JP2618315B2 - 細胞培養用担体およびその製造方法 - Google Patents
細胞培養用担体およびその製造方法Info
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- JP2618315B2 JP2618315B2 JP4200263A JP20026392A JP2618315B2 JP 2618315 B2 JP2618315 B2 JP 2618315B2 JP 4200263 A JP4200263 A JP 4200263A JP 20026392 A JP20026392 A JP 20026392A JP 2618315 B2 JP2618315 B2 JP 2618315B2
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- producing
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞培養用担体および
その製造方法に関する。すなわち、本発明は付着依存性
細胞を培養する際に使用される細胞培養マイクロキャリ
アに関するものであり、詳しくは付着依存性動物細胞を
マイクロキャリアに付着させ、懸濁状態で高密度培養す
るのに好適な細胞培養マイクロキャリアに関するもので
ある。
その製造方法に関する。すなわち、本発明は付着依存性
細胞を培養する際に使用される細胞培養マイクロキャリ
アに関するものであり、詳しくは付着依存性動物細胞を
マイクロキャリアに付着させ、懸濁状態で高密度培養す
るのに好適な細胞培養マイクロキャリアに関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】従来、動物細胞培養の方法の一つとして
マイクロキャリア培養法が行われている。従来のマイク
ロキャリアは、デキストラン、セルローズ、ゼラチン、
ポリアクリルアミド、ポリスチレンなどが素材として用
いられており、その形状は粒状で、粒子径５０〜１００
０μの粒子である。その粒子の表面に動物細胞を付着し
て培養する担体として使用される。
マイクロキャリア培養法が行われている。従来のマイク
ロキャリアは、デキストラン、セルローズ、ゼラチン、
ポリアクリルアミド、ポリスチレンなどが素材として用
いられており、その形状は粒状で、粒子径５０〜１００
０μの粒子である。その粒子の表面に動物細胞を付着し
て培養する担体として使用される。
【０００３】上記担体を培養液と共に攪拌タンク内に充
填し、浮遊させ、その担体表面に動物細胞を付着させて
培養して、インターフェロン、モノクローナル抗体、各
種ウィルスの生産などに用いられている。
填し、浮遊させ、その担体表面に動物細胞を付着させて
培養して、インターフェロン、モノクローナル抗体、各
種ウィルスの生産などに用いられている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来のマイクロキャリ
アは流動性に優れ、機械的強度のある球形が有利とされ
てきた。そして細胞の付着面積を増加させるために、粒
子径を許容される範囲で極力小さくする方法や多孔質粒
子にする方法などがとられている。しかし、いずれの方
法をとっても従来の担体は、攪拌タンク内で培養液を攪
拌することによりマイクロキャリア同士が衝突し、この
衝突による付着細胞のダメージが大きいので、工業的規
模で使用するときには大きな問題となった。
アは流動性に優れ、機械的強度のある球形が有利とされ
てきた。そして細胞の付着面積を増加させるために、粒
子径を許容される範囲で極力小さくする方法や多孔質粒
子にする方法などがとられている。しかし、いずれの方
法をとっても従来の担体は、攪拌タンク内で培養液を攪
拌することによりマイクロキャリア同士が衝突し、この
衝突による付着細胞のダメージが大きいので、工業的規
模で使用するときには大きな問題となった。
【０００５】
【発明の目的】本発明は、上記問題を解決し、付着、増
殖性に優れた担体であって、かつ担体が培養液中での攪
拌によって容易に浮遊し、しかも極めて柔軟であって弾
性を有することにより、衝突による抵抗のない担体を提
供することおよびそのような担体の製造方法を提供する
ことを目的とするものである。
殖性に優れた担体であって、かつ担体が培養液中での攪
拌によって容易に浮遊し、しかも極めて柔軟であって弾
性を有することにより、衝突による抵抗のない担体を提
供することおよびそのような担体の製造方法を提供する
ことを目的とするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、上記目
的を精練された天然海綿からなり、該海綿の大きさが５
