐出法、凸版印刷や凹版印刷、グラビア印刷等の印刷法、凸部先端に毛管現象等を利用して液を吸引させこの先端を基板に接触させることにより基板上に液を付着させるペン先付着法といったような所定の部位にのみ選択的に液を付着させることができる方法を示すものである。

本発明においては、中でもインクジェット法等の吐出法を用いることが好ましい。このような吐出法を用いて細胞接着部上に細胞含有液を塗布することにより、比較的多量の細胞含有液を細胞接着部上に付着させることが可能となるからである。本発明においては、中でもインクジェット法を用いることが好ましい。インクジェット法を用いることにより、精度良く、かつ効率的に、細胞含有液を細胞接着部上に付着させることが可能となるからである。また、異なる細胞種を含む複数の細胞含有液と複数のインク吐出装置とを用いることによって、複数の細胞種を任意の位置に配置することも可能となるからである。

本発明に用いられるインクジェット法としては、細胞にダメージを与えない方法であれば特に限定されるものではなく、細胞含有液を帯電させ、これを連続的に噴射し磁場によって制御する方法、圧電素子を用いて間欠的にインクを噴射するピエゾ素子を用いる方法、インクを加熱しその発泡を利用して間欠的に噴射する方法や、静電ジェット法、、超音波ジェット法、遠心ジェット法、慣性力ヘッド法等、各種の方法を用いたインクジェット法を用いることができる。本発明においては、中でもピエゾ素子を用いたインクジェット法であることが好ましい。ピエゾ素子を用いる方法であれば、細胞含有液に対して加熱等を行う必要がないことから、生きた細胞を基板上に付着させる方法として好適だからである。

ここで、本発明においては、上記部位選択塗布法による細胞含有液の塗布は、細胞が乾燥や死滅等しない温度や湿度を有する雰囲気下で行うことが好ましい。このような雰囲気は、後述する細胞含有液の種類等によって、適宜選択されるものであるが、通常温度が２０℃〜４０℃程度であることが好ましく、また湿度が８０％〜１００％程度であることが好ましい。なお、このような環境下では目的とする細胞以外の微生物も繁殖し易い為、無菌環境下で行われることが好ましく、部位選択法に用いられる装置に滅菌機能等を備えることが望ましい。

（細胞含有液）
本態様に用いられる細胞含有液としては、上記細胞接着部上に付着させて培養することが可能な細胞を含有し、かつ上記部位選択塗布法により塗布される際に、安定であるものであれば、特に限定されるものではなく、上記部位選択塗布法の種類等によっても、適宜選択される。
このような細胞培養液としては例えば、細胞の他に培養液や、生物学的細胞接着材料等を含有していてもよく、また細胞を保護するために、細胞がマイクロカプセルに包含されているようなものであってもよい。

また、本発明に用いられる細胞としては例えば、神経組織、肝臓、腎臓、膵臓、血管、脳、軟骨等、血球系等の非接着性細胞以外なら、生体に存在するあらゆる組織とそれに由来する細胞とすることができる。また一般的に非接着性の細胞についても、近年、接着固定を行う為に細胞膜を修飾する技術が考案されており、必要に応じてこのような技術を用いる事で本発明に用いることが可能である。

ここで、上述したような各組織は種々の機能をもつ細胞により形成されていることから、所望する細胞を選択し、使用する必要がある。例えば肝臓の場合、肝実質細胞以外にも上皮細胞、内皮細胞、クッパー細胞、繊維芽細胞、脂肪摂取細胞等から形成されることとなる。なおこの場合、細胞の種類により細胞接着部に対する接着性が異なる為、細胞種に応じて、上記細胞接着部に用いられる細胞接着材料やその組成比等の選択が必要となる。
なお、本発明の細胞含有液塗布工程に用いられる細胞含有液については、後述するインクジェット用細胞含有液の項で説明するものと同様とすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。

ここで、上記細胞培養液は、上記部位選択塗布法によって塗布される際や、その装置等の中でも、一定の温度で保たれることが好ましい。細胞は温度の影響を受けやすく、所定の範囲外の温度になると、細胞が死滅するからである。

（細胞接着部）
次に、本工程において、上記細胞含有液が塗布される細胞接着部について説明する。本発明においては、上記エネルギー照射工程において、細胞接着部と細胞接着阻害部とがパターン状に形成されている。したがって、本工程においては、上記細胞接着阻害部上には細胞含有液が接着せず、容易に細胞接着部上のみに上記細胞含有液を塗布することが可能となるのである。

本工程においては特に、上記パターニング用基板形成工程で説明した第２の態様、第４の態様、第６の態様である場合には、上記エネルギー照射工程で照射された細胞接着部が親水性となり、細胞接着阻害部を撥水性とすることができるので、上記細胞含有液を塗布した際に、細胞含有液が細胞接着阻害部上には付着せず、より高精細に細胞接着部上にのみ細胞を付着させることができる。また、細胞を親水性領域と撥水性領域という異なる性質の境界域に接着させることにより、細胞種によっては細胞の伸展や配向等の形態変化を引き起こす例が報告されていることから、上記態様においては、上記細胞接着部上に接着させた細胞の形態を変化させて、細胞の組織化を促すことができる場合等もある。

ここで、上記細胞接着部は、上記細胞含有液が塗布される際に、所定の温度とされていることが好ましい。この場合においても、細胞は温度の影響を受けやすく、所定の範囲外の温度になると、細胞接着部上に塗布された細胞が死滅してしまうからである。

４．その他
また、本発明の細胞培養基板の製造方法においては、上述した各工程以外にも、必要に応じて適宜、他の工程を有していても良い。このような工程としては、例えば光触媒の作用を利用してパターンを維持するパターン維持工程等が挙げられる。
上記パターン維持工程としては、上記パターニング用基板で説明した第１の態様、第３の態様、第５の態様である場合には、上記細胞含有液を細胞接着部上に付着させた後、上記細胞接着阻害部に、エネルギー照射に伴う光触媒の作用を及ぼすことにより、細胞接着阻害部上に付着した細胞等を除去すること等が可能となり、上記細胞接着部上に接着した細胞のパターンを高精細に維持させることが可能となる。

この際、第１の態様および第３の態様においては、上記細胞接着阻害部のパターン状に開口部を有するフォトマスクを用いてエネルギーを照射すること等により、上記パターン維持工程を行うことができる。また、第５の態様においては、上記細胞接着層と光触媒含有層側基板とを対向させて、上記細胞接着阻害部のパターン状に開口部を有するフォトマスク等を用いてエネルギーを照射すること等により、上記パターン維持工程を行うことができる。

なお、上記のいずれの態様においても、基材が透明であり、かつ上記細胞接着部のパターン状に遮光部が形成されている場合には、フォトマスクを用いることなく、基材側からエネルギーを照射することによって、上記パターン維持工程を行うことができる。

またこの際、照射するエネルギーは、エネルギー照射に伴う光触媒の作用によって、細胞接着阻害部上に接着した細胞を除去することが可能なエネルギーであれば特に限定されるものではなく、上記エネルギー照射工程で照射されるエネルギーと同様のものとすることができる。

また、上記パターン維持工程を行う時期としては、細胞接着部上に細胞含有液を塗布する細胞含有液塗布工程直後に行われるものであってもよく、また細胞接着部上の細胞を所定の期間培養した場合に、細胞接着阻害部上に細胞が付着し、パターンが太くなる等といった不具合がないように、細胞の種類や状態に合わせて適宜行われるものであってもよい。また、上記パターン維持工程は繰り返し行われるものであってもよい。

Ｂ．インクジェット用細胞含有液
次に、本発明のインクジェット用細胞含有液について説明する。本発明の細胞含有液は、その態様により二つの実施態様に分けることができる。以下、各実施態様に分けて説明する。

１．第１実施態様
本発明のインクジェット用細胞含有液の第１実施態様は、インクジェット法により基板上にパターン状に吐出されることにより、パターン状に細胞が接着した細胞培養基板を形成するインクジェット用細胞含有液であって、細胞と、培養液と、生物学的細胞接着性材料とを有するものであることを特徴とする。

本実施態様においては、インクジェット用細胞含有液中に生物学的細胞接着性材料を含有するものであるので、基板に吐出された後の細胞と基板との接着性を良好なものとすることが可能なものとすることができる。

なお、本実施態様に用いられるインクジェット用細胞含有液は、例えば上述した細胞培養基板の方法等に用いられることが好ましい。これにより、細胞が付着した後、細胞が培養される際に、細胞が規則的に配列したり、細胞形態変化を生じて、組織を形成すること等が可能となるからである。
以下、このようなインクジェット用細胞含有液の各材料について説明する。

（細胞）
まず、本実施態様に用いられる細胞について説明する。本実施態様に用いられる細胞は、インクジェット法により吐出されることができ、かつ吐出される際や、吐出された後に安定であるものであれば、特に限定されるものではない。

インクジェット法により吐出されることが可能な細胞の大きさとしては、通常１μｍ〜５０μｍ程度、中でも１０μｍ〜２０μｍ程度のものとされる。このような細胞としては、例えば肝実質細胞、ランゲルハンス島細胞、血管内皮細胞などが挙げられる。
このような細胞の含有量は、細胞の種類、吐出機の孔径等によって適宜選択されるものであるが、通常、本実施態様の細胞含有液中に１×１０^５cells／ml〜１×１０^１０cells／ml、中でも１×１０^６cells／ml〜１×１０^８cells／mlの範囲内含有されることが好ましい。

（培養液）
次に、本実施態様に用いられる培養液について説明する。本実施態様に用いられる培養液は、上記細胞を培養するための液であり、上記細胞は、この細胞液中に存在することにより細胞が死滅等することなく、インクジェット装置等の中でも安定に存在することが可能となるのである。

このような培養液として用いられる材料としては、インクジェット装置により吐出された後も安定なものであることが好ましく、例えばアミノ酸、ビタミン、糖質、塩を混合したもの等が挙げられる。本実施態様においては、これらを予め必要量混合したイーグル培地、フィッシャー培地、ハム培地、およびこれらの改良品に対し、後述の生物学的細胞接着性材料や血清を加えて用いることが好ましい。

このような培養液の含有量は、細胞の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常、本実施態様の細胞含有液中に０．５重量％〜２．０重量％、中でも１．０重量％〜１．５重量％の範囲内含有されることが好ましい。

（生物学的細胞接着性材料）
次に、生物学的細胞接着材料について説明する。本実施態様に用いられる生物学的細胞接着材料とは、本実施態様のインクジェット用細胞含有液が、例えば基材等の上に塗布される際に、細胞と基材との接着性を良好なものとするものである。
このような生物学的細胞接着材料とは、例えば、特定の細胞と接着性が良好なもの、または多くの細胞と接着性が良好なもの等が挙げられ、具体的には、フィブロネクチン、ラミニン、テネイシン、ビトロネクチン、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）配列含有ペプチド、ＹＩＧＳＲ（チロシン−イソロイシン−グリシン−セリン−アルギニン）配列含有ペプチド、コラーゲン、アテロコラーゲン、ゼラチン等が挙げられ、中でもアテロコラーゲン、ゼラチンが細胞含有液の濃度、粘度調整という点から好ましい。