００μ〜５０００μであり、水で濡らすとＰＨが７より
大きく、８．５以下の弱アルカリ性を示すことを特徴と
する細胞培養用担体により達成した。
的を精練された天然海綿からなり、該海綿の大きさが５
００μ〜５０００μであり、水で濡らすとＰＨが７より
大きく、８．５以下の弱アルカリ性を示すことを特徴と
する細胞培養用担体により達成した。
【０００７】また、本発明によれば上記目的を海綿を精
練する第一の工程と、前記第一の工程で得られた海綿を
乾燥して、微細体もしくは粗粒体とする第二の工程と、
前記第二の工程で得られた海綿の微細体もしくは粗粒体
を清浄活性化する第三の工程よりなることを特徴とする
細胞培養用担体の製造方法により達成した。
練する第一の工程と、前記第一の工程で得られた海綿を
乾燥して、微細体もしくは粗粒体とする第二の工程と、
前記第二の工程で得られた海綿の微細体もしくは粗粒体
を清浄活性化する第三の工程よりなることを特徴とする
細胞培養用担体の製造方法により達成した。
【０００８】本発明に用いる海綿は天然の動物海綿であ
って、尋常海綿の中で角質海綿目のものが好ましく、主
として沐浴海綿科に属するものを用いる。この海綿を採
集し、現地で内臓を除去し、水洗乾燥されたもの（海綿
と略称する）を原料とする。
って、尋常海綿の中で角質海綿目のものが好ましく、主
として沐浴海綿科に属するものを用いる。この海綿を採
集し、現地で内臓を除去し、水洗乾燥されたもの（海綿
と略称する）を原料とする。
【０００９】海綿は海洋動物であり、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、
Ｓ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｋ等を不純物として含有
するので、これらの不純物を完全に除去するために次の
ように精練を行う。
Ｓ、Ｎａ、Ｍｇ、Ｆｅ、Ｃａ、Ｋ等を不純物として含有
するので、これらの不純物を完全に除去するために次の
ように精練を行う。
【００１０】精練の方法としては、硫酸、塩酸、硝酸、
蓚酸等の１〜５％溶液を用いて常温で１〜２０時間処理
し、次いで苛性加里、苛性ソーダ、アンモニア、炭酸ソ
ーダ等の０．１％〜０．５％溶液を用いて、３０〜４０
℃で５〜６０分間処理して水洗脱水する。場合によっ
て、過マンガン酸加里０．１〜０．５％溶液を用いて２
５〜３５℃で２０分〜１時間処理してから、硫酸、塩
酸、硝酸、蓚酸の１〜５％溶液を用いて常温で処理して
もよい。
蓚酸等の１〜５％溶液を用いて常温で１〜２０時間処理
し、次いで苛性加里、苛性ソーダ、アンモニア、炭酸ソ
ーダ等の０．１％〜０．５％溶液を用いて、３０〜４０
℃で５〜６０分間処理して水洗脱水する。場合によっ
て、過マンガン酸加里０．１〜０．５％溶液を用いて２
５〜３５℃で２０分〜１時間処理してから、硫酸、塩
酸、硝酸、蓚酸の１〜５％溶液を用いて常温で処理して
もよい。
【００１１】このようにして精練した海綿を乾燥し、乾
燥後に破砕機にかけて破砕する。破砕の程度は５００μ
〜５０００μの長さで、枝を有する太さ１０〜３０μの
微細体にするか、もしくは海綿の網目構造を有する粒子
径０．５mm〜５mmの粗粒体にする。この場合、攪拌タン
クの容量および細胞の種類によって担体のサイズを適宜
選択すればよい。攪拌タンクの容量が大きい場合は、微
細体より粗粒体の方が取扱い易い。
燥後に破砕機にかけて破砕する。破砕の程度は５００μ
〜５０００μの長さで、枝を有する太さ１０〜３０μの
微細体にするか、もしくは海綿の網目構造を有する粒子
径０．５mm〜５mmの粗粒体にする。この場合、攪拌タン
クの容量および細胞の種類によって担体のサイズを適宜
選択すればよい。攪拌タンクの容量が大きい場合は、微
細体より粗粒体の方が取扱い易い。
【００１２】次に、海綿の破砕時に付着した海綿の表面
汚れを精製水により洗浄し、清浄する。そして、細胞の
付着性を良くするために、精製水で洗浄した後に、ＰＨ
７．５〜８．５、温度３５〜４５℃の液で、１０〜３０
分間の清浄活性化処理を行う。ＰＨの調節は苛性カリ、
苛性ソーダ、アンモニア、炭酸ソーダを使用すればよ
い。清浄活性化処理後は脱水乾燥する。
汚れを精製水により洗浄し、清浄する。そして、細胞の
付着性を良くするために、精製水で洗浄した後に、ＰＨ
７．５〜８．５、温度３５〜４５℃の液で、１０〜３０
分間の清浄活性化処理を行う。ＰＨの調節は苛性カリ、
苛性ソーダ、アンモニア、炭酸ソーダを使用すればよ
い。清浄活性化処理後は脱水乾燥する。
【００１３】このようにして得られた本発明の担体を構
成する海綿は大きさが５００μ〜５０００μであり、水
に濡らした際のＰＨが７より大きく、８．５以下の弱ア
ルカリ性を示した。