このような生物学的細胞接着材料の含有量は、細胞の種類や、生物学的細胞接着材料の種類等によって適宜選択されるものであるが、通常、本実施態様の細胞含有液中に０．０１重量％〜５．０重量％、中でも０．５重量％〜２．０重量％の範囲内含有されることが好ましい。

２．第２実施態様
次に、本発明のインクジェット用細胞含有液の第２実施態様について説明する。本実施態様のインクジェット用細胞含有液は、インクジェット法により基板上にパターン状に吐出されることにより、パターン状に細胞が接着した細胞培養基板を形成するインクジェット用細胞含有液であって、上記インクジェット用細胞含有液中に含有される細胞がマイクロカプセルに包含されていることを特徴とする。

本実施態様においては、用いられる細胞がマイクロカプセルに包含されているので、インクジェット法により吐出される際に細胞自体が傷つくことがなく、吐出された細胞の生存率を向上させることができる。したがって、このようなインクジェット用細胞含有液を用いて得られる細胞培養基板の歩留まりを向上させることができる。

なお、本実施態様に用いられるインクジェット用細胞含有液は、例えば上述した細胞培養基板の方法等に用いられることが好ましい。これにより、細胞が付着した後、細胞が培養される際に、細胞が規則的に配列したり、細胞形態変化を生じて、組織を形成すること等が可能となるからである。
以下、このようなインクジェット用細胞含有液の各材料について説明する。

（細胞）
本実施態様に用いられる細胞は、後述するマイクロカプセル内に含有されるものであり、そのマイクロカプセル内で安定であり、かつインクジェット装置により吐出される際や吐出された後に、安定なものであれば、特に限定されるものではない。
このような細胞としては、例えば肝実質細胞、ランゲルハンス島細胞、血管内皮細胞や、脳細胞や神経細胞のように基材への接着性が乏しく、また損傷を受けやすい細胞等を挙げることができる。
このような細胞は、通常後述するマイクロカプセル内に１個〜１００個程度含有されることとなる。

（マイクロカプセル）
次に、本実施態様に用いられるマイクロカプセルについて説明する。本実施態様に用いられるマイクロカプセルとは、上記細胞を含有し、インクジェット装置から吐出される際に、細胞を衝撃や熱等から保護することが可能なものであれば、特に限定されるものではない。このようなマイクロカプセルとしては、例えばカプセル皮膜をゼラチン等のゲル化合物で形成し、その内部に前述の細胞含有液を含むマイクロカプセルが挙げられる。このようなカプセルは例えば皮膜材料と細胞含有液とを同心円ノズルよりノズル滴下すること等により成することができる。通常、このようなマイクロカプセルは直径１００μｍから数ｍｍ程度の大きさであるが、本方式では直径１００〜３００μｍ程度のカプセルを用いることが望ましい。

Ｃ．細胞培養基板製造用インクジェット装置
最後に、本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置について説明する。本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置は、細胞含有液が充填された細胞含有液供給部、および上記細胞含有液供給部から供給される細胞含有液を細胞培養用パターニング基板に吐出するピエゾ駆動型ヘッド部を有する吐出部と、上記細胞培養用パターニング基板を固定するステージとを有する細胞培養基板製造用インクジェット装置であって、上記細胞含有液供給部には、充填された細胞含有液中の細胞を均一に分散させるための攪拌手段が設けられており、上記吐出部およびステージには、吐出前後の細胞含有液の温度を一定に保つための温度制御手段が設けられていることを特徴とするものである。

本発明においては、細胞含有液供給部に攪拌手段が配置されているので、供給部内において細胞含有液中に細胞が均一に分散された状態とすることができる。したがって、吐出される細胞含有液中の細胞の含有率を一定とすることができるので、得られる細胞培養基板上に接着する細胞数を均一化することができる。これにより、高品質な細胞培養基板を得ることができる。また、本発明においては、吐出部およびステージの温度を一定に保つ温度制御手段を有するものであるので、例えば細胞含有液供給部や、この細胞含有液供給部からピエゾ駆動型ヘッド部のオリフィスまでの流路、さらにはステージに固定された細胞培養用パターニング基板上に吐出された際の細胞含有液中の細胞が死滅することを防止することができ、細胞の生存率を向上させることができるので、得られる細胞培養基板の歩留まりを向上させることができる。

本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置は、例えば図６に示すように、細胞含有液が細胞含有供給部３１に充填されており、この細胞含有液供給部には、攪拌手段が設けられている。またこの細胞含有供給部３１から供給された細胞含有液を、目的とする細胞培養用パターニング基板３０等の上に吐出するためのピエゾ駆動型ヘッド部を有し、かつ温度制御手段を有する吐出部３２が設けられている。またさらに、細胞培養用パターニング基板３０を固定するステージ３３についても温度制御手段が設けられているものである。この際、目的とする位置に細胞含有液を塗布するために、ステージ３３が移動するものであってもよく、また吐出部３２が移動するものであってもよく、また両方が移動するものであってもよい。また例えば、細胞含有液供給部３１の攪拌、温度制御等や、吐出部３２の温度制御等を行う制御部３４等が、設けられていてもよい。

なお、本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置に用いられる細胞含有液としては、吐出時や細胞含有液供給部での保存時に安定であるものであれば、特に限定されるものではないが、特に上述した「Ｂ．インクジェット用細胞含有液」が用いられることが好ましい。これにより、細胞を安定に吐出することができ、かつ歩留まりを向上させることができるからである。また、細胞含有液が吐出される細胞培養用パターニング基板においても、吐出された細胞を培養することが可能なものであれば、特に限定されるものではないが、本発明においては特に、「Ａ．細胞培養基板の製造方法」で説明したような細胞接着部および細胞接着阻害部を有する細胞培養パターニング用層を有する基板であることが好ましい。これにより、吐出された細胞を、細胞接着部および細胞接着阻害部のパターンに沿って配列されたり、細胞の形態を変化させたりすることが可能となり、容易に細胞を培養して組織を形成することが可能となるからである。なお、このような細胞培養用パターニング基板には、所定の位置に位置検知マークが形成されていることが好ましい。これにより、細胞培養用パターニング基板の位置あわせが容易となり、細胞接着部上にのみ選択的に、高精細に細胞含有液を塗布すること等が可能となるからである。このような位置検知マークとしては、検知可能なものであれば特に限定されるものではなく、一般的に基板の位置合わせに用いられているもの等と同様とすることができる。
以下、本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置の各構成ごとに説明する。

１．細胞含有液供給部
まず、本発明の細胞培養用基板製造用インクジェット装置の細胞含有液供給部について説明する。本発明の細胞培養用基板製造用インクジェット装置の細胞含有液供給部は、細胞含有液が充填されており、細胞含有液を攪拌する機能を有するものであれば、特に限定されるものではない。

上記攪拌する機能とは、充填された細胞含有液内で、細胞が沈殿して死滅したりすること等を防ぐため、均一に細胞含有液を均一に分散させることが可能なものであり、かつ細胞含有液中の細胞に攪拌による損傷や活性の低下をもたらさないものであれば、特に限定されるものではなく、例えば旋回攪拌や振盪攪拌すること等により行うことができる。
また、上記細胞含有液供給部は、一定の温度に保たれることが好ましく、後述する吐出部の温度調整手段によって温度が調整されるものであってもよく、また別途、温度を調整することが可能な温度調整手段を有していてもよい。

２．吐出部
次に、本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置における吐出部について説明する。本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置におけるピエゾ駆動型ヘッド部は、上記細胞含有液供給部から温度調節可能なホース等を介して供給される細胞含有液を、細胞培養用パターニング基板に吐出するピエゾ駆動型ヘッド部を有するものである。また、この吐出部は温度制御機能を有している。

ここで、本発明においては、上記ピエゾ駆動型ヘッド部のオリフィスの開口幅として、２０μｍ〜５００μｍの範囲内とされていることが好ましい。なお、通常の細胞含有液を用いる場合には、２０μｍ〜２５０μｍ程度とされることが好ましく、上述したマイクロカプセル等を用いる場合には、１００μｍ〜５００μｍ程度とされることが好ましい。これにより、細胞含有液中の細胞を傷つけたりすることがなく、安定に細胞含有液を供給することができるからである。このようなオリフィスの開口幅を有するピエゾ駆動型ヘッド部を有するものとしては、一般的なピエゾ駆動型ヘッド部と同様とすることができるので、ここでの詳しい説明は省略する。

また、温度制御手段についても、上記細胞含有液供給部からの流路や、ピエゾ駆動型ヘッド部の温度等を調整することが可能なものであれば、特に限定されるものではなく、一般的に温度制御手段として用いられているものを用いることが可能であるので、ここでの説明は省略する。

３．ステージ
次に、ステージ部について説明する。本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置に用いられるステージとしては、細胞含有液が吐出される細胞培養用パターニング基板を固定することが可能であり、かつ温度を一定に保つための温度制御手段を有するものであれば、特に限定されるものではない。

本発明における温度制御手段としては、上記吐出部から吐出された基板の温度を目的とする温度に保持することが可能であれば、特に限定されるものではなく、例えば水やペルチェ素子により冷却する冷却機構および加熱機構を有するものが挙げられる。

４．その他
本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置においては、上記部材の他に、必要に応じて適宜他の部材を有していてもよく、特に、上記吐出部のピエゾ駆動型ヘッド部と、細胞培養用パターニング基板との間の湿度を制御する湿度制御手段が設けられていることが好ましい。これにより、上記ピエゾ駆動型ヘッド部と、細胞培養用パターニング基板との間で、細胞が乾燥して死滅すること等を防ぐことが可能となるからである。

このような湿度制御手段としては、上記ピエゾ駆動型ヘッド部と、細胞培養用パターニング基板との間の湿度を局所的に調整するものであってもよく、また、本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置全体の湿度を調整するもの等であってもよい。

また本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置には、上記吐出部のピエゾ駆動型ヘッド部と、細胞培養用パターニング基板との間の炭酸ガス濃度を調整する炭酸ガス濃度制御手段も設けられていることが好ましい。このような炭酸ガス濃度制御手段としては、上記ピエゾ駆動型ヘッド部と、細胞培養用パターニング基板との間の炭酸ガス濃度を局所的に調整するものであってもよく、また、本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置全体の炭酸ガス濃度を調整するもの等であってもよい。

なお、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するもの、またはこれらの均等物は、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。