成する海綿は大きさが５００μ〜５０００μであり、水
に濡らした際のＰＨが７より大きく、８．５以下の弱ア
ルカリ性を示した。
【００１４】本発明の海綿は海綿動物であり、そのアミ
ノ酸構成を分析した結果、従来のマイクロキャリアの表
面処理に使用されたコーケンアテロコラーゲンやゼラチ
ンと類似したアミノ酸構成であった。このことから細胞
培養の良好な結果が期待でき、そして実施例に示すよう
に良好な結果を得られた。
ノ酸構成を分析した結果、従来のマイクロキャリアの表
面処理に使用されたコーケンアテロコラーゲンやゼラチ
ンと類似したアミノ酸構成であった。このことから細胞
培養の良好な結果が期待でき、そして実施例に示すよう
に良好な結果を得られた。
【００１５】また、活性化処理により海綿蛋白質の等電
点付近としたことにより細胞の付着性および増殖性が高
められている。なお、中性から微酸性液による洗浄では
海綿蛋白質の等電点からずれ、細胞の付着性および増殖
性が低下するので、好ましくない。
点付近としたことにより細胞の付着性および増殖性が高
められている。なお、中性から微酸性液による洗浄では
海綿蛋白質の等電点からずれ、細胞の付着性および増殖
性が低下するので、好ましくない。
【００１６】更に、本発明の海綿を培養液中に入れ、５
０rpn の攪拌速度で攪拌したら海綿が液中に安定に浮遊
し、攪拌を中止すれば徐々に沈降した。このことは培養
時および回収時に極めて有効である。
０rpn の攪拌速度で攪拌したら海綿が液中に安定に浮遊
し、攪拌を中止すれば徐々に沈降した。このことは培養
時および回収時に極めて有効である。
【００１７】本発明の細胞培養用担体は海綿であり、水
分で濡れると柔軟で且つ弾性を有する性質がある。従っ
て、培養液中では極めて柔軟で弾性があるので、衝突に
よる抵抗は全くなく、付着細胞にダメージを与えること
がない。
分で濡れると柔軟で且つ弾性を有する性質がある。従っ
て、培養液中では極めて柔軟で弾性があるので、衝突に
よる抵抗は全くなく、付着細胞にダメージを与えること
がない。
【００１８】また、他のマイクロカプセルと併用すると
担体機能と同時に担体間の衝突のクッションの作用をな
し、ダメージの減少に有効である。
担体機能と同時に担体間の衝突のクッションの作用をな
し、ダメージの減少に有効である。
【００１９】
【実施例】以下実施例に基いて本発明を説明する。
【００２０】〔実施例１〕 海綿を硫酸２％液を用いて
常温で８時間処理して水洗した。次いで苛性ソーダ２ｇ
／ｌ液を用いて３５℃で１５分間処理して水洗した。遠
心脱水して室温で乾燥した後、破砕機械にかけて５００
μ〜２０００μの長さで枝を有する太さ約２０μの微細
体とした。該微細体を精製水で洗浄して苛性ソーダによ
りＰＨ８に調節した液に４０℃で１０分間清浄活性化処
理を行って遠心脱水して乾燥した。得られた海綿を水で
濡らして、測定したらＰＨ７．５であった。
常温で８時間処理して水洗した。次いで苛性ソーダ２ｇ
／ｌ液を用いて３５℃で１５分間処理して水洗した。遠
心脱水して室温で乾燥した後、破砕機械にかけて５００
μ〜２０００μの長さで枝を有する太さ約２０μの微細
体とした。該微細体を精製水で洗浄して苛性ソーダによ
りＰＨ８に調節した液に４０℃で１０分間清浄活性化処
理を行って遠心脱水して乾燥した。得られた海綿を水で
濡らして、測定したらＰＨ７．５であった。
【００２１】上記の如く製造した担体１００mlとＰＢＳ
（燐酸塩緩衝生理食塩水）５０mlを５００mlのスピナー
フラスコに入れ、１１０℃で２０分滅菌した。次いでＤ
ＭＥＭ培地（ダルベッコズ・モディファイド・イーグル
ズ・メディウム）で洗浄し５％牛胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ培地２００mlを加え３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2
で平衡させた。細胞としてＣＨＯ−Ｋｌ（チャイニーズ
ハムスター子宮卵巣細胞）を使用し播種密度を２．０×
１０5 cell／mlとした。４日後の細胞密度は１．６×１
０6 cell／mlに増殖した。
（燐酸塩緩衝生理食塩水）５０mlを５００mlのスピナー
フラスコに入れ、１１０℃で２０分滅菌した。次いでＤ
ＭＥＭ培地（ダルベッコズ・モディファイド・イーグル
ズ・メディウム）で洗浄し５％牛胎児血清を含むＤＭＥ
Ｍ培地２００mlを加え３７℃、９５％空気、５％ＣＯ2
で平衡させた。細胞としてＣＨＯ−Ｋｌ（チャイニーズ
ハムスター子宮卵巣細胞）を使用し播種密度を２．０×
１０5 cell／mlとした。４日後の細胞密度は１．６×１
０6 cell／mlに増殖した。
【００２２】〔実施例２〕 海綿を塩酸３％液を用いて