以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。
＜実施例１＞
［パターニング用基板形成工程］
（パターニング用基板の形成）
オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン社製）５．０ｇ、フルオロアルキルシランＴＳＬ８２３３（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．５５ｇ、および０．００５Ｎ塩酸２．３６ｇを混合し、攪拌しながら１２時間混合した。この溶液をイソプロピルアルコールで１００倍に希釈の上、スピンコーティング法により予めアルカリ処理を施したソーダガラス基板上に塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、光触媒による分解反応にて細胞接着阻害性から細胞接着性に変化する細胞接着阻害材料含有層を有するパターニング用基板を形成した。

［エネルギー照射工程］
（光触媒含有含層を有するフォトマスクの形成）
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．４ｇ、および光触媒無機コーティング剤ＳＴ−Ｋ０１（石原産業）１．５ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。
この溶液をイソプロピルアルコールで１０倍に希釈の上、スピンコーティング法により、遮光部が５００μｍであり、スペース部が１５０μｍであるストライプ状のパターンが形成され、予めアルカリ処理を施されている石英フォトマスク基板に塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、加水分解、重縮合反応を進行させ、光触媒がオルガノポリシロキサン中に強固に固定された膜厚０．２μｍの光触媒含有層を有するフォトマスクを形成した。
（エネルギー照射）
上記パターニング用基板に、上記フォトマスク越しに水銀ランプにより６J/ｃｍ²のエネルギー量で紫外線露光を行い、未露光部が細胞接着阻害性で露光部が細胞接着性にパターン化された細胞接着性表面を有する細胞培養用パターニング基板を得た。

［細胞含有液塗布工程］
（細胞含有液の調製）
各種組織に由来する細胞含有液の調製手順については、例えば“組織培養の技術 第三版 基礎編”、日本組織培養学会編,朝倉書店等にその詳細が述べられており、ここでは初代人臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)を上記文献のp.146以降に記載されている方法で得た。
（細胞含有液の塗布）
ソニー社製ＸＹステージディスペンサ装置に対しインクジェット吐出装置 (オリフィス幅７５μｍ)、温湿度調整装置、細胞含有液攪拌装置を装着し、上記細胞含有液を温度３７℃で攪拌した。
ステージ環境条件を温度３７℃，５％二酸化炭素、９５％空気、相対湿度９９％とした環境下で上記細胞培養用パターニング基板の細胞接着部に対し、上記細胞含有液を播種し、そのまま２時間静置した。次いで、この細胞培養基板を静かに培養ディッシュ内に配置し、１０％ウシ胎仔血清を加えたＤＭＥＭ培地を、上記ディッシュ内に注意深く静かに注ぎいれ、３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気、相対湿度９０％の環境下で１６時間培養した。
基板に接着した細胞を観察し、細胞が細胞培養領域中全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。
また更にＤＭＥＭ培地を、ｂＦＧＦ(シグマ社) １０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えたものに交換、３７℃，５％二酸化炭素環境下で２４時間培養を継続し、細胞が連続したキャピラリ組織を形成した事を確認した。

＜比較例＞
実施例１と同様の実験を、細胞培養用パターニング基板の代わりに、プラズマ処理済み培養用シャーレを用いて行ったところ、細胞のパターン接着は行われたが、細胞の配向，伸展が生じず、更にｂＦＧＦを培地に添加しても連続したキャピラリ形成は生じず、小組織切片をランダムに形成した。

＜実施例２＞
［パターニング用基板形成工程およびエネルギー照射工程］
開口部１０００μｍ、間隔２０００μｍのアレイ状フォトマスクを用いた以外は、実施例１と同様にパターニング用基板形成工程およびエネルギー照射工程を行い、細胞培養用パターニング基板を作成した。
［細胞含有液塗布工程］
(細胞含有マイクロカプセルの調製)
実施例１と同様の手順で細胞含有液を調製した。続いて、コハク酸ゼラチン(ニッピ社製)を純水に４０％の濃度で５０℃にて２０分間攪拌した。このゼラチン液と予め作成した細胞含有液とを、内径３００μｍ、２００μｍの同軸円ノズルから２５℃に加温したＷａｙｍｏｕｔｈ ＭＢ７５２／１培地液に滴下することにより、細胞を含有するマイクロカプセルを調製した。
(細胞含有液の塗布)
実施例１と同様の手法で、オリフィス幅５００μｍの吐出ヘッドを装着したインクジェット吐出装置から、細胞培養用パターニング基板の細胞接着部に対し、細胞含有マイクロカプセル液を滴下して細胞のパターニングを行った。この基板を３７℃，５％ＣＯ₂付与したインキュベータ内に３時間静置し、基板上に肝実質細胞を接着させた。
次に、培地液を満たした培養シャーレに細胞を接着させた上記細胞培養基板を浸漬し、培地液を交換しながら４８時間まで細胞の培養を続け光学顕微鏡で細胞を観察したところ、細胞が細胞培養用パターニング基板上の細胞接着部に従って、アレイ状に接着している事を確認した。

＜実施例３＞
［パターニング用基板形成工程］
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランTSL8114（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．４ｇ、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン（Huels America社製）０．０４ｇ、および光触媒無機コーティング剤ＳＴ−Ｋ０１（石原産業社製）１．５ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。
この溶液をスピンコーティング法により予めアルカリ処理を施した石英ガラス基板に塗布し、その基板を温度１５０℃で１０分間乾燥させて、加水分解および重縮合反応を進行させ、光触媒がオルガノポリシロキサン中に強度に固定された膜厚０．２μｍの、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞接着性から細胞接着阻害性に変化する光触媒含有細胞接着層を有するパターニング用基板を形成した。
［エネルギー照射工程］
このパターニング用基板にフォトマスクを用いて水銀ランプ（波長３６５ｎｍ）により３００ｍＷ／ｃｍ^２の照度で９００秒間紫外線露光を行い、未露光部が細胞接着部、露光部が細胞非接着部となる細胞培養用パターニング基板を得た。
［細胞含有液塗布工程］
実施例１と同様に、細胞含有液塗布工程において細胞含有液を塗布したところ、基板に接着した細胞を観察し、細胞が細胞培養領域中全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。
また更にＤＭＥＭ培地を、ｂＦＧＦ(シグマ社) 10ng/mlの濃度で加えたものに交換、３７℃，５％二酸化炭素環境下で２４時間培養を継続し、細胞が連続したキャピラリ組織を形成した事を確認した。

＜実施例４＞
［パターニング用基板形成工程］
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．４ｇ、フルオロアルキルシランＴＳＬ８２３３（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．０４ｇ、光触媒無機コーティング剤ＳＴ−Ｋ０１（石原産業社製）１．５ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。
この溶液を、裏面に幅３００μｍの遮光部と幅６０μｍの開口部とからなる遮光パターンが形成された石英基板にスピンコーティング法により塗布し、その基板を温度１５０℃で１０分間乾燥させて、加水分解および重縮合反応を進行させ、光触媒がオルガノポリシロキサン中に強度に固定された膜厚０．２μｍの、エネルギー照射に伴う光触媒の作用により細胞接着阻害性から細胞接着性に変化する光触媒含有細胞接着阻害材料層を有するパターニング用基板を形成した。
［エネルギー照射工程］
上記パターニング用基板に裏面から水銀ランプ（波長２５４ｎｍ）により５Ｊ／ｃｍ^２の露光量で紫外線照射を行い、未露光部が細胞接着阻害部、露光部が細胞接着部となるパターンを有する細胞培養用パターニング基板を得た。
［細胞含有液塗布工程］
実施例１と同様に、細胞含有液塗布工程において細胞含有液を塗布したところ、基板に接着した細胞を観察し、細胞が細胞培養領域中全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。
また更にＤＭＥＭ培地を、ｂＦＧＦ(シグマ社) 10ng/mlの濃度で加えたものに交換、３７℃，５％二酸化炭素環境下で24時間培養を継続し、細胞が連続したキャピラリ組織を形成した事を確認した。

＜実施例５＞
［パターニング用基板形成工程］
（光触媒含有層の形成）
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．４ｇ、および光触媒無機コーティング剤ＳＴ−Ｋ０１（石原産業）１．５ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。
この溶液をスピンコーティング法により予めアルカリ処理を施した石英ガラス基板に塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、加水分解、重縮合反応を進行させ、光触媒がオルガノポリシロキサン中に強固に固定された膜厚０．２μｍの光触媒含有層を基板上に形成した。
（細胞接着層の形成）
フィブロネクチンＦ−４７５９（シグマ）０．２ｍｇと、純水２００ｍｌとを混合し、この水溶液を上記光触媒含有層を設けた基板の光触媒含有層に対し、基板面積１ｃｍ^２当たり３００μｌの比率で滴下し、これを４℃下で２４時間静置した。更に基板をＰＢＳにて２回洗浄の上、窒素ガスにさらし乾燥する事により、基板上に光触媒含有層と細胞接着層を有するパターニング用基板を得た。
［エネルギー照射工程］
続いてこのパターニング用基板に遮光部８０μｍ、スペース部３００μｍのストライプ状のフォトマスク越しに、水銀ランプにより５Ｊ／ｃｍ^２（波長２５４ｎｍ）の紫外線照射を行い、未露光部が細胞接着性で、露光部が細胞接着阻害性を有するようにパターン化された細胞接着層を有する細胞培養用パターニング基板を得た。
［細胞含有液塗布工程］
実施例１と同様に、細胞含有液塗布工程において細胞含有液を塗布したところ、基板に接着した細胞を観察し、細胞が細胞培養領域中全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。
また更にＤＭＥＭ培地を、ｂＦＧＦ(シグマ社) １０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えたものに交換、３７℃，５％二酸化炭素環境下で２４時間培養を継続し、細胞が連続したキャピラリ組織を形成した事を確認した。

＜実施例６＞
［パターニング用基板形成工程］
（光触媒含有層の形成）
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランTSL8114（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．４ｇ、および光触媒無機コーティング剤ＳＴ−Ｋ０１（石原産業）１．５ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。
この溶液をスピンコーティング法により予めアルカリ処理を施した石英ガラス基板に塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、加水分解、重縮合反応を進行させ、光触媒がオルガノポリシロキサン中に強固に固定された膜厚０．２μｍの光触媒含有層を基板上に形成した。
（細胞接着阻害材料層の形成）
この基板にイソプロピルアルコール５ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．４ｇ、およびフルオロアルキルシランＴＳＬ８２３３（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．０４ｇから成る溶液をスピンコーティングにより塗布し、その後基板を１５０℃で１０分間乾燥することにより細胞接着阻害材料層を形成した。
［エネルギー照射工程］
このパターニング用基板にフォトマスク越しに水銀ランプにより６Ｊ／ｃｍ^２(波長２５４ｎｍ)の紫外線照射を行い、未露光部が細胞接着阻害性、露光部が細胞接着性にパターン化された細胞接着性である表面を有する細胞培養用パターニング基板を得た。
［細胞含有液塗布工程］
実施例１と同様に、細胞含有液塗布工程において細胞含有液を塗布したところ、基板に接着した細胞を観察し、細胞が細胞培養領域中全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。
また更にＤＭＥＭ培地を、ｂＦＧＦ(シグマ社) １０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えたものに交換、３７℃，５％二酸化炭素環境下で２４時間培養を継続し、細胞が連続したキャピラリ組織を形成した事を確認した。