常温で１０時間処理して水洗し、次いで、過マンガン酸
加里０．１％溶液を用いて３０℃で３０分処理してか
ら、次いで苛性ソーダ２ｇ／ｌ液を用いて３５℃で１５
分間処理して水洗した。遠心脱水して室温で乾燥した
後、破砕機械にかけて粒子径１mm〜２mmで海綿の網目構
造を有する粗粒体とした。該微細体を精製水で洗浄して
炭酸ソーダによりＰＨ７．５に調節した液に４０℃で１
０分間清浄活性化処理を行って遠心脱水して乾燥した。
得られた海綿を水で濡らして、測定したらＰＨ７．５で
あった。
常温で１０時間処理して水洗し、次いで、過マンガン酸
加里０．１％溶液を用いて３０℃で３０分処理してか
ら、次いで苛性ソーダ２ｇ／ｌ液を用いて３５℃で１５
分間処理して水洗した。遠心脱水して室温で乾燥した
後、破砕機械にかけて粒子径１mm〜２mmで海綿の網目構
造を有する粗粒体とした。該微細体を精製水で洗浄して
炭酸ソーダによりＰＨ７．５に調節した液に４０℃で１
０分間清浄活性化処理を行って遠心脱水して乾燥した。
得られた海綿を水で濡らして、測定したらＰＨ７．５で
あった。
【００２３】上記の如く製造した担体１００mlとＰＢＳ
５０mlを５００mlのスピナーフラスコに入れ、１１０℃
で２０分滅菌した。次いでＤＭＥＭ培地で洗浄し５％牛
胎児血清を含むＤＭＥＭ培地２００mlを加え３７℃、９
５％空気、５％ＣＯ2 で平衡させた。細胞としてＣＨＯ
−Ｋｌを使用し播種密度を２．０×１０5 cell／mlとし
た。４日後の細胞密度は１．４×１０6 cell／mlに増殖
した。
５０mlを５００mlのスピナーフラスコに入れ、１１０℃
で２０分滅菌した。次いでＤＭＥＭ培地で洗浄し５％牛
胎児血清を含むＤＭＥＭ培地２００mlを加え３７℃、９
５％空気、５％ＣＯ2 で平衡させた。細胞としてＣＨＯ
−Ｋｌを使用し播種密度を２．０×１０5 cell／mlとし
た。４日後の細胞密度は１．４×１０6 cell／mlに増殖
した。
Claims (2)
- 【請求項１】 精練された天然海綿からなり、該海綿の
大きさが５００μ〜５０００μであり、水で濡らすとＰ
Ｈが７より大きく、８．５以下の弱アルカリ性を示すこ
とを特徴とする細胞培養用担体。 - 【請求項２】 海綿を精練する第一の工程と、前記第一
の工程で得られた海綿を乾燥して、微細体もしくは粗粒
体とする第二の工程と、前記第二の工程で得られた海綿
の微細体もしくは粗粒体を清浄活性化する第三の工程よ
りなることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養用担
体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4200263A JP2618315B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | 細胞培養用担体およびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4200263A JP2618315B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | 細胞培養用担体およびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0622755A JPH0622755A (ja) | 1994-02-01 |
| JP2618315B2 true JP2618315B2 (ja) | 1997-06-11 |
Family
ID=16421439
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4200263A Expired - Lifetime JP2618315B2 (ja) | 1992-07-03 | 1992-07-03 | 細胞培養用担体およびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2618315B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4797396B2 (ja) * | 2004-02-19 | 2011-10-19 | 大日本印刷株式会社 | 細胞培養基板の製造方法 |
-
1992
- 1992-07-03 JP JP4200263A patent/JP2618315B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0622755A (ja) | 1994-02-01 |
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