＜実施例７＞
［パターニング用基板形成工程］
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン社製）０．４ｇ、およびアミノプロピルトリエトキシシラン０．４ｇを混合し、攪拌しながら２０分間、１００℃で加温した。この溶液をスピンコーティング法により予めアルカリ処理を施した石英ガラス基板に塗布し、その基板を１５０℃の温度で１０分間乾燥することにより、加水分解、重縮合反応を進行させ、膜厚が約８０ｎｍの、アミノ基を含むオルガノポリシロキサン層を基板上に形成し、パターニング用基板とした。
［エネルギー照射工程］
実施例１と同様に、光触媒含有層を有するフォトマスクを用いてエネルギー照射を行ったところ、未露光部が細胞接着性で、露光部が細胞接着阻害性にパターン化された細胞接着性表面を有する細胞培養用パターニング基板を得た。
［細胞含有液塗布工程］
実施例１と同様に、細胞含有液塗布工程において細胞含有液を塗布したところ、基板に接着した細胞を観察し、細胞が細胞培養領域中全領域に沿う方向に配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。
また更にＤＭＥＭ培地を、ｂＦＧＦ(シグマ社) １０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えたものに交換、３７℃，５％二酸化炭素環境下で２４時間培養を継続し、細胞が連続したキャピラリ組織を形成した事を確認した。

〈実施例８〉
［パターニング用基板形成工程およびエネルギー照射工程］
イソプロピルアルコール３ｇ、オルガノシランＴＳＬ８１１４（ＧＥ東芝シリコーン）０．２ｇ、およびＰＥＧ−シラン（Methoxypolyethylene glycol 5,000 trimethylsilyl ether、Fluka）０．２ｇを混合し、攪拌しながら２０分間１００℃で加温した。この溶液をスピンコーティング法により、洗浄済みガラス基板（厚さ約０．１ｍｍのガラス基板）上に塗布し、続いて上記基板を１５０℃で１０分間加熱処理を行った。これにより、膜厚が１６０ｎｍの、ポリエチレングリコールを含むオルガノポリシロキサン層からなる細胞接着阻害材料層が基板上に形成されたパターニング用基板を得た。
次いで、実施例１と同様にエネルギー照射工程を行い、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。続いて、市販の直径３５ｍｍのプラスチックディッシュ（コーニング社製）の底面の中央部に、直径１４ｍｍの穴をあけ、切断された細胞培養用パターニング基板のガラス基板を、上記プラスチックディッシュに、接着剤ＫＥ４５Ｔ（信越シリコーン社製）を用いて貼りつけた。
［細胞含有液塗布工程］
上記プラスチックディッシュを、殺菌灯で滅菌し、ＰＢＳで洗浄した後、ＤＭＥＭ培地で洗浄した。その後、細胞培養基板をディッシュに配置しないこと以外は実施例１と同様に、細胞含有液を塗布し、培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。

〈実施例９〉
厚さ約０．１ｍｍの石英基板を用いて実施例２と同様に、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、実施例８と同様の手順により、切断された細胞培養用パターニング基板の石英基板を、上記プラスチックディッシュに貼りつけた。
［細胞含有液塗布工程］
実施例８と同様の方法により、プラスチックディッシュ内に細胞含有液を塗布し、培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。

〈実施例１０〉
厚さ約０．１ｍｍの石英基板を用いて実施例３と同様に、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、実施例８と同様の手順により、切断された細胞培養用パターニング基板の石英基板を、上記プラスチックディッシュに貼りつけた。
［細胞含有液塗布工程］
実施例８と同様の方法により、プラスチックディッシュ内に細胞含有液を塗布し、培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。

〈実施例１１〉
厚さ約０．１ｍｍの石英基板を用いて実施例４と同様に、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、実施例８と同様の手順により、切断された細胞培養用パターニング基板の石英基板を、上記プラスチックディッシュに貼りつけた。
［細胞含有液塗布工程］
実施例８と同様の方法により、プラスチックディッシュ内に細胞含有液を塗布し、培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。

〈実施例１２〉
厚さ約０．１ｍｍの石英基板を用いて実施例５と同様に、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、実施例８と同様の手順により、切断された細胞培養用パターニング基板の石英基板を、上記プラスチックディッシュに貼りつけた。
［細胞含有液塗布工程］
実施例８と同様の方法により、プラスチックディッシュ内に細胞含有液を塗布し、培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。

〈実施例１３〉
厚さ約０．１ｍｍの石英基板を用いて実施例６と同様に、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、実施例８と同様の手順により、切断された細胞培養用パターニング基板の石英基板を、上記プラスチックディッシュに貼りつけた。
［細胞含有液塗布工程］
実施例８と同様の方法により、プラスチックディッシュ内に細胞含有液を塗布し、培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。

〈実施例１４〉
厚さ約０．１ｍｍの石英基板を用いて実施例７と同様に、細胞培養用パターニング基板を形成し、この細胞培養用パターニング基板を２１ｍｍ角に切断した。その後、実施例８と同様の手順により、切断された細胞培養用パターニング基板の石英基板を、上記プラスチックディッシュに貼りつけた。
［細胞含有液塗布工程］
実施例８と同様の方法により、プラスチックディッシュ内に細胞含有液を塗布し、培養したところ、細胞がプラスチックディッシュ内の細胞接着部に沿いながら配向し、更に伸展形状を示す事を確認した。

本発明の細胞培養基板の製造方法におけるエネルギー照射工程の一例を示した工程図である。 本発明の細胞培養基板の製造方法におけるエネルギー照射工程の他の例を示した工程図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の一例を示す概略断面図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。 本発明に用いられる光触媒含有層側基板の他の例を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養基板製造用インクジェット装置を示す概略断面図である。 本発明の細胞培養基板の製造法方法に用いられる基材を説明するための概略断面図である。

符号の説明

１…基材
２…光触媒含有細胞接着層
４…エネルギー
５…細胞接着阻害部
６…細胞接着部
１２…細胞接着層
２１…光触媒含有層
２２…基体
２３…光触媒含有層側基板
３０…細胞培養用パターニング基板
３１…細胞含有液供給部
３２…吐出部
３３…ステージ

Claims (12)

1. 基材上に、エネルギー照射の際の光触媒の作用により、細胞との接着性を有する細胞接着部と、細胞と接着阻害性を有する細胞接着阻害部とを形成することができる細胞培養パターニング用層を形成し、パターニング用基板とするパターニング用基板形成工程と、
   前記細胞培養パターニング用層に、エネルギーを照射し、光触媒の作用により前記細胞接着部と前記細胞接着阻害部とをパターン状に形成するエネルギー照射工程と、
   前記パターン状の細胞接着部に対して、選択的に細胞含有液を塗布する部位選択塗布法により細胞接着部上に細胞含有液を塗布する細胞含有液塗布工程と
   を有し、
   前記細胞含有液中に含有される細胞がマイクロカプセルに包含されていることを特徴とする細胞培養基板の製造方法。
2. 前記パターニング用基板が、基材と、前記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する光触媒含有細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、
   前記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、前記光触媒含有細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、前記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板の製造方法。
3. 前記パターニング用基板が、基材と、前記基材上に形成され、少なくとも光触媒および、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有する光触媒含有細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、
   前記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、前記光触媒含有細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、前記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板の製造方法。
4. 前記パターニング用基板が、基材と、前記基材上に形成され、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層、および、前記光触媒含有層上に形成された細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、
   前記細胞接着層は、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を少なくとも含有するものであり、
   前記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、前記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、前記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板の製造方法。
5. 前記パターニング用基板が、基材と、前記基材上に形成され、少なくとも光触媒を含有する光触媒含有層、および、前記光触媒含有層上に形成された細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、
   前記細胞接着阻害材料層は、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着阻害材料を含有するものであり、
   前記エネルギー照射工程では、所定の方向からエネルギー照射し、前記細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、前記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板の製造方法。
6. 前記パターニング用基板が、基材と、前記基材上に形成され、細胞と接着性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により分解または変性される細胞接着材料を含有する細胞接着層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、
   前記エネルギー照射工程では、前記細胞接着層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、前記細胞接着層と前記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、前記細胞接着層中に含有される細胞接着材料が分解または変性された細胞接着阻害部と、前記細胞接着阻害部以外の細胞接着部とからなるパターンを形成することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板の製造方法。
7. 前記パターニング用基板が、基材と、前記基材上に形成され、細胞と接着することを阻害する細胞接着阻害性を有しかつエネルギー照射に伴う光触媒の作用により変性される細胞接着阻害材料を含有する細胞接着阻害材料層を有する細胞培養パターニング用層とを含むものであり、
   前記エネルギー照射工程では、前記細胞接着阻害材料層と、光触媒を含有する光触媒含有層および基体を有する光触媒含有層側基板とを、前記細胞接着阻害材料層と前記光触媒含有層とが対向するように配置した後、所定の方向からエネルギー照射し、前記細胞接着阻害材料層中に含有される細胞接着阻害材料が分解または変性された細胞接着部と、前記細胞接着部以外の細胞接着阻害部とからなるパターンを形成することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養基板の製造方法。
8. 前記細胞接着部が親水性領域であり、前記細胞接着阻害部が撥水性領域であることを特徴とする請求項３、請求項５または請求項７に記載の細胞培養基板の製造方法。
9. 前記基材または前記光触媒含有層上にパターン状に遮光部が形成されていることを特徴とする請求項２から請求項８までのいずれかの請求項に記載の細胞培養基板の製造方法。
10. 前記部位選択塗布法が、インクジェット法であることを特徴とする請求項１から請求項９までのいずれかの請求項に記載の細胞培養基板の製造方法。
11. 細胞含有液が充填された細胞含有液供給部、および前記細胞含有液供給部から供給される細胞含有液を細胞培養用パターニング基板に吐出するピエゾ駆動型ヘッド部を有する吐出部と、前記細胞培養用パターニング基板を固定するステージとを有する細胞培養基板製造用インクジェット装置であって、
    前記細胞含有液供給部には、充填された細胞含有液中の細胞を均一に分散させるための攪拌手段が設けられており、
    前記吐出部およびステージには、吐出前後の細胞含有液の温度を一定に保つための温度制御手段が設けられ、
    前記細胞含有液中に含有される細胞がマイクロカプセルに包含されていることを特徴とする細胞培養基板製造用インクジェット装置。
12. 前記ピエゾ駆動型ヘッド部と、前記ステージに固定された前記細胞培養用パターニング基板との間の湿度を制御する湿度制御手段が設けられていることを特徴とする請求項１１に記載の細胞培養基板製造用インクジェット装置。

